ES2315296T3 - Composiciones para la terapia uy el diagnostico del cancer ovarico. - Google Patents
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Abstract
Epítopo para anticuerpo aislado del antígeno O8E de carcinoma ovárico, consistiendo dicho epítopo en la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 398 o una variante de la misma que tiene al menos una identidad del 90% a lo largo de toda su longitud con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 398.
Description
Composiciones para la terapia y el diagnóstico
del cáncer ovárico.
La presente invención se refiere de forma
general al tratamiento del cáncer ovárico. La invención se refiere
más específicamente a polipéptidos que comprenden una porción de una
proteína de carcinoma ovárico, y a polinucleótidos que codifican
tales polipéptidos, así como a los anticuerpos que reconocen
específicamente tales polipéptidos. Tales polipéptidos,
polinucleótidos y anticuerpos se pueden utilizar en vacunas y
composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer
ovárico.
El cáncer ovárico es un problema sanitario
importante para las mujeres en los Estados Unidos y en todo el
mundo. Aunque se ha avanzado en la detección y el tratamiento de
este cáncer, en la actualidad no se dispone de ninguna vacuna ni de
otro método universalmente exitoso para su prevención o tratamiento.
El tratamiento de la enfermedad se basa en la actualidad en una
combinación de diagnóstico temprano y tratamiento agresivo, que
puede incluir uno o más de una serie de tratamientos tales como
intervención quirúrgica, radioterapia, quimioterapia y tratamiento
hormonal. El ciclo de tratamiento de un determinado cáncer a menudo
se selecciona según una serie de parámetros pronósticos, incluido
un análisis de los marcadores tumorales específicos. No obstante,
la utilización de marcadores establecidos a menudo conduce a un
resultado que es difícil de interpretar y se continúa observando
una mortalidad elevada en muchos pacientes con cáncer.
Las inmunoterapias tienen la posibilidad de
mejorar significativamente el tratamiento del cáncer y la
supervivencia. Tales tratamientos pueden implicar la generación o
la mejora de una respuesta inmunitaria contra un antígeno del
carcinoma ovárico. Sin embargo, hasta la fecha, se conocen
relativamente pocos antígenos del carcinoma ovárico y no se ha
demostrado que la generación de una respuesta inmunitaria contra
tales antígenos sea terapéuticamente beneficiosa. Las solicitudes
de las patentes internacionales WO 99/63083, WO 00/12758 y WO
00/36107 describen la secuencia completa del antígeno 08E del
carcinoma ovárico.
En consecuencia, existe una necesidad en la
técnica de mejores métodos para identificar los antígenos del tumor
ovárico y de utilizar tales antígenos para tratar el cáncer ovárico.
La presente invención satisface estas necesidades y además
proporciona otras ventajas relacionadas.
De conformidad con la presente invención, se da
a conocer un epítopo para anticuerpo del antígeno 08E del carcinoma
ovárico aislado, consistiendo dicho epítopo en la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEQ ID n.º 398 o una variante de la
misma que tenga al menos el 90% de identidad a lo largo de toda la
secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID n.º 398.
En el segundo aspecto, se da a conocer un
anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que
se une específicamente al epítopo para anticuerpo de la presente
invención.
La presente invención también da a conocer la
utilización del epítopo de la invención y el anticuerpo de la
invención en el tratamiento, incluida su utilización para prevenir
el desarrollo del cáncer ovárico y para tratar el cáncer
ovárico.
La presente invención también da a conocer un
polinucleótido que codifica el epítopo de la presente invención,
junto con su utilización en tratamientos y su utilización para
prevenir el desarrollo del cáncer ovárico y para tratar el cáncer
ovárico.
También se da a conocer una composición
farmacéutica y una vacuna que incluye el epítopo de la presente
invención, el anticuerpo de la presente invención o el
polinucleótido de la presente invención.
Dicho brevemente, esta invención da a conocer
composiciones y su utilización para el tratamiento del cáncer,
tales como el cáncer ovárico. En un aspecto, la invención da a
conocer polipéptidos que comprenden una porción inmunógena de una
proteína del cáncer ovárico, o una variante de la misma que difiere
en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones,
de tal manera que la capacidad de la variante para reaccionar con
los antisueros específicos contra la proteína del carcinoma ovárico
no disminuya significativamente, como se define en las
reivindicaciones.
La presente invención da a conocer además
composiciones de polipéptidos que consisten en una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias
listadas en la SEQ ID n.º 398, o secuencias idénticas al menos al
90% a éstas.
En otros aspectos, la presente invención da a
conocer composiciones farmacéuticas y vacunas.
En otros aspectos, también se describen
proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido tal y
como se ha descrito anteriormente, así como los polinucleótidos que
codifican tales proteínas de fusión.
En aspectos relacionados, se describen
composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión o
polinucleótido que codifica una proteína de fusión en combinación
con un excipiente fisiológicamente aceptable.
En otros aspectos, se describen vacunas que
comprenden una proteína de fusión o polinucleótido que codifica una
proteína de fusión en combinación con un potenciador inespecífico de
la respuesta inmunitaria.
En otros aspectos, la presente descripción da a
conocer una composición farmacéutica o vacuna tal y como se expuso
anteriormente, para inhibir el desarrollo del cáncer en una
paciente.
La presente invención describe un epítopo para
anticuerpo reconocido por el suero policlonal
anti-O8E cuyo epítopo se presenta en la presente
memoria como la SEQ ID n. 398.
La presente descripción describe adicionalmente
péptidos de 10 y 9 restos que se predice que se unen a
HLA-0201, describiéndose dichos péptidos en la
presente invención como SEQ ID n.º 416-435 y SEQ ID
n.º 436-455, respectivamente.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción
detallada y los dibujos adjuntos.
De acuerdo con otro aspecto, se describen
polipéptidos de O8E que comprenden al menos una secuencia del
epítopo para anticuerpo presentada en la SEQ ID n.º 398.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID n.º 1-71 son
polinucleótidos del antígeno del carcinoma ovárico mostrados en las
figuras 1A-1S.
SEQ ID n.º 72-74 son
polinucleótidos del antígeno del carcinoma ovárico mostrados en las
figuras 2A-2C.
SEQ ID n.º 75 es el polinucleótido 3g del
carcinoma ovárico (Figura 4).
SEQ ID n.º 76 es el polinucleótido 3f del
carcinoma ovárico (Figura 5).
SEQ ID n.º 77 es el polinucleótido 6b del
carcinoma ovárico (Figura 6).
SEQ ID n.º 78 es el polinucleótido 8e del
carcinoma ovárico (Figura 7A).
SEQ ID n.º 79 es el polinucleótido 8h del
carcinoma ovárico (Figura 7B).
SEQ ID n.º 80 es el polinucleótido 12e del
carcinoma ovárico (Figura 8).
SEQ ID n.º 81 es el polinucleótido 12h del
carcinoma ovárico (Figura 9).
SEQ ID n.º 82-310 son
polinucleótidos del antígeno del carcinoma ovárico mostrados en las
figuras 15A-15EEE.
SEQ ID n.º 391 es una secuencia completa del
polinucleótido O8E del carcinoma ovárico.
SEQ ID n.º 392-393 son
secuencias proteicas codificadas por O8E.
SEQ ID n.º 394-415 son
secuencias peptídicas que corresponden a los epítopos para
anticuerpo de OE8.
SEQ ID n.º 416-435 son posibles
decapéptidos de unión a HLA-A2 predichos con el
marco de lectura abierto completo de OE8.
SEQ ID n.º 436-455 son posibles
nonapéptidos de unión a HLA-A2 predichos con el
marco de lectura abierto completo de OE8.
Las figuras 1A-1S (SEQ ID n.º
1-71) representan secuencias parciales de
polinucleótidos que codifican antígenos representativos y
secretados del carcinoma ovárico.
Las figuras 2A-2C representan
secuencias de todo el inserto de tres de los clones de la figura 1.
La figura 2A muestra la secuencia denominada O7E (11731; SEQ ID n.º
72), la figura 2B muestra la secuencia denominada O9E (11785; SEQ
ID n.º 73) y la figura 2C muestra la secuencia denominada O8E
(13695; SEQ ID n.º 74).
La figura 3 presenta los resultados del análisis
de expresión con micromatrices de la secuencia del carcinoma
ovárico denominada O8E.
\newpage
La figura 4 presenta una secuencia parcial de un
polinucleótido (denominada 3g; SEQ ID n.º 75) que codifica una
secuencia de carcinoma ovárico que es una fusión de empalme entre
TAX, una oncoproteína de tipo I del virus de la leucemia de
linfocitos T humanos, y la osteonectina.
La figura 5 presenta el polinucleótido del
carcinoma ovárico denominado 3f (SEQ ID n.º 76).
La figura 6 presenta el polinucleótido del
carcinoma ovárico denominado 6b (SEQ ID n.º 77).
Las figuras 7A y 7B presentan los
polinucleótidos del carcinoma ovárico denominados 8e (SEQ ID n.º 78)
y 8h (SEQ ID n.º 79).
La figura 8 presenta el polinucleótido del
carcinoma ovárico denominado 12c (SEQ ID n.º 80).
La figura 9 presenta el polinucleótido del
carcinoma ovárico denominado 12h (SEQ ID n.º 81).
La figura 10 describe los resultados del
análisis de expresión con micromatrices de la secuencia del
carcinoma ovárico denominada 3f.
La figura 11 describe los resultados del
análisis de expresión con micromatrices de la secuencia del
carcinoma ovárico denominada 6b.
La figura 12 describe los resultados del
análisis de expresión con micromatrices de la secuencia del
carcinoma ovárico denominada 8e.
La figura 13 describe los resultados del
análisis de expresión con micromatrices de la secuencia del
carcinoma ovárico denominada 12c.
La figura 14 describe los resultados del
análisis de expresión con micromatrices de la secuencia del
carcinoma ovárico denominada 12h.
Las figuras describen secuencias parciales de
polinucleótidos adicionales que codifican antígenos representativos
y secretados del carcinoma ovárico (SEQ ID n.º
82-310).
La figura 16 es un diagrama que ilustra la
ubicación de varias secuencias parciales de O8E dentro de la
secuencia completa.
La figura 17 es un gráfico que ilustra los
resultados de los estudios de cartografía de epítopos sobre la
proteína O8E.
La figura 18 es un gráfico de un análisis de
clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) de la
expresión de O8E en la superficie celular.
La figura 19 es un gráfico de análisis de FACS
de la expresión de O8E en la superficie celular.
La figura 20 muestra los resultados del análisis
de FACS de células HEK293 transfectadas con O8E que demuestra la
expresión de O8E en la superficie celular.
La figura 21 muestra los resultados del análisis
de FACS de células SKBR3 de tumor de mama que muestran la expresión
de O8E en la superficie celular.
La figura 22 muestra la expresión de O8E en
células HEK293. Se sondaron las células con antisueros policlonales
de conejo anti-O8E n.º 2333L.
La figura 23 muestra el análisis de ELISA de
sueros de conejo anti-O8E.
La figura 24 muestra el análisis de ELISA del
anticuerpo policlonal anti-O8E de conejo purificado
por afinidad.
La figura 25 es un gráfico que determina la
interiorización del anticuerpo monoclonal (Acm)
anti-O8E que muestra que los Acm contra los
aminoácidos 61 a 80 inducen la interiorización del ligando.
Tal y como se observó anteriormente, la presente
invención generalmente se dirige a composiciones como las definidas
por las reivindicaciones y su utilización para el tratamiento del
cáncer, tal como el cáncer ovárico. Las composiciones descritas en
la presente invención pueden incluir polipéptidos inmunógenos,
agentes de unión tales como anticuerpos que se unen a un
polipéptido, células presentadoras de antígenos (CPA) y/o células
del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T).
Los polipéptidos descritos en la presente
invención por lo general comprenden al menos una porción inmunógena
de una proteína del carcinoma ovárico o una variante de la misma. Se
han identificado algunas proteínas del carcinoma ovárico mediante
una técnica inmunoanalítica, y se citan en la presente memoria como
antígenos del carcinoma ovárico. Un "antígeno del carcinoma
ovárico" es una proteína expresada por las células del tumor
ovárico (preferentemente células humanas) a un nivel que es al menos
dos veces superior que el nivel de las células ováricas normales.
Determinados antígenos del carcinoma ovárico reaccionan de forma
detectable (en un inmunoanálisis, tal como un ELISA o un análisis
de inmunotransferencia) con antisueros generados contra el suero de
un animal inmunodeprimido al que se le ha implantado un tumor
ovárico humano. Tales antígenos del carcinoma ovárico se desprenden
o secretan al suero desde un tumor ovárico del animal
inmunodeprimido. En consecuencia, determinados antígenos del
carcinoma ovárico dados a conocer en la presente memoria son
antígenos secretados. Determinadas secuencias de ácido nucleico de
la invención en cuestión comprenden por lo general una secuencia de
ADN o ARN que codifica todo o una parte de tal polipéptido, o que es
complementaria a tal secuencia.
Se describen secuencias del carcinoma ovárico
que se identifican utilizando técnicas para evaluar la alteración
de la expresión dentro de un tumor ovárico. Tales secuencias pueden
ser secuencias polinucleotídicas o proteicas. Las secuencias del
carcinoma ovárico por lo general se expresan en un tumor ovárico a
un nivel que es al menos dos veces y, preferentemente al menos
cinco veces, superior al nivel de expresión en un tejido ovárico
normal, que se determina mediante un análisis representativo dado a
conocer en la presente memoria. En la presente memoria se presentan
algunas secuencias polinucleotídicas parciales del carcinoma
ovárico. Las proteínas codificadas por los genes que comprenden
tales secuencias polinucleotídicas (o complementarias a las mismas)
también se consideran proteínas del carcinoma ovárico.
Por lo general, los anticuerpos son proteínas
del sistema inmunitario, o fragmentos de unión al antígeno de los
mismos, que son capaces de unirse al menos a una porción de un
polipéptido del carcinoma ovárico tal y como se describe en la
presente memoria. Los linfocitos T que se pueden emplear en las
composiciones proporcionadas en la presente memoria son
generalmente linfocitos T (por ejemplo, CD4^{+} y/o CD8^{+}) que
son específicos de tal polipéptido. Determinados métodos descritos
en la presente memoria emplean además células presentadoras de
antígenos (tales como células dendríticas o macrófagos) que expresan
un polipéptido del carcinoma ovárico tal y como se da a conocer en
la presente memoria.
Cualquier polinucleótido que codifica una
proteína del carcinoma ovárico o una porción u otra variante de la
misma tal y como se describe en la presente memoria es parte de la
presente descripción. Los polinucleótidos preferidos comprenden al
menos 15 nucleótidos consecutivos, preferentemente al menos 30
nucleótidos consecutivos, y más preferentemente al menos 45
nucleótidos consecutivos, que codifican una porción de una proteína
del carcinoma ovárico. Más preferentemente, un polinucleótido
codifica una porción inmunógena de una proteína del carcinoma
ovárico, tal como un antígeno del carcinoma ovárico. También se
describen polinucleótidos complementarios a cualquiera de las
secuencias. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios
(codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas
de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Pueden estar presentes,
pero no necesariamente, secuencias codificantes o no codificantes
adicionales dentro de un polinucleótido tal y como se ha descrito,
y un polinucleótido puede estar unido, pero no necesariamente, a
otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una
secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica una
proteína del carcinoma ovárico o una porción de la misma) o puede
comprender una variante de tal secuencia. Las variantes de los
polinucleótidos pueden contener uno o más sustituciones, adiciones,
deleciones y/o inserciones, de tal forma que la inmunogenia del
polipéptido codificado no disminuya respecto a una proteína natural
del carcinoma ovárico. Por lo general, se puede evaluar el efecto
sobre la inmunogenia del polipéptido codificado tal y como se
describe en la presente memoria. Las variantes muestran
preferentemente una identidad de al menos un 70%, más
preferentemente una identidad de al menos un 80% y, más
preferentemente, una identidad de al menos un 90%, con una
secuencia polinucleotídica que codifica una proteína nativa del
carcinoma ovárico o una porción de la misma.
El porcentaje de identidad de dos secuencias
polinucleotídicas o polipeptídicas se puede determinar fácilmente
comparando las secuencias con algoritmos informáticos bien conocidos
por los expertos en la técnica, tales como Megalign, con los
parámetros por omisión. Las comparaciones entre las dos secuencias
normalmente se realizan comparando las secuencias en una ventana de
comparación para identificar y comparar regiones locales de
similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" tal y
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento de
al menos 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a unas 75, o de
40 a unas 50, en el que la secuencia se puede comparar con una
secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas
después de que las dos secuencias se alineen óptimamente. El
alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se pueden
llevar a cabo, por ejemplo, con el programa Megalign del paquete
Lasergene de programas bioinformáticos (DNASTAR, Inc., Madison,
WI), con los parámetros por detecto. Preferentemente, el porcentaje
de identidad de la secuencia se determina comparando dos secuencias
alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación de al menos
20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica
o polipeptídica en la ventana puede comprender adiciones o
deleciones (es decir, huecos) del 20% o menos, normalmente del 5 al
15% o del 10 al 12%, respecto a la secuencia de referencia (que no
contiene ni adiciones ni deleciones). Se puede calcular el
porcentaje de identidad determinando el número de posiciones en el
que se encuentran bases del ácido nucleico o residuos de
aminoácidos idénticos en ambas secuencias para producir el número de
posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones
emparejadas por el número total de posiciones en la secuencia de
referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los
resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de las
secuencias.
Las variantes pueden también, o
alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen natural, o
una porción o secuencia complementaria del mismo. Tales variantes
polinucleotídicas son capaces de hibridarse en condiciones
moderadamente rigurosas a una secuencia de ADN que se produce de
forma natural que codifica una proteína nativa del carcinoma
ovárico (o una secuencia complementaria). Las condiciones
moderadamente rigurosas adecuadas incluyen el prelavado en una
disolución de SSC 5X, SDS al 0,5%, EDTA a 1,0 mM (pH 8,0); hibridar
a 50ºC-65ºC en SSC 5X durante una noche; seguido de
dos lavados a 65ºC durante 20 minutos cada uno con SSC 2X, 0,5X y
0,2X con SDS al 0,1%.
