JP2002509724A - ブドウ球菌感染の治療および診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ブドウ球菌感染の治療および診断に有用な技術を提供する。 【解決手段】 ブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌感染の治療および診断に使用できるタンパク質、そのエピトープ、ならびにそれらに特異的な抗体その他の結合剤および中和剤を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ブドウ球菌（特に黄色ブドウ球菌）の感染（症）の治療および診断
に関し、該ブドウ球菌のタンパク質、エピトープ、ならびにそれらの特異的な抗
体およびその他の結合剤や中和剤を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】

グラム陽性菌の多重薬剤耐性（ＭＤＲ）は、特に病院において、ますます問題
視されている（Banergee, S.N. 他、1991, Am. J. Med. 91 : 865-895 ; Shaber
g, D.R. 他、1991, Am. J. Med. Suppl., 88 : 72-75 ; Gaynes, R.P. 他、1994
, Infect. Dis. Clin. Pract., 6 : 452-455）。特に、メチシリン耐性黄色ブド
ウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）（ＭＲＳＡ）およびコアグラーゼ陰
性ブドウ球菌（ＣＮＳ）（特にメチシリン耐性ＣＮＳ）は、ペニシリンおよびセ
ファロスポリン全てに対して耐性であり、問題であることが明らかにされている
。キノロンのような他の薬剤に対する耐性も広まっている（Malabarta, A. 他、
1997, Eur. J. Med. Chem., 32 : 459-478 ; Lewis, K., 1994, TIBS, 19 : 119
-123 ; Traub, W.H. 他、1996, Chemotherapy, 42 : 118-132）。代表的な治療 はバンコマイシンまたはテイコプラニンを使用するものである。しかしながら、
これらの薬剤に対する耐性も拡大しつつあり、新しい治療法が要望されている。

【０００３】 ＷＯ９８／０１１５４は、人間または動物の身体の治療および診断方法に、バ
クテリアおよび真菌のＡＢＣ輸送（トランスポーター）タンパク質ならびにそれ
らに特異的な中和剤を使用することを開示している。治療に有用なものとして、
見かけの分子量が９７ｋＤａおよび５４ｋＤａの腸球菌ＡＢＣ輸送タンパク質が
明らかにされ、さまざまのエピトープも明かにされている。バチルス・チューリ
ンジエンシスのIstAおよびIstBタンパク質（Menou 他、1990, J. of Bacteriolo
gy, 173 : 6689-6696）に類似のブドウ球菌ホモログも明かにされており、該ホ モログは６９および３７ｋDaのみかけの分子量を有し主要保存抗原である。それ
らのエピトープも明かにされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】

このたび本発明者は、流行性のＭＲＳＡ株から６７ｋＤａのみかけの分子量を
有するブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質の分離および精製に成功し、配列番号（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１のコード配列および配列番号：２のアミノ酸配列とし
ている。これらの配列の一部は、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ８３
２５ゲノム解読プロジェクトにより、コンティグ１１８４、コンティグ１１７７
およびコンティグ１１５８（アミノ末端配列データを含有する）として明らかに
されたものである。このタンパク質は、これまでＡＢＣ輸送タンパク質であると
示されたことはなく、それを診断や治療に用いることもこれまで提示されたこと
はなかった。該タンパク質は計算による真の分子量は６０．１ｋＤａであるが、
翻訳後修飾により６７ｋＤａのみかけの分子量を有するものとして実験的に明か
にされた。

【０００５】 該タンパク質の機能は、ＷＯ９８／０１１５４のIstAおよびIstBホモログによ
って示唆されるものでなければ開示されているものでもない。それらは配列が異
なり分子量が異なっているからである。さらに、そのIstAおよびIstBホモログが
単離されたサンプルは、本発明について用いられたような血液や創傷培養物（後
記）ではなく腹腔透析物であり、そのような精製法によっては本発明は導かれ得
ない。該従来技術によって採用されている透析工程は、血清に比較すると、透析
物中の抗体の相対的な割合を変化させてしまうからである。同様にして、その他
の既知技術も、本発明に係る該タンパク質の機能について何らの示唆をしておら
ず、該タンパク質を診断または治療に用いることも示唆していない。

【０００６】

【発明の実施の形態】

かくして、本発明に従えば、配列番号：２またはその部分的な修飾形態または
その免疫原性フラグメントから成り、人間または動物の身体の治療または診断方
法に用いられるブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質が提供される。

【０００７】 該タンパク質の免疫原性フラグメントとしては、免疫応答を起こすようなタン
パク質フラグメントであればいずれでもよく、エピトープ（すなわちエピトープ
を有するペプチド）を含む。同様にして、エピトープのアナログ（ミモトープ）
を簡単に作製することもでき、そのようなミモトープは配列は異なるが同じエピ
トープを有するものである。このようにして「免疫原性フラグメント」とは、該
フラグメントの免疫原性アナログ（例えばミモトープ）も包含するものとする。
エピトープの決定やミモトープの設計は容易に行うことができる（Geysen, H.M.
他、1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274 ; Geysen, H.M
. 他、1988, J. Mol. Recognit., 1 (1) : 32-41 ; Jung, G. およびBeck-Sicki
nger, A.G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31 : 367-486）。

【０００８】 本発明の範囲は、他の非ブドウ球菌のＡＢＣ輸送タンパク質、例えばＷＯ９８
／０１１５４のタンパク質にまで及ぶものではない。しかし、本発明は、非実質
的に修飾された（すなわち、部分的に修飾された）タンパク質形態、特に、当該
タンパク質自身と同一の免疫原性を有するようなタンパク質形態を包含するもの
である。

【０００９】 「部分修飾」または「部分的に修飾された」とは、アミノ酸配列に関して用い
られる場合、部分的に修飾された形態の分子が、それが誘導された元の分子の性
質を実質的に保持している（勿論、追加の機能が生じることもある）ことを意味
する。部分修飾は、例えば、アミノ酸残基の付加、削除または置換による。置換
は保存的置換の場合もある。したがって、部分的に修飾された分子とは、例えば
、それが誘導された元の分子のホモログ（相同体）である。例えば、誘導された
元の分子に対して少なくとも７０％のホモロジーを有する。例えば、誘導された
元の分子に対して少なくとも８０，９０または９５％のホモロジーを有するよう
なものである。ホモログの例は、アレル（対立遺伝子）変異体である。同様に、
そのような分子またはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が部分的に修
飾されて、アミノ酸配列や分子の部分修飾をコードするようになることもある。
勿論、ヌクレオチド配列の修飾には、同じアミノ酸をコードしながらヌクレオチ
ド配列は異なるように修飾されることも含まれる。

【００１０】 ブドウ球菌は、例えば、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス：
S. aureus）であり、あるいは、例えば、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフ ィロコッカス・エピデルミヂス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモ
リチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・フィクス（S. hyicus）ま
たはスタフィロコッカス・サプロフィチクス（S. saprophyticus）である。

