CN1522152A - 牛支原体疫苗及在动物中减少肺炎的方法 - Google Patents

牛支原体疫苗及在动物中减少肺炎的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及牛支原体疫苗及通过给予动物以有效量的牛支原体疫苗而在动物中治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法。该牛支原体疫苗可为完整或部分细胞的灭活的或修饰的活制剂、亚单位疫苗或核酸或DNA疫苗。根据本发明给予的该牛支原体疫苗可进行合成或重组生产。本发明也涉及组合疫苗、制备牛支原体疫苗和试剂盒的方法。

Description

牛支原体疫苗及在动物中 减少肺炎的方法
                    发明领域
本发明涉及牛支原体(Mycoplasma bovis)疫苗制剂及在动物中治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法。该牛支原体疫苗可为完整或部分细胞灭活的或修饰的活制剂、亚单位疫苗或核酸或DNA疫苗。根据本发明给予的该牛支原体疫苗可进行合成或重组生产。本发明也涉及组合疫苗、制备牛支原体疫苗和试剂盒的方法。
                    发明背景
牛支原体在家养的或集中饲养的菜牛和乳牛中是重要的全球性牛病原体。最经常报道的临床现象是牛肺炎，并常常伴随以关节炎，也已知为肺炎-关节炎综合症。其病原作用也与母牛和公牛的乳腺炎、耳炎和生殖疾病或病症有关。显著的经济损失与牛支原体诱导的呼吸疾病有关，这是因为已发现牛支原体与由于牛呼吸疾病(BRD)所致的高达36％的死亡率有关。为了减小死亡率，经常应用抗生素治疗，这是由于目前没有完全许可的疫苗可用。对牛支原体疾病的预防也可减少动物对其他呼吸疾病的易患病体质。因此，对于小牛高度有效和安全的牛支原体菌苗对于养牛业是非常有价值的。
                    发明概述
本发明提供了牛支原体疫苗和通过给予动物以有效量的牛支原体疫苗和药学可接受的载体而治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法。本发明的疫苗是以有效的量提供的，该有效的量足以引起或增加牛支原体特异性细胞或体液初级和次级免疫反应。在一个方面，动物是牛。本免疫接种方法可保护牛免于被牛支原体攻击。此外，应用牛支原体疫苗的本免疫接种方法向牛提供了增加的免疫活性，因此增加了对其他BRD病原体的抗性，如降低了对感染和疾病的易患病体质，该感染和疾病由以下病原体导致：牛疱疹病毒1型(bovineherpesvirus type 1，BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viraldiarrhea virus，BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratorysyncitial virus，BRSV)、副流感病毒(parainfluenza virus)(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)、加利福尼亚支原体(Mycoplasma californicum)、牛鼻支原体(Mycoplasmabovirhinis)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)、犬支原体(Mycoplasma canis)和Manheimia haemolytica，但不限于此。本方法也提供了牛支原体疫苗和通过给予动物以有效量的牛支原体疫苗和药物可接受的载体而从感染的畜群中根除牛支原体的方法。
根据本发明给予的牛支原体疫苗可包括额外的成分，如用于组合疫苗的佐剂和非必要的第二种或更多的抗原。第二种抗原选自但不局限于牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌、睡眠嗜血菌、蕈状支原体、无乳支原体、加利福尼亚支原体、牛鼻支原体、殊异支原体、犬支原体和Manheimia haemolytica。
本发明也提供了制备牛支原体疫苗的方法，该方法包含使牛支原体的分离物在适当的培养基中培养生长；用二元吖丙啶(binaryetheleneimine)处理牛支原体以使牛支原体灭活，及使灭活的牛支原体与适当的药物可接受的载体混合，从而制备菌苗。
本发明进一步提供了包含牛支原体和佐剂以及非必要的抗原的试剂盒，该非必要的抗原选自牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌、睡眠嗜血菌、蕈状支原体、无乳支原体、加利福尼亚支原体、牛鼻支原体、殊异支原体、犬支原体和Manheimiahaemolytica，但并不限于此。