Los expertos en la técnica apreciarán que, como
resultado de la degeneración del código genético, hay muchas
secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido como los
descritos en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos
albergan una homología mínima con la secuencia nucleotídica de algún
gen original. Sin embargo, también se describen los polinucleótidos
que varían debido a las diferencias en el uso de los codones.
Además, se describen los alelos de los genes que comprenden las
secuencias de los polinucleótidos dados a conocer en la presente
memoria. Los alelos son genes endógenos que están alterados como
resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones
y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes
pueden, pero no necesariamente, tener una estructura o función
alterada. Los alelos se pueden identificar con técnicas estándares
(tales como hibridación, amplificación y/o comparación de las
secuencias con bases de datos).
Los polinucleótidos se pueden preparar
utilizando numerosas técnicas. Por ejemplo, se puede identificar un
polinucleótido del carcinoma ovárico, tal y como se describe con más
detalle a continuación, cribando una genoteca de expresión de
tumores ováricos de pases tardíos con antisueros generados contra el
suero de ratones inmunocompetentes después de inyectar a tales
ratones sueros de ratones SCID a los que se les ha implantado
tumores ováricos de pases tardíos. También se pueden identificar
polinucleótidos de carcinoma ovárico utilizando alguna de una serie
de técnicas diseñadas para evaluar la expresión génica diferencial.
Alternativamente, se pueden amplificar los polinucleótidos a partir
de ADNc preparado de las células de tumor ovárico. Se pueden
amplificar tales polinucleótidos mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). Para este enfoque, se pueden diseñar cebadores
específicos de la secuencia basados en las secuencias proporcionadas
en la presente memoria, y se pueden comprar o sintetizar.
Se puede utilizar una porción amplificada para
aislar un gen completo de una genoteca adecuada (por ejemplo, una
genoteca de ADNc de carcinoma ovárico) mediante técnicas bien
conocidas. En tales técnicas, una genoteca (de ADNc o genómica) se
criba con una o más sondas de polinucleótidos o cebadores adecuados
para la amplificación. Preferentemente, la genoteca está
seleccionada por tamaño para incluir moléculas más grandes. También
se pueden preferir genotecas cebadas aleatoriamente para
identificar las regiones 5' y cadena arriba de los genes. Se
prefieren genotecas genómicas para obtener intrones y extender
secuencias en 5'.
Para las técnicas de hibridación, se puede
marcar una secuencia parcial (por ejemplo, mediante incisión
ambulante o con marcación terminal con ^{32}P) mediante técnicas
bien conocidas. A continuación, la genoteca en bacterias o
bacteriófagos se criba al hibridar los filtros que contienen las
colonias bacterianas desnaturalizadas (o céspedes que contienen
placas de fagos) con la sonda marcada (v. Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias o las
placas que hibridan se seleccionan o se expanden, y se aísla el ADN
para análisis posteriores. Los clones de ADNc se pueden analizar
para determinar la cantidad de secuencia adicional mediante, por
ejemplo, PCR con un cebador de la secuencia parcial y un cebador
del vector. Se pueden generar mapas de restricción y secuencias
parciales para identificar uno o más clones solapantes. Luego se
puede determinar la secuencia completa mediante técnicas estándares,
que pueden implicar la generación de una serie de clones de
deleción. A continuación, las secuencias solapantes resultantes se
ensamblan en una única secuencia contigua. Se puede generar una
molécula de ADNc completa al ligar los fragmentos adecuados,
mediante técnicas bien conocidas.
Alternativamente, existen numerosas técnicas de
amplificación para obtener una secuencia codificante completa a
partir de una secuencia de ADNc parcial. En tales técnicas, por lo
general, la amplificación se realiza por PCR. Se puede utilizar
cualquiera de los muchos kits disponibles comercialmente para llevar
a cabo la etapa de amplificación. Se pueden diseñar cebadores
utilizando, por ejemplo, programas informáticos bien conocidos en
la técnica. Los cebadores tienen una longitud preferentemente de 22
a 30 nucleótidos, tienen un contenido de GC de al menos el 50% y se
alinean a una secuencia diana a temperaturas de unos 68ºC a 72ºC. Se
puede secuenciar la región amplificada tal y como se describió
anteriormente, y ensamblar las secuencias solapantes en una
secuencia continua.
Una de tales técnicas de amplificación es la PCR
inversa (véase Trigilia et al., Nucl. Acids Res.
16:8186, 1988) que utiliza enzimas de restricción para generar un
fragmento en la región conocida del gen. A continuación, se
circulariza el fragmento mediante una ligación intramolecular y se
utiliza como plantilla para la PCR con cebadores divergentes
derivados de la región conocida. En un enfoque alternativo, se
pueden recuperar las secuencias adyacentes a una secuencia parcial
mediante amplificación con un cebador a una secuencia conectora y
un cebador específico a una región conocida. Típicamente, las
secuencias amplificadas se someten a un segundo ciclo de
amplificación con el mismo cebador conector y un segundo cebador
específico de la región conocida. Una variación de este
procedimiento, que utiliza dos cebadores que inician la extensión en
direcciones opuestas de la secuencia conocida, se describe en la
patente internacional WO 96/38591. Otras técnicas incluyen PCR de
captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:
111-19, 1991) y paseo por PCR (Parker et al.,
Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60, 1991).
También se pueden emplear otros métodos que utilizan la
amplificación para obtener una secuencia del ADNc completo.
En algunos casos, es posible obtener una
secuencia de ADNc completo al analizar las secuencias contenidas en
una base de datos de secuencias etiquetadas por la expresión (EST),
tal como la disponible en GenBank. Las búsquedas para solapar las
EST por lo general se pueden realizar con programas bien conocidos
(por ejemplo, búsquedas con el BLAST del NCBI) y tales EST se
pueden utilizar para generar una secuencia completa continua.
Determinadas secuencias de ácido nucleico de
moléculas de ADNc que codifican porciones de antígenos del carcinoma
ovárico se proporcionan en las figuras 1A a 1S (SEQ ID n.º 1 a 71)
y las figuras 15A a 15EEE (SEQ ID n.º 82 a 310). Las secuencias
dadas a conocer en las figuras 1A a 1S parecen ser nuevas. Para las
secuencias en las figuras 15A-15EEE, las búsquedas
en la base de datos revelaron emparejamientos que tienen una
identidad significativa. Estos polinucleótidos se aislaron mediante
cribado serológico de una genoteca de expresión de ADNc del tumor
ovárico, utilizando una técnica diseñada para identificar antígenos
tumorales secretados. Brevemente, se preparó una genoteca de
expresión de tumor ovárico de pase tardío a partir de tumor ovárico
humano derivado de una SCID (OV9334) en el vector
\lambda-screen (Novagen). Los sueros utilizados
para el cribado se obtuvieron al inyectar a ratones
inmunocompetentes sueros de ratones SCID a los que se les
implantaron tumores ováricos de pase tardío. Esta técnica permite
identificar las moléculas de ADNc que codifican porciones
inmunógenas de los antígenos tumorales secretados. Se describen
específicamente los polinucleótidos expuestos en la presente
memoria, así como los polinucleótidos de longitud completa que
comprenden tales secuencias, otras porciones de tales
polinucleótidos de longitud completa y las secuencias
complementarias a toda o a una porción de tales moléculas de
longitud completa. A los expertos en la técnica les resultará
evidente que también se puede aplicar está técnica a la
identificación de antígenos que se secretan desde otros tipos de
tumores.
Otras secuencias de ácido nucleico de moléculas
de ADNc que codifican porciones de proteínas del carcinoma ovárico
se dan a conocer en las figuras 4 a 9 (SEQ ID n.º 75 a 81). Se
identificaron estas secuencias cribando una micromatriz de ADNc en
busca de la expresión relacionada con el tumor (es decir, que la
expresión que sea al menos cinco veces mayor en un tumor ovárico
que en un tejido ovárico normal, según se determinó con un análisis
representativo proporcionado en la presente memoria). Tales cribados
se realizaron con una micromatriz Synteni (Palo Alto, CA) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (y se describe
esencialmente en Schena et al., Proc. Natl: Acad.
Sci. USA 93: 10614-10619, 1996 y Heller
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
2150-2155, 1997).
Se puede utilizar una cualquiera de una serie de
técnicas bien conocidas para evaluar la expresión de un ADNc
relacionado con el tumor. Por ejemplo, se pueden emplear técnicas de
hibridación que utilizan sondas polinucleotídicas marcadas.
Alternativamente, o además, se pueden utilizar técnicas de
amplificación tal como la PCR en tiempo real (véase Gibson et
al., Genome Research 6: 955-1101, 1996;
Heid et al., Genome Research 6:
986-994, 1996). La PCR en tiempo real es una
técnica que evalúa el nivel de acumulación del producto de PCR
durante la amplificación. Esta técnica permite la evaluación
cuantitativa de los niveles del ARNm en varias muestras.
Brevemente, se extrae un ARNm de tejido tumoral y del normal y se
prepara el ADNc mediante técnicas estándares. Se puede realizar la
PCR en tiempo real, por ejemplo, con un instrumento 7700 Prism de
Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Se pueden
diseñar cebadores complementarios y sondas fluorescentes de genes
de interés utilizando, por ejemplo, el programa Primer Express
proporcionado por Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City,
CA). Los expertos en la técnica pueden determinar inicialmente la
concentración óptima de los cebadores y las sondas, y se pueden
obtener comercialmente los cebadores y sondas de control (por
ejemplo, \beta-actina), por ejemplo, de Perkin
Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Para cuantificar la
cantidad de ARN específico en una muestra, se genera una curva
estándar junto a él con un plásmido que contiene el gen de interés.
Se pueden generar curvas estándares utilizando los valores de Ct
determinados en la PCR en tiempo real, que están relacionados con
la concentración del ADNc inicial utilizada en el análisis. Por lo
general, bastan diluciones estándares que oscilen de 10 a 10^{6}
copias del gen de interés. Además, se genera una curva estándar
para la secuencia de control. Esto permite normalizar el contenido
de ARN inicial de una muestra de tejido por la cantidad de control,
para permitir la comparación.
Por lo general, se pueden preparar variantes del
polinucleótido con cualquier método conocido en la técnica,
incluida la síntesis química, mediante, por ejemplo, la síntesis
química de fosforamidita en fase sólida. También se pueden
introducir modificaciones en una secuencia polinucleotídica mediante
técnicas de mutagénesis estándares, tal como la mutagénesis
específica de sitio dirigida por oligonucleótidos (véase Adelman
et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativamente, se pueden
generar moléculas de ARN mediante la transcripción in vitro
o in vivo de secuencias de ADN que codifican un antígeno del
carcinoma ovárico, o una porción del mismo, siempre y cuando se
incorpore el ADN en un vector con un promotor adecuado para la ARN
polimerasa (tales como T7 o SP6). Se pueden usar determinadas
porciones para preparar un polipéptido codificado, tal y como se
describe en la presente memoria. Además, o alternativamente, se
puede administrar una porción a un paciente de tal forma que el
polipéptido codificado se genere in vivo.
También se puede utilizar una porción de una
secuencia complementaria a una secuencia codificante (a saber, un
polinucleótido antisentido) como sonda o para modular la expresión
génica. Las construcciones de ADNc que se pueden transcribir en el
ARN antisentido también se pueden introducir en células o tejidos
para facilitar la producción del ARN antisentido. Se puede utilizar
un polinucleótido antisentido, tal y como se describe en la
presente memoria, para inhibir la expresión de una proteína del
carcinoma ovárico. Se puede usar la tecnología de antisentidos para
controlar la expresión génica por la formación de hélices triples,
lo que compromete la capacidad que tiene la doble hélice de abrirse
lo suficiente para unirse a las polimerasas, los factores de
transcripción o las moléculas reguladoras (véase Gee et al.,
en Huber y Carr, "Molecular and Immunologic Approaches",
Futura Publishing Company Co. (Mt. Kisco, NY; 1994).
Alternativamente, se puede diseñar una molécula antisentido para
hibridar con una región controladora de un gen (por ejemplo,
promotor, potenciador o sitio de inicio de la transcripción) y
bloquear la transcripción del gen; o para bloquear la traducción al
inhibir la unión de un transcrito a los ribosomas.
Se puede modificar adicionalmente un
polinucleótido para aumentar su estabilidad in vivo. Las
modificaciones posibles incluyen, pero sin limitarse a ellas, la
adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; la
utilización de fosforotioato o O-metilos en 2' en
vez de enlaces fosfodiéster en el esqueleto; y/o la inclusión de
bases distintas a las tradicionales tales como inosina, queosina o
wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y otras formas
modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Las secuencias nucleotídicas tal y como se
describen en la presente memoria se pueden unir a muchas otras
secuencias nucleotídicas mediante técnicas de ADN recombinante
establecidas. Por ejemplo, se puede clonar un polinucleótido en
cualquiera de los numerosos vectores de clonación, incluidos
plásmidos, fagómidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los
vectores de interés particular incluyen vectores de expresión,
vectores de replicación, vectores de generación de sondas y
vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un
origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de
endonucleasas de restricción adecuados y uno o más marcadores de
selección. Otros elementos dependerán del uso deseado y serán
evidentes para los expertos en la técnica.
En determinadas realizaciones, se pueden
formular polinucleótidos de tal modo que permitan la entrada en una
célula de un mamífero, y la expresión dentro de ésta. Tales
formulaciones son particularmente útiles a efectos terapéuticos,
tal y como se describe más adelante. Los expertos en la técnica se
darán cuenta de que hay muchas maneras de conseguir la expresión de
un polinucleótido en una célula diana, y que se puede utilizar
cualquier método que sea adecuado. Por ejemplo, se puede incorporar
un polinucleótido en un vector vírico tal como, pero sin limitarse
a ellos, adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, o virus de la
variolovacuna u otros virus de la viruela (por ejemplo, el virus de
la viruela aviar). Las técnicas para incorporar el ADN en tales
vectores las conocen bien los expertos en la técnica. Un vector
retrovírico puede transferir o incorporar adicionalmente un gen de
un marcador de selección (para ayudar a identificar o seleccionar
las células transfectadas) y/o un resto selector, tal como un gen
que codifica un ligando para un receptor sobre una célula diana
específica, para hacer que el vector sea específico de la diana. La
acción selectiva también se puede conseguir con un anticuerpo, por
los métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Otras formulaciones con fines terapéuticos
incluyen sistemas de dispersión coloidales, tales como complejos de
macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base
de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas,
micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para
utilizar como vehículo de administración in vitro e in
vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula membranosa
artificial). Se conoce bien en la técnica la preparación y la
utilización de tales sistemas.
Se describen polipéptidos que comprenden al
menos una porción inmunógena de una proteína del carcinoma ovárico
o una variante de la misma. Tal y como se señaló anteriormente,
determinadas proteínas del carcinoma ovárico son antígenos del
carcinoma ovárico que se expresan en las células del tumor ovárico y
que reaccionan de manera detectable en un inmunoanálisis (tal como
un ELISA) con antisueros generados contra el suero de un animal
inmunodeficiente al que se ha implantado un tumor ovárico. Otras
proteínas del carcinoma ovárico están codificadas por
polinucleótidos del carcinoma ovárico citados en la presente
memoria. Los polipéptidos tal y como se describen en la presente
memoria pueden ser de cualquier longitud. Pueden estar presentes
otras secuencias derivadas de la proteína original y/o secuencias
heterólogas, y tales secuencias pueden (aunque no necesariamente)
poseer otras propiedades inmunógenas o antigénicas.
Una "porción inmunógena" tal y como se
utiliza en la presente memoria es una porción de un antígeno que es
reconocido (es decir, se une específicamente) por un receptor de
antígenos de la superficie de los linfocitos B y/o linfocitos T.
Tales porciones antigénicas comprenden por lo general al menos 5
restos aminoacídicos, más preferentemente al menos 10, y aún más
preferentemente al menos 20 restos aminoacídicos de una proteína
del carcinoma ovárico o una variante de la misma. Las porciones
inmunógenas preferentes están codificadas por moléculas de ADNc
aisladas tal y como se describe en la presente memoria. Se pueden
identificar otras porciones inmunógenas mediante técnicas bien
conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental
Immunology, 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993)
y las referencias citadas en ésta. Tales técnicas incluyen el
cribado de polipéptidos por su capacidad para reaccionar con
anticuerpos específicos contra la proteína del carcinoma ovárico,
antisueros y/o estirpes de linfocitos T o clones. Tal y como se
utiliza en la presente memoria, los antisueros y los anticuerpos
son "específicos de la proteína del carcinoma ovárico" si se
unen específicamente a una proteína del carcinoma ovárico (es
decir, reaccionan con la proteína del carcinoma ovárico en un ELISA
u otro inmunoanálisis, y no reaccionan de manera detectable con
otras proteínas que no tienen ninguna relación). Tales antisueros,
anticuerpos y linfocitos T se pueden preparar tal y como se describe
en la presente memoria, y mediante técnicas bien conocidas. Una
porción inmunógena de una proteína natural de un carcinoma ovárico
es una porción que reacciona con tales antisueros, anticuerpos y/o
linfocitos T a un nivel que no es significativamente menor que la
reactividad del polipéptido completo (por ejemplo, un análisis por
ELISA y/o un análisis de reactividad de linfocitos T). Tales
porciones inmunógenas pueden reaccionar en tales ensayos a un nivel
que es similar o mayor que la reactividad de la proteína completa.
Tales cribados se pueden realizar por lo general mediante métodos
que conocen bien los expertos en la técnica, tales como los
descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, se inmoviliza un
polipéptido en un soporte sólido y se pone en contacto con el suero
de un paciente para permitir que los anticuerpos del suero se unan
al polipéptido inmovilizado. A continuación, se retira el suero sin
unir y los anticuerpos unidos se detectan mediante, por ejemplo, la
proteína A marcada con ^{125}I.