【００１１】 免疫原性フラグメントは、例えば、ＡＴＰ結合サイトまたはその一部から成る
。当該ＡＢＣ輸送タンパク質の多くのエピトープを保有する（発現する）ペプチ
ドも明かにされており（後述）、したがって該タンパク質の免疫原性フラグメン
トは、例えば、配列番号：３，４，５，９，１０，１１または１２の配列を含む
ものである。配列番号：３，４および５のエピトープは、それぞれ、配列番号：
６，７および７の配列を有するペプチドによって示され、したがって、免疫原性
フラグメントは、例えば、配列番号：６，７または８の配列を含むものである。
特に、実験によって示されるところによれば、配列番号：３および４を有するエ
ピトープを示す配列番号：６および７を有するペプチドは特に治療用として適し
ている。配列番号：１３および１４の配列を有するペプチドも、その抗体が動物
モデルで治療効果を有する（後述の実験参照）ようなエピトープを保持しており
、したがって、免疫原性はフラグメントは、例えば、配列番号：１３または１４
の配列を含むものである。更なるエピトープとして配列番号：１７の配列を有す
るものも見出されており、該エピトープを保有し配列番号：１８の配列を有する
ペプチドは、６７ｋＤａの抗原に特異的なポリクローナル抗血清の産生を引き起
こす。したがって、配列番号：１７または１８のいずれか一方の配列を有するも
のも免疫原性フラグメントの１例である。

【００１２】 かくして、上述のようなエピトープを保有するブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク
質は治療や診断に有用であり、該タンパク質およびその免疫原性フラグメントは
、ブドウ球菌感染の治療および予防（例えば、ワクチンのような免疫刺激剤とし
て）に用いられることができる。

【００１３】 さらに、該ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメントまたはその
部分的に修飾された形態に特異的な結合剤および中和剤（例えば抗体）も、診断
および治療に用いられることができる。結合剤には、それが特異的な標的があり
、結合剤が抗体である場合には標的は抗原である。治療用薬剤の例は、該ＡＢＣ
輸送タンパク質に特異的な抗体であり、これは、免疫治療（例えば、受動免疫治
療）に採用することができる。抗体とその製法および使用法は周知であり（Harl
ow, E.およびLane, D., "Antibodies・A Laboratory Manual", Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New Youk, 1988 ; Harlow, E.お よびLane, D., "Using Antibodies : A Laboratory Manual", Cold Spring Harb
or Laboratory Press, New York, 1998）、したがって、抗体およびその抗原結 合性フラグメントについては当業者には自明であろう。

【００１４】 該タンパク質またはその免疫原性フラグメントのヌクレオチド配列も治療用途
の基礎を与えるものである。例えば、該タンパク質またはその免疫原性フラグメ
ントをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡワクチンの製法に用いられること
ができる（Montgomery, D.L.他、1997, Pharmacol. Ther., 74 (2) : 195-205 ;
Donnelly, J.J,他、1997, Annu. Rev. Immunol., 15 : 617-648 ; Manickan, E
.他、1997, Crit, Rev. Immunol., 17 (2) : 139-154）。リボザイムやアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドのような他の中和剤も当業者には自明であろう。

【００１５】 このようにして、本発明は、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法において、
ブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質、その免疫原性フラグメント、ならびに、それ
らに特異的な結合剤および中和剤を使用することも提供する。また、それらを使
用することを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法も提供する。さ
らに、それらを使用することから成る、人間または動物の身体の治療方法も提供
する。薬剤の用量は、標準的な用量（服量）−反応実験により容易に決定するこ
とができる。薬剤上許容できるキャリア、稀釈剤または賦形剤を含むこともでき
る（Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia, 1984, Mack
Publishing Company, Easton, PA, USA参照）。

【００１６】 上述したように、本発明の該ＡＢＣ輸送タンパク質、その免疫原性フラグメン
ト、それらに特異的な結合剤および結合剤は診断にも有用であり、したがって、
本発明は、ブドウ球菌に対する診断テストキットの製造におけるそれらの使用に
も関する。さらに、ブドウ球菌の診断テスト方法におけるそれらの使用も提供す
る。

【００１７】 本発明に従えば、さらに、ブドウ球菌感染の診断テスト方法であって、 ｉ）ブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメントをサン
プルと反応させる工程； ｉｉ）抗原−抗体反応を検出する工程；および ｉｉｉ）該抗原−抗体反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を
含む方法が提供される。

【００１８】 さらに、本発明に従えば、ブドウ球菌感染の診断テスト方法であって、 ｉ）本発明に従うＡＢＣ輸送タンパク質に対する抗体またはその他の結合剤を
サンプルと反応させる工程； ｉｉ）結合剤−標的結合反応を検出する工程；および ｉｉｉ）結合剤−標的結合反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工
程を含む方法が提供される。

【００１９】 サンプルは、例えば、患者の血漿またそれらのフラクション（画分）、例えば
血清もしくは抗血清である。上記の診断テスト方法は、例えば、患者のブドウ球
菌感染を調べるためのものであり、サンプルとして患者サンプルを用い、上記の
相関を調べることにより患者のブドウ球菌感染を判定する。

【００２０】 さらに、本発明に従えば、本発明に従う診断テスト方法を実施するための診断
テストキットが提供される。この診断テストキットは該キットを用いる診断テス
トを行うための使用説明（書）を含むこともある。

【００２１】 本発明に従えば、さらに、本発明に従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質、そ
の免疫原性フラグメント、結合剤または中和剤を使用することを含むブドウ球菌
感染の治療方法または診断方法が提供される。 本発明は、ブドウ球菌感染の診断および治療を示す以下の記述から更に明らか
になるであろうが、それらの記述は単に例示のためのものである。

【００２２】

【実施例】

各種グループの患者の血液および創傷培養物由来のＭＲＳＡ血清を用いて実験
を行なった。各グループから抗原抽出物を調製し、患者の抗血清によりスクリー
ニングを行なった。これによって６７ｋＤａの抗原を取得し、さらに、ＥＲＳＡ
の流行株から構築された発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、目
的のタンパク質を取得した。次いで、エピトープマッピングにより該タンパク質
の抗原領域を確認し、さらに実験を行なうことにより治療効果の可能性のあるエ
ピトープおよび該エピトープを有するペプチドを明かにした。

【００２３】 イムノブロッティング バクテリア株 ＥＲＳＡの流行株（ＥＭＲＳＡ）は、Manchester Royal Infim
ary (MRI)のClinical Microbiology Laboratoryから入手した。この菌株は、バ ンコマイシンおよびリファンピシンに感受性であるので、ＥＭＲＳＡ（ＶＳＲＳ
）と呼ぶ。リファンピシン投与によりインビボでリファンピシン耐性が誘起され
た患者から、このクローンの単離物を得た（ＶＳＳＲ）。

【００２４】 血清グループ グループ１：バンコマイシンおよびリファンピシンによる全身治療を必要とする
感染患者由来（痰または創傷）（ｎ＝３）。単離物は常にリファンピシン感受性
。 グループ２：バンコマイシンおよびリファンピシンによる全身治療を必要とする
患者由来（陽性血液培養物）（ｎ＝３）。単離物は常にリファンピシン感受性。 グループ３：リファンピシン耐性クローンを持つ糖尿病患者の脚潰瘍コロニー由
来（ｎ＝３）。全身治療なし。 グループ４：バンコマイシンおよびリファンピシンで治療された敗血症患者由来
（陽性血液培養物）（ｎ＝３）。菌は治療中にリファンピシン耐性となった。