                    附图简述
图1是表示在实验性牛支原体攻击之前时刻和之后各组平均体温的图。与用安慰剂进行免疫接种的动物(B组)相比，用两剂量的牛支原体菌苗进行免疫接种的小牛(A组)在第4-8日、10-18日和20日具有显著低的平均体温。
图2是表示在实验性牛支原体攻击之前时刻和之后各组的平均体温的图。与用安慰剂进行免疫接种的动物(D组)相比，用两剂量的牛支原体菌苗进行免疫接种的小牛(A、B和C组)在第7-17日具有显著低的平均体温。
图3是表示在实验性牛支原体攻击之前时刻和之后各组平均体温的图。与用安慰剂进行免疫接种的动物(处理组1)相比，用两剂量的牛支原体菌苗进行免疫接种的小牛(处理组2、3、4和5)在第5-20日具有显著低的平均体温。
                      发明详述
本发明包含疫苗和在动物中治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法，该方法包含给予动物以有效量的灭活牛支原体疫苗和药物可接受的载体。本发明包含制备牛支原体疫苗和牛支原体疫苗试剂盒的方法。牛支原体菌株的例子是ATCC 25025(由R.G.Wittler于1968年10月8日存放)、25523(由R.G.Wittler于1969年10月22日存放)和27368(由R.G.Wittler于1972年7月5日存放)，所有这些菌株均保藏于美国典型培养物保藏中心，1801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209。在一个优选的实施方案中，菌苗的牛支原体分离物包含一种或多种下面的菌株：2300、3625、16150、20518或5063。
本发明预见任何灭活的牛支原体分离物均可制备为有效的菌苗。在一个优选的实施方案中，可将用二元吖丙啶(BEI)灭活的牛支原体分离物制备为有效的菌苗。已按照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，将牛支原体分离物菌株2300、3625、16150、20518或5063保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏号分别为菌株PTA-3558、-3559、-3560、-3561和-3685。
在某些实施方案中，用于本发明方法的疫苗包含部分或完整细胞的牛支原体灭活制剂(菌苗)或修饰的活疫苗和药物可接受的载体，或者部分或完整细胞的牛支原体灭活制剂(菌苗)或修饰的活疫苗和佐剂。
为了清楚公开的目的，本发明的详细描述分为下面的部分，这些部分描述或阐明本发明的某些特征、实施方案或应用，但不以任何方式限制本发明。
                     定义和缩写
位于物种名称前的缩写M.指支原体属(Mycoplasm)。
如在此处关于牛支原体感染所用的术语“治疗或预防”指抑制牛支原体细菌的复制、抑制牛支原体的释放或传播，或者防止牛支原体在宿主中的确立，以及减轻由牛支原体感染导致的疾病或病症的症状，或加速牛支原体从动物中的清除。如果有细菌负荷的减少、肺感染的减少、肺病变的减少、直肠温度的降低和/或体重增长和/或生长的增加，那么该治疗则为有治疗效果的。例如，本发明的方法可有效用于预防或减少肺炎、呼吸感染和肺病变，有效用于减少肺中牛支原体的水平、降低温度和增加动物、尤其是牛的体重增重。
如在此处所用的术语“牛支原体疫苗”指可用于预防或治疗由牛支原体感染导致的病症或疾病的疫苗。牛支原体疫苗可包括任何在治疗或预防由毒性牛支原体导致的牛感染中有效的疫苗。可用于本发明的牛支原体疫苗包括如完整或部分牛支原体细胞制剂、灭活的或修饰的活的疫苗、具有一种或多种牛支原体衍生多肽或蛋白质或这种蛋白质或多肽的免疫原性片段的亚单位疫苗、或者编码一种或多种牛支原体衍生多肽或蛋白质或其免疫原性片段的一种或多种牛支原体基因或核酸，该基因或核酸能够在牛体内进行表达。牛支原体多肽、蛋白质、这种多肽和蛋白质的免疫原性片段或牛支原体基因或核酸可用本领域公知的技术进行合成或重组生产。优选地，用于本发明方法中的牛支原体疫苗是菌苗。
如在此处所用的术语免疫原性片段指来自牛支原体的蛋白质的片段，该片段能够在宿主动物中诱导免疫反应。免疫反应可包括细胞和/或体液免疫力的诱导，但不限于此。
如在此处所用的术语“动物”指所有非人的动物，包括哺乳动物。
如在此处所用的术语“牛”指牛类动物，包括但不局限于阉割的公牛、公牛、母牛和小牛。优选地，本发明的方法可应用于非人的哺乳动物；最优选地为小牛。
如在此处所用的术语“菌苗”指适合用作疫苗的灭活的完整或部分牛支原体细胞制剂。