Tal y como se señaló anteriormente, una
composición puede comprender una variante de una proteína natural
del carcinoma ovárico. Una "variante" del polipéptido, tal y
como se utiliza en la presente memoria, es un polipéptido que
difiere de una proteína de un carcinoma ovárico original en una o
más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de tal
forma que la inmunogenia del polipéptido no disminuya
significativamente. En otras palabras, se puede mejorar o dejar
inalterada la capacidad de una variante para reaccionar con un
antisuero específico contra la proteína del carcinoma ovárico que
tenga una proteína, respecto a la proteína natural del carcinoma
ovárico, o se puede disminuir a menos del 50%, y preferentemente
menos del 20%, en relación con la proteína natural del carcinoma
ovárico. Por lo general, tales variantes se pueden identificar al
modificar una de las secuencias polipeptídicas anteriores y evaluar
la reactividad del polipéptido modificado con los anticuerpos o
antisueros específicos de la proteína del carcinoma ovárico tal y
como se describe en la presente memoria. Las variantes referentes
incluyen aquellas en las que se han retirado una o más porciones,
tales como una secuencia líder del extremo amino o un dominio
transmembranario. Otras variantes preferentes incluyen variantes en
las que se ha retirado una porción pequeña (por ejemplo, 1 a 30
aminoácidos, preferentemente 5 a 15 aminoácidos) del extremo amino
y/o del extremo carboxilo de la proteína madura.
Las variantes polipeptídicas muestran
preferentemente una identidad de al menos un 70%, más
preferentemente de al menos un 90% y lo más preferentemente de al
menos un 95%, con el polipéptido natural. Preferentemente, una
variante contiene sustituciones conservativas. Una "sustitución
conservativa" es una en la que el aminoácido se sustituye por
otro aminoácido que tiene unas propiedades similares, de tal forma
que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría
que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del
polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. Por lo
general, las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar
basándose en la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad,
la hidrofobia, la hidrofília y/o la naturaleza anfipática de los
restos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente
incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados
positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con
grupos polares inalterados que tienen unos valores de hidrofília
similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina;
asparragina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y
tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios
conservativos incluyen: 1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser,
thr; 2) cys, ser, tyr, thr; 3) val, ile, leu, met, ala, phe; 4) lys,
arg, his; y 5) phe, tyr, trp, his. Una variante también, o
alternativamente, puede contener cambios no conservativos. Las
variantes también (o alternativamente) se pueden modificar mediante,
por ejemplo, la deleción o la adición de aminoácidos que tienen una
influencia mínima sobre la inmunogenia, la estructura secundaria y
la naturaleza hidropática del polipéptido.
Tal y como se señaló anteriormente, los
polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el
extremo amino de la proteína que dirige cotraduccional o
postraduccionalmente el transporte de la proteína. El polipéptido
también puede estar conjugado con un conector u otras secuencia para
facilitar la síntesis, purificación o identificación del
polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar
la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, se puede
conjugar un polipéptido a un región Fc de las inmunoglobulinas.
Los polipéptidos se pueden preparar con alguna
de las numerosas técnicas bien conocidas. Los polipéptidos
recombinantes codificados por las secuencias de ADN tal y como se
describieron anteriormente se pueden preparar fácilmente a partir
de secuencias de ADN utilizando alguno de los muchos vectores de
expresión conocidos por los expertos en la técnica. La expresión se
puede conseguir en cualquier célula hospedadora adecuada que se
haya transformado o transfectado con un vector de expresión que
contenga un molécula de ADN que codifique un polipéptido
recombinante. Las células hospedadoras adecuadas incluyen
procariotas, levadura y células de eucariotas superiores.
Preferentemente, las células hospedadoras empleadas son E.
coli, levadura o una estirpe celular de mamíferos como COS y
CHO. Los sobrenadantes de sistemas hospedador/vector adecuados que
secretan la proteína recombinante o el polipéptido en un medio de
cultivo se pueden concentrar primero utilizando un filtro
disponible comercialmente. Después de la concentración, se puede
aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada, tal
como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico.
Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase
inversa para purificar más un polipéptido recombinante.
También se pueden generar por medios sintéticos
porciones y otras variantes que tengan menos de 100 aminoácidos y,
por lo general, menos de 50 aminoácidos, mediante técnicas que
conocen bien los expertos en la técnica. Por ejemplo, tales
polipéptidos se pueden sintetizar mediante cualquiera de las
técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tales como el
método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en la que los
aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos
creciente. Véase J. Am. Che. Soc. 85:
2149-2146, 1963. El equipamiento para la síntesis
automática de polipéptidos está disponible comercialmente de
proveedores tales como Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) y
se puede hacer funcionar según las instrucciones del
fabricante.
Un polipéptido puede ser una proteína de fusión
que comprende varios polipéptidos tal y como se describe en la
presente memoria, o que comprende un polipéptido tal y como se
describe en la presente memoria y un antígeno tumoral conocido, tal
como una proteína de carcinoma ovárico o una variante de tal
proteína. Un compañero de la fusión puede, por ejemplo, ayudar a
proporcionar epítopos para los linfocitos T cooperadores (un
copartícipe de fusión inmunitario), preferentemente epítopos para
los linfocitos T cooperadores que son reconocidos en los humanos, o
pueden ayudar a expresar la proteína (un potenciador de la
expresión) en más cantidad que la proteína recombinante natural.
Algunos compañeros de fusión preferentes son los compañeros de
fusión tanto inmunitarios como potenciadores de la expresión. Se
pueden seleccionar otros compañeros de fusión para aumentar la
solubilidad de la proteína o para permitir dirigir la proteína a los
compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión
adicionales incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la
purificación de la proteína.
Las proteínas de fusión generalmente se pueden
preparar mediante técnicas estándares, incluida la conjugación
química. Preferentemente, una proteína de fusión se expresa como una
proteína recombinante, lo que permite producirla en más cantidad,
respecto a la proteína sin fusionar, en un sistema de expresión.
Brevemente, las secuencias de ADN que codifican componentes
polipeptídicos se pueden ensamblar por separado, y ligar, en un
vector de expresión adecuado. El extremo 3' de la secuencia de ADN
que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un
conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que
codifica el segundo componente del polipéptido de tal forma que los
marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la
traducción en una única proteína de fusión que conserva la
actividad biológica de los dos polipéptidos que la componen.
Se puede emplear una secuencia conectora
peptídica para separar el primer y el segundo polipéptido componente
por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se
pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Tal secuencia
conectora peptídica se incorpora en la proteína de fusión utilizando
las técnicas bien conocidas en la técnica. Se pueden elegir
secuencias conectoras peptídicas adecuadas según los factores
siguientes: 1) su capacidad para adoptar una conformación extendida
flexible; 2) su capacidad para adoptar una estructura secundaria
que pueda interaccionar con los epítopos funcionales del primer y
del segundo polipéptido; y 3) la ausencia de restos hidrófobos o
cargados que pudieran interaccionar con los epítopos funcionales del
polipéptido. Las secuencias conectoras peptídicas preferidas
contienen restos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros,
tales como Thr y Ala, también se pueden utilizar en la secuencia
conectora. Secuencias de aminoácidos que se pueden emplear de modo
útil como conectores incluyen las descritas en Maratea et
al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
8258-8262, 1986; la patente de los Estados Unidos
n.º 4.935.233 y la patente de los Estados Unidos n.º 4.751.180.
Generalmente, la secuencia conectora puede tener de 1 a unos 50
aminoácidos de longitud. No se necesitan secuencias conectoras
cuando el primer y el segundo polipéptido no tienen regiones
esenciales de aminoácidos en el extremo amino que se pueden utilizar
para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia
estérica.
Las secuencias de ADN ligadas están
operativamente unidas a elementos reguladores transcripcionales o
traduccionales adecuados. Los elementos reguladores responsables de
la expresión del ADN se localizan sólo en 5' de la secuencia de ADN
que codifica el primer polipéptido. De igual forma, los codones de
parada requirieron finalizar las señales de terminación de la
traducción y la transcripción sólo están presentes hacia 3' de la
secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
También se describen proteínas de fusión que
comprenden un polipéptido como el descrito junto con una proteína
inmunógena sin relación. Preferentemente, la proteína inmunógena es
capaz de desencadenar una respuesta de recuerdo. Ejemplos de tales
proteínas incluyen las proteínas del tétanos, la tuberculosis y la
hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al., New Engl.
J. Med., 336: 86-91, 1997).
Se puede obtener un compañero de fusión
inmunitario a partir de la proteína D, una proteína de la superficie
de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenzae B
(patente internacional WO 91/18926). Preferentemente, un derivado
de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la
proteína (por ejemplo, los primeros 100 a 110 aminoácidos del
extremo amino), y se puede lipidar un derivado de la proteína D. En
determinadas realizaciones preferentes, los primeros 109 restos de
un compañero de fusión de la lipoproteína D se incluyen sobre el
extremo amino para proporcionar el polipéptido con los epítopos
exógenos adicionales para los linfocitos T y para aumentar el nivel
de expresión en E. coli (por lo tanto, funciona como un
potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura la
presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de
antígenos. Otros compañeros de fusión incluyen la proteína no
estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Típicamente,
se utilizan 81 aminoácidos del extremo amino aunque se pueden
utilizar diferentes fragmentos que incluyan epítopos para los
linfocitos T cooperadores.
El compañero de fusión inmunológico puede ser la
proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma
(preferentemente, una porción del extremo carboxilo). La LYTA se
obtiene de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen
LytA; Gene 43: 265-292, 1986). La
LYTA es una autolisina que degrada específicamente determinados
enlaces del esqueleto del peptidoglucano. El dominio del extremo
carboxilo de la proteína LYTA es responsable de la afinidad para la
colina o algunos análogos de la colina, tales como DEAE. Se ha
explotado esta propiedad para el desarrollo de plásmidos que
expresan C-LYTA de E. coli útiles para la
expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de
proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA
en el extremo amino (véase Biotechnology
10:795-798, 1992). Se puede incorporar una porción
repetida de LYTA en una proteína de fusión. Una porción repetida se
encuentra en la región del extremo carboxilo que comienza en el
resto 178. Una porción repetida particularmente preferente
incorpora los residuos 188 a 305.
Por lo general, se han aislado polipéptidos
(incluidas las proteínas de fusión) y polinucleótidos como los
descritos en la presente memoria. Un polipéptido o polinucleótido
"aislado" es el que se retira de su ambiente natural. Por
ejemplo, una proteína que se produce naturalmente se aísla si se
separa de parte o todos los materiales coexistentes en el sistema
natural. Preferentemente, tales polipéptidos son al menos puros a
un 90%, más preferentemente, puros al menos a un 95%, y lo más
preferentemente, puros al menos a un 99%. Se considera que un
polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector
que no forma parte del ambiente natural.
La presente descripción describe además
anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se
unen específicamente a una proteína del carcinoma ovárico. Tal y
como se describe en la presente memoria, se dice que un anticuerpo,
o un fragmento de unión a antígenos del mismo, se "une
específicamente" a una proteína del carcinoma ovárico si
reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ELISA)
con una proteína del carcinoma ovárico y no reacciona
detectablemente con proteínas no relacionadas en condiciones
similares. Tal y como se usa dentro de la presente memoria,
"unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos
moléculas diferentes de tal forma que se forma un "complejo".
Se puede evaluar la capacidad de unión, por ejemplo, al determinar
una constante de unión para la formación del complejo. La constante
de unión es el valor que se obtiene al dividir la concentración del
complejo por el producto de las concentraciones de los componentes.
En general, se dice que dos compuestos "se unen", en el
contexto de la presente invención, cuando la constante de unión para
la formación del complejo supera unos 10^{3} l/mol. Se puede
determinar la constante de unión mediante los métodos bien conocidos
en la técnica.
Los agentes de unión pueden ser capaces además
de diferenciar entre pacientes con o sin un cáncer, tal como el
cáncer ovárico, mediante los análisis representativos dados a
conocer en la presente memoria. En otras palabras, los anticuerpos
u otros agentes de unión que se unen a un antígeno del carcinoma
ovárico generarán una señal que indica la presencia de un cáncer en
al menos un 20% de los pacientes con la enfermedad, y generará una
señal negativa para indicar la ausencia de la enfermedad en, al
menos, un 90% de los individuos sin el cáncer. Para determinar si
un agente de unión satisface este requisito, se pueden analizar
muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero, leucoforesis,
orina y/o biopsias de tumores) de pacientes con y sin cáncer (que
se determina con pruebas clínicas estándares), tal y como se
describe en la presente memoria, para detectar la presencia de
polipéptidos que se unan al agente de unión. Será evidente que se
debe ensayar un número estadísticamente significativo de muestras
con o sin la enfermedad. Cada agente de unión debe satisfacer los
criterios anteriores; sin embargo, los expertos en la técnica
reconocerán que los agentes de unión se pueden utilizar en
combinación para mejorar la sensibilidad.
Cada agente que satisface los requisitos
anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de
unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una
molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un
agente de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une
al antígeno. Se pueden preparar anticuerpos mediante cualquiera de
las técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, se pueden producir
anticuerpos mediante técnicas de cultivo de células, incluida la
generación de anticuerpos monoclonales tal y como se describe en la
presente memoria, o a través de la transfección de los genes del
anticuerpo en células hospedadoras bacterianas o de mamíferos
adecuadas, para permitir la producción de anticuerpos
recombinantes. En una técnica, se inyecta inicialmente un inmunógeno
que comprende el polipéptido en alguno de una gran variedad de
mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras).
En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir de
inmunógeno sin modificación. Alternativamente, en particular para
polipéptidos relativamente cortos, se puede desencadenar una
respuesta inmunitaria superior si se adjunta el polipéptido a una
proteína transportadora, tal como la seroalbúmina bovina o la
hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el
animal hospedador, preferentemente de acuerdo con el programa
predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de recuerdo, y
los animales se sangran periódicamente. Después, se pueden
purificar los anticuerpos policlonales específicos contra el
polipéptido desde tales antisueros mediante, por ejemplo,
cromatografía de afinidad con el polipéptido acoplado a un soporte
sólido adecuado.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales
específicos para el polipéptido antígénico de interés, por ejemplo,
mediante la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:
511-519, 1976, y mejoras de la misma. Brevemente,
estos métodos implican la preparación de estirpes celulares
inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la
especificidad deseada (a saber, reactividad con el polipéptido de
interés). Tales estirpes celulares se pueden producir, por ejemplo,
de los esplenocitos obtenidos de un animal inmunizado tal y como se
describe anteriormente. A continuación se inmortalizan los
esplenocitos mediante, por ejemplo, la fusión con un compañero de
fusión de células de mieloma, preferentemente uno que sea singénico
con el animal inmunizado. Se pueden emplear numerosas técnicas de
fusión. Por ejemplo, se pueden juntar los esplenocitos y las células
del mieloma con un detergente no iónico durante unos pocos minutos
y, a continuación, sembrarlos en placa a una densidad baja en un
medio selectivo que deje crecer las células híbridas, pero no de las
células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza la
selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de
un tiempo suficiente, normalmente de 1 a 2 semanas, se observan
colonias de híbridos. Se seleccionan colonias únicas y se analizan
sus sobrenadantes de cultivo en busca de actividad de unión contra
el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen reactividad
y especificidad elevadas.
Se pueden aislar anticuerpos monoclonales de
sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, se
pueden emplear distintas técnicas para mejorar el rendimiento, tal
como la inyección de la estirpe celular de hibridoma en la cavidad
peritoneal de un vertebrado hospedador adecuado, tal como un ratón.
A continuación, se pueden recoger los anticuerpos monoclonales del
líquido ascítico o de la sangre. Los anticuerpos se pueden dejar
sin contaminantes mediante técnicas convencionales, tales como la
cromatografía, la filtración en gel, la precipitación o la
extracción. Los polipéptidos de esta invención se pueden utilizar en
el procedimiento de purificación en, por ejemplo, una etapa de
cromatografía de afinidad.
En determinadas realizaciones se puede preferir
la utilización de los fragmentos de los anticuerpos que se unen a
los antígenos. Tales fragmentos incluyen los fragmentos Fab, que se
pueden preparar utilizando técnicas estándares. Brevemente, se
pueden purificar inmunoglobulinas del suero de los conejos mediante
cromatografía de afinidad en columnas de perlas con proteína A
(Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1988) y digerirlas con papaína para producir los
fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc se pueden separar
mediante cromatografía de afinidad en columnas de perlas con
proteína A.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención se pueden acoplar a uno o más agentes terapéuticos.
Agentes terapéuticos adecuados en este sentido incluyen
radionúclidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas y
derivados de los mismos. Los radionúclidos preferentes incluyen
^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re
^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferentes incluyen
metotrexato, pirimidina y análogos de purina. Los inductores de
diferenciación preferentes incluyen los ésteres de forbol y el
ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina,
toxina diftérica, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de las
Pseudomonas, toxina de las sigelas y la proteína antivírica
de Phytolacca americana.
Se puede acoplar un agente terapéutico (por
ejemplo, unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado
bien directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un grupo
conector). Se puede llevar a cabo una reacción directa entre un
fármaco y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz
de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal
como un grupo amino o uno sulfhidrilo, de uno puede ser capaz de
reaccionar con un grupo que contiene un carbonilo, tal como un
anhídrido o un haluro ácido, o con un grupo alquilo que contiene un
grupo de salida bueno (por ejemplo, un haluro) sobre del otro.
Alternativamente, puede ser deseable acoplar un
agente terapéutico y un anticuerpo a través de un grupo conector.
Un grupo conector puede funcionar como espaciador para distanciar un
anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con
capacidades de unión.
Un grupo conector también puede servir para
aumentar la reactividad química de un sustituyente sobre un agente
o un anticuerpo y, por lo tanto, aumentar la eficacia de
acoplamiento. Un aumento de la reactividad química también puede
facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales sobre agentes, que
de otro modo no sería posible.
A los expertos en la técnica les resultará
evidente que se pueden emplear como grupo conector un gran número
de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como
heterofuncionales (tales como los descritos en el catálogo de
Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El acoplamiento se puede
efectuar, por ejemplo, a través de los grupos amino, los grupos
carboxilo, los grupos sulfhidrilo o los restos de glúcidos oxidados.
Hay numerosas referencias que describen tal metodología, por
ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º 4.671.958, de Rodwell et
al.