【００２５】 バンコマイシン耐性ＥＭＲＳＡの調製 上記のＶＲＲＳおよびＶＳＲＲの単一コロニーを、１０ｍｌの栄養培地ナンバ
ー２（英国Oxoid製）にバンコマイシン１μｇ／ｍｌとともに接種し、振盪下に ３７℃でインキュベートした。培地が濁状を呈したときに、４滴（１２０μｌ）
を、2μｇ／ｍｌのバンコマイシンを含有する別の培地１０ｍｌに接種した。こ の培地が濁状を呈したら、該培養物１２０ｍｌを３μｇ／ｍｌのバンコマイシン
を含有する別の培地に接種した。この操作を繰り返すことにより、バンコマイシ
ン濃度を４，５，６，７，８μｇ／ｍｌという具合に漸次増加させ、最後に、Ｅ
ＭＲＳＡ１５については２２μｇ／ｍｌ、そしてリランピシン耐性ＥＭＲＳＡに
ついては１６μｇ／ｍｌとなるようにした。これらの新しいクローンをそれぞれ
、ＶＳＲＲおよびＶＲＲＲと指称した。 ４ヶの１リットルフラスコ（それぞれ、５００ｍｌの栄養培地ナンバー２を含
有する）に、バンコマイシンに対して高い耐性を有する培養物を接種した。リフ
ァンピシン感受性菌株については３０μｇ／ｍｌとし、また、リファンピシン耐
性単離物については２０μｇ／ｍｌとなるようにした。

【００２６】 バンコマイシン分析用培地サンプルの採集 殺菌処理した５ｍｌピペットを用いて、上記培地にバンコマイシンを添加した
後、フラスコを静かに振盪した。殺菌処理した新しいピペットで培地サンプル（
１ｍｌ）を取り出した後、フラスコにテスト用バクテリアを接種した。該サンプ
ルはバンコマイシンを分析するためにClinical Microbioloy Laboratoryに送っ た。 各フラスコは、培地が濁状を呈するまで、振盪下に３７℃でインキュベートし
た。殺菌処理したピペットを用いて安全キャビネット内で培地サンプル（２ｍｌ
）を取得した後、細胞をハーベストした。該サンプルは、１３，０００ｒｐｍで
１０分間遠心した。沈渣はHibitaneに廃棄し、上清はMillipore０．２２μｍフ ィルターを用いてろ過してからバンコマイシンの分析のために送った。リンファ
ピシン感受性菌株の値は、接種の開始時には２７．１μｇ／ｍｌであり終了時に
は８．１μｇ／ｍｌであった。リンファピシン耐性クローンのそれらの値は、２
０．７μｇ／ｍｌおよび７μｇ／ｍｌであった。

【００２７】 細胞のハーベスト 安全キャビネット内で次の工程を実施した。ハーベスト時に各培養物からの血
液寒天純度のプレートを調製して培養物が汚染されていないことを確認した。３
５００ｒｐｍで１５分間遠心を行なうことによりインキュベート後、細胞をハー
ベストした。上清はHibitaneに廃棄した。沈降物を無菌塩水で２回洗浄し、各洗
浄後３５００ｒｐｍで１５分間遠心した。

【００２８】 バイオＸ−プレス細胞分解装置を用いる細胞の溶解 使い捨て用プラスチックピペットを使用して、組み立て式バイオＸ−Press分 解装置（Bio X-Press disintegrator：スウェーデンのBrommaにあるLKB Instrum
ents製）の空のシリンダー内にハーベスト後の細胞を投入し、二次プランジャー
をその平面側が下方を向くように配置した。ピストンを僅かな抵抗が感知される
まで押入した。次に、これら全体をプラスチック製ラップで覆い、横にして細胞
を含有するシリンダーの液位を上昇させ、−２０℃で一晩放置した。油圧プレス
に手動式の油圧ポンプを取り付けネジ付きのカラーを指で締めた。凍結した分解
装置からラップを外して、プレス上で垂直に配置して分解装置のピストンがプレ
スの上面を向くようにした。ピストンの上面にプラスチック製サポートを配置し
て該サポートがピストンの中央にあるようにし、プラスチック製サポートが上昇
してプレスの上面に到達するまでハンドルをゆっくりと押し、多数の「破裂音」
が聞こえるようになるまでこれを続け（但し、圧力計の針が赤色領域に入らない
ようにした）、ピストンが全距離を移動したときにポンプのレバーを回して圧力
を解放した。 分解装置を取り外し、スパチュラを用いて分解した細胞をすくい殺菌処理した
容器に入れた。この細胞を３５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り出し、
ペレット分は廃棄した。上清は後に適当な濃度でドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用した。

【００２９】 ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置とゲルの調製 この手法を利用するのに以下の器具を用いて２つのゲルを作製した：サイドク
ランプ４個、短ガラスプレート２個、長ガラスプレート２個、プレートセパレー
タ４個、ゴム製基板２個および基板クランプ１個。 各ゲルを調製するため、ガラスプレート対（短ガラスプレートおよび長ガラス
プレート）の側部をクランプで止めた。２つのプレートの間にプレートセパレー
ターにより隙間をつくった。これらのプレートをゴム製基板シール上に配置し基
板クランプ内に固定した。サイドクランプの矢印の少し上のレベルまで蒸留水を
注入した。この水位をフェルトペンでマークを付けておき、数分間放置して漏れ
が無いことを確認した。その後、傾けて水を捨てた。

【００３０】 短ガラスプレートの頂部から４ｃｍ下方にマークを付けた。この高さになるま
で解離用ゲル混合物を注入した。プラスチック製ピペットを用いて該ゲル混合物
の上部に蒸留水の層を添加し、室温下に６０分間放置して硬化させた。硬化後、
解離用ゲルの上にある蒸留水層を流し出し、１０ウエルのコームを２つのガラス
プレーと間に４５度の角度で挿入した。気泡が発生しないように注意しながらピ
ペットを用いて約５ｍｌのスタッキングゲル混合物を添加し、コームを挿入し中
央に動かし、さらにゲル混合物を添加してプレートの上部からあふれるように満
たし、３０分間放置して硬化させた。このようにして得られたゲルは同じ日に使
用するか、または、解離用ゲルの頂部とコームをプラスチック製のラップで覆い
冷室で貯蔵する。 ゲルの使用に当たってはコームを静かに取り除き、ウエルを電気泳動用バッフ
ァーで３回洗浄した。ウエルの底に残っている電気泳動用バッファを注射器で取
り除いた。ゲルを含有しているガラスプレートを基板クランプから取り外し、タ
ンクホルダーに締結して電気泳動タンクに沈めた。

