CN112301041B

CN112301041B - 牛支原体p21蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112301041B
Application number: CN202011073306.1A
Authority: CN
Inventors: 陈曦; 郭爱珍; 刘东明; 智晔; 陈俊妮; 韦昊华; 陈颖钰; 胡长敏; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-10-09
Also published as: CN112301041A

Abstract

本发明公开了牛支原体Mbov_0461基因及其编码的蛋白，属于动物传染病防治与生物技术领域。申请人以牛支原体(M.bovis)HB0801株为模板，设计引物，克隆和表达了Mbov_0461基因编码的蛋白P21，验证其具有免疫原性和反应原性，此外，该蛋白还可黏附胚胎牛肺上皮细胞(EBL)以及与纤连蛋白(Fn)结合，确定该蛋白是一种黏附蛋白，并且抗重组蛋白P21(rP21)的多克隆抗体能明显抑制M.bovis黏附EBL细胞，黏附功能与细菌毒力相关，因此M.bovis P21蛋白也是一种毒力相关蛋白。鉴于以上特性，P21蛋白有望成为M.bovis疫苗、诊断和治疗制剂研发的重要候选靶标。

Description

牛支原体P21蛋白及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治与生物技术领域，具体涉及一种牛支原体P21蛋白及其在牛支原体疫苗、诊断试剂研发和致病机理研究中的应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)无细胞壁，属于柔膜体纲支原体属，是引起牛呼吸道疾病的重要病原之一，并导致多种临床病症，主要包括支气管肺炎、乳腺炎、关节炎、中耳炎、生殖道炎、腱鞘炎、脑膜炎、角结膜炎、流产与不孕等。该病原最早于1961年在美国由牛乳汁中分离得到，我国于2008年首次从患病牛肺脏中分离到M.bovis。目前，该病在世界范围内广泛流行，由于其致病机理仍然不十分清楚，致使本病现在仍无有效的防控手段，给养牛业带来重大经济损失，因此，深入研究M.bovis的致病机理，开发新型疫苗和诊断技术具有重要意义。

病原菌对宿主细胞表面的黏附是定植和随后疾病发展的重要先决条件，支原体缺乏细胞壁，细胞膜成分在组织定植和感染中直接与宿主细胞接触，在黏附中起重要作用。在微生物黏附素与宿主细胞受体之间的相互作用中，大多数致病性生物体会结合各种宿主细胞外基质成分，包括纤连蛋白(Fn)，胶原蛋白，弹性蛋白和层粘连蛋白等。Fn是一种高分子量的多功能糖蛋白，在体液中以可溶性二聚体形式存在，在细胞外基质中以不溶性多聚体形式存在。Fn结合蛋白(FnBPs)通过三明治模型促进细菌感染和入侵，其中Fn充当连接细菌黏附素与宿主细胞表面受体的分子桥。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的许多FnBP不仅有助于简单的细胞黏附，而且在细菌的毒性特性中也起着重要作用(Henderson等，2011)。因此，鉴定FnBPs对细菌发病机理研究具有重要意义。

大量研究表明，一些Fn结合蛋白基因的失活能显著降低细菌的黏附。此外，一些菌株中Fn结合蛋白基因失活后，毒力显著降低。黏附于宿主Fn，然后成功定植和侵入宿主靶细胞，也是M.penetrans，M.hyopneumoniae和M.gallisepticum等多种支原体的重要特征，在这些支原体中，黏附素是主要的毒力因子之一，并且黏附缺陷型突变体毒力是致弱的。

因此，M.bovis毒力相关蛋白的发掘有助于从蛋白质水平认识其与机体的相互作用关系，从而深入阐明该病的发病机制；此外，新的毒力相关蛋白有可能成为新型疫苗研发的靶标；同时，具有免疫原性和反应原性的蛋白可能成为该病的新型诊断标识。