术语“免疫有效量”指牛支原体疫苗的量，该量足以在该疫苗给予的被试者中引起免疫反应。免疫反应可包括细胞和/或体液免疫力的诱导，但不限于此。例如，有效量的牛支原体疫苗指该菌苗可预防或减少支原体肺炎的严重性。
如在此处所用的术语“佐剂”是免疫反应的增效剂。
术语“药物可接受的载体”指不干扰活性成分生物学活性的有效性的载体介质，它是化学惰性的，且对于被给予的被试者是无毒的。
          灭活的(部分或完整细胞)和修饰的活疫苗
本发明提供了牛支原体疫苗和制备牛支原体疫苗的方法，该方法包含使牛支原体分离物在适当的培养基上培养生长；用二元吖丙啶处理牛支原体以使牛支原体灭活，并使灭活的牛支原体与适当的药物可接受的载体混合从而制备菌苗。在一个实施方案中，牛支原体是从肺组织中分离的。在另一个实施方案中，牛支原体是从淋巴结组织分离的。多种这样的载体是本领域中众所周知的，包括蒸馏水或去离子水、盐水或矿物油。除灭活的细菌分离物之外，菌苗产物中也可包括适当量的一种或多种常用的佐剂。适当的佐剂可包括但不局限于：矿物凝胶，如氢氧化铝；表面活性物质，如溶血卵磷脂；糖苷类，如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100；阳离子表面活性剂，如DDA(季烃基卤化铵(quaternary hydrocarbon ammonium halogenides)，多元醇(pluronic polyols)；聚阴离子和多原子的离子；聚丙烯酸、非离子嵌段聚合物，如Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；Avridine和Rantidine；肽；重组突变体易变毒素，如白细胞毒素(LT)或霍乱毒素(CT)；化学结合的或紧密接近的分子转运蛋白；矿物油，如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，法国)、卡波普(carbopol)、Amphigen(Hydronics，美国)、Omaha(NE.，美国)、Alhydrogel(Superfos Biosector，Frederikssund，丹麦)；油乳剂，如矿物油如BayolF/Arlacel A和水的乳剂，或植物油、水和乳化剂如卵磷脂的乳剂；明矾、胆固醇、细胞因子和佐剂组合。多原子的离子也可发挥分散、增厚和防结块(anticaking)剂的作用，使得疫苗在较长时期的放置之后能够作为单分散性悬浮液而重悬。佐剂组合可以以含水的、被囊化的(控制的或延迟的释放)或微被囊化的形式存在。该免疫原也可掺入到脂质体中，或与多糖和/或其他聚合物缀合以用于疫苗制剂。可包括于用于本方法的菌苗产物中的额外物质包括如一种或多种防腐剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)的二钠或四钠盐、硫柳汞等。疫苗制备成液体剂型，或以可用可溶性成分补足的固体剂型或微颗粒存在，该可溶性成分或微颗粒在使用前在药物可接受的稀释剂中重悬。制备可溶性成分或微颗粒的方法包括但不局限于biacervation、冻结作用(congelgation)、喷雾干燥、起泡冲洗(bubble srying)、沉淀、超临界溶剂化/被囊化和冻干。在一个优选的实施方案中，命名为2300的牛支原体分离物用于制备菌苗。在进一步优选的实施方案中，Quil A、Amphigen和胆固醇的佐剂组合用于制备菌苗。
分离物生长的精确条件可依培养基的精确组成和生长的具体分离物而有变化。然而分离物一般生长约24小时～约72小时，该时间按从温育时间到收获时间计算。然后用二元吖丙啶(BEI)处理这样生长的毒性牛支原体分离物，并如美国专利No.5,565,205中所述使牛支原体灭活，或者用福尔马林、戊二醛、加热、辐射、BPL或其他本领域中公知的灭活剂来灭活。例如，当用BEI处理分离物时，可将分离物的培养物与浓度为约2～约10mM的BEI接触。然后使培养物在有效灭活牛支原体的条件下进行温育，如于约37℃温育至少约24小时。然后通过添加有效中和浓度如2～10mM的硫代硫酸钠而中和BEI培养物。
所得的灭活牛支原体可进行浓缩。用于浓缩这种生物体的各种方法是本领域中公知的。例如，该生物可通过离心如超速离心或通过过滤如超滤来浓缩。
然后用本领域中众所周知的方法回收结果所得的浓缩灭活牛支原体。最后，使这样回收的浓缩灭活牛支原体与适当的药物可接受的载体混合从而制备菌苗。该菌苗也可通过对前述方法的几种修改方案中的任何一种来生产，该修改是技术人员公知的。
牛支原体分离物也可用公知的技术直接从受感染牛的肺病灶中获得。牛支原体分离物也可用公知的技术直接从受感染牛的淋巴结组织中获得。本发明也涵盖修饰的活牛支原体疫苗的制备，如通过传代使毒性菌株减毒，该技术是本领域中公知的。
本发明疫苗的适当制剂包括作为液体溶液或悬浮液的注射剂；也可制备适合于在注射前溶于或悬浮于液体中的固体形式。该制剂也可被乳化。