【００３１】 試料の調製と装入 試料の調製は１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管内で行った。ゲルに通す各サ
ンプルの合計量２５μｌ（抗原滴定の結果に従い蒸留水で希釈したもの）をクラ
ッキングバッファー２５μｌと混合した。さらに、２０μｌのレインボー（ＲＴ
Ｍ）着色タンパク質分子量マーカー（英国BuckighamshireのAmersham Internati
onal製）に合計２０μｌのクラッキングバッファーを添加した。 クラッキングバッファー中の試料およびマーカーを適当な容器内で２〜３分間
煮沸した。次にギルソンピペットを用いて、２５ｍｌのマーカーを１つのウエル
に、また、５０μｌの各サンプルをそれぞれ適当なウエルに注意深く装入した。

【００３２】 試料が別の試料内に流入しないように注意しながら、プラスチック製ピペット
を用いてサンプル上に電気泳動バッファーを積層した。ガラスプレート間に残存
するスペースに電気泳動バッファーを満たし、中央タンクはタンクの頂部から約
２ｍｍ下方になるように該バッファーを満たし、冷却水を流し始めた。タンクの
ふたを交換し、装置のスイッチを入れてゲル当たり４０〜５０ｍＡの定常電流を
流し、中央タンクに発生する気泡をチェックした。 ゲルの実験は、３時間または青いラインがプレートの底から約１ｃｍ上方にな
るまで行なった。 電気泳動の電源と水を停止した後、ガラスプレートを保有するホルダーをタン
クから取り出し、過剰の電気泳動バッファーを捨てた。ガラスプレートのセッテ
ィングを外し、プラスチック製サイドピース（プレートセパレーター）をてこに
してゆっくりとガラスプレートを互いに分離した。スタッキングゲルを除去した
後、分離用ゲルを取り外して銀染色またはトランスブロッティングに供した。

【００３３】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色 ポリアクリロアミド（解離用）ゲル内で分離されたタンパク質に、Daiichi Si
lver Stain-IIキット（日本のIntegrated Separation Systems製）を用いて染色
を行なった。抗原調製物の滴定で用いられたゲル、および、いろいろなインキュ
ベーション条件下で成長した生物中のタンパク質発現を比較するために使用した
ゲルをメーカーの指図書に従いこの方法で染色した。

【００３４】 イムノブロッティング 抗体応答を調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセルロース膜に転写され
た生物タンパク質に対して血清のブロッティングを行なった。抗ヒトＩｇＧまた
は抗ヒトＩｇＭコンジュゲートを添加した後、適当な基質を添加することによっ
て、血清中に存在するＩｇＧまたはＩｇＭ抗体が結合した該タンパク質のバンド
を可視化することができた。

【００３５】 トランスブロッティング 各ゲルについて必要とした材料は、プラスチック製ゲルホルダー（１対）、ス
コッチブライト２枚、ブロッティングペーパー４枚およびニトロセルロース膜１
枚である。 トランスファータンクをトランスブロッティングバッファーで部分的に満たし
、プラスチックホルダーのハンドルサイドをタンク内に配置した。回転運動を利
用して気泡をトラップしないように注意しながら２枚のスコッチブライトをホル
ダーに載せた。同様にして、スコッチブライトの上方に２枚のろ紙を配置した。
１５×１６．５ｃｍの大きさにカットされた1枚のニトロセルロース膜を一番上 に載せ、２０分間浸潤させた。

【００３６】 電気泳動電源および水（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）を停止した後、ガラスプレート
を含有するホルダーを電気泳動タンクから取り出した。ガラスプレートのセット
を外し、プラスチック製サイドピースをてこにしてガラスプレートを互いに分離
した。スタッキングゲルを除去した後、解離用ゲルをガラスプレートからゆっく
りと取り除いて残りのスタッキングゲルを除去した。浸潤後のニトロセルロース
膜の一番上に解離用ゲルを配置し、さらに、このゲルの上に２枚のブロッティン
グペーパーを配置した。プラスチック製ホルダーの片方をクリップで止め、この
ホルダー全体をトランスブロッティングタンク（米国San FranciscoのHoefer Sc
ientific Instruments製Transport Power Lid）に沈めた。タンクの蓋を交換し 冷却水を開始した。この装置を最大出力で４５分間運転した。 トランスブロッティングが終了したら、電流のスイッチを切り冷却水を停止し
た。ホルダーを取り外しゲルとニトロセルロース膜を取り出した。膜を鋭利なメ
スでゲルの大きさに切り、３％のＢＳＡ（米国セントルイスのSigma Chemical社
製）１００ｍｌに入れ４℃で一晩放置した。

【００３７】 抗体のプロービング、コンジュゲーションおよび染色 ガイドとして１０ウエルのコームを用いてニトロセルロースの頂部および底部
にマークをつけた。メスと定規を用いて膜を幾つかのストリップに切断した。そ
れらのストリップをストリップボックスに配置し、各ストリップを３％ＢＳＡ（
一晩ニトロセルロース膜を貯蔵した３％ＢＳＡを用いた）３．８ｍｌで被覆した
。各ストリップについて、イムノブロッティングを行なう血清２００ｍｌ（全量
）を添加し、血清を２０倍に希釈した。これらのストリップをロータリーシェー
カー上で室温下に２時間インキュベートした。

【００３８】 洗浄液を用いストリップを５回洗浄（各回６分間）した。ストリップに、１０
００倍希釈（３％ＢＳＡで希釈）抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭアルカリホス
フェートコンジュゲートを添加し、室温下に１時間振盪した。前記と同様に各ス
トリップを５回洗浄した。一方、ＮＢＴ（ニトロ−ブル−テトラゾリウム）およ
びＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）粉末のそ
れぞれ０．０５ｇに１ｍｌのＤＭＦ（ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド）を添加す
ることによりＮＢＴおよびＢＣＩＰを調製した。使用の直前に６６０μｌのＮＢ
Ｔおよび３３０μｌのＢＣＩＰを１００ｍｌのアルカリホスフェート基質バッフ
ァーに添加した。この溶液５ｍｌを各ストリップに添加して充分に染色が行なわ
れるようにした（約５〜１５分間）。次に、それぞれのストリップを蒸留水で洗
浄することにより反応を停止させ、ブロッティングペーパー上に配置して乾燥さ
せた。

【００３９】 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のゲノムライブラリーの調製およびスクリーニ ング YoungおよびDaviesらの記述（1983, PNAS USA, 80 : 1194-1198）に従い、発 現／クローニングベクター、ラムダＺＡＰエクスプレス内にゲノムライブラリー
を構築した。臨床単離物由来の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ａにより部分分解し、２
〜９ｋｂｐのサイズ範囲にあるフラグメントを上記ベクターに挿入して、βガラ
クトシダーゼ融合タンパク質を得た。ＩｇＧ抗体で各ライブラリーをスクリーニ
ングし、血液培養物陽性の敗血症から回復した患者由来のＥＭＲＳＡ（１００倍
希釈）の６７ｋＤａのバンドに陽性なものを検出した。陽性クローンの検出はア
ルカリホスフェートとコンジュゲート（複合化）したヤギ抗ヒト免疫グロブリン
（ＩｇＧ）（５０００倍希釈）（英国PooleのSigma製）を用いて行なった。Huyn
h, YoungおよびDavies ( 1985, DNA cloning vol 1, a practical approach, IR
L Press Oxford, p49-78, Ed. D.M. Glover)に従い、大腸菌Y１０８９での陽性 クローンからリソゲンを調製した。Lyonらの記述（1986, PNAS USA, 83 : 2989-
2993）に従い抗原選択により、各陽性クローンによって発現されたエピトープを
同定した。このために、陽性の組換えラムダプラークでハイブリダイズすること
により）血清をアフィニティ精製した。次に、結合した抗体をグリシンバッファ
ー（ｐH２．８）で溶出させ、関連するバクテリアのライゼートをイムノブロッ ティングするのに用いた。