发明内容

本发明的目的在于提供一种M.bovis P21蛋白，为研发新型疫苗、诊断和治疗制剂提供潜在的候选靶标。

为了实现本发明的目的，申请人以所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室分离的M.bovis HB0801株为模板，设计引物，克隆了Mbov_0461基因并表达了其编码的蛋白P21，验证其具有免疫原性和反应原性。此外，该蛋白还可黏附牛肺上皮细胞(EBL)以及与纤连蛋白(Fn)结合，是一种黏附蛋白，并且抗重组蛋白P21(rP21)的多抗能明显抑制M.bovis黏附EBL细胞。黏附功能与细菌毒力密切相关，因此，M.bovis P21蛋白是一种毒力相关蛋白，鉴于此，M.bovis P21蛋白是支原体疫苗、诊断和治疗制剂研发的重要候选靶标。

本发明的技术方案具体如下：

本发明首先以M.bovis HB0801基因组(GenBank登录号为CP002058)为模板克隆Mbov_0461基因。大肠杆菌与支原体的表达系统不同，支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌表达系统中被作为终止密码子，因此，含有UGA的支原体基因序列如果插入到大肠杆菌表达系统中，得到的基因表达产物是被截短的产物，为了在大肠杆菌中获得全长表达，需采用重叠延伸PCR方法，先将支原体中UGA碱基定点突变成在大肠杆菌中表达色氨酸的同义密码子UGG碱基，在Mbov_0461基因中共有1个UGA碱基对需要密码子突变。

经过人工突变后的Mbov_0461基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，长度为552bp；其中在该序列的384位发生等位基因突变。Mbov_0461基因编码的P21蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码184个氨基酸。

将Mbov_0461基因的核苷酸序列通过构建重组质粒pET-30a-Mbov_0461转化大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0461(Escherichia coli pET-30a-Mbov_0461)，该菌株在IPTG诱导下，表达P21蛋白。

经过验证，纯化的rP21蛋白具有免疫原性和反应原性，并且能够特异性黏附宿主EBL上皮细胞和结合细胞外基质成分纤连蛋白(Fn)。

具体内容详见实施例。

本发明具有以下优点：

1、M.bovis P21蛋白由M.bovis Mbov_0461基因编码，被发明人证实具有免疫原性和反应原性，可用于M.bovis抗体的检测，还可以通过制备抗rP21蛋白多克隆抗体或单克隆抗体，用于M.bovis抗原的检测。

2、rP21蛋白能与牛肺上皮细胞(EBL)和纤连蛋白(Fn)特异性结合，表明M.bovisP21蛋白是一种黏附相关蛋白，与牛支原体的毒力相关，抗P21蛋白多克隆抗体能竞争性抑制M.bovis与受体结合，从而减少M.bovis的黏附，降低M.bovis的致病性。因此可利用该抗体制备M.bovis治疗制剂，也可构建P21蛋白缺失减毒株，作为疫苗候选菌株。

序列表说明：

SEQ ID NO：1是经过碱基突变后的M.bovis Mbov_0461基因的核苷酸序列(原基因来源：M.bovis HB0801菌株，基因登录号GenBank Accession：CP002058)，Mbov_0461基因在基因组中的位置：532880—533431，反向。该修饰后的M.bovis Mbov_0461基因的核苷酸序列如1-552位碱基所示，其中在该序列的384位发生密码子突变。

SEQ ID NO：2是M.bovis P21蛋白的氨基酸序列，共编码183个氨基酸。

SEQ ID NO：3是扩增Mbov_0461基因片段的引物0461a1的序列。

SEQ ID NO：4是扩增Mbov_0461基因片段的引物0461a2的序列。

SEQ ID NO：5是扩增Mbov_0461基因片段的引物0461b1的序列。

SEQ ID NO：6是扩增Mbov_0461基因片段的引物0461b2的序列。

附图说明

图1：重组质粒pET-30a-Mbov_0461的图谱，是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_0461基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图2：纯化的rP21蛋白SDS-PAGE图。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1：纯化的rP21蛋白。

图3：ELISA检测抗rP21蛋白多抗效价。

图4：ELISA检测rP21蛋白与M.bovis阳性血清和健康牛血清的反应原性。

图5：Western blot分析M.bovis P21蛋白的免疫原性。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1：M.bovis全菌蛋白。