灭活的牛支原体分离物也可与下面的细菌和病毒进行组合，包括但不局限于牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌、睡眠嗜血菌、蕈状支原体、无乳支原体、加利福尼亚支原体、牛鼻支原体、殊异支原体、犬支原体和Manheimia haemolytica。
                     亚单位疫苗
本发明的方法可用亚单位疫苗来实施，该亚单位疫苗具有纯化的牛支原体免疫原性蛋白质、多肽以及这种蛋白质和多肽的免疫原性片段。这种蛋白质和多肽可用本领域中公知的技术制备，如用表面活性剂制备的提取物，或热的、化学的和机械的提取物。进一步地，本领域技术人员众所周知的方法可用于确定蛋白质的纯度或均一性，如对样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色的凝胶上显现单一的多肽条带。可用HPLC或本领域中众所周知的其他类似方法确定高分辨率。
在一个特定的实施方案中，用于本发明的疫苗包含至少一种牛支原体蛋白质，如P13、P18、P21、P25-26、P33-34、P39-40、P45-46、P50、P54-58、P77、P82、P87-89、P97和P175，但不局限于此。
在另一实施方案中，本发明的亚单位疫苗包括至少一种其他的免疫原性或抗原性分子，该分子不是牛支原体蛋白质、多肽或其免疫原性片段，而优选地是病毒或细菌抗原。在一个优选的实施方案中，该抗原是牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌、睡眠嗜血菌、蕈状支原体、无乳支原体、加利福尼亚支原体、牛鼻支原体、殊异支原体、犬支原体和Manheimia haemolytica。这种组合物作为组合疫苗是有利的。本发明的亚单位疫苗和组合疫苗可应用于本发明治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法中。
在进一步特定的实施方案中，这种蛋白质或多肽的免疫原性片段具有如下的序列，该序列包含用于本发明方法中的免疫原性蛋白质和多肽的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或至少100个连续的氨基酸，所述蛋白质和多肽包括但不局限于P13、P18、P21、P25-26、P33-34、P39-40、P45-46、P50、P54-58、P77、P82、P87-89、P97和P175。
进一步地，用于疫苗的牛支原体蛋白质是基本纯的或均一的。本发明的方法中使用一般从宿主细胞中纯化的蛋白质或多肽，该宿主表达编码这些蛋白质的重组核苷酸序列。这种蛋白质纯化可通过各种本领域中众所周知的方法来实现。参见如描述于“酶学方法(Methods InEnzymology)”，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，“蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification：Principles andpractice)”，1982，Springer-Verlag，New York中的技术。
纯化的牛支原体多肽和蛋白质及其免疫原性片段也可用公知的合成方法制备。
牛支原体多肽和蛋白质及其免疫原性片段也可用活的重组病毒和细菌载体如腺病毒或沙门氏菌属(Salmonella)来表达和送递。实际的载体也是公知的，且在本领域中是可用的，或可由本领域的技术人员用众所周知的方法学构建。
                    基因和核酸疫苗
本发明的方法可用编码免疫原性蛋白质、多肽及这种蛋白质和多肽的免疫原性片段的牛支原体基因或核酸来实施。这种基因和核酸可在体内表达并可用本领域中公知的技术进行制备。
在一个特定的实施方案中，用于本发明的疫苗包含至少一种编码牛支原体蛋白质的基因或核酸，该蛋白质例如是P13、P18、P21、P25-26、P33-34、P39-40、P45-46、P50、P54-58、P77、P82、P87-89、P97和P175，但不局限于此。
在进一步的特定实施方案中，用于本发明方法的基因或核酸编码牛支原体蛋白质或多肽的免疫原性片段，且具有如下的序列，该序列包含用于本发明方法中的免疫原性蛋白质和多肽的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或至少100个连续的氨基酸，所述蛋白质和多肽包括但不局限于P13、P18、P21、P25-26、P33-34、P39-40、P45-46、P50、P54-58、P77、P82、P87-89、P97和P175。