【００４０】 ＤＮＡ配列決定 Ｔ３およびＴ７をフォワードプライマーおよびバックプライマーとするＰＣＲ
を用いて、血清陽性クローン由来のインサートＤＮＡを増幅した。これをＴＡク
ローニングシステム（バージョン１．３、英国Oxong Invitrogen社製）にサブク
ローニングした後、ジデオキシターミネーション法（シーケンスバージョン２．
０キット、英国CambridgeのUnited States Biochemical社製）を用いてＤＮＡシ
ークエンシングを行なった。当初のシークエンス反応はユニバーサルプライマー
を用いて行い、残りの配列は、プライマー歩行法を用いシークエンスプライマー
を逐次合成して新しい配列データを得ることにより決定した。

【００４１】 結果 イムノブロッティング 銀染色した抗原抽出物（ＶＳＲＳ、ＶＲＲＳ、ＶＳＲＲおよびＶＲＲＲ）は、
４つとも同じパターを生じた。イムノブロッティングによって、見かけの分子量
が２７から１４０ＫＤａの抗原バンドが確認された（表１および２）。

【００４２】 ４つのグループのいずれの患者も６７ＫＤａの抗原に対する抗体を生じた。特
に、血液培養物が陽性の感染を示してバンコマイシンによる治療が必要とする患
者についてこのことが該当した。グループ４においては、さらに、２人の患者か
ら続発性血清も入手され、いずれも回復時には該抗原に対する抗体レベルが増大
していた。この抗原は、４種類の抗原抽出物のいずれにも存在していた。ＩｇＧ
は、リファンピシン耐性株のいずれにも存在していた。ＩｇＧは、リファンピシ
ン耐性株に因る敗血症からの生存患者の血清中には存在したが、リファンピシン
感受性敗血症から回復した患者の血清中には存在しなかった。

【００４３】 次に、６７ＫＤａの抗原に陽性の血清を用いて、ＥＭＲＳＡ由来の発現ライブ
ラリーのスクリーニングを行なった。２つの陽性クローンが得られた。ＥＭＲＳ
Ａ流行株の保存６７ｋＤａに反応した両クローンは１つのエピトープを有するこ
とが抗原選択により示された。配列分析により、βガラクトシダーゼ遺伝子との
フレーム内に部分配列が示された。挿入サイズの全長は４．５Ｋｂであった。こ
のようにして得られたアミノ酸配列は、３つのＡＴＰ結合性ドメインを有するタ
ンパク質を産生し、また、ＡＢＣ輸送タンパク質に属するタンパク質群にホモロ
ジーを有していた（FathおよびKilter, 1993, Microbiological Reviews 37, 99
5-1017）。これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１３３位のアミノ酸から始まるタ
ンパク質のＣ末端であった。黄色ブドウ球菌ＮＴＣＣゲノム配列プロジェクトデ
ータベースでこの配列を検索したところ、コンティグ1184、1177および1158にマ
ッチングし、配列が部分的にオーバーラップしていた。これによって、該タンパ
ク質をコードする全遺伝子をクローニングするためのＰＣＲプライマーを合成す
ることができた。

【００４４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＮＯ：１６を有するＰＣＲプライマー（それ
ぞれ、フォワードプライマーおよびバックプライマー）を用いて、精製後のＥＭ
ＲＳＡ ＤＮＡから全長のＡＢＣ輸送タンパク質が得られた。

【００４５】 ｐＢＡＤ−ＴＡ−ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen製）によりｐＢＡ
Ｄベクターに上記の全遺伝子をクローニングし、大腸菌内で発現させた。発現後
、アフィニティクロマトグラフィーを用いて該タンパク質を精製し、生の（ネー
ティブ）構造のタンパク質を得た。Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Qiagenから入手）を
用いてカラムを作製し、タンパク質のN末端のＨｉｓタグを結合するようにした 。２５０ｍＭのイミダゾールによりカラムからタンパク質を溶出させ、最終タン
パク質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。 ウサギに該ＡＢＣ輸送タンパク質を注射（０．５ｇをフロイントの完全アジュ
バントに溶かしたものを注射、１４日後に再注射し、その後、フロイントの不完
全アジュバントに溶かしたものを２週間毎に注射）することによりポリクローナ
ル抗血清を調製した。出血前および出血後血清（２８日後に入手）を１００倍希
釈したＥＭＲＳＡ流行株由来のプレゼートにイムノブロッティングした。この結
果、みかけの分子量６７および３３ｋＤａの抗原に血清転換していることが示さ
れた。 このことからも、６７ｋＤａのブドウ球菌抗原の存在が確認された。

【００４６】 エピトープマッピング Geysen H. M.他による記述に従い（Journal of Immunological Methods, 102
: 259-274）、エピトープスキャンニングキット（英国CambridgeのCambridge Re
search Biochemicals製）の試薬を用いポリエチレンピン上に、上記のように得 られたアミノ酸配列の残基１３５〜５３３をカバーし互いにオーバーラップする
一連のノナペプチドを合成した。すなわち、ペプチド１は残基１から９から成り
、ペプチド２は残基２から１０から成るという具合にした。ＥＬＩＳＡにより、
患者血清（２００倍希釈）に対する各ペプチドの反応性（ＩｇＧ）を測定した。
データは、３０分のインキュベーション後のＡ４０５として示した。調べたのは
、重要な臨床部位のＥＭＲＳＡコロニー形成を伴う患者由来の血清〔慢性の外来
患者透析液、感染後（ｎ＝２）；感染した断端、感染後（ｎ＝３）、血液培養物
は陰性だが全身的なバンコマイシン治療を要したもの；バンコマイシンおよびリ
ファンピシンによる治療に成功したＥＭＲＳＡに因る敗血症（感染後、ｎ＝３）
；ＥＭＲＳＡに因る致命的敗血症（ｎ＝４）〕および存院患者によるコントロー
ル血清（ｎ＝２）である。

【００４７】 間接ＥＬＩＳＡ 上述のようにして得られた３つのエピトープを選び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
〜ＮＯ：５）、それらを表わすペプチドをＢＴ７４００マルチプルペプチドシン
セサイザー（英国LutonのBiotech Instruments製）により合成し、間接ＥＬＩＳ
Ａに用いた。