Si un agente terapéutico es más potente cuando
se libera de la porción del anticuerpo de los inmunoconjugados tal
y como ya se describió, puede ser deseable utilizar un grupo
conector que sea escindible durante la interiorización, o en la
misma, en una célula. Se ha descrito una serie de grupos conectores
escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación
intracelular de un agente desde estos grupos conectores incluyen la
escisión mediante la reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo,
la patente de los EE.UU. n.º 4.489.710 de Spitler), mediante la
irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, la patente de los
EE.UU. n.º 4.625.014, de Senter et al.), mediante la
hidrólisis de las cadenas laterales de aminoácidos derivados (por
ejemplo, la patente de los EE.UU., n.º 4.638.045 de Kohn et
al.), mediante la hidrólisis mediada por el complemento (por
ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º 4.671.958 de Rodwell et
al.) y mediante la hidrólisis catalizada por ácidos (por
ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º 4.569.789 de Blattler et
al.).
Puede ser deseable acoplar más de un agente a un
anticuerpo. En una realización, varias moléculas de un agente se
acoplan a una molécula de anticuerpo. En otra realización, se puede
acoplar más de un tipo de agente a un anticuerpo.
Independientemente de la realización particular, se pueden preparar
inmunoconjugados con más de un agente de diversas maneras. Por
ejemplo, se puede acoplar más de un agente directamente a una
molécula de anticuerpo, o se pueden utilizar conectores que
\hbox{proporcionen varios sitios para la adhesión.
Alternativamente, se puede utilizar un excipiente.}
Un excipiente puede llevar los agentes de
diversas maneras, incluida la unión directa o a través de un grupo
conector. Los excipientes adecuados incluyen proteínas tales como
albúminas (por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º 4.507.234 de
Kato et al.), péptidos y polisacáridos tales como el
aminodextrano (por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º 4.699.784
de Shih et al.). Un excipiente también puede llevar un agente
unido no covalentemente o mediante encapsulación, tal como dentro
de una vesícula liposómica (por ejemplo, las patentes de los EE.UU.
n.º 4.429.008 y 4.873.088). Los excipientes específicos para los
agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas
y compuestos quelantes. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.º
4.735.792 describe moléculas pequeñas radiohalogenadas
representativas y su síntesis. Se puede formar un quelato de
radionúclido a partir de compuestos quelantes que incluyen los que
contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para
unir el radionúclido metálico o de óxido metálico. Por ejemplo, la
patente de los EE.UU n.º 4.673.562 de Davison et al describe
compuestos quelantes representativos y su síntesis.
Se pueden utilizar numerosas vías para la
administración de los anticuerpos y los inmunoconjugados.
Normalmente, la administración será intravenosa, intramuscular,
subcutánea o en el lecho de un tumor extirpado. Resultará evidente
que la dosis exacta del anticuerpo/inmunoconjugado variará según el
anticuerpo utilizado, la densidad del antígeno sobre el tumor y la
tasa de eliminación del anticuerpo.
También se describen en la presente memoria los
anticuerpos antiidiotípicos que imitan una porción inmunógena de
una proteína del carcinoma ovárico. Tales anticuerpos se pueden
dirigir contra un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno
del mismo, que se une específicamente a una porción inmunógena de
una proteína del carcinoma ovárico, mediante técnicas bien
conocidas. Los anticuerpos antiidiotípicos que imitan una porción
inmunógena de una proteína del carcinoma ovárico son los
anticuerpos que se unen a un anticuerpo, o fragmento de unión al
antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción
inmunógena de una proteína del carcinoma ovárico, tal y como se
describe en de la presente memoria.
Las composiciones inmunoterapéuticas también, o
alternativamente, pueden comprender linfocitos T específicos de una
proteína del carcinoma ovárico. Tales células generalmente se pueden
preparar in vitro o ex vivo, mediante procedimientos
estándares. Por ejemplo, los linfocitos T pueden estar presentes
dentro de (o aislarse de) la médula ósea, la sangre periférica o
una fracción de médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal
como un paciente, utilizando un sistema de separación celular
comercialmente disponible, tal como el sistema CEPRATE^{TM},
disponible de CellPro Inc, Bothell WA (véase también la patente de
los EE.UU. n.º 5.240.856; la patente de los EE.UU. n.º 5.215.926;
la patente internacional WO 89/06280; la patente internacional WO
91/16116 y la patente internacional WO 92/07243). Alternativamente,
los linfocitos T se pueden obtener de estirpes celulares o cultivos
humanos o de animales no humanos relacionados o sin relacionar.
Los linfocitos T se pueden estimular con
polipéptidos del carcinoma ovárico, un polinucleótido que codifica
un polipéptido del carcinoma ovárico y/o una célula presentadora de
antígenos (CPA) que expresa tal polipéptido. Tal estimulación se
realiza en condiciones que permitan la generación de linfocitos T
específicos para el polipéptido, y en un tiempo suficiente para
ello. Preferentemente, un polipéptido o polinucleótido del carcinoma
ovárico está presente dentro de un vehículo de administración, tal
como una microesfera, para facilitar la generación de linfocitos T
específicos.
Los linfocitos T se consideran específicos de un
polipéptido del carcinoma ovárico si los linfocitos T destruyen las
células diana recubiertas con un polipéptido del carcinoma ovárico o
si expresan un gen que codifica tal polipéptido. La especificidad
de los linfocitos T se puede evaluar utilizando numerosas técnicas
estándares. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo
o ensayo de proliferación, un índice de estimulación que aumente
más de dos veces la lisis y/o proliferación, en comparación con los
controles negativos, indica especificidad de los linfocitos T. Se
pueden realizar tales ensayos, por ejemplo, tal y como se describió
en Chen et al., Cancer Res. 54:
1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de
la proliferación de los linfocitos T se puede llevar a cabo
mediante numerosas técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede
detectar la proliferación de los linfocitos T al medir un aumento
de la tasa de la síntesis de ADN (por ejemplo, mediante cultivos de
marcación por pulsos de linfocitos T con timidina tritiada y
midiendo la cantidad de la timidina tritiada incorporada en el
ADN). El contacto con un polipéptido del carcinoma ovárico (200
ng/ml a 100 \mug/ml, preferentemente 100 ng/ml a 25 \mul/ml)
durante 3 a 7 días debe dar lugar a al menos un aumento del doble
en la proliferación de los linfocitos T y/o el contacto, tal y como
se describió anteriormente, durante 2 a 3 horas debe dar lugar a la
activación de los linfocitos T, tal y como se midió utilizando los
análisis de citocinas estándares en la que un aumento de dos veces
en el nivel de la liberación de la citocina (por ejemplo, TNF o
INF-\gamma) es indicativo de la activación de los
linfocitos T (véase Coligan et al., Current Protocols in
Immunology, vol. 1. Wiley Interscienc (Greene 1998). Los
linfocitos T que se han activado en respuesta a un polipéptido del
carcinoma ovárico, polinucleótido o CPA que expresa el polipéptido
del carcinoma ovárico pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}. Los
linfocitos T específicos del polipéptido del carcinoma ovárico se
pueden expandir utilizando técnicas estándares. En realizaciones
preferentes, los linfocitos T se obtienen de un paciente o un
donante no relacionado y se administran al paciente después de la
estimulación y la expansión.
Para los propósitos terapéuticos, se pueden
expandir in vitro o in vivo los linfocitos T CD4^{+}
o CD8^{+} que proliferan en respuesta a un polipéptido del
carcinoma ovárico, polinucleótido o CPA. La proliferación de tales
linfocitos T in vitro se puede llevar a cabo de diversas
formas. Por ejemplo, los linfocitos T se pueden volver a exponer a
un polipéptido del carcinoma ovárico, con o sin la adición de
factores de crecimiento para los linfocitos T, tal como
interleucina 2, y/o células estimuladoras que sintetizan un
polipéptido del carcinoma ovárico. Alternativamente, uno o más
linfocitos T que proliferan en presencia de un polipéptido del
carcinoma ovárico se pueden expandir en número mediante clonación.
Los métodos para clonar linfocitos se conocen bien en la técnica e
incluyen poca dilución. Después de la expansión, se pueden
administrar las células al paciente tal y como se describió, por
ejemplo, en Chang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol.
22: 213, 1996.
Dentro de determinados aspectos, polipéptidos,
polinucleótidos, agentes de unión y/o células del sistema
inmunitario tal y como se describen dentro de la presente memoria
se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas o vacunas. Las
composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de tales compuestos
o células y un excipiente fisiológicamente aceptable. Las vacunas
pueden comprender uno o más de tales compuestos o células y un
potenciador inespecífico de la respuesta inmunitaria. Un
potenciador inespecífico de la respuesta inmunitaria puede ser
cualquier sustancia que mejore la respuesta inmunitaria a un
antígeno exógeno. Ejemplos de potenciadores inespecíficos de la
respuesta inmunitaria incluyen adyuvantes, microesferas
biodegradables (por ejemplo, galáctido poliláctico) y liposomas (en
los que se incorpora el compuesto; véase, por ejemplo, Fullerton,
patente de los EE.UU. n.º 4.235.877). La preparación de las vacunas
se describe de forma general en, por ejemplo, M. F. Powel y M. J.
Newman, eds., "Vacinne Design (the subunit and adjuvant
approach)", Plenum Press, (NY, 1995). Las composiciones
farmacéuticas y las vacunas como las descritas también pueden
contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o
inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones
inmunógenas de otros antígenos tumorales, bien incorporado en un
polipéptido de fusión o como un compuesto independiente dentro de
la composición o vacuna.
Una composición farmacéutica o vacuna puede
contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos como se
describe anteriormente, de tal forma que el polipéptido se genera
in situ. Tal y como se señaló anteriormente, el ADN puede
estar presente en uno cualquiera de los sistemas de administración
conocidos por los expertos en la técnica, incluidos los sistemas de
expresión de ácidos nucleicos, y los sistemas de expresión
bacterianos y víricos. Los sistemas de expresión adecuados de
ácidos nucleicos contienen las secuencias de ADN necesarias para la
expresión en el paciente (tal como un promotor adecuado y una señal
de terminación). Los sistemas de administración bacterianos
implican la administración de una bacteria (tal como el bacilo de
Calmette-Guérin) que expresa una porción inmunógena
del polipéptido sobre su superficie celular. En una realización
preferente, el ADN se puede introducir mediante un sistema de
expresión vírico (por ejemplo, virus de la variolovacuna u otro
virus de la viruela, retrovirus o adenovirus), que puede implicar la
utilización de un virus capaz de replicarse pero que no es patógeno
(defectuoso). Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en
Fisher-Hoch et al., PNAS 86:
317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y.
Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et
al., Vaccine 8: 17-21, 1990; las patentes
de los EE.UU. n.º 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; la patente
internacional WO 89/01973; la patente de los EE.UU. n.º 4.777.127;
la patente de Gran Bretaña GB 2.200.651; la patente europea EP
0.345.242; la patente internacional WO 91/02805; Berkner,
Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld
et al., Science 252: 431-434, 1991;
Kolls et al., PNAS 91: 215-219, 1994;
Kass-Eisler et al., PNAS 90:
11498-11502, 1993; Guzman et al.,
Circulation 88: 2838-2848, 1993; y Guzman
et al., Cir. Res. 73: 1202-1207,
1993. Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de
expresión las conocen bien los expertos en la técnica. El ADN
también puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo,
en Ulmer et al., Science 259:
1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science
259: 1691-1692, 1993. La captación del ADN desnudo
se puede aumentar recubriendo con el ADN las perlas biodegradables,
que se transportan con eficacia dentro de las células.
Mientras que en las composiciones farmacéuticas
de esta invención se puede emplear cualquier excipiente adecuado
conocido por los expertos en la técnica, el tipo del excipiente
dependerá del modo de administración. Las composiciones de la
presente invención se pueden formular para cualquier modo adecuado
de administración, incluidas, por ejemplo, la administración
tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal
como la inyección subcutánea, el excipiente comprende
preferentemente agua, disolución salina, alcohol, una grasa, una
cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear
cualquiera de los excipientes anteriores o un excipiente sólido, tal
como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de
sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio.
También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo,
poliglicolato polilactato) como excipientes para las composiciones
farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables
adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados
Unidos n.º 4.897.268 y 5.075.109.
Tales composiciones también pueden comprender
tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o
disolución salina tamponada con fosfato), glúcidos (por ejemplo,
glucosa, manosa, sacarosa o dextrano), manitol, proteínas,
polipéptidos o aminoácidos tal como glicina, antioxidantes,
quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo,
hidróxido de aluminio) y/o conservantes. Alternativamente, las
composiciones de la presente invención se pueden formular como un
liofilizado. Los compuestos también se pueden encapsular dentro de
liposomas utilizando la tecnología bien conocida.
En las vacunas de esta invención se puede
emplear cualquiera de los diferentes potenciadores inespecíficos de
la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede incluir un
adyuvante. La mayor parte de los adyuvantes contienen una sustancia
destinada a proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como
hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de
respuestas inmunitarias, tal como el lípido A, proteínas derivadas
de Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis.
Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por
ejemplo, el adyuvante incompleto y el adyuvante completo de Freund
(Difco Laboratories, Detroit, MI), el adyuvante 65 de Merk (Merck
and Company, Inc., Rahway, NJ), alumbre, microesferas
biodegradables, lípido A monofosforilado y Quil A. También se
pueden utilizar como adyuvantes las citocinas, tales como
GM-CSF o interleucina-2, -7 o
-12.
Dentro de las vacunas dadas a conocer dentro de
la presente memoria, la composición adyuvante se diseña
preferentemente para inducir una respuesta inmunitaria
predominantemente de tipo Th1. La alta concentración de las
citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma,
IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la
inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un
antígeno administrado. En cambio, la concentración elevada de
citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4,
IL-5, IL-6- IL-10 y
TNF-\beta) tienden a favorecer la inducción de
respuestas inmunitarias humorales. Después de la aplicación de una
vacuna tal y como se da a conocer en la presente memoria, un
paciente desarrollará una respuesta inmunitaria que incluye
respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en la
que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, la concentración
de las citocinas de tipo Th1 aumentará más que la concentración de
las citocinas de tipo Th2. La concentración de estas citocinas se
puede evaluar con facilidad mediante análisis estándares.
\hbox{Para una revisión de las familias de citocinas, véase
Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:
145-173, 1989.}
Adyuvantes preferentes que se utilizan para
desencadenar una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen,
por ejemplo, una combinación de lípido A monofosforilado,
preferentemente lípido A monofosforilado
3-des-O-acetilado
(3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los
adyuvantes MPL están disponibles de Ribi InmunoChem Research Inc.
(Hamilton, MT; véase las patentes de los EE.UU n.º 4.436.727;
4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). También se prefiere
AS-2 (SmithKline Beecham). Los oligonucleótidos que
contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG está sin metilar)
también inducen una respuesta predominantemente Th1. Tales
oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en la
patente internacional WO 96/02555. Otro adyuvante preferido es una
saponina, preferentemente QS21, que se puede utilizar sola o en
combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado
implica la combinación de un lípido A monofosforilado y un derivado
de la saponina, tal como la combinación de QS21 y
3D-MPL que se describe en la patente internacional
WO 94/00153, o una composición menos reactógena en la que QS21 se
extingue con colesterol, tal y como se describe en la patente
internacional WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas
comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una
formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21,
3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua
se describe en la patente internacional WO 95/17210. Cualquier
vacuna proporcionada en la presente memoria se puede preparar
mediante métodos bien conocidos que dan lugar a una combinación de
antígeno, potenciador de respuesta inmunitaria y un vehículo o
excipiente adecuado.
Las composiciones descritas en la presente
invención se pueden administrar como parte de una formulación de
liberación prolongada (es decir, una formulación tal como una
cápsula o una esponja que afecta a la liberación lenta del
compuesto después de la administración). Por lo general, tales
formulaciones se pueden preparar mediante tecnología bien conocida
y administrada mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o
subcutánea, o mediante la implantación en el sito de destino
deseado. Las formulaciones de liberación prolongada pueden contener
un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo disperso en una matriz
de excipiente y/o contenida dentro de un contenedor rodeado de una
membrana que controla la velocidad. Los excipientes a utilizar en
tales formulaciones son biocompatibles y también pueden ser
biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel
de la liberación del compuesto activo relativamente constante. La
cantidad del compuesto activo contenido dentro de una formulación
de liberación prolongada depende del sitio de implantación, de la
velocidad y de la duración esperada de la liberación, y de la
naturaleza de la enfermedad a tratar o prevenir.
En las composiciones farmacéuticas y vacunas se
puede emplear cualquiera de los muchos vehículos de administración
para facilitar la producción de una respuesta inmunitaria específica
al antígeno que actúa selectivamente sobre las células tumorales.
Los vehículos de administración incluyen células presentadoras de
antígenos (CPA), tales como células dendríticas, macrófagos,
linfocitos B, monocitos y otras células que se pueden modificar
genéticamente para que sean CPA eficaces. Tales células pueden, pero
no necesariamente, estar modificadas genéticamente para aumentar la
capacidad de presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o
mantener la respuesta de los linfocitos T, para tener efectos
antitumorales de por sí y/o para ser inmunitariamente compatibles
con el receptor (es decir, compatibles con el haplotipo HLA). Las
CPA por lo general se pueden aislar de muy diferentes tipos de
líquidos biológicos u órganos, incluidos tejidos tumorales y
peritumorales, y pueden ser células autólogas, alógenas, singénicas
o xenogénicas.
Las células dendríticas o progenitoras de las
mismas se pueden utilizar como células presentadoras de antígenos.
Las células dendríticas son CPA muy potentes (Banchereau y Steinman,
Nature, 392: 245-251, 1998) y se ha
demostrado que son eficaces como adyuvante fisiológico para
desencadenar inmunidad antitumoral preventiva o terapéutica (v.
Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529,
1999). Por lo general, las células dendríticas se pueden
identificar basándose en su forma típica (estrellada in situ,
con prolongaciones citoplásmicas notables [dendritas] visibles
in vitro) y basándose en la ausencia de marcadores de
diferenciación de linfocitos B (CD19 y CD20), linfocitos T (CD3),
monocitos (CD14) y linfocitos citolíticos naturales (CD56), lo que
se determinó mediante ensayos estándares. Las células dendríticas
pueden, por supuesto, modificarse genéticamente para expresar
receptores específicos de la superficie celular o ligandos que no se
encuentran habitualmente en las células dendríticas in vivo
o ex vivo, y tales células dendríticas modificadas están
contempladas en la presente descripción. Como una alternativa a las
células dendríticas, en una vacuna se pueden utilizar células
dendríticas cargadas de antígenos en vesículas de secreción
(llamadas exosomas) (v. Zitvogel et al., Nature Med.