在本发明方法的另一些实施方案中，所用的基因或核酸是通过公知的方法给药的，如通过用基因枪或其他无针送递仪器。
在本发明方法的另外一些实施方案中，所用的基因或核酸是DNA疫苗。进一步地，该核酸或基因可与脂质体或其他转染促进剂联合存在，如本领域中公知的。
用于制备和送递DNA疫苗的方法是本领域中公知的。参见如Krishnan，B.R.的“兽医学中DNA疫苗的现状(Current Status ofDNA vaccines in veterinary medicine)”，Advanced Drug DeliveryReviews，Elsevier Science(2000)。
                给药和治疗的剂量、模式
根据本发明，向动物优选地约1～10周龄的小牛给予至少一个剂量的有效量牛支原体疫苗可对以后牛支原体的攻击提供有效的免疫。优选地，牛支原体疫苗是在约7～28日龄、并再次在28-48日龄给予的。有效量的牛支原体菌苗疫苗在每剂中含有约1×106～5×106个菌落形成单位(CFU)。优选地，提供有效免疫力的牛支原体菌苗疫苗含有约1×108～5×1010的CFU/剂，且更优选地约5×108～5×1010的CFU/剂。
根据本发明，用于给药的牛支原体菌苗疫苗的有效量为约0.5～约5.0ml，优选地为约1.5ml～约2.5ml，且最优选地为约2ml。
作为亚单位疫苗的牛支原体疫苗的量为约0.01μg～约200μg，该亚单位疫苗包含在本发明方法中有效的一种或多种蛋白质或多肽或这些蛋白质或多肽的免疫原性片段。
作为包含一种或多种牛支原体基因或核酸(优选地为DNA)的牛支原体疫苗的量为约0.1μg～约200mg，该基因或核酸编码在本发明方法中有效的免疫原性蛋白质或多肽或者这些蛋白质或多肽的免疫原性片段。根据本发明，给药可通过公知的途径实现，包括经口、鼻内、粘膜局部、经皮肤和肠胃外途径(如静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌内)。给予也可用无针送递仪器来实现。给予还可用途径组合来实现，如首先经肠胃外途径给予，随后经粘膜途径给予。优选的给予途径是皮下或肌内给予。
本发明也涵盖单一剂量的接种方法，该方法不必向小牛给予额外的剂量来生成和/或维持对牛支原体的免疫力。
根据本发明，向约3和6周龄的小牛给予有效量的牛支原体菌苗可提供了对呼吸感染包括肺炎的有效免疫力，减少肺病变、减少肺中牛支原体的水平、降低温度并增加体重增重。
本发明提供了对小牛进行抗牛支原体感染的免疫接种方法，该方法包含向小牛给予至少一个剂量的、且优选地为两个剂量的菌苗，从而使小牛对牛支原体感染进行免疫接种。在一个优选的实施方案中，该菌苗是经皮下给予的。此外，优选的是该菌苗剂量包含约2ml菌苗，每ml含有约2.5×108个牛支原体菌落形成单位。理想地是将该菌苗两次给予小牛；一次在小牛出生后约第3星期，另一次在约第6星期。
本发明也涵盖对动物优选地为小牛给予有效量的牛支原体菌苗，以治疗或预防病症，包括这种动物中的肺炎、关节炎、乳腺炎、耳炎和生殖病症。
                     疫苗试剂盒
本发明也提供了一种包含一或多个容器的药物试剂盒，该容器中包含本发明的疫苗制剂的一种或多种成分。本发明因而提供了对动物进行免疫接种或治疗或预防动物中的各种疾病或病症的方法，该方法包含向动物给予有效免疫接种剂量的本发明的疫苗。在一个优选的实施方案中，该试剂盒在容器中包含灭活的牛支原体分离物和佐剂，该佐剂选自Quil A或GPI-0100、DDA、皂苷、胆固醇、铝凝胶、卡波普、Amphigen、Alhydrogel、水泡油乳剂、油包水乳剂、细胞因子或佐剂组合。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒非必要地在相同的容器中或在另一个容器中包含抗原，该抗原可选自牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒(P13)、多杀性巴斯德氏杆菌、睡眠嗜血菌、蕈状支原体、无乳支原体、加利福尼亚支原体、牛鼻支原体、殊异支原体、犬支原体和Manheimia haemolytica，但不限于此。
                        包装
如果需要的话，疫苗组合物可存在于包装中或分配器中，其中可含有一种或多种含有活性成分的单位剂量形式。例如该包装可包含金属或塑料薄片，如发泡药包装。包装或分配器可伴有给药的说明书。也可制备配制在相容性药物载体中的包含本发明化合物的组合物，将其置于适当的容器中并标记为用于治疗指示的状况。
本发明进一步通过下面的实施例进行阐明
                       实施例1
                    材料与方法
动物