图6：间接免疫荧光法检测M.bovis P21蛋白的分布。A:M.bovis与抗rP21蛋白兔多抗作用；B:M.bovis与免前兔血清作用；C:M.bovis与PBS作用；Bars＝2μm。

图7：间接免疫荧光法检测rP21与牛肺上皮细胞(EBL)的黏附。A图：25μg rP21蛋白与EBL细胞(1×10⁵/孔)孵育后，用抗rP21蛋白兔多抗和驴抗兔IgG-Alexa 488荧光二抗检测黏附的蛋白；B图：EBL细胞与PBS孵育的对照组；细胞核用DAPI染色。激光共聚焦显微镜下观察两组细胞荧光信号，Bars＝10μm。

图8：抗rP21兔血清抑制M.bovis黏附EBL细胞检测。1×10⁸CFU M.bovis预先与200μL免疫前兔血清或抗rP21兔高免血清(在PBS中1:25和1:50稀释)孵育后，再与EBL细胞(1×10⁵/孔)共孵育，最后计算黏附到EBL细胞上的M.bovis数量(CFU/孔)。图中数值代表来自4个独立实验的平均值±SEM，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图9：rP21蛋白与纤连蛋白(Fn)结合能力鉴定图。A图：斑点杂交法检测rP21与Fn结合能力；B图：ELISA检测Fn与微孔板包被的rP21的结合。

具体实施方式

实施例1：M.bovis P21蛋白的表达和纯化

1.1M.bovis Mbov_0461基因克隆

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中M.bovis Mbov_0461基因中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达M.bovis基因时，需要对支原体Mbov_0461基因进行突变，将密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。具体步骤是：以M.bovis HB0801基因组为模板，根据Mbov_0461基因序列设计2对引物(编号分别为：0461a1/0461a2、0461b1/0461b2)，分别在0461a1和/0461b2引物的近5′端添加酶切位点和保护性碱基，分别扩增出突变后的Mbov_0461基因的2个片段，然后，以突变后的2个片段为模板，利用0461a1/0461b2引物对扩增，得到突变后的Mbov_0461基因的全长序列，长度为552bp(见序列表SEQ ID NO：1中1-552位碱基所示的序列，其编码区也是1-552位碱基对应的序列)。

扩增Mbov_0461基因的引物序列如下所示：

1、引物0461a1/0461a2，扩增片段在基因组中的位置为1-405碱基处，PCR扩增产物长度为414bp(包括酶切位点和保护性碱基长度)。

(1)正向引物0461a1：5′-CCGGAATTCATGAAGAAAACAAAAAAGATCTT-3′，(对应序列表SEQ ID NO：3所示的序列；下划线为限制性酶切位点EcoR I)。

(2)反向引物0461a2：5′-TTCCTTTATCTCTTCTTCTGCCCATAGCACTA-3′，(对应序列表SEQ ID NO：4所示的序列；下划线部分为突变位点，即由T突变为C)。

2、引物0461b1/0461b2，扩增片段在Mbov_0461基因中的位置为367-552碱基处，PCR扩增产物长度为195bp(包括酶切位点和保护性碱基长度)。

(1)正向引物0461b1：5′-AAATATCTAGTGCTATGGGCAGAAGAAGAGAT-3′(对应序列表SEQ ID NO：5所示的序列：下划线部分为突变位点，即由A突变为G)。

(2)反向引物0461b2：5′-CGCAAGCTTTTAGACACTAAAATCAGAGATTT-3′(对应序列表SEQ ID NO：6所示的序列；下划线为限制性酶切位点HindⅢ)。

上述2个片段的PCR反应体系如下：

模板DNA 2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10×dNTP mix(Thermo)5μL，引物各2μL，超纯水32μL。

回收以上2个PCR扩增片段，以此为模板，使用引物0461a1/0461b2扩增突变后的Mbov_0461基因，其PCR反应体系如下：每个片段2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu bufferwith MgSO₄(Thermo)5μL，10×dNTP mix(Thermo)5μL，引物各2μL，超纯水29.5μL。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2M.bovis Mbov_0461基因表达质粒的构建