4: 594-600, 1998).
Se pueden obtener células dendríticas y
progenitoras de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes
de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios
linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical y cualquier
otro tejido o líquido adecuado. Por ejemplo, se pueden diferenciar
las células dendríticas ex vivo al añadir una combinación de
citocinas tales como GM-CSF, I-4,
IL-13 y/o TNF\alpha a cultivos de monocitos
recogidos de sangre periférica. Alternativamente, los linfocitos
CD34^{+} recogidos de sangre periférica, sangre del cordón
umbilical o médula ósea se pueden diferenciar en células dendríticas
al añadir al medio de cultivo combinaciones de
GM-CSF, IL-3, TNF\alpha, ligando
CD40, LPS, ligando flt3 y/o otro(s) compuesto(s) que
inducen la maduración y la proliferación de las células
dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican
adecuadamente como células "inmaduras" y "maduras", lo
que permite de un modo sencillo discriminar entre dos fenotipos bien
caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no se debe
interpretar como excluyente de todas las etapas de diferenciación
intermedias posibles. Las células dendríticas inmaduras se
caracterizan como CPA con una gran capacidad para la captación y
procesamiento del antígeno, lo que se correlaciona con la expresión
elevada del receptor Fc\gamma, el receptor de la manosa y el
marcador DEC-205. Normalmente, el fenotipo maduro se
caracteriza por la menor expresión de estos marcadores, pero por
una elevada expresión de moléculas de la superficie celular
responsables de la activación de los linfocitos T, tales como el
CMH de clase I y clase II, las moléculas de adhesión (por ejemplo,
CD54 y CD11) y las moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD40,
CD80 y CD86).
Por lo general, las CPA se pueden transfectar
con un polinucleótido que codifica un antígeno del carcinoma
ovárico (o una porción u otra variante del mismo) de tal forma que
el antígeno, o una porción inmunógena del mismo, se exprese en la
superficie celular. Tal transfección puede tener lugar ex
vivo, y se puede utilizar una composición o vacuna que
comprende tales células transfectadas con fines terapéuticos, tal y
como se describe en la presente memoria. Alternativamente, a un
paciente se le puede administrar un vehículo de administración
génica que se dirija selectivamente a una célula dendrítica u otra
célula presentadora de antígenos, lo que da lugar a que la
transfección se produzca in vivo. La transfección in
vivo y ex vivo de las células dendríticas, por ejemplo,
se puede realizar generalmente mediante los métodos conocidos en la
técnica, tales como los descritos en la patente internacional WO
97/24447, o el método de bombardeo de genes (gene gun)
descrito por Mahvi et al., Immunology and cell Biology
75: 456-460, 1997. La carga del antígeno de las
células dendríticas se puede conseguir incubando células dendríticas
o células progenitoras con el polipéptido, el ADN (desnudo o dentro
de un vector plasmídico) o el ARN; o con una bacteria o virus
recombinante que exprese el antígeno (por ejemplo, vectores del
virus de la variolovacuna, viruela aviar, adenovirus o lentivirus).
Antes de la carga, el polipéptido se puede conjugar covalentemente a
un asociado inmunitario que ayude al linfocito T (por ejemplo, una
molécula de excipiente). Alternativamente, se puede pulsar una
célula dendrítica con un asociado inmunitario no conjugado, por
separado o en presencia del polipéptido.
En otros aspectos de la presente invención, las
composiciones descritas en la memoria se pueden utilizar para la
inmunoterapia del cáncer, tal como el cáncer ovárico. En tales
métodos, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se
administran típicamente a un paciente. Tal y como se utiliza en la
presente memoria, un "paciente" se refiere a cualquier animal
de sangre caliente, preferentemente un humano. Un paciente puede
estar o no afectado por un cáncer. En consonancia, las
composiciones farmacéuticas y las vacunas anteriores se pueden
utilizar para prevenir el desarrollo de un cáncer o para tratar un
paciente afectado por un cáncer. Dentro de determinadas
realizaciones preferidas, un paciente está afectado por un cáncer
ovárico. Tal cáncer se puede diagnosticar con criterios
generalmente aceptados en la técnica, incluida la presencia de un
tumor maligno. Las composiciones farmacéuticas y las vacunas se
pueden administrar bien antes o bien después de la extirpación
quirúrgica de tumores primarios y/o el tratamiento tal como la
administración de radioterapia o fármacos quimioterápicos
convencionales.
En determinadas realizaciones, la inmunoterapia
puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en
la estimulación in vivo del sistema inmunitario endógeno del
hospedador para reaccionar contra los tumores al administrar
agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como
vacunas, adyuvantes bacterianos y/o citocinas).
En otras realizaciones, la inmunoterapia puede
ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica la
administración de fármacos con reactividad inmunitaria tumoral
establecida (tal como células efectoras o anticuerpos) que pueden
intervenir directamente o indirectamente en los efectos
antitumorales y no dependen necesariamente de un sistema
inmunitario intacto en el hospedador. Ejemplos de células efectoras
incluyen linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos
CD8^{+} y linfocitos T cooperadores CD4^{+} infiltrantes de
tumores), linfocitos citolíticos (tales como los linfocitos
citolíticos naturales y los linfocitos citolíticos activados por
linfocinas), linfocitos B y células presentadoras de antígenos
(tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan un
polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Los receptores de
los linfocitos T y los receptores de anticuerpos específicos para
los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden clonar,
expresar y transferir a otros vectores o células efectoras para la
inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos proporcionados dentro de
la presente memoria también se pueden utilizar para generar
anticuerpos o anticuerpos antiidiotípicos (como los descritos
anteriormente y en la patente de los EE.UU. n.º 4.918.164) para la
inmunoterapia pasiva.
Generalmente, las células efectoras se pueden
obtener en cantidad suficiente para la inmunoterapia adoptiva
mediante el crecimiento in vitro, tal y como se describió en
la presente memoria. Se conocen bien en la técnica las condiciones
de cultivo para expandir una única célula efectora específica de
antígeno hasta alcanzar varios miles de millones en total, a la vez
que conserva el reconocimiento del antígeno in vivo. Tales
condiciones de cultivo in vitro normalmente utilizan la
estimulación intermitente con el antígeno, a menudo en presencia de
citocinas (tal como la IL-2) y células alimenticias
que no se dividen. Tal y como se observó anteriormente, los
polipéptidos inmunorreactivos tal y como se dan a conocer en la
presente memoria se pueden utilizar para expandir rápidamente los
cultivos de linfocitos T específicos de antígeno para generar una
cantidad suficiente de células para la inmunoterapia. En
particular, a las células presentadoras de antígenos, tales como las
células dendríticas, los macrófagos o los linfocitos B, se les
pueden dar un pulso con polipéptidos inmunorreactivos o transfectar
con uno o más polinucleótidos mediante técnicas estándares bien
conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células presentadoras de
antígenos se pueden transfectar con un polinucleótido que tiene un
promotor adecuado para aumentar la expresión en un virus
recombinante u otro sistema de expresión. Las células efectoras
cultivadas a utilizar en los tratamientos deben ser capaces de
crecer y distribuirse ampliamente, y de sobrevivir a largo plazo
in vivo. Los estudios han demostrado que las células
efectoras cultivadas se pueden inducir para que crezcan in
vivo y para que sobrevivan a largo plazo en cantidades
considerables mediante la estimulación repetida con antígeno
complementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever
et al., Immunological Reviews, 157: 177, 1997).
Alternativamente, se puede introducir un vector
que expresa un polipéptido descrito en la presente memoria en las
células troncales tomadas de un paciente y permitirle la propagación
clonal in vitro para devolverlas mediante autotrasplante al
mismo paciente.
Las vías y la frecuencia de administración, así
como la dosificación, variarán entre los individuos, y se pueden
establecer fácilmente utilizando técnicas estándares. En general,
las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar
por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa
o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, mediante
aspiración), por vía oral o en el lecho de un tumor extirpado.
Preferentemente, se pueden administrar entre 1 y 10 dosis durante
52 semanas. Preferentemente, se administran 6 dosis, a intervalos
de 1 mes, y se pueden administrar vacunas de recuerdo periódicamente
de aquí en adelante. Los protocolos alternativos pueden ser
adecuados para determinados pacientes. Una dosis adecuada es una
cantidad de un compuesto que, al administrarse tal y como se
describe anteriormente, es capaz de promover una respuesta
inmunitaria antitumoral y está, al menos, del 10 al 50% por encima
del nivel basal (a saber, sin tratar). Se puede monitorizar tal
respuesta midiendo los anticuerpos antitumorales en un paciente o
mediante la generación dependiente de la vacuna de células
efectoras citolíticas capaces de acabar con las células tumorales
del paciente in vitro. Tales vacunas también deben ser
capaces de causar una respuesta inmunitaria que conduzca a una
mejora de los resultados clínicos (por ejemplo, remisiones más
frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial o
mayor) en los pacientes vacunados en comparación con los pacientes
sin vacunar. Por lo general, para las composiciones farmacéuticas y
las vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de
cada polipéptido presente en una dosis oscila de unos 100 \mug a
5 mg por kg del huésped. El tamaño adecuado de la dosis variará con
el tamaño del paciente, pero por lo general oscilará de
aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.
En general, una dosis y una pauta terapéutica
adecuadas proporcionan el compuesto activo, o los compuestos
activos, en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio
terapéutico y/o profiláctico. Tal respuesta se puede monitorizar
estableciendo un mejor resultado clínico (por ejemplo, remisiones
más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial, o
mayor) en los pacientes tratados en comparación con los pacientes
sin tratar. El aumento de la respuesta inmunitaria preexistente a
un antígeno del carcinoma ovárico generalmente se correlaciona con
un mejor resultado clínico. Tales respuestas inmunitarias se pueden
evaluar generalmente mediante ensayos estándares de proliferación,
de citotoxicidad o de citocinas, que se pueden realizar con
muestras obtenidas de un paciente antes y después del
tratamiento.
Se describen métodos para identificar antígenos
tumorales secretados. En tales métodos, los tumores se implantan en
animales inmunodeficientes tales como ratones SCID, y se mantienen
durante un tiempo suficiente para permitir la secreción de los
antígenos tumorales al suero. En general, los tumores se pueden
implantar subcutáneamente o dentro de la almohadilla de la grasa
gonadal de un animal inmunodeficiente y mantenerlos durante 1 a 9
meses, preferentemente 1 a 4 meses. La implantación generalmente se
puede realizar tal y como se describió en la patente internacional
WO 97/18300. A continuación, el suero que contiene los antígenos
secretados se utiliza para preparar antisueros en ratones
inmunocompetentes, mediante las técnicas estándares y tal como se
describe en la presente memoria. Brevemente, de 50 a 100 \mul de
suero (agrupado de tres conjuntos de ratones inmunodeficientes,
llevando cada conjunto derivado de ratones SCID un tumor ovárico
humano diferente) se puede mezclar 1:1 (vol:vol) con un adyuvante
adecuado, tal como RIBI-MPL o MPL + TDM (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) e inyectarlo por vía intraperitoneal
en animales inmunocompetentes singénicos a intervalos mensuales
durante 5 meses. Los antisueros de los animales inmunizados de esta
manera se pueden obtener al extraer la sangre después de la
tercera, la cuarta y la quinta inmunización. Por lo general, el
antisuero resultante se limpia previamente de E. coli y de
antígenos de fagos, y se utiliza (generalmente después diluirlo, tal
como 1:200) en un cribado de expresión sérica.
La genoteca es típicamente una genoteca de
expresión que contiene los ADNc de uno o más tumores del tipo que
se implantó en los ratones SCID. Esta genoteca de expresión se puede
preparar en un vector adecuado, tal como
\lambda-screen (Novagen). Los ADNc que codifican
un polipéptido que reacciona con el antisuero se pueden identificar
mediante técnicas estándares, y secuenciarlos. Tales moléculas de
ADNc se pueden caracterizar adicionalmente para evaluar la
expresión en tejido tumoral y normal, y para evaluar la secreción
del antígeno en los pacientes.
Los métodos proporcionados en la presente
memoria presentan ventajas sobre otros métodos para el
descubrimiento de antígenos tumorales. En particular, todos los
antígenos identificados por tales métodos se deben secretar o
liberar a través de la necrosis de las células tumorales. Tales
antígenos pueden estar presentes en la superficie de las células
tumorales durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir
que, tras la vacunación, el sistema inmunitario actúe
selectivamente sobre ellas y las destruya.
Por lo general, se puede detectar un cáncer en
un paciente por la presencia de una o más proteínas del carcinoma
ovárico y/o polinucleótidos que codifican tales proteínas en una
muestra biológica (tal como sangre, suero, orina y/o biopsias de
tumor) obtenidas del paciente. Es decir, tales proteínas se pueden
utilizar como marcadores para indicar la presencia o la ausencia de
un cáncer tal como un cáncer ovárico. Además, tales proteínas pueden
ser útiles para detectar otras neoplasias malignas. Los agentes de
unión dados a conocer en la presente memoria permiten por lo
general la detección de la cantidad de proteína que une el fármaco
en la muestra biológica. Los cebadores y sondas polinucleotídicos
se pueden utilizar para detectar el nivel de ARNm que codifica una
proteína tumoral, que también es indicativa de la presencia o
ausencia de un cáncer. En general, una secuencia asociada al
carcinoma ovárico debe estar presente a una cantidad que es al menos
3 veces mayor en el tejido tumoral que en el tejido normal.
Existen muchos formatos de ensayo conocidos por
los expertos en la técnica para utilizar un agente de unión para
detectar marcadores polipeptídicos en una muestra. Véase, por
ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o
ausencia de un cáncer en un paciente se puede determinar al
a) poner en contacto con un agente de unión una muestra
biológica obtenida de un paciente; b) detectar en la muestra
una cantidad de polipéptido que se une al agente de unión; y
c) comparar la cantidad de polipéptido con un valor
discriminatorio predeterminado.
El análisis puede implicar la utilización del
agente de unión inmovilizado sobre un soporte sólido para unir y
retirar el polipéptido del resto de la muestra. Luego, el
polipéptido unido se puede detectar utilizando un reactivo de
detección que contiene un grupo indicador y que se une
específicamente al complejo agente de unión/polipéptido. Tales
reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente de
unión que se une específicamente al polipéptido o un anticuerpo u
otro agente que se une específicamente al agente de unión, tal como
una antiinmunoglobulina, la proteína G, la proteína A o una lectina.
Alternativamente, se puede utilizar un análisis competitivo, en el
que el polipéptido se marca con un grupo indicador y se deja unir al
agente de unión inmovilizado después de la incubación del agente de
unión con la muestra. El alcance con el que los componentes de la
muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al agente de unión
es indicativo de la reactividad entre la muestra y el agente de
unión inmovilizado. Los polipéptidos adecuados para ser utilizados
en tales análisis incluyen proteínas completas del carcinoma ovárico
y porciones de las mismas a las que el agente de unión se une, tal
y como se describe anteriormente.
El soporte sólido puede ser cualquier material
conocido por los expertos en la técnica al que la proteína tumoral
se puede adherir. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un
pocillo de prueba en una placa de microtitulación o una membrana de
nitrocelulosa o de otro tipo que sea adecuada. Alternativamente, el
soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de
vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o cloruro
de polivinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética
o un sensor de fibra óptica, tales como los descritos, por ejemplo,
en la patente de los EE.UU. n.º 5.359.681. Se puede inmovilizar el
agente de unión sobre el soporte sólido mediante una serie de
técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que se describen
ampliamente en la patente y en la bibliografía científica. En el
contexto de la presente descripción, la terminología
"inmovilización" se refiere a la asociación no covalente, tal
como la adsorción, y una unión covalente (que puede ser un enlace
directo entre el agente y los grupos funcionales del soporte, o
puede ser un enlace formado por un agente de entrecruzamiento). Se
prefiere la inmovilización mediante la adsorción a un pocillo en
una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, se
puede conseguir la adsorción haciendo contactar el agente de unión,
en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad de
tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura,
que por lo general está entre casi 1 hora y casi 1 día.
Generalmente, poner en contacto un pocillo de una placa de
microtitulación de plástico (tal como poliestireno o cloruro de
polivinilo) con una cantidad del agente de unión que oscila de unos
10 ng a unos 10 \mug, y preferentemente unos de 100 ng a
aproximadamente 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una
cantidad adecuada del agente de unión.
La adhesión covalente del agente de unión a un
soporte sólido generalmente se puede conseguir primero haciendo
reaccionar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará
tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo
hidroxilo o amino, del agente de unión. Por ejemplo, el agente de
unión se puede adherir covalentemente a los soportes que tienen un
recubrimiento adecuado polimérico con benzoquinona o al condensar
un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno
activo sobre el compañero de unión (véase, por ejemplo, Pierce
Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en
A12-A13).
El ensayo puede ser un análisis de tipo sandwich
con dos anticuerpos. Este ensayo se puede realizar primero poniendo
en contacto un anticuerpo que se ha inmovilizado sobre un soporte
sólido, habitualmente el pocillo de una placa de microtitulación,
con la muestra, de tal forma que se dejan unir al anticuerpo
inmovilizado los polipéptidos de la muestra. A continuación, la
muestra sin unir se retira de los complejos polipéptido
inmovilizado-anticuerpo y se añade un reactivo de
detección (preferentemente un segundo anticuerpo capaz de unirse a
un sitio diferente del polipéptido) que contiene un grupo indicador.
La cantidad del reactivo de detección que permanece sin unir al
soporte sólido se determina entonces mediante un método adecuado
para el grupo indicador específico.
Más específicamente, una vez que el anticuerpo
se inmoviliza sobre el soporte tal y como se describió
anteriormente, normalmente se bloquean los restantes sitios de
unión a la proteína sobre el soporte. Se puede utilizar cualquier
agente bloqueante adecuado conocido por los expertos en la técnica,
tales como albúmina de suero bovino o Tween 20^{TM} (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO). A continuación, el anticuerpo
inmovilizado se incuba con la muestra, y se deja que el polipéptido
se una al anticuerpo. La muestra se diluye con un diluyente
adecuado, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS)
antes de la incubación. Por lo general, un tiempo de contacto
adecuado (a saber, tiempo de incubación) es un periodo de tiempo que
es suficiente para detectar la presencia del polipéptido dentro de
una muestra obtenida de un individuo con cáncer ovárico.
Preferentemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir
un nivel de unión que es al menos de aproximadamente el 95% del
conseguido en equilibrio entre el polipéptido unido y sin unir. Los
expertos en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para
conseguir el equilibrio se puede determinar fácilmente al ensayar el
nivel de unión que se produce durante un periodo de tiempo. A
temperatura ambiente, generalmente basta con un tiempo de
incubación de unos 30 minutos.
Luego, la muestra sin unir se retira lavando el
soporte sólido con un tampón adecuado, tal como PBS que contiene
Tween 20^{TM} al 0,1%. El segundo anticuerpo, que contiene un
grupo indicador, se añade después al soporte sólido. Los grupos
indicadores preferidos incluyen los grupos citados
anteriormente.
A continuación, el reactivo de detección se
incuba con el complejo anticuerpo
inmovilizado-polipéptido durante una cantidad de
tiempo suficiente para detectar el polipéptido unido. Por lo
general, se puede determinar una cantidad de tiempo adecuada
analizando el nivel de unión que se produce durante un periodo de
tiempo. Luego, se retira el reactivo de detección sin unir y se
detecta el reactivo de detección unido mediante el grupo indicador.
El método empleado para detectar el grupo indicador depende de la
naturaleza del grupo indicador. Para los grupos radioactivos, por
lo general resultan adecuados los métodos de recuento por centelleo
o autorradiográficos. Se pueden utilizar métodos espectroscópicos
para detectar tintes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes.
Se puede detectar la biotina utilizando avidina, acoplada a un grupo
indicador diferente (lo más habitual, un grupo radiactivo o
fluorescente o una enzima). Por lo general, los grupos indicadores
enzimáticos se pueden detectar al añadir el sustrato (generalmente
durante un periodo de tiempo específico),
\hbox{seguido por
análisis espectroscópicos u otro análisis de los productos de
reacción.}
Para determinar la presencia o la ausencia de un
cáncer, tal como un cáncer ovárico, la señal detectada del grupo
indicador que permanece unido al soporte sólido se compara por lo
general con la señal que corresponde a un valor discriminatorio
predeterminado. En una realización preferida, el valor
discriminatorio para la detección de un cáncer es la media
promediada de la señal obtenida cuando se incuba el anticuerpo
inmovilizado con muestras de pacientes sin el cáncer. En general,
una muestra que genera una señal que está tres desviaciones
estándares por encima del valor discriminatorio predeterminado se
considera positivo para el cáncer. En una realización preferente
alternativa, el valor discriminatorio se determina mediante una
Receiver Operator Curve (curva de operador receptor), de
acuerdo con el método de Sackett et al., Clinical
Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little
Brown and Co., 1985, pág. 106-7. Brevemente, en esta
realización, el valor discriminatorio se puede determinar de un
gráfico de parejas de tasas positivas verdaderas (es decir,
sensibilidad) y tasas positivas falsas (especificidad al 100%) que
corresponden a cada valor discriminatorio posible para el resultado
de la prueba diagnóstica. El valor discriminatorio sobre el gráfico
que está más cerca de la esquina superior izquierda (a saber, el
valor que encierra el mayor área) es el valor discriminatorio más
preciso, y una muestra que genera una señal que es mayor que el
valor discriminatorio determinado por este método se puede
considerar positiva. Alternativamente, el valor discriminatorio se
puede desplazarse hacia la izquierda a lo largo del gráfico, para
minimizar la tasa de falsos positivos, o hacia la derecha, para
minimizar la tasa de falsos negativos. En general, una muestra que
genera una señal que es mayor que el valor discriminatorio
determinado por este método se considera positivo para un
cáncer.
Se puede realizar el ensayo en un formato de
prueba de flujo continuo o de tiras, en la que el agente de unión
se inmoviliza sobre una membrana, tal como nitrocelulosa. En el
análisis de flujo continuo, los polipéptidos de la muestra se unen
al agente de unión inmovilizado a medida que la muestra pasa por la
membrana. A continuación, un segundo agente de unión marcado se une
al complejo agente de unión-polipéptido a medida que
una disolución que contiene el segundo agente de unión fluye por la
membrana. La detección de segundo agente de unión unido se puede
realizar tal y como se describió anteriormente. En la prueba de
tiras, un extremo de la membrana al que se une el fármaco de unión
se introduce en una disolución que contiene la muestra. La muestra
migra a lo largo de la membrana por una región que contiene el
segundo agente de unión y por el área del agente de unión
inmovilizado. La concentración del segundo agente de unión a la zona
del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cáncer.
Típicamente, la concentración del segundo agente de unión en el
sitio genera un patrón, como una línea, que se puede leer
visualmente. La ausencia de tal patrón indica un resultado negativo.
En general, la cantidad de agente de unión inmovilizado sobre la
membrana se selecciona para generar un patrón visualmente
discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de
polipéptido que sería suficiente para generar una señal positiva en
el ensayo de tipo sándwich con dos anticuerpos, en el formato
discutido anteriormente. Los agentes de unión preferentes a
utilizar en tales ensayos son anticuerpos y fragmentos de unión a
antígenos de los mismos. Preferentemente, la cantidad del anticuerpo
inmovilizado sobre la membrana oscila de unos 25 ng a
aproximadamente 1 \mug, y más preferentemente de unos 50 ng a unos
500 ng. Tales pruebas se pueden realizar típicamente con una
cantidad muy pequeña de muestra biológica.
Por supuesto, existen muchos otros protocolos de
ensayo que son adecuados para su utilización con proteínas
tumorales o agentes de unión de la presente invención. Las
descripciones anteriores pretenden ser ejemplares solamente. Por
ejemplo, para los expertos en la técnica resultará evidente que los
protocolos anteriores se pueden modificar fácilmente para utilizar
polipéptidos del carcinoma ovárico para detectar anticuerpos que se
unen a tales polipéptidos en una muestra biológica. La detección de
tales anticuerpos específicos de proteínas del carcinoma ovárico se
puede correlacionar con la presencia de un cáncer.
Un cáncer también, o alternativamente, se puede
detectar por la presencia de linfocitos T que reaccionan
específicamente con una proteína del carcinoma ovárico en una
muestra biológica. Dentro de determinados métodos, una muestra
biológica que comprende linfocitos T CD4^{+} y/o CD8^{+}
aislados de un paciente se incuba con una proteína del carcinoma
ovárico, un polinucleótido que codifica tal polipéptido y/o una APC
que expresa al menos una porción inmunógena de tal polipéptido, y
se detecta la presencia o la ausencia de la capacidad de activación
específica de los linfocitos T. Las muestras biológicas adecuadas
incluyen, pero sin limitarse a ellos, linfocitos T aislados. Por
ejemplo, se pueden aislar linfocitos T de un paciente mediante las
técnicas habituales (tales como centrifugación de los linfocitos de
la sangre periférica en gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque).
Los linfocitos T se pueden incubar in vitro durante 2 a 9
días (típicamente, 4 días) a 37ºC con una proteína del carcinoma
ovárico (por ejemplo, 5 a 25 \mug/ml). Puede ser deseable incubar
otra alícuota de una muestra de linfocitos T en ausencia de una
proteína del carcinoma ovárico que servirá de control. Para los
linfocitos CD4^{+}, la activación se detecta preferentemente al
evaluar la proliferación de los linfocitos T. Para los linfocitos T
CD8^{+}, la activación se detecta preferentemente al evaluar la
actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos
veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un
20% mayor que en los pacientes sin enfermedad indican la presencia
de un cáncer en el paciente.
Tal y como se indicó anteriormente, una cáncer
también, o alternativamente, puede detectarse por el nivel del ARNm
que codifica una proteína del carcinoma ovárico en una muestra
biológica. Por ejemplo, se pueden emplear al menos dos cebadores
oligonucleotídicos en un análisis por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para amplificar una porción de un ADNc de la
proteína del carcinoma ovárico obtenido de una muestra biológica,
en la que al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es
específico de (es decir, se hibrida con) un polinucleótido que
codifica la proteína del carcinoma ovárico. Luego, el ADNc
amplificado se separa y se detecta mediante técnicas bien conocidas
en la técnica, tales como electroforesis en gel. De igual forma, las
sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a un
polinucleótido que codifica una proteína del carcinoma de ovarios
se puede utilizar en un ensayo de hibridación para detectar la
presencia del polinucleótido que codifica la proteína tumoral en
una muestra
biológica.
biológica.
Para permitir la hibridación en las condiciones
del ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotídicos deben
comprender una secuencia oligonucleotídica que tiene una identidad
de al menos el 60%, preferentemente al menos del 75% y más
preferentemente de al menos el 90%, con una porción de un
polinucleótido que codifica una proteína del carcinoma ovárico que
tiene al menos 10 nucleótidos, y preferentemente al menos 20
nucleótidos, de longitud. Preferentemente, los cebadores y/o sondas
oligonucleotídicas se hibridan a un polinucleótido que codifica un
polipéptido descrito en la presente invención en condiciones
moderadamente rigurosas, tal y como se definió anteriormente. Los
cebadores y/o sondas oligonucleotídicos que se pueden emplear
exitosamente en los métodos diagnóstico descritos dentro de la
presente memoria tienen preferentemente al menos de 10 a 40
nucleótidos de longitud. Los cebadores oligonucleotídicos comprenden
al menos 10 nucleótidos contiguos, más preferentemente al menos 15
nucleótidos contiguos, de una molécula de ADN que tiene una
secuencia descrita en la presente memoria. Las técnicas para ambos
ensayos por PCR y ensayos de hibridación se conocen bien en la
técnica (véase por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1987; Erlich ed., PCR Technology,
Stockton Press, NY, 1989).
Un ensayo preferido emplea la
RT-PCR, en la que la PCR se aplica junto con la
transcripción inversa. Típicamente, el ARN se extrae de una muestra
biológica, tal como un tejido de biopsia, y se retrotranscribe para
producir moléculas de ADNc. La amplificación por PCR que utiliza al
menos un cebador específico genera una molécula de ADNc, que se
puede separar y visualizar mediante, por ejemplo, electroforesis en
gel. La amplificación se puede realizar sobre muestras biológicas
tomadas de un paciente de prueba y de un individuo que no está
afectado por el cáncer. La reacción de amplificación se puede
realizar con varias diluciones del ADNc que abarcan dos órdenes de
magnitud. Un aumento de dos veces o más de la expresión en varias
diluciones de la muestra del paciente de prueba se considera
típicamente positivo al compararlo con las mismas diluciones de la
muestra que no es cancerígena.
Las proteínas y los polinucleótidos del
carcinoma ovárico que codifican tales proteínas se pueden utilizar
como marcadores para monitorizar la progresión del cáncer. Los
ensayos tal y como se describen anteriormente para el diagnóstico
de un cáncer se pueden realizar con el tiempo, y se evalúa el cambio
del nivel del polipéptido, o polipéptidos, reactivo. Por ejemplo,
los análisis se pueden realizar cada 24 a 72 h durante 6 meses a 1
año y, de aquí en adelante, cuando sea necesario. Por lo general, un
cáncer progresa en los pacientes en los que el nivel del
polipéptido detectado por el agente de unión aumenta con el tiempo.
Por el contrario, el cáncer no progresa cuando el nivel del
polipéptido reactivo permanece constante o disminuye con el
tiempo.
Se pueden realizar determinados ensayos
diagnósticos in vivo directamente en un tumor. Tal análisis
implica poner en contacto las células tumorales con un agente de
unión. A continuación, el agente de unión así unido se puede
detectar directa o indirectamente mediante un grupo indicador. Tales
agentes de unión también se pueden utilizar en aplicaciones
histológicas. Alternativamente, se pueden utilizar sondas
polinucleotídicas en tales aplicaciones.
Tal y como se observó anteriormente, para
mejorar la sensibilidad se pueden ensayar numerosos marcadores de
proteínas del carcinoma ovárico en una muestra determinada.
Resultará evidente que los agentes de unión específicos para
diferentes proteínas descritos en la presente invención se pueden
combinar dentro de un sólo ensayo. Además, se pueden utilizar a la
vez varios cebadores o sondas. La selección de los marcadores de las
proteínas tumorales se puede basar en experimentos sistemáticos
para determinar combinaciones que dan lugar a una sensibilidad
óptima. Además, o alternativamente, los análisis para detectar las
proteínas tumorales dadas a conocer en la presente memoria se
pueden combinar con ensayos de otros antígenos tumorales
conocidos.
La presente invención describe adicionalmente
kits para su utilización en uno cualquiera de los métodos
diagnósticos anteriores. Tales kits comprenden típicamente dos o
más compuestos necesarios para realizar un análisis diagnóstico.
Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, contenedores y/o
equipamiento. Por ejemplo, un contenedor en un kit puede contener
un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une
específicamente a una proteína del carcinoma ovárico. Tales
anticuerpos o fragmentos se pueden proporcionar adheridos a un
material de soporte, tal y como se describió anteriormente. Uno o
más contenedores adicionales puede encerrar elementos, tales como
reactivos o tampones, a utilizar en el análisis. Tales kits también,
o alternativamente, pueden contener un reactivo de detección, tal y
como se describió anteriormente, que contiene un grupo indicador
adecuado para la detección directa o indirecta de la unión al
anticuerpo.
Alternativamente, se puede diseñar un kit para
detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína del carcinoma
ovárico en una muestra biológica. Tales kits generalmente comprenden
al menos una sonda o cebador oligonucleotídico, tal y como se
describió anteriormente, que se hibrida a un polinucleótido que
codifica una proteína del carcinoma ovárico. Tal oligonucleótido se
puede utilizar, por ejemplo, en una PCR o ensayo de hibridación.
Otros componentes que pueden estar presentes en tales kits incluyen
un segundo oligonucleótido y/o reactivo diagnóstico o contenedor
que facilita la detección de un polinucleótido que codifica una
proteína del carcinoma ovárico.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
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Ejemplo
1
(Sólo para
ilustrar)
Este ejemplo ilustra la identificación de
moléculas de ADNc que codifican proteínas del carcinoma ovárico.
Del suero anti-SCID de ratón
(generado contra el suero de ratones SCID que llevan el carcinoma
ovárico de pase tardío) se retiraron previamente los antígenos de
E. coli y de fagos, y se utilizó a una dilución de 1:200 en
un cribado de expresión sérica. El cribado de la genoteca se realizó
a partir de un tumor ovárico humano obtenido de un SCID (OV9334)
mediante un kit de construcción de genotecas de ADNc direccionales
RH cebadas con oligo(dT) y el vector \lambdaScreen
(Novagen). Se empleó un bacteriófago lambda screen. Se cribaron
aproximadamente 400.000 ufp de la genoteca de OV9334
amplificada.
Se aislaron 196 clones positivos. Algunas
secuencias que parecen ser nuevas se dan a conocer en las figuras
1A a 1S y las SEQ ID n.º 1 a 71. En las figuras
2A-2C (SEQ ID n.º 72 a 74) se muestran tres
secuencias completas de insertos. En las figuras
15A-15EEE (SEQ ID n.º 82 a 310) se presentan otros
clones que tienen secuencias conocidas. Las búsquedas en la base de
datos identificaron las secuencias que les siguen que eran
sustancialmente idénticas a las secuencias presentadas en las
figuras 15A a 15EEE.
Estos clones se caracterizaron adicionalmente
mediante tecnología de micromatrices para determinar los niveles de
expresión del ARNm en una serie de tejidos tumorales y normales.
Tales análisis se realizaron con una micromatriz de Synteni (Palo
Alto, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
productos de amplificación de PCR se ordenaron sobre portaobjetos,
ocupando cada producto una posición única en la matriz. Se extrajo
el ARNm de la muestra de tejido a analizar, se retrotranscribió y se
generaron sondas de ADNc marcadas con fluorescencia. Se rastrearon
las micromatrices con las sondas de ADNc marcadas y se exploraron
los portaobjetos para medir la intensidad de la fluorescencia. Se
analizaron los datos con el programa GEMtools proporcionado por
Synteni. Los resultados de un clon (13695, también citado como O8E)
se muestran en la figura 3.
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Ejemplo
2
(Sólo para
ilustrar)
Este ejemplo ilustra la identificación de los
polinucleótidos del carcinoma ovárico mediante sustracción por PCR
y el análisis de las micromatrices. Se analizaron los micromatrices
de ADNc para detectar la expresión específica del tumor ovárico
mediante una micromatriz de Synteni (Palo Alto, CA), de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (y esencialmente tal y como se
describe en Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93:10614-10619; 1996 y en Heller et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
2150-2155, 1997).
Se realizó una sustracción por PCR con un
sustrato problema que comprende ADNc de cuatro tumores ováricos
(tres de los cuales eran tumores metastásicos) y un ADNc substractor
de cinco tejidos normales (glándulas suprarrenales, pulmón,
páncreas, bazo y cerebro). Los fragmentos de ADNc recuperados de
esta sustracción se analizaron en las micromatrices de ADN, en las
que se amplificaron los fragmentos, se adhirieron a chips y se
hibridaron con sondas marcadas con fluorescencia obtenidas de los
ARNm de tumores ováricos humanos y una serie de tejidos humanos
normales. En este análisis, se exploraron los portaobjetos, se midió
la intensidad de la fluorescencia, y se analizaron los datos con el
programa GEMtools de Synteni. En general, las secuencias que
muestran un aumento de al menos 5 veces en la expresión de las
células tumorales (respecto a las células normales) se consideraron
antígenos del tumor ovárico. Se analizaron los resultados de
fluorescencia y los clones cuya expresión aumentaba en los tumores
ováricos se caracterizaron adicionalmente mediante la secuenciación
del ADN y búsquedas en las bases de datos para determinar si las
secuencias eran nuevas.
Con la utilización de tales análisis, se
identificó un antígeno del tumor ovárico que es una fusión por
empalme entre la oncoproteína TAX de tipo I del virus de la
leucemia de los linfocitos T humanos (véase Jin et al.,
Cell 93: 81-91, 1998) y una proteína de la
matriz extracelular llamada osteonectina. En el punto de fusión
existe una secuencia de unión del empalme. La secuencia de este clon
se presenta en la figura 4 y la SEQ ID n.º 75. La osteonectina, sin
empalmar y sin alterar, también se identificó a partir de tales
análisis independientemente.