获得约14日龄的健康杂交小奶牛以进行免疫接种。在开始研究之前将小牛驯化7日。所有小牛每日均获得浓缩的不含药品的食物，该食物不含任何已知的污染物或杀虫剂，且小牛可自由获得水。
疫苗
菌苗以每个剂量适当的浓度含有BEI灭活的全细胞牛支原体菌苗。此外，每一种疫苗制剂均含有磷酸缓冲盐水(PBS)和适当的佐剂。安慰剂含有PBS或PBS和水包油佐剂。
攻击方法
通过鼻内途径在连续的3天内对每一头小牛给予10或12ml新鲜的牛支原体培养物[约1×108～1×1010个菌落形成单位(CFU/ml)]。攻击接种物的计数(CFU/ml)是在每一个实验攻击完成后不久确定的。
实验程序
独特的耳朵标记号码可鉴别每一头小牛。动物是随机地按年龄分配到围栏和处理组的。
通过皮下途径在第0日(左颈)和第21日(右颈)用2ml适当的疫苗或安慰剂对动物进行免疫接种。
所有动物均在攻击前1日、攻击后7日、攻击后14日和攻击后约3周称重。
直肠温度是在攻击前1日、攻击前时刻和攻击后20日的每个早晨进行测量的。
血液样品是从每一头小牛的颈静脉中收集的。使小牛在第一次免疫接种前约1日、第二次免疫接种前1日、攻击前1日(第二次免疫接种后约3周)、攻击后7日、攻击后14日和在尸体剖检(攻击后约3周)进行放血。来自每一种血液样品的血清贮存于-20℃，直到用由Bommeli AG(Hoechst Roussel Vet Diagnostics，Liebefeld-Bern，瑞士)制备的牛支原体ELISA试剂盒(Chekit牛支原体Sero)进行估计。ELISA平板是用Multiscan读数器在波长405nm时读数的。将光密度(OD)值用下面的公式翻译为相对于阳性对照血清OD值的百分比：百分比＝(样品OD-阴性血清OD)/(阳性血清OD-阴性血清OD)*100。低于60％的值视为是阴性的。百分比在60和80％之间的血清视为可疑，而显示OD大于80％的血清则视为阳性的。
所有动物均在实验性牛支原体攻击后约3周进行尸体剖检。使小牛安乐死，并将除中枢神经系统之外的所有主要器官进行总体检查。
取出肺，并总体估计归因于牛支原体感染的特征性病灶。将病灶在标准的肺图表中绘制草图。每一肺叶的总相关百分比用下面单个肺叶对总肺质量的比例来加权。
  肺叶     肺的百分比
左侧顶部 5
右侧顶部 6
中部 5
左侧心部 6
右侧心部 7
辅叶 4
左隔膜 32
右隔膜 35
然后将加权后的肺叶值加和，以确定总病灶与总肺的百分比(Pointon等人，1992)。此外，下面的公式用于计算百分比减少。
100- 处理组的平均肺损伤百分比＝百分比减少
对照组的平均肺损伤百分比
此外，每一个肺均用50ml的PBS进行灌洗。尝试从支气管灌洗液中分离并确定活的牛支原体数。活牛支原体计数(CFU/ml)是通过制备支气管灌洗液的适当的系列稀释度并将样品涂板于适当的琼脂培养基上而确定的。
                       实施例2
在本实施例中，牛支原体菌苗的功效是在年轻小牛中评估的。24头健康的杂交小牛根据年龄进行随机分配。
动物通过皮下途径在第0日(左颈)和第21日(右颈)用2ml疫苗或安慰剂进行免疫接种。试验处理组和所用的疫苗显示于表1中。
                        表1
                     实验处理组
处理组 实验疫苗(2ml剂量) 动物数目
A 牛支原体(5×108CFU)+Amphigen 11
B 安慰剂(PBS+Amphigen) 13
如上所述将小牛在第二次免疫接种后3周进行攻击。在连续3日内通过鼻内途径使每一头小牛接受10ml新鲜的牛支原体培养物。
每一攻击接种物的数(CFU/ml)在牛支原体实验性攻击完成后1个小时内确定活计。结果显示于表2中。
          表2牛支原体攻击接种物的活计数(CFU/ml)
攻击接种物 CFU/ml
第1日 5.0×109
第2日 1.0×109
第3日 1.2×109
所有动物均在攻击前1日、攻击后7日、攻击后14日和实验性牛支原体攻击后约3周进行称重。结果总结于表3中。与用安慰剂免疫接种的组(处理组B)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A)体重增重增加。
                              表3
                   实验性牛支原体攻击后体重的总结
                       平均体重(kg)±标准偏差
处理组  攻击前  攻击后1周  攻击后2周 攻击后3周  体重增重
A  94.8±12.9  98.7±13.9  107.3±13.6 14.6±12.9  19.8
B  104.0±15.6  106.8±14.7  109.9±14.1 113.0±14.7  9.0