【００４８】 血清 グループＡ ：ＥＭＲＳＡコロニー形成または感染が認められない（ｎ＝１２）。グループＢ ：臨床的に重要な部位においてＥＭＲＳＡによりコロニー形成した患
者。慢性の外来患者透析液（ｎ＝２）または断端部位（ｎ＝２）で、全身的なバ
ンコマイシン治療が必要とするもの。グループＣ ：バンコマイシン治療されたＥＭＲＳＡに因る敗血症から生存した患
者（ｎ＝３）。グループＤ ：ＥＭＲＳＡに因る敗血症で死亡した患者（ｎ＝３）。

【００４９】 マイクロタイタープレートにペプチドを単純吸着させることにより各ペプチド
について以下の操作を実施した。０．０１Ｍのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）
２ｍｌ、ｐＨ７．２にペプチドを溶かし、同じバッファーで濃度１０μｇ／ｍｌ
（１／１００）に希釈した。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３およびＮＯ：１３を有するペプチド４およびペプチ
ド５については間接ＥＬＩＳＡも実施した。異なる臨床歴を有する全部で３９の
血清を用いた。

【００５０】 血清 グループＥ ：ブドウ球菌の感染またはコロニー形成が認められない１２人の患者
由来の１２の血清。グループＦ ：リファンピシン耐性クローンによりコロニー形成が認められた糖尿
病および脚潰瘍患者３人由来の３つの血清。グループＧ ：バンコマイシンおよびリファンピシンの全身治療を必要とし、静脈
線、唾液または創傷スワブの培養物が陽性であった１４人の患者由来の１４の血
清。グループＨ ：血液培養物陽性の敗血症から回復した患者由来の７つの血清。グループＩ ：抗体治療にもかかわらずＭＲＳＡ感染（血液培養物が恒常的に陽性
であったことから証明）で死亡した患者由来の３つの血清。

【００５１】 （１）ペプチド（０．０１ＭのＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ）の１５０μｌのア
リコートをピペットでFalcon３９１２ミクロプレートアッセイプレートのウエル
内に注入し、４℃で一晩インキュベートした。 （２）０．０１MのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶かした０．０５％Tween２０で４
回（４×１０分）洗浄することにより非結合ペプチドを除去した。 （３）２％スキムミルク−１０％ＦＣＳ（０．０１ＭのＰＢＳ中）を用い１時
間、３７℃でプレートのブロッキングを行なった。 （４）０．０５％Tween２０（０．０１MのＰＢＳ中）でプレートを４回（４×
１０分）洗浄し、ミクロアッセイプレートのウエルに被検血清（ブロッキング溶
液で１００倍希釈）を添加し（各血清について３ヶのウエルを使用）、３７℃で
２時間インキュベートした。 （５）０．０１ＭのＰＢＳに溶かした０．０５％Tween２０でプレートを４回 （４×１０分）洗浄し、二次抗体である抗ヒトＩｇＭ（またはＩｇＧ）ペルオキ
シダーゼコンジゲート（ブロッキング溶液で１０００倍希釈）を添加し、３７℃
で１時間インキュベートした。 （６）０．０５％Tween２０（０．０１MのＰＢＳ中）でプレートを４回（４×
１０分）洗浄し、さらに、０．０１Ｍ ＰＢＳで洗った。次に、０．０１％（ｗ
／ｖ）の過酸化水素を含有するｐＨ４．０クエン酸に溶かした０．５ｍｇ／ｍｌ
の新たに調製した２．２−アジノ−ビス[３−エチルベンズ−チアゾリン−６− スルホン酸]ジアンモニウム（ＡＢＴＳタブレット）中で該プレートを室温下に 攪拌しながら４５分間インキュベートした。 （７）各プレートにコントロール（対照）ウエルを用いた。ＡＢＴＳ溶液のみ
を有する３ヶのウエル、およびＡＢＴＳに加えて抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼコンジゲートのみを有する3ヶのウエルを用いた。 （８）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Titertek Multiscan）を用い波長４０５
ｎｍにおける光学密度（O.D.）測定を行った。 （９）１つの患者血清に対して３ヶのウエルの示値の平均値を求めた。 上述のプロトコールに従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の配列を有するペプチ
ド６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）に対するポリクローナルウサギ抗血清を作製
することにより該ペプチド６の免疫原性を試験した。クローニングし発現された
上記のＡＢＣ輸送タンパク質について出血前および出血後血清を用いてイムノブ
ロッティングを行ったところ、６７ｋＤａ抗原への血清転換が示された。

【００５２】 ファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびＳｃＦｖの調製 Matthews, R. C.他による記述（1995, J. Infect. Dis., 171 : 1668-1671） に従って、ファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびＳｃＦｖを作製した。
略述すると、Ficoll上でヘパリン処理した血液２０ｍｌを分離することにより、
ＥＭＲＳＡから回復した患者から末梢血リンパ球を入手した。チオシアン酸グア
ニジニウムによりＭＲＮＡを抽出し、次いで、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラ
ム（Quick Prep mRNA；英国St. AlbansのPharmacia製）で精製した。トリ骨髄芽
細胞症ウイルス逆転写酵素（英国CambridgeのBiotechnology製）を用い、ヒトＩ
ｇＧのＨ鎖（HulgG1-4）（Matthews, R.C.他、1994, Serodiagn. Immnother. In
fect. Dis., 6 : 213-217）の４つのサブクラス全てについて不変部による１st ストランドｃＤＮＡ合成を行なった。ファミリー分析に基づくフォワードプライ
マー（ＨｕＪＨ１−６）およびバックプライマー（ＨｕＶＨ１ａから６ａ）を用
いて一次ＰＣＲによりＨ鎖可変ドメイン遺伝子を増幅した。ＶＨ３ａを用いて逆
方向に調製した生成物の上流にＳｆｉ１制限部位を導入した後、軽鎖可変ドメイ
ン遺伝子のプールに組み入れた。更にリンカーフラグメント（Ｇｌｙ₄ ＳＥＲ₃ ）および下流にＮｏｔ１部位を導入したＳｆｉ１およびＮｏｔ１制限酵素部位を
利用して、生成物をファージミドベクターに一方向クローニングした。このよう
にライゲーションしたベクターをエレクトロポーレションにより大腸菌ＴＧ１内
に導入し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Pharmacia）を用いてファージをレ スキューした。抗原特異的なＳｃＦｖを増幅するため、エピトープマッピングで
示されるエピトープの２つを表わすペプチド、すなわちペプチド１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：６）およびペプチド２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）についてファージ
ライブラリーのパンニングを行なった。このパンニングは、それぞれのペプチド
が被覆されたイムノチューブ内で実施した。ｌｏｇ相大腸菌ＴＧ１を用いて、結
合したファージを溶出させた。Ｍ１３Ｋ０７によるレスキュー後、ファージを更
に３回、ペプチドについて再パンニングした。ＢｓｔＮ１（英国HiychenのNew E
ngland Labs製）を用いるＤＮＡフィンガープリント法により、各パンニング後 の特異的ＳｃＦｖの増幅を確認した。