回收Mbov_0461基因扩增产物，用EcoR I和HindⅢ酶切，同时将pET-30a质粒(商业化质粒，购自Novagen公司)用相同的酶进行双酶切。将酶切后的突变基因产物和pET-30a质粒连接后得到重组质粒pET-30a-Mbov_0461(图1)，转化到大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆经PCR鉴定、重组质粒双酶切鉴定和公司测序，获得正确表达M.bovis Mbov_0461基因的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，重组质粒命名为：pET-30a-Mbov_0461。

1.3M.bovis P21蛋白表达与纯化

将构建的重组质粒pET-30a-Mbov_0461转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆经0.8mmol/L IPTG在37℃诱导3h，离心收集菌体，并用PBS洗涤后，液压破碎，12000r/min离心30min，收集上清，经过0.45μm孔径滤器过滤后，采用亲和层析法用Ni-NTA His树脂纯化rP21蛋白，并测定蛋白浓度，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后染色观察蛋白纯化效果(图2)。

实施例2：抗rP21蛋白多抗的制备

将纯化的rP21蛋白免疫雄性日本大耳白兔，免疫量约为1mg/只，根据免疫量算出所用rP21蛋白的体积，并与等体积弗氏完全佐剂混合乳化完全，皮下多点注射进行免疫，以后每两周免疫一次，从第二次免疫时改用弗氏不完全佐剂进行乳化，并于第3次免疫一周后耳缘静脉采血，采用间接ELISA法检测抗体水平，一般免疫3-4次即可达到所需效价，当抗体水平不再升高时，即可进行心脏采血，纯化多抗。结果表明，rP21蛋白产生的多克隆抗体效价为1:2¹⁶×100，即1:6.5×10⁶(图3)。

实施例3：rP21蛋白的反应原性分析

采用ELISA方法进行检测，主要步骤为：将rP21蛋白以100ng/孔包被在96孔ELISA板，4℃过夜。洗涤和封闭后，将蛋白与M.bovis阳性牛血清在37℃下孵育45min，然后用山羊抗牛IgG-HRP(1:4000)抗体在在37℃下孵育30min；健康牛血清作为阴性对照；最后用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)溶液将反应物显色10min，并用氢氟酸终止反应；用酶标仪在630nm处检测吸光值。结果显示：rP21蛋白能与M.bovis阳性牛血清发生反应，OD630 nm处吸光值极显著高于rP21蛋白与健康牛血清反应的吸光值(图4)，表明rP21蛋白具有很好的反应原性。

实施例4：rP21蛋白的免疫原性分析

利用Western Blot方法进行检测，主要步骤：M.bovis全菌蛋白转印到PVDF膜后，与抗rP21蛋白兔血清(1:500)室温下孵育1h，TBST洗涤三次后，将膜与羊抗兔IgG-HRP抗体(1:4000)室温下孵育1h；TBST洗涤三次；膜与Bio-rad化学发光底物作用2-5min，然后在化学发光检测仪上检测信号。结果显示：抗rP21蛋白多克隆抗体与M.bovis全菌蛋白作用后，在M.bovis P21蛋白理论大小位置出现反应条带，表明rP21蛋白具有免疫原性，能够引起机体产生特异性抗体(图5)。

实施例5：P21蛋白在M.bovis的分布

采用间接免疫荧光法进行检测，主要步骤：收集培养至对数期M.bovis，PBS离心洗涤后，以1×10¹⁰CFU/mL悬于PBS中，分别与抗rP21多抗(1:100)、免疫前兔血清(1:100)或PBS在37℃下孵育1.5h；洗涤后，M.bovis与驴抗兔IgG-Alexa 488抗体(1:300)在37℃孵育1h；洗涤后，重悬于300μL PBS溶液中，取少量滴于盖玻片上，用激光共聚焦显微镜检测。结果显示：完整的M.bovis与抗rP21蛋白的多抗孵育后，在镜下可见绿色荧光信号(图6A)，而与免前兔血清(图6B)和PBS(图6C)作用的M.bovis表面无绿色荧光信号，表明M.bovis P21蛋白分布其表面，是一种膜蛋白。