直肠温度是在攻击前1日、攻击前时刻和实验性牛支原体攻击后20日的每个早晨进行测量的。结果总结于图1中。与用安慰剂免疫接种的组(处理组B)相比，用牛支原体菌苗进行免疫接种的小牛(处理组A)在第4～8日、第10～18日和第20日具有较低的平均体温。
牛支原体特异性血清抗体反应(IgG)总结于表4中。平均光密度(OD)值百分比大于阳性对照血清的80％的血清样品视为是牛支原体阳性的。所有小牛在进行免疫接种前均为牛支原体阴性的。接受实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A)在第二次免疫接种前对于牛支原体是血清反应阳性的，并在研究中维持血清反应阳性。处理组B中的动物(安慰剂免疫接种的动物)是血清反应阴性的，这种阴性持续到实验性牛支原体攻击后2周。
                                   表4
                        牛支原体血清抗体(IgG)的总结
                 光密度值占阳性对照血清的平均百分比±标准偏差
处理组  免疫接种前  第二次免疫接种前  攻击前  攻击后1周  攻击后2周  攻击后3周
A  26.4±29.1  210.2±79.5  94.6  342.6±12.6  392.5±11.3  385.4±13.2
B  29.9±39.5  71.4±64.8  24.9±42.2  77.5±55.5  250.7±79.7  326.6±50.0
所有动物均在实验性牛支原体攻击后约3周进行尸体剖检。将肺取出并总体估计由于牛支原体感染所致的特征性病灶。肺损伤百分比评分和肺病灶减少百分比总结于表5中。与用安慰剂免疫接种的动物(处理组B)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A)在肺损伤评分方面有71.2％减少。这些结果证明，两个剂量的实验性牛支原体菌苗能够在小牛中诱导针对实验性攻击的保护。
                 表5
        肺损伤百分比评分的总结
        平均加权百分比±标准偏差
处理组 肺损伤百分比 减少百分比
A  1.80±3.04  71.2
B  6.25±6.73  ------
将每一个肺用50ml的PBS进行灌洗。表6中概述了从实验性牛支原体攻击后约21日的支气管灌洗样品中分离牛支原体的结果。与用安慰剂免疫接种的小牛(处理组B)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A)在肺灌洗样品中具有降低的活牛支原体发生率和水平。
                     表6
       来自肺灌洗液的牛支原体分离物的总结
处理组  牛支原体阳性动物的数目  CFU/ml
A  3/11  3.27×102
B  13/13  2.41×106
总之，与用安慰剂给药的动物(处理组B)相比，接受了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A)发展的肺病变较少、直肠温度降低、体重增重增加，从肺灌洗样品中分离的活牛支原体水平有约4个对数(log)的减少。结果显示两个剂量的牛支原体菌苗能够诱导血清学反应和对牛支原体实验性攻击的保护。
                        实施例3
在本实施例中，各种牛支原体菌苗的功效是在年轻小牛中估计的。58只健康的杂交小牛按年龄随机分配。
动物通过皮下途径在第0日(左颈)和第21日(右颈)用2ml适当的疫苗或安慰剂进行免疫接种。试验处理组和所用的疫苗显示于表1中。
                         表1
                      实验处理组
处理组 实验性疫苗(2ml剂量) 动物数目
A 牛支原体(5×108CFU)+Amphigen+Alhydrogel 14
B 牛支原体(5×108CFU)+Amphigen+QuilA/胆固醇 14
C 牛支原体(5×108CFU)+Amphigen 15
D 安慰剂(PBS) 15
如上所述将小牛在第二次免疫接种后3周进行攻击。连续3日内通过鼻内途径使每一头小牛接受12ml新鲜的牛支原体培养物。
每一攻击接种物的活计数(CFU/ml)是在牛支原体实验性攻击完成后1个小时内确定的。结果显示于表2中。
        表2牛支原体攻击接种物的活计数(CFU/ml)
攻击接种物 CFU/ml
第1日 2.2×109
第2日 3.2×109
第3日 1.7×109
所有动物均在攻击前1日、攻击后7日、攻击后14日和实验性牛支原体攻击后约3周进行称重。结果总结于表3中。与用安慰剂免疫接种的组(处理组D)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)的体重增重增加。