【００５３】 動物実験 実験１ ３０匹のメスのＣＤ１マウスに、ＩＶ注射により、２×１０⁶ｃｆｕ（コロニ ー形成単位）のＥＭＲＳＡ丸剤を投与した。２時間後、Ｍ１３Ｋ０７（１２．２
×１０⁸ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）、ファージ１２（２×１０⁸ファ
ージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）またはファージ１６（３．１６×１０⁶ファ ージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）を投与した。注射日を１日目としたときの注
射後３日目および７日目に、腎臓、肝臓および脾臓のコロニー数を測定した。

【００５４】 実験２ ３０匹のメスのＣＤ１マウスのそれぞれに、３×１０⁷ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸 剤１００μｌを投与した。２時間後、陰性ファージスーパーライブラリー（７×
１０¹⁰ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）、ファージ１２（９×１０⁷ファ ージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）またはファージ１６（５×１０⁶ファージ、 ２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）を投与した。１日目および２日目に、腎臓、肝臓お
よび脾臓のコロニー数を測定した。

【００５５】 実験３ ４８匹のメスのＣＤ１マウスのそれぞれに、２×１０⁶ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸 剤１００μｌを投与した。２時間後、陰性ファージ（１０⁸ファージ、２００μ ｌ丸剤、ｎ＝１２）、ファージ１２（１０⁸ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１ ２）またはファージＸ（１０⁷ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）またはフ ァージ（１０⁶ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）。マウスの半分を殺し第 ２回目のファージ投与を行なった。残りのマウスは２日目に殺した。

【００５６】 実験４ ４５匹のメスのＣＤ１マウスに、２×１０⁷ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸剤１００μ ｌを投与した。２時間後、陰性ファージ（２．５×１０⁷ファージ、２００μｌ 丸剤、ｎ＝１５）、ファージＸ（３．３×１０⁶ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ ＝１５）またはファージ１６（１．３×１０⁶ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝ １５）を投与した。各グループについて５匹のマウスを殺し２回目にコロニーの
数を測定し、また、各グループについて残りの１０匹を殺し3日目にコロニー数 を測定した。

【００５７】 結果 エピトープマッピング ＡＢＣ輸送タンパク質の１３５〜５３３位の残基の中から、ＥＭＲＳＡ敗血症
に対して患者を治療するのに有効な７つの領域がエピトープマッピングにより確
認された。３つ以上の連続したウエルの平均光学密度が在院コントロールの値お
よび死亡した敗血症患者の値よりも大きい（標準偏差で少なくとも２）ときに、
その領域がエピトープを有するものとした。オーバーラップするアミノ酸配列の
誘導は、最初のペプチド配列および最後のペプチド配列を比較することにより行
なった。コロニー形成した患者由来の血清は、それらのエピトープの幾つかにつ
いても陽性であった。

【００５８】 間接ＥＬＩＳＡ ペプチド１〜３についての結果は表４に示されている。ペプチド４および５に
ついての結果は表１０に示されている。

【００５９】 結論 コロニー形成した患者（グループＢ）は、ペプチド２よりもペプチド１および
３を認識した。ペプチド３は最も免疫原性が低かった。ペプチド２に対するＩｇ
Ｇは、敗血症から生存した患者（グループＣ）に見出されたが、コロニー形成し
た患者（グループＢ）および死亡した患者（グループＤ）には見出されなかった
。ペプチド４および５について得られた結果は、ペプチド４および５の両方に対
する抗体と全身性感染からの生存との間に明らかな相関があることを示している
。

【００６０】 組換えヒト抗体 これらのペプチド類を用いてファージ抗体ディスプレイライブラリー（上述）
のパンニングを行なった。Ｈ鎖可変ドメイン遺伝子のファミリーを一次ＰＣＲで
増幅したところ、ＶＨ３ａのみが増幅され、軽鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリ
ーに組み込まれた３３０ｂｐの生成物を生じた。パンニング前のＰＣＲ増幅Ｓｃ
ＦｖインサートのＢｓｔＮフィンガープリントは、きわめて雑多なライブラリー
を示した。ペプチド１に対してパンニングした後は２種類のＢｓｔＮ１フィンガ
ープリント（ＸおよびＹ）が優勢となり、ペプチド２についてパンニングした後
は、さらに２種類のＢｓｔＮ１フィンガープリント（１２および１６）が優勢と
なった。これらを動物実験に選択した。

【００６１】 動物実験 実験１：コロニー数は表５にまとめている。クローン１２を投与したグループ
で２匹のマウス、また、クローン１６を投与したグループで１匹のマウスが１日
目に自然死した。 結論：３日目におけるＭ１３Ｋ０７（陰性コントロール）は腎臓については類
似の結果を与えたが、肝臓および脾臓はクローン１２および１６によって活性を
示した。７日目においてＭ１３Ｋ０７およびクローン１６は類似の結果を与えた
が、クローン１２はＭ１３Ｋ０７よりも腎臓、肝臓および脾臓について少ないコ
ロニー数を示した。

【００６２】 実験２：コロニー数は表６にまとめている。 結論：スーパーライブラリー（陰性コントロール）はクローン１６に対しては
類似の結果を与えた。クローン１２のコロニー数は、腎臓および脾臓（１日目）
また、脾臓および肝臓（２日目）について低くなっている。

【００６３】 実験３：コロニー数は、表７および表８にまとめられている。 結論：陰性ファージは、１日目においてファージ１２（腎臓、肝臓）およびフ
ァージＸ（肝臓、脾臓）に、また、２日目においてファージＸ（肝臓、脾臓）に
類似のコロニー数を示した。ファージＹは、恒常的に陽性であり、また、２日目
の腎臓におけるコロニー数を除きファージ１２よりも陽性であった。

【００６４】 実験４：コロニー数は表９にまとめている。 結論：陰性ファージは、３日目においてファージＸ（腎臓、脾臓）に、また、
２日目においてファージＹ（腎臓）に類似のコロニー数を生じた。その他のパラ
メータは、ファージＸおよびファージＹの治療効果についてはファージＹの方が
２日目および３日目のいずれにおいても活性が高い（但し、２日目の腎臓の場合
を除く）ことを示した。

【００６５】 まとめ ファージ１２、ＸおよびＹはいずれも治療活性を示し、ペプチド１〜５で表わ
されるエピトープが抗体治療用の標的として有用であることが確認された。

【００６６】

【表１】

【００６７】

【表２】

【００６８】

【表３】

【００６９】

【表４】

【００７０】

【表５】

【００７１】

【表６】

【００７２】

【表７】

【００７３】

【表８】

【００７４】

【表９】

【００７５】

【表１０】

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１１月１日（２０００．１１．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項３】 配列番号：２の配列に対して少なくとも８０％、９０％また
は９５％のホモロジーを有する、請求項１または２のいずれかに従うブドウ球菌
ＡＢＣ輸送タンパク質。

【請求項４】 人間または動物の治療または診断方法に用いられる、請求項
１〜請求項３のいずれかに従うブドウ球菌輸送タンパク質をコードするヌクレオ
チド配列。

【請求項５】 配列番号：１の配列を有する、請求項４に従うヌクレオチド
配列。

【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣの輸送タン
パク質の免疫原性フラグメントであって、配列番号：３〜１４、１７または１８
のいずれかの配列を有する免疫原性フラグメント。