实施例6：检测rP21蛋白与EBL细胞黏附

6.1黏附检测

间接免疫荧光结合激光共聚焦扫描显微镜检测rP21蛋白与EBL细胞的黏附。将EBL细胞在24孔板中培养24～36h后，用4％多聚甲醛固定后，将200μL rP21蛋白(25μg)加入细胞培养孔中，与EBL细胞(1×10⁵/孔)在4℃孵育1h，洗涤后，在室温下用1％BSA-PBS封闭细胞1h；然后，将细胞与抗rP21兔血清(1:300)室温孵育1h。充分洗涤后，将细胞与驴抗兔IgG-Alexa 488抗体(1:400)在室温下孵育1h；细胞核用DAPI染色；最后，在激光共聚焦扫描显微镜下检测荧光信号。结果表明：rP21蛋白与EBL细胞作用后，蓝染的细胞核外周可以检测到绿色荧光，其分布轮廓与EBL细胞轮廓相似(图7A)，而相同实验条件下，不加入蛋白的对照组中，EBL细胞外周不能检测到绿色荧光(图7B)，表明rP21蛋白能与EBL细胞特异性结合，是一种黏附蛋白，该蛋白与M.bovis的毒力相关。

6.2黏附抑制检测

抗rP21蛋白兔血清抑制M.bovis黏附EBL细胞实验。EBL细胞接种于24孔细胞培养板，在37℃，5％CO₂培养箱中培养20h(约1×10⁵个细胞/孔)。在抑制实验之前，弃掉培养基，用1％BSA-MEM在37℃封闭细胞15min。预先将大约1×10⁸CFU的M.bovis与56℃热灭活的兔抗rP21高免血清(1:25，1:50)和免疫前兔血清(1:25)在4℃孵育2h。然后将M.bovis与血清的混合物一起加入到已封闭的细胞培养板中，并在37℃振荡孵育30min。充分洗涤4次后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，采用连续稀释法将细胞悬液涂布到PPLO琼脂平板上，培养72h后显微镜下观察并计数M.bovis菌落数目，最后计算每孔黏附的M.bovis数目(用CFU/孔表示)。结果表明：与免疫前血清孵育相比，兔抗rP21高免血清与M.bovis孵育后，黏附到EBL细胞上的M.bovis数量显著下降(p<0.01，p<0.05)(图8)，说明抗rP21蛋白多克隆抗体能抑制M.bovis表面分布的P21蛋白与EBL细胞结合，从而减少M.bovis在EBL细胞上的黏附，抗rP21蛋白多克隆抗体通过抑制M.bovis与宿主细胞受体结合从而可以降低M.bovis的致病性。

实施例7：rP21蛋白黏附Fn检测

7.1Dot-Blot检测

将硝酸纤维素膜安装在Bio-Dot微孔过滤器上，用PBS连续两倍稀释rP21蛋白(从1μg至0.0625μg)，每个稀释度以每孔100μL量加入微孔过滤器上，滤液流尽后将膜从装置中取出，用5％脱脂乳TBS溶液封闭4h；洗涤三次后，将膜与含10μg/mL牛Fn的1％脱脂乳-TBS溶液4℃孵育过夜，洗涤后，依次用兔抗牛Fn抗体(1:1000)和山羊抗兔IgG-HRP抗体(1:4000)室温孵育1h，洗涤后，用化学发光底物显色，最后在化学发光检测仪上检测信号。结果表明：Fn与rP21蛋白呈剂量依赖性结合(图9A)，随着rP21蛋白量增加，反应的信号也越来越强。