Otros clones identificados por este método se
citan en la presente memoria como 3f, 6b, 8e, 8h, 12c y 12h. Las
secuencias de estos clones se muestran en las figuras 5 a 9 y la SEQ
ID n.º 76 a 81. Se analizaron las micromatrices tal y como se
describió anteriormente, y se presentan en las figuras 10 a 14. Una
secuencia completa que abarca los clones 3f, 6b, 8e y 12h se obtuvo
al cribar una genoteca de ADNc de tumor ovárico (derivado de SCID).
El análisis del ADNc indica que una proteína transmembranaria de
tipo 1a se localiza en la membrana plasmática.
El análisis de otra secuencia dio lugar a un
clon completo de O8E (2627 pb, que concuerda con el tamaño del
mensajero observado por transferencia Northern; SEQ ID n.º 391).
Esta secuencia nucleotídica se obtuvo de la siguiente forma: se
encontró que 33 nucleótidos de la secuencia de O8E original
(OrigO8Econs) solapaban con una secuencia de un clon de EST
(IM-AGE n.º 1987589). Este clon proporcionaba 1042
nucleótidos adicionales cadena arriba de la secuencia original O8E.
La conexión entre EST y O8E se confirmó mediante la secuenciación
de numerosos fragmentos de PCR generados de una genoteca de tumores
ováricos primarios utilizando cebadores para las secuencias únicas
de la EST y de O8E (ESTxO8EPCR). El que se trataba de un gen
completo quedó indicado cuando la PCR anclada sobre la genoteca de
tumor ovárico produjo varios clones (AnchoredPCR cons) que
terminaron cadena arriba de la posible metionina iniciadora, pero
no lograban producir ninguna información adicional sobre la
secuencia. La figura 16 presenta un diagrama que ilustra la
ubicación de cada secuencia parcial dentro de la secuencia completa
de O8E.
Se pueden traducir dos secuencias proteicas a
partir del O8E completo. Para la "a" (SEQ ID n.º 393),
comienza con una posible metionina iniciadora. Una segunda forma
"b" (SEQ ID n.º 392) incluye 27 restos adicionales cadena
arriba hasta el extremo en 5' de la secuencia nucleotídica.
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Ejemplo
3
Este ejemplo describe la identificación y la
caracterización de los epítopos para anticuerpo reconocidos por los
antisueros policlonales de O8E.
Se generó antisuero de conejo obtenido contra la
proteína recombinante de O8E obtenida de E. coli y se
analizó el reconocimiento de los epítopos para anticuerpo en
péptidos de 20 ó 21 restos que corresponden a la secuencia de
aminoácidos de O8E. Los péptidos que abarcan las regiones de los
aminoácidos 31 a 65, 76 a 110, 136 a 200 y 226 a 245 de la proteína
de O8E completa se reconocieron mediante un pico eluido con ácido
y/o un pico eluido con sal a partir del suero
anti-O8E purificado por afinidad. Por lo tanto, las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los péptidos
anteriores constituyen los epítopos para anticuerpo reconocidos por
los anticuerpos anti-O8E purificados por
afinidad.
El análisis de ELISA de los sueros de conejo
anti-O8E se muestra en la figura 23, y un análisis
de ELISA del anticuerpo policlonal anti-O8E de
conejo purificado por afinidad se muestra en la figura 24.
Para la cartografía de los epítopos, se
sintetizaron péptidos de 20 ó 21 restos que corresponden a la
proteína O8E. Para la purificación por afinidad de los anticuerpos,
se depositó suero anti-O8E de conejo sobre una
columna de O8E-sepharose, luego se eluyó el
anticuerpo con un tampón salino que contenía NaCl a 0,5 M y PO_{4}
a 20 mM, seguido de una etapa de elución con ácido utilizando
glicina a 0,2 M, pH 2,3. Se neutralizó el anticuerpo purificado por
la adición de Tris a 1 M, pH 8 y se cambió el tampón por una
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para el análisis de
ELISA (análisis inmunoenzimático), se utilizaron péptidos de O8E y
de la proteína recombinante de O8E para recubrir placas de 96
pocillos con fondo plano a 2 \mug/ml durante 2 horas a
temperatura ambiente (TA) A continuación se lavaron las placas 5
veces con PBS + Tween 20 al 0,1% y se bloquearon con PBS +
seroalbúmina bovina al 1% (BSA) durante 1 h. Después se añadió a los
pocillos anticuerpo anti-O8E a 1 \mug/ml
purificado por afinidad, en una fracción eluida bien con sal o con
ácido, y se incubó a TA durante 1 hora. Se lavaron de nuevo las
placas, y luego se añadió el anticuerpo de burro
anti-Ig de conejo conjugado a la peroxidasa de
rábano picante (HRP) durante 1 h a TA. Se lavaron las placas y luego
se revelaron mediante la adición del sustrato cromógeno
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (descrito por
Bos et al., J. of Immunoassay 2:
187-204 [1981]; disponible de Sigma [St. Louis,
MO]). Se incubó la reacción 15 minutos a TA y luego se detuvo por
la adición de H_{2}SO_{4} a 1 N. Se leyeron las placas a una
densidad óptica de 450 nm (DO450) en un lector de placas
automático. Las secuencias de péptidos que corresponden a los
epítopos para anticuerpo contra O8E se describen en la presente
memoria como SEQ ID n.º 394-415. Los epítopos para
anticuerpo reconocidos por los antisueros policlonales contra O8E
se describen en la presente memoria en la figura 17.
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Ejemplo
4
(Sólo para
ilustrar)
Este ejemplo describe el análisis mediante IHQ
(inmunohistoquímica) de la expresión de O8E en las muestras de
tejido de cáncer ovárico.
Para los estudios de IHQ, el tejido de cáncer
ovárico fijado en formol e incluido en parafina se cortó en
secciones de 8 \mum. Se utilizó la recuperación de epítopos
inducida por vapor caliente (SHIER) en un tampón de citrato de
sodio al 0,1 M (pH 6,0) como condiciones óptimas de tinción. Se
incubaron las secciones con suero/PBS al 10% durante 5 minutos. Se
añadió el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal
anti-O8E de conejo purificado por afinidad) a cada
sección durante 25 min y después se incubó 25 min con un anticuerpo
biotinilado anticonejo. Se bloqueó la actividad de la peroxidasa
endógena por medio de 3 incubaciones de 1,5 minutos con peróxido de
hidrógeno. Se utilizó el sistema del complejo de
biotina-avidina/peroxidasa de rábano picante junto
con el cromógeno DAB para visualizar la expresión del antígeno. Se
contracoloraron los portaobjetos con hematoxilina. Una (carcinoma
seroso papilar) de las seis secciones de tejido de cáncer ovárico
mostraron inmunorreactividad con O8E. Con la optimización de las
condiciones de tinción, 4/5 de las muestras de cáncer ovárico se
tiñeron positivamente con el anticuerpo policlonal contra O8E. La
expresión de O8E se localizó en la membrana plasmática.
Se analizaron seis tejidos del cáncer ovárico
con el anticuerpo policlonal de conejo anti-O8E. Una
(carcinoma seroso papilar) de las seis muestras de tejido de cáncer
ovárico se tiñeron positivamente por la expresión del O8E. La
expresión de O8E se localizó en la superficie de la membrana.
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Ejemplo
5
(Sólo para
ilustrar)
Este ejemplo describe los péptidos de O8E que se
predice que se unen a HLA-A2 y que son inmunógenos
de la respuesta de los linfocitos T CD8 en los humanos.
Se predijeron posibles péptidos de O8E que se
unirían a HLA-A2 utilizando el marco abierto de
lectura completo (ORF) de O8E y se analizó con "Episeek", un
programa que se utiliza para predecir los péptidos de unión al CMH.
El programa utilizado se basa en el algoritmo publicado por Parker,
K. C. et al., J. Immunol. 152 (1):
163-175 (1994) (incorporado por referencia en la
presente memoria en su totalidad). Los decapéptidos y nonapéptidos
que se predijo que se unían a HLA-0201 se describen
en la presente memoria como las SEQ ID n.º 416 a 435 y las SEQ ID
n.º 436 a 455, respectivamente.
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Ejemplo
6
(Sólo para la
ilustrar)
Este ejemplo describe la expresión en la
superficie celular de O8E medida por la clasificación de células
activadas por fluorescencia (FACS).
Para el análisis de FACS, se lavaron las células
con un tampón de tinción enfriado en hielo (PBS/BSA al 1%/azida). A
continuación, se incubaron las células durante 30 minutos en hielo
con 10 \mug/ml de anticuerpo policlonal
anti-B305D de conejo purificado por afinidad. Se
lavaron las células 3 veces con un tampón de tinción y después se
incubaron con una dilución 1:100 de un reactivo
FITC-Ig anticonejo de cabra (H+L) (Southern
Biotechnology) durante 30 minutos en hielo. Después de 3 lavados,
se resuspendieron las células en un tampón de tinción que contenía
yoduro de prodio, una tinción vital que permite la identificación de
las células permeables, y se analizó mediante FACS. Se confirmó la
expresión de O8E en la superficie de las células de cáncer de mama
SKBR3 y las células HEK293 que sobreexpresan de manera estable el
ADNc de O8E. Ni las células MB415 ni las células HEK293
transfectadas establemente con un ADN plasmídico irrelevante de
control mostraron expresión de O8E en la superficie (figuras 18 y
19).
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Ejemplo
7
(Sólo para
ilustrar)
Este ejemplo evalúa adicionalmente la expresión
y la localización de O8E en la superficie.
Para la expresión y la purificación del antígeno
utilizado para la inmunización, se expresa O8E en un sistema de
expresión recombinante en E. coli al hacerlo crecer durante
una noche en caldo LB con los antibióticos adecuados a 37ºC en un
incubador con agitación. A la mañana siguiente, se añadieron 10 ml
del cultivo de una noche a 500 ml de YT 2x más los antibióticos
adecuados en un matraz Erlenmeyer de 2 L con deflectores. Cuando la
densidad óptica (a 560 nm) del cultivo alcanzó 0,4 a 0,6, se
indujeron las células con IPTG (1 mM). Cuatro horas después de la
inducción con IPTG, se recogieron las células por centrifugación.
Luego, las células se lavaron con disolución salina tamponada con
fosfato y se centrifugaron de nuevo. Se desechó el sobrenadante, y
las células o bien se congelaron para su uso futuro o bien se
procesaron inmediatamente. Se añadieron 20 ml del tampón de lisis a
los sedimentos celulares y se mezclaron vorticialmente. Para romper
las células de E. coli, esta mezcla se hizo pasar por la
prensa French a una presión de 16.000 psi. A continuación, se
centrifugaron las células de nuevo y, por SDS-PAGE,
se comprobó el reparto de la proteína recombinante entre el
sobrenadante y el sedimento. Para la proteína que se localizaba en
el sedimento celular, se resuspendió el sedimento en Tris a 10 mM
pH 8,0, CHAPS al 1% y se lavó y centrifugó de nuevo el sedimento de
cuerpos de inclusión. Se repitió dos veces más este procedimiento.
El sedimento lavado de cuerpos de inclusión se solubilizó con urea
a 8 M o con clorhidrato de guanidina a 6 M que contiene Tris a 10
mM, pH 8,0 más imidazol a 10 mM. Se añadió la proteína solubilizada
a 5 ml de una resina de quelato de níquel (Qiagen) y se incubó
durante 45 min a 1 h a temperatura ambiente con agitación continua.
Después de la incubación, se vertió la mezcla de resina y proteína
por una columna desechable y se recogió el flujo. Luego, se lavó la
columna con 10 a 20 volúmenes de la columna de tampón de
solubilización. A continuación se eluyó el antígeno de la columna
con urea a 8 M, Tris a 10 mM, pH 8,0, e imidazol a 300 mM y se
recogió en fracciones de 3 ml. Se migró en gel de
SDS-PAGE para determinar qué fracciones había que
agrupar para purificarla adicionalmente. Como última etapa de
purificación, se equilibró una resina de intercambio aniónico fuerte
tal como Hi-Prep Q (Biorad) con el tampón adecuado,
y las fracciones agrupadas anteriores se cargaron en la columna.
Cada antígeno de la columna se retiró al eluir con un gradiente
creciente de sal. Se recogieron las fracciones cuando se hizo fluir
la columna y se migró otro gel de SDS-PAGE para
determinar qué fracciones de la columna había que agrupar. Se
dializaron las fracciones agrupadas contra Tris a 10 mM, pH 8,0. A
continuación, se evaluó este material para determinar si resultaban
aceptables la pureza que se determinó por SDS-PAGE o
HPLC, la concentración que se determinó con un análisis de Lowry o
con un análisis de aminoácidos, la identidad que se determinó
mediante la secuenciación del extremo amino de la proteína, y el
nivel de endotoxina que se determinó mediante el ensayo del
Limulus (LAL). A continuación, las proteínas se introdujeron
en un vial tras la filtración por un filtro de 0,22 \mum y se
congelaron los antígenos hasta que se necesitaran para la
inmunización.
Para la generación de antisueros policlonales,
se combinaron 400 \mug de cada antígeno prostático con 100 \mug
de muramildipéptido (MDP). Se añadió un volumen igual de adyuvante
incompleto de Freund (AIF) y luego se mezcló. Cada cuatro semanas
se repitió la vacunación de los animales con 100 \mug de antígeno
mezclado con un volumen igual de AIF. Siete días después de cada
vacuna de refuerzo, se sangraron los animales. Se generó suero
incubando la sangre a 4ºC durante 12 a 24 h y luego
centrifugándola.
Para la caracterización de los antisueros
policlonales, se cubrieron 96 pocillos con antígeno incubándolos
con 50 \mul (típicamente 1 \mug) a 4ºC durante 20 h. Se
añadieron 250 \mul de tampón de bloqueo con SAB a los pocillos y
se incubó a TA durante 2 h. Se lavaron las placas 6 veces con
PBS/Tween al 0,01%. Se diluyó en PBS el suero de conejo
anti-O8E o el anticuerpo anti-O8E
purificado por afinidad. Se añadieron 50 \mul del anticuerpo
diluido a cada pocillo y se incubó a TA durante 30 min. Se lavaron
las placas tal y como se acaba de describir antes de añadir 50
\mul de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada a anticuerpos
anticonejo de cabra a un dilución de 1:10.000 y se incubó a TA
durante 30 minutos. Se lavaron las placas tal y como se describió
anteriormente y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de sustrato
de peroxidasa TMB para micropocillos. Tras incubar 15 minutos a
temperatura ambiente en la oscuridad, se paró la reacción
colorimétrica con 100 \mul de H_{2}SO_{4} a 1 N y se leyó
inmediatamente a 450 nm. Todos los anticuerpos policlonales
mostraron inmunoreactividad con el antígeno O8E.
Para la expresión recombinante en células HEK293
de mamíferos, se subclonó el ADNc completo de O8E en los vectores
de expresión de mamíferos pcADN3.1+ y pCEP4 (Invitrogen), que se
modificaron para contener etiquetas del epítopo de His y FLAG,
respectivamente. Estas construcciones se transfectaron en las
células HEK293 (ATCC) mediante el reactivo Fugene 6 (Roche).
Brevemente, se sembraron en placa las células HEK293 a una densidad
de 100.000 células/ml en DMEM (Gibco) que contiene FBS al 10%
(Hyclone) y se dejaron crecer durante una noche. Al día siguiente,
se añadieron 2 \mul de Fugene 6 a 100 \mul de DMEM que no
contiene FBS y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, se añadió la mezcla de Fugene6/DMEM a 1 \mug de ADN
plasmídico de O8E/pCEP4 o O8E/pcADN3.1 y se incubó durante 15
minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la mezcla
de Fugene/ADN a las células HEK293 y se incubó durante 48 a 72 h a
37ºC con CO_{2} al 7%. Se enjuagaron las células con PBS, luego
se recogieron y se sedimentaron por centrifugación. Para el análisis
de inmunotransferencia, se generaron lisados de células completas
incubando las células en hielo en un tampón de lisis que contiene
Triton-X100 durante 30 minutos. Después se limpiaron
los lisados por centrifugación a 10.000 rpm durante 5 minutos a
4ºC. Se diluyeron las muestras con un tampón de carga con
SDS-PAGE que contiene
beta-mercaptoetanol, luego se hirvió 10 minutos
antes de cargar el gel de SDS-PAGE. Se transfirió la
proteína a nitrocelulosa y se rastreó con el suero policlonal de
conejo anti-O8E n.º 2333L a una dilución de 1:750.
Se reveló la inmunotransferencia con Ig anti-conejo
de cabra unida a HRP y posterior incubación en un sustrato de
ECL.
Para el análisis de FACS, se lavaron las células
además con tampón de tinción enfriado en hielo (PBS + SAB al 1% +
azida). A continuación, se incubaron las células durante 30 minutos
en hielo con 10 \mug/ml de suero policlonal
anti-O8E purificado con proteína A. Se lavaron las
células 3 veces con un tampón de tinción y después se incubaron con
una dilución 1:100 de un reactivo de Ig (H + L) anticonejo de cabra
conjugada a FITC (Southern Biotechnology) durante 30 min en hielo.
Después de 3 lavados, se resuspendieron las células en un tampón de
tinción que contenía yoduro de propidio (PI), una tinción vital que
permite la identificación de las células permeables, y se analizó
por FACS.
A partir de estos experimentos, cuyos resultados
se ilustran en las figuras 20 a 21, se detectó la expresión de O8E
sobre la superficie de las células HEK293 y SKBR3 transfectadas
mediante un análisis de FACS con suero anti-O8E de
conejo. También se detectó su expresión en los lisados de células
HEK293 por análisis de inmunotransferencia (figura 22).
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Ejemplo
8
Se generaron anticuerpos monoclonales de ratón
contra la proteína O8E obtenida en E. coli como se describe
a continuación. Se inmunizaron ratones A/J por vía intraperitoneal
(i.p.) con adyuvante completo de Freund (ACF) que contiene 50
\mug de O8E recombinante, seguido de una vacuna de refuerzo i.p.
posterior con adyuvante incompleto de Freund (AIF) que contiene 10
\mug de la proteína O8E recombinante. Tres días antes de retirar
los bazos, se inmunizaron los ratones por vía i.v. con
aproximadamente 50 \mug de la proteína O8E recombinante soluble.