【請求項８】 ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１〜７の
いずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメン
トの使用。

【請求項９】 ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１〜７の
いずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメン
トに特異的な結合剤または中和剤の使用。

【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タン
パク質またはその免疫原性フラグメントを使用することを特徴とする、ブドウ球
菌感染治療用薬剤の製造方法。

【請求項１１】 請求項１〜７のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タン
パク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な結合剤または中和剤を使用す
ることを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法。

【請求項１２】 中和剤がＤＮＡワクチン、リボザイムおよびアンチセンス
オリゴヌクレオチドから成る群のいずれかより選ばれる、請求項９または１１の
いずれかに従う使用または方法。

【請求項１４】 診断テストにおける、請求項１〜７のいずれかに従うブド
ウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはそれらに
特異的な結合剤もしくは中和剤の使用。

【請求項１５】 ブドウ球菌の診断のための診断テストキットの製造方法ま
たは診断テスト方法における、請求項１２または１３のいずれかに従うブドウ球
菌ＡＢＣ輸送タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはそれらに特異
的な結合剤もしくは中和剤の使用。

【請求項１７】 ブドウ球菌の診断テスト方法であって、 ｉ）請求項１〜７のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはそ
の免疫原性フラグメントに特異的な結合剤または中和剤をサンプルと反応させる
工程； ｉｉ）結合剤または中和剤−標的結合反応を検出する工程；および ｉｉｉ）該結合剤または中和剤−標的結合反応の検出結果をブドウ球菌の存在
と相関させる工程を含む方法。

【請求項１８】 結合剤が抗体であり標的が抗原である請求項１６または１
７に従う診断テスト方法。

【請求項１９】 請求項１６〜１８のいずれかに従う診断テスト方法であっ
て、患者のブドウ球菌感染の診断に用いられ、サンプルが患者由来のサンプルで
あり、患者のブドウ球菌感染との相関を判定する方法。

【請求項２０】 サンプルが患者由来の血漿、血清または抗血清である、請
求項１６〜１９のいずれかに従う診断テスト方法。

【請求項２１】 請求項１６〜２０のいずれかに従う診断テスト方法を実施
するための診断テストキット。

【請求項２２】 キットを使用して診断テストを行なうための使用説明を含
む、請求項２１に従う診断テストキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｃ０８５ 16/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/04 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/04 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/569 33/68 33/68 Ｃ１２Ｒ 1:44） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:445） Ｃ１２Ｒ 1:44） 1:45） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:45） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 AA28 CA26 CB21 DA12 DA13 DA20 DA36 DA77 FB03 FB04 4B024 AA01 AA13 BA50 BA80 CA01 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR48 QR56 QS33 QX02 4B064 AG01 AG27 BA17 CA19 CC24 DA01 DA15 4C084 AA13 NA14 ZB351 ZB352 4C085 AA03 BA13 CC07 CC32 DD62 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 EA29 EA52 FA74 HA06

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：２の配列またはその部分的な修飾形態を有しまた
   はそれらの免疫原性フラグメントから成り、人間または動物の身体の治療または
   診断方法に用いられるブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号：２の配列の部分的な修飾形態を有し、請求項１の
   ブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質のアレル変異体から成る請求項１に従うブドウ
   球菌ＡＢＣ輸送タンパク質。
3. 【請求項３】 人間または動物の治療または診断方法に用いられる、請求項
   １または請求項２に従うブドウ球菌輸送タンパク質をコードするヌクレオチド配
   列。
4. 【請求項４】 配列番号：１の配列を有する、請求項３に従うヌクレオチド
   配列。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣタンパク質
   または該タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ブドウ球菌が、ス
   タフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、 スタフィロコッカス・エピデルミヂス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス
   ・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・フィクス（S. hyic
   us）またはスタフィロコッカス・サプロフィチクス（S. saprophyticus）である
   もの。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣの輸送タン
   パク質の免疫原性フラグメントであって、配列番号：３〜１４、１７または１８
   のいずれかの配列を有する免疫原性フラグメント。
7. 【請求項７】 ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１〜６の
   いずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメン
   トの使用。
8. 【請求項８】 ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１〜６の
   いずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメン
   トに特異的な結合剤または中和剤の使用。
9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパ
   ク質またはその免疫原性フラグメントを使用することを特徴とする、ブドウ球菌
   感染治療用薬剤の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タン
    パク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な結合剤または中和剤を使用す
    ることを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法。
11. 【請求項１１】 中和剤がＤＮＡワクチン、リボザイムおよびアンチセンス
    オリゴヌクレオチドから成る群のいずれかより選ばれる、請求項８または１０の
    いずれかに従う使用または方法。
12. 【請求項１２】 ブドウ球菌の診断テストキットの製造方法における、請求
    項１〜６のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質もしくはその免疫原
    性フラグメントまたはそれらに特異的な結合剤もしくは中和剤の使用。
13. 【請求項１３】 診断テストにおける、請求項１〜６のいずれかに従うブド
    ウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはそれらに
    特異的な結合剤もしくは中和剤の使用。
14. 【請求項１４】 ブドウ球菌の診断のための診断テストキットの製造方法ま
    たは診断テスト方法における、請求項１１または１２のいずれかに従うブドウ球
    菌ＡＢＣ輸送タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはそれらに特異
    的な結合剤もしくは中和剤の使用。
15. 【請求項１５】 ブドウ球菌の診断テスト方法であって、 ｉ）請求項１〜６のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはそ
    の免疫原性フラグメントをサンプルと反応させる工程； ｉｉ）抗原−抗体反応を検出する工程；および ｉｉｉ）該抗原−抗体反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を
    含む方法。
16. 【請求項１６】 ブドウ球菌の診断テスト方法であって、 ｉ）請求項８に従う抗体またはその他の結合剤をサンプルと反応させる工程； ｉｉ）結合剤−標的結合反応を検出する工程；および ｉｉｉ）該結合剤−標的結合反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる
    工程を含む方法。
17. 【請求項１７】 結合剤が抗体であり標的が抗原である請求項１５に従う診
    断テスト方法。
18. 【請求項１８】 請求項１４〜１６のいずれかに従う診断テスト方法であっ
    て、患者のブドウ球菌感染の診断に用いられ、サンプルが患者由来のサンプルで
    あり、患者のブドウ球菌感染との相関を判定する方法。
19. 【請求項１９】 サンプルが患者由来の血漿、血清または抗血清である、請
    求項１４〜１７のいずれかに従う診断テスト方法。
20. 【請求項２０】 請求項１４〜１８のいずれかに従う診断テスト方法を実施
    するための診断テストキット。
21. 【請求項２１】 キットを使用して診断テストを行なうための使用説明を含
    む、請求項１９に従う診断テストキット。
22. 【請求項２２】 請求項１〜８のいずれかに従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タン
    パク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはそれらに特異的な結合剤もしく
    は中和剤を使用することを含む、ブドウ球菌感染の治療または診断方法。