7.2ELISA检测

将rP21蛋白与BSA(阴性对照)包被96孔板，500ng/孔，4℃过夜；洗涤后，用5％脱脂乳PBS溶液在37℃封闭2h；洗涤后，将不同浓度的Fn(0，3.125，6.25，12.5，25μg/mL)加入96孔板，100μL/孔，室温孵育1.5h；洗涤后，加入兔抗Fn抗体(1:1000)，室温孵育1h；最后加入抗兔IgG-HRP抗体(1:4000)，室温孵育1h；显色液显色10min后用酶标检测仪在630nm波长下测吸光值。结果表明：Fn以剂量依赖性和饱和性的方式与包被在微孔板中的rP21蛋白结合(图9B)。随着Fn浓度增加，rP21蛋白结合Fn的量也逐渐趋于饱和，表明rP21与Fn的结合是一种特异性结合；相反，Fn与BSA则是以低水平、不饱和的方式结合，表明BSA和Fn的结合是非特异性的。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体Mbov_0461基因编码的蛋白以P21蛋白表示。

牛支原体湖北分离株以M.bovis HB0801表示。

牛纤连蛋白以Fn表示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体P21蛋白及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

atgaagaaaa caaaaaagat cttattgtca ctaggtttag tagtatctgc aatgtcaatt 60

ccagtagtag ctgcatcatg taagcaacaa aaagctaaaa atgaagataa taaacaagaa 120

aataaaaaag aagaaaaaaa taaagaaaca caacaaaaca aaattgctct agaaaaatat 180

aagcaaaaaa ttgctaaaga aataaaaaat ttagaagaag caattataaa agtaaaaggc 240

acaaaatata atgaggctaa gtttaaaaaa tttatgaaca aaaaaccaga tagcctcaag 300

caaatggagc aatcagttta cttacaatac aaagaagatt tattagaaat aaatgcagaa 360

aactttaaat atctagtgct atgggcagaa gaagagataa aggaatttat aagtcatcta 420

aatgaagaat taaatgagtt attaaaagaa aaaaatgata ttaaagaaac agataataat 480

catgaatata ttaatgagtt agttactgag ctacttgatg tatttagtga aatctctgat 540

tttagtgtct aa 552

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

Met Lys Lys Thr Lys Lys Ile Leu Leu Ser Leu Gly Leu Val Val Ser

1 5 10 15

Ala Met Ser Ile Pro Val Val Ala Ala Ser Cys Lys Gln Gln Lys Ala

20 25 30

Lys Asn Glu Asp Asn Lys Gln Glu Asn Lys Lys Glu Glu Lys Asn Lys

35 40 45

Glu Thr Gln Gln Asn Lys Ile Ala Leu Glu Lys Tyr Lys Gln Lys Ile

50 55 60

Ala Lys Glu Ile Lys Asn Leu Glu Glu Ala Ile Ile Lys Val Lys Gly

65 70 75 80

Thr Lys Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Lys Lys Phe Met Asn Lys Lys Pro

85 90 95

Asp Ser Leu Lys Gln Met Glu Gln Ser Val Tyr Leu Gln Tyr Lys Glu

100 105 110

Asp Leu Leu Glu Ile Asn Ala Glu Asn Phe Lys Tyr Leu Val Leu Trp

115 120 125

Ala Glu Glu Glu Ile Lys Glu Phe Ile Ser His Leu Asn Glu Glu Leu

130 135 140

Asn Glu Leu Leu Lys Glu Lys Asn Asp Ile Lys Glu Thr Asp Asn Asn

145 150 155 160

His Glu Tyr Ile Asn Glu Leu Val Thr Glu Leu Leu Asp Val Phe Ser

165 170 175

Glu Ile Ser Asp Phe Ser Val

180

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca tgaagaaaac aaaaaagatc tt 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctttatc tcttcttctg cccatagcac ta 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaatatctag tgctatgggc agaagaagag at 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcaagcttt tagacactaa aatcagagat tt 32

Claims

1.抗牛支原体P21蛋白的多克隆抗体在制备牛支原体治疗制剂中的应用，所述多克隆抗体竞争性抑制牛支原体与受体结合，从而减少牛支原体的黏附，降低牛支原体的致病性，

所述牛支原体P21蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，该蛋白由牛支原体Mbov_ 0461基因所编码，所述牛支原体Mbov_0461基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。