Se retiró el bazo de un ratón con una valoración positiva de O8E, y
se fabricó y utilizó una suspensión de una única célula para la
fusión con células de mieloma SP2/0 para generar hibridomas de
linfocitos B. Se analizaron los sobrenadantes de los clones
híbridos por ELISA para evaluar la especificidad frente a la O8E
recombinante, y se cartografió el epítopo mediante péptidos que
abarcaban toda la secuencia de O8E. También se analizaron los Acm
mediante citometría de flujo para determinar su capacidad para
detectar el O8E sobre la superficie de las células transfectadas
establemente con O8E y sobre la superficie de una estirpe celular
de tumor de mama.
Para el análisis de ELISA, se recubrieron placas
de 96 pocillos con la proteína O8E recombinante o bien con péptidos
de 20 restos que se solapan y que abarcan toda la molécula del O8E a
una concentración de 1.2 \mug/ml o 10 \mug/ml, respectivamente.
Después del recubrimiento, las placas se lavaron 5 veces con tampón
de lavado (PBS + Tween-20 al 0,1%) y se bloquearon
con PBS que contenía SAB al 0,5% y Tween-20 al 0,4%.
A continuación se añadieron sobrenadantes híbridos o Acm
purificados y se incubaron las placas durante 60 minutos a
temperatura ambiente. Se lavaron las placas 5 veces con un tampón
de lavado y el anticuerpo secundario, Ig antirratón de burro unido
a la peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch), se
añadió durante 60 minutos. De nuevo se lavaron las placas 5 veces
en tampón de lavado, y después se añadió el sustrato de peroxidasa.
De los clones generados del hibridoma, se identificaron 15 Acm
secretados que reconocieron la proteína del O8E completa. La
cartografía de epítopos reveló que de estos 15 clones, 14 Acm
secretados reconocían los residuos aminoacídicos 61 a 80 de O8E, y
un clon secretó un Acm que reconoció los residuos de los aminoácidos
151 a 170.
Para el análisis por citómetro del flujo, las
células HEK293 que se habían transfectado de forma estable con las
O8E y las células SKBR3 que expresan el ARNm de O8E se recogieron y
se lavaron en tampón de tinción de flujo (PBS + SAB al 1% + azida).
Se incubaron las células con el sobrenadante de los híbridos del Acm
durante 30 minutos en hielo seguidos de 3 lavados con tampón de
tinción. Se incubaron las células con Ig antirratón de cabra
conjugado a FITC durante 30 minutos en hielo, seguido de 3 lavados
con tampón de tinción antes de resuspenderlo en tampón de lavado
con yoduro de propidio. El análisis por citómetro del flujo reveló
que 15/15 Acm eran capaces de detectar la proteína de O8E expresada
sobre la superficie de las células HEK293 transfectadas con O8E.
Los 6/6 Acm analizados sobre células SKBR3 eran capaces de reconocer
el O8E expresado sobre la superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
A los anticuerpos monoclonales de ratón (Acm)
generados contra la O8E obtenida de E. coli, tal y como se
describió en el ejemplo 8, se les analizó su capacidad para promover
la interiorización del antígeno O8E. La interiorización del
anticuerpo se determinó mediante un análisis de citotoxicidad in
vitro. Brevemente, las células transfectadas HEK293 y O8E/HEK
se sembraron en placas de 96 pocillos que contenían DME más FBS
inactivado por calor al 10% en presencia de 50 ng/pocillo del
anti-O8E purificado o de anticuerpos de control. El
isotipo de los Acm anti-O8E son los siguientes:
11A6-IgG1/kappa, 15C6-IgG2b/kappa,
18A8-IgG2b/kappa y 14F1-IgG2a/kappa.
W6/32 es un anticuerpo monoclonal universal de ratón
anti-CMH humano de clase I que sirve de control
positivo, y se incluyeron dos Acm irrelevantes,
Ir-Pharm e Ir-Crxa, como controles
negativos. Después de la incubación con anticuerpos específicos
contra O8E o los anticuerpos de control relevantes, el
Acm-zap, un anticuerpo secundario Ig antirratón de
cabra conjugado con saporina (Advanced Targeting Systems) se añadió
a una concentración de 100 ng/ml hasta la mitad de los pocillos, y
se incubaron las placas durante 48 a 72 h a 37ºC en un incubador de
CO_{2} al 7%. Este análisis se aprovecha de la naturaleza tóxica
de la saporina, una proteína inactivadora de ribozimas, que tiene
un efecto citotóxico al interiorizarse. Después de la incubación con
el Acm-zap, se cuantificó la interiorización
mediante la adición del reactivo MTS, seguido de la lectura de DO490
de la placa en un lector de ELISA de placas multipocillo. La figura
25 describe los resultados de estos análisis. El panel superior
representa células HEK que no se han transfectado con O8E y, por lo
tanto, el anticuerpo contra O8E no se debe unir ni ser
interiorizado. Los niveles de proliferación eran los mismos en todas
las muestras si se habían incubado con el Acm-zap o
sin él, con la excepción del Ac de control positivo, el W6/32. El
panel inferior representa las células que se han transfectado con
O8E y que, por lo tanto, deben unirse a anticuerpos específicos
contra O8E. Los anticuerpos de los hibridomas 11H6, 14F1 y 15C6, que
reconocen los aminoácidos 61 a 80 de O8E, eran capaces de promover
la interiorización de la proteína de la superficie O8E, lo que se
midió por la disminución de los niveles de proliferación debido a la
naturaleza tóxica del Acm-zap (véase la figura 25).
El anticuerpo generado por el hibridoma 18A8, que reconoce los
aminoácidos 151-170 de O8E, fue incapaz de promover
la interiorización, lo que se determinó por unos niveles normales de
proliferación tanto en ausencia como en presencia del
Acm-zap.
Ejemplo
14
Para determinar qué tejidos expresan el antígeno
O8E del cáncer ovárico, se realizó un análisis IHQ en un abanico
diverso de secciones de tejido utilizando tanto anticuerpos
monoclonales como policlonales específicos contra O8E. La
generación de los anticuerpos policlonales específicos contra O8E se
describe en detalle en el ejemplo 8. Los anticuerpos monoclonales
utilizados para teñir fueron 11A6 y 14F1, que eran específicos de
los aminoácidos 61 a 80 de O8E, y 18A8, que reconoce los aminoácidos
151 a 170 de O8E (véase el ejemplo 12 para más detalles sobre cómo
se generan).
Para realizar la tinción, se fijaron muestras de
tejido en una disolución de formol durante 12 a 24 h y se
incluyeron en parafina antes de cortarlas en secciones de 8 \mum.
Se utilizó la recuperación de epítopos inducida por vapor caliente
(SHEIR) en tampón de citrato de sodio a 0,1 M (pH 6,0) para las
condiciones de tinción óptimas. Se incubaron secciones con suero al
10%/PBS durante 5 minutos. A continuación se añadió el anticuerpo
primario a cada sección durante 25 minutos seguido de 25 minutos de
incubación con anticuerpo biotinilado anticonejo o antirratón. Se
bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena mediante tres
incubaciones de 1,5 minutos con peróxido de hidrógeno. Se utilizó
el sistema complejo biotina-avidina/peroxidasa de
rábano picante (ABC/HRP) junto con cromógeno DAB para visualizar la
expresión del antígeno. Se contracoloraron los portaobjetos con
hematoxilina para visualizar los núcleos celulares.
Los resultados utilizando anticuerpo policlonal
purificado por afinidad de conejo contra O8E (a.a.
29-283, para más detalles sobre la generación de
este Ac, véase el ejemplo 3) se presentan en la tabla 3. Los
resultados con los tres anticuerpos monoclonales se presentan en la
tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Corixa Corporation
{}\hskip1cm Mitcham, Jennifer L.
{}\hskip1cm King, Gordon E.
{}\hskip1cm Algate, Paul A.
{}\hskip1cm Fling, Steven P.
{}\hskip1cm Retter, Marc W.
{}\hskip1cm Fanger, Gary Richard
{}\hskip1cm Reed, Steven G.
{}\hskip1cm Vedvick, Thomas S.
{}\hskip1cm Carter, Darrick
{}\hskip1cm Hill, Paul
{}\hskip1cm Albone, Earl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA
TERAPIA Y EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER OVÁRICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 210121.46201PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
17-07-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 596
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4,0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 454, 492, 526
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 692
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 518, 528
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 544
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1043
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 896
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 230, 320
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 472, 494
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> característica_misc
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<222> 480, 491
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<223> n = A, T, C o G
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<221> característica_misc
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<222> 517
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<223> n = A, T, C o G
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<221> característica_misc
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<222> 963, 995, 1001, 1008, 1010
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<223> n = A, T, C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 531
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<212> ADN
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<223> n = A, T, C o G
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<223> n = A, T, C o G
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 46, 125, 140, 148, 220, 229, 291,
388, 456
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
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<210> 173
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<211> 635
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 444, 453, 517, 540, 546, 551, 573,
593
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 457, 511, 520, 552, 568
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
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<222> 247
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<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 94, 225
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 55, 299, 317, 332, 342, 348
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 47, 60, 67
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 337
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 169, 195, 253, 314
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 30, 174, 248, 285, 306, 332, 345,
368
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 28, 36, 86
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 397
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 145, 286, 363, 365, 425, 433, 452,
462, 471, 512, 514, 534, 536, 590, 565, 583
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 136, 486
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 41, 280, 314, 330, 350, 353
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 247, 304, 306, 332, 337
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 218, 299, 306, 326, 333, 337,
341
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 9, 33, 58, 71, 90
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22, 37, 39, 105, 268, 276, 302, 323,
331, 335, 347, 351, 371, 378
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 19, 83, 168, 252, 271, 292, 43.0
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 71, 96
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 41, 53, 98, 195, 350
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 92, 107
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 210, 226, 227, 230, 236
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9, 354
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
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\hskip0,8cm
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<210> 204
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<211> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 770
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 529, 591, 623, 626, 629, 630, 656,
702, 709, 712, 717, 743, 746, 749, 759, 762, 766
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 574, 621, 625, 636, 668, 673, 704,
728, 743, 767, 772, 786, 789, 807, 809, 810
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 208
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<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
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\hskip0,8cm
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<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 453, 538, 540, 542, 546, 554, 556,
598, 659, 670, 679, 689, 693, 711, 723, 724, 731, 747
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
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<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 872
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 165, 174, 181, 256, 260, 269, 271,
277, 286, 289, 294, 298, 300, 301, 303, 308, 311, 321, 325, 328,
329, 333, 338, 342, 346, 349, 351, 357, 359, 364, 366, 379, 385,
395, 396, 397, 407, 408, 410, 414, 415, 429, 431, 434, 435, 440,
443
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 444, 446, 447, 448, 449, 450, 451,
464, 470, 472, 475, 479, 483, 484, 485, 488, 494, 496, 497, 504,
508, 509, 511, 513, 517, 522, 524, 526, 532, 533, 542, 543, 553,
559, 566, 567, 571, 572, 578, 582, 588, 591, 594, 595, 596, 600,
606
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 612, 614, 617, 618, 629, 630, 631,
652, 654, 655, 661, 663, 664, 666, 671, 673, 678, 679, 681, 688,
690, 691, 698, 706, 707, 708, 714, 719, 721, 723, 726, 741, 751,
761, 762, 769, 770, 778, 779, 781, 782, 785, 791, 802, 807, 808,
812
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 815, 820, 827, 828, 838, 841, 844,
851, 857, 864, 866, 869, 872
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 517
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 462, 464, 506
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 432, 476, 522, 547, 621, 624, 647,
679
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 804
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 552, 555, 592, 624, 629, 633, 658,
695, 697, 698, 700, 702, 745, 753, 755, 762, 773, 786, 788, 793,
795
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 452, 509, 585
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 801
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 22; 25, 26, 328, 373, 385, 440,
473, 534, 571, 572, 573, 582, 587, 589, 593, 600, 605, 617, 633,
642, 653, 672, 681, 685, 696, 699, 709, 715, 717, 726, 731, 739,
742, 745, 758, 769, 772, 778, 780, 788, 789, 791, 793, 796
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10, 157, 170
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 9, 557, 571, 587, 588, 601, 642,
643, 647, 654, 664, 681, 688, 698, 719, 720, 725, 734, 738, 743,
744, 757, 765, 773, 778, 780, 782, 783, 793, 798, 805, 809, 822,
827
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 574, 610, 631, 643, 657, 660, 666,
688, 712, 735, 747
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
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\hskip0,8cm
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<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 4, 5, 13, 15, 17, 29
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6, 15, 19, 21
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 776
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 505, 550, 574, 601, 604, 608, 612,
649, 656, 657, 680, 711, 750, 776
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 805
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 637, 684, 705, 724, 733, 756, 778,
793, 796, 804
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 478, 557, 563, 566, 620, 660, 663,
672, 673, 684, 693, 695
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 691
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 564, 582, 640, 651, 666, 669,
690
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 808
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 680, 715, 721, 728, 735, 749, 757,
762, 772, 776, 779, 781, 792, 796, 800, 808
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 496, 541, 624, 662, 679, 688
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 284, 297, 299, 322, 325, 338, 342,
345
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 308, 310, 312, 320, 331, 336, 383,
392, 396
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 249
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 338, 357, 361, 369, 388, 394
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 250
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 107, 312, 338, 351, 352, 357,
363, 366, 373, 380, 405, 421, 444, 508
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 251
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20, 21, 25, 44, 343, 347, 356, 362,
387, 391, 398, 409, 428, 430, 453, 494
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 253
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 327, 403
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 255
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 347, 456, 475
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 256
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 544
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 495, 511
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 257
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 258
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 259
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 320, 326, 342, 352
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 259
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 412, 582, 612, 641, 646
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 262
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 263
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 453, 458, 544
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 263
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 39, 174, 352, 526
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 264
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 347, 352, 353, 534, 555, 587
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 265
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 393, 473
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 266
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 346, 358, 432, 510, 512
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 267
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 98, 380, 421, 454, 495, 506, 512,
561, 565, 579
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 268
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 265, 329
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 269
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 54, 163, 219, 229, 316
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 270
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 271
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 279, 329, 362, 384, 400
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 271
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 422, 492, 510, 513, 515, 525
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 272
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 223, 265, 277, 308, 329, 346, 360,
366, 429, 448, 517, 524, 531, 578
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 273
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 274
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 275
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 35, 72
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 275
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 610
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 358, 360, 363, 382, 424, 433, 464,
468, 477, 491, 499, 511, 558, 584, 588, 590
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 276
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 277
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 5, 18, 21, 31
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 277
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipancgnggtcg cggccgangt nttttttctt nttttttt
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 278
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 156, 212, 233, 245, 327, 331, 336,
361, 364, 381, 391, 397, 419, 437
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 278
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 219, 256, 291, 297, 307, 314,
317
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 279
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 18, 34, 51, 118, 120, 140
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 383, 386, 388, 393
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 281
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 507
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 320, 341, 424, 450, 459, 487,
498
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 282
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 216, 292, 303, 304
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 283
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 54, 59, 63, 121, 312, 327
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 284
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 316, 319, 327, 329, 339, 344, 357,
384, 398, 427, 443, 450, 478
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 188, 251, 267
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 286
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 18
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 287
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtggncg cggacganga caacaacccc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22, 130
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 288
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 36, 165, 191, 195, 218, 235
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 289
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 290
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 249, 267
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 291
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6, 19, 25, 51, 53, 61, 63, 70, 109,
136, 157, 241, 276
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 292
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 293
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 64, 103, 110, 237, 282
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 294
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 295
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 296
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 10, 33, 61, 62, 63, 88, 109, 122,
255, 298, 307, 340, 355, 386, 393
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 296
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 312, 326, 335, 361
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 297
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 345, 346
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 298
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 281, 285, 306
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 299
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 300
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 301
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 129, 295
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 302
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 139, 146, 195
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 303
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 304
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5, 11, 22, 98, 102
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 305
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 144, 159
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 306
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 307
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 307
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 308
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 309
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 430
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 310
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 436
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 437
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 438
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 438
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 439
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 439
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 440
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 440
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 441
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 442
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 442
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 443
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 444
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 445
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 446
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 447
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 447
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 448
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 449
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 450
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 451
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 452
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 452
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 453
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 453
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 454
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 455
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 455
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (13)
1. Epítopo para anticuerpo aislado del antígeno
O8E de carcinoma ovárico, consistiendo dicho epítopo en la
secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 398 o una
variante de la misma que tiene al menos una identidad del 90% a lo
largo de toda su longitud con la secuencia de aminoácidos
representada en la SEQ ID n.º 398.
2. Anticuerpo aislado o un fragmento de unión a
antígeno del mismo, que se une específicamente al epítopo para
anticuerpo según la reivindicación 1.
3. Anticuerpo aislado o el fragmento de unión a
antígeno según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal.
4. Anticuerpo aislado o un fragmento de unión a
antígeno según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es
eficaz para favorecer la interiorización de la proteína O8E.
5. Epítopo según la reivindicación 1, para
utilización en tratamientos.
6. Anticuerpo según las reivindicaciones 2, 3 ó
4, para utilización en tratamientos.
7. Utilización del epítopo según la
reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento a utilizar
en la prevención del desarrollo del cáncer ovárico o para el
tratamiento del cáncer ovárico.
8. Utilización del anticuerpo según una
cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, para la fabricación de
un medicamento para prevenir el desarrollo del cáncer ovárico o para
el tratamiento del cáncer ovárico.
9. Polinucleótido, que codifica el epítopo según
la reivindicación 1.
10. Polinucleótido según la reivindicación 9,
para utilización en tratamientos.
11. Utilización del polinucleótido según la
reivindicación 9, para fabricar un medicamento para prevenir el
desarrollo del cáncer ovárico o para el tratamiento del cáncer
ovárico.
12. Composición farmacéutica que comprende:
- a)
- un epítopo según la reivindicación 1, o
- b)
- un anticuerpo según las reivindicaciones 2, 3 ó 4; o
- c)
- un polinucleótido según la reivindicación 9; y
un excipiente fisiológicamente
aceptable.
13. Vacuna que comprende:
- a)
- un epítopo según la reivindicación 1, o
- b)
- un anticuerpo según las reivindicaciones 2, 3, ó 4; o
- c)
- un polinucleótido según la reivindicación 9; y
un potenciador de la respuesta
inmunitaria
inespecífica.
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| US667857 | 2000-09-20 | ||
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