                                表3
                     实验性牛支原体攻击后体重的总结
                         平均体重(kg)±标准偏差
  处理组     攻击前    攻击后1周    攻击后2周    攻击后3周   体重增重
  A     79.79±12.29     88.00±13.86     98.43±12.35     103.71±10.76     23.92±5.99
  B     78.21±9.50     86.93±9.90     98.29±8.47     105.21±9.32     27.00±5.23
  C     78.07±16.78     86.60±17.11     98.00±20.92     104.00±21.56     25.93±8.80
  D     78.93±19.16     88.60±20.44     94.43±20.01     96.93±20.89     18.00
直肠温度是在攻击前1日、攻击前时刻和实验性牛支原体攻击后20日的每个早晨进行测量的。结果总结于图2中。与用安慰剂免疫接种的动物(处理组D)相比，给予了两个剂量的牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)在第7～17日具有较低的平均体温。
牛支原体特异性血清抗体反应(IgG)总结于表4中。平均光密度(OD)值百分比超过阳性对照血清值的80％的血清样品视为是牛支原体阳性的。所有小牛在进行免疫接种前均为牛支原体阴性的。接受实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)在第二次免疫接种前对于牛支原体是血清反应阳性的，并在整个研究中维持血清反应阳性。处理组D中的动物(安慰剂免疫接种的动物)是血清反应阴性的，这种阴性持续到实验性牛支原体攻击后3周。
                                   表4
                         牛支原体血清抗体(IgG)的总结
                 光密度值占阳性对照血清的百分比平均值±标准偏差
    处理组 免疫接种前   第二次免疫接种前     攻击前   攻击后1周   攻击后2周   攻击后3周
    A   阴性     244.3±66.0     314.7±10.5     134.9±7.4     115.5±8.0     142.5±6.9
    B 阴性     262.1±86.9     309.9±33.6     139.5±7.5     114.9±7.5     145.0±4.1
    C   阴性     184.5±60.6     292.2±93.7     141.1±9.1     118.9±7.5     140.4±7.7
    D   阴性     36.9±70.6     37.2±81.0     37.4±27.9     53.2±39.4     100.5±99.6
所有动物均在实验性牛支原体攻击后约3周进行尸体剖检。将肺取出并总体评估因于牛支原体感染所致的特征性病灶。肺损伤评分百分比和肺病灶减少百分比总结于表5中。与用安慰剂免疫接种的动物(处理组D)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)具有较低的肺损伤评分百分比。这些结果证明两个剂量的实验性牛支原体菌苗能够诱导小牛在实验性攻击后受到保护。
             表5
    肺损伤评分百分比的总结
   平均加权百分比±标准偏差
处理组 肺损伤百分比 减少百分比
 A  1.71±3.03  77.5
 B  1.49±3.23  80.4
 C  3.61±6.17  52.5
 D  7.60±15.93  ------
将每一个肺用50ml的PBS进行灌洗。表6中概述了从实验性牛支原体攻击后约21日的支气管灌洗样品中分离牛支原体的结果。与用安慰剂免疫接种的小牛(处理组D)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)在肺灌洗样品中活牛支原体的发生率和水平均有降低。
                   表6
    来自肺灌洗液的牛支原体分离物的总结
 处理组  牛支原体阳性动物的数目  CFU/ml
 A  5/14  1.93×102
 B  1/14  42.9
 C  9/15  1.34×106
 D  12/14  4.50×106
总之，与用安慰剂给药的动物(处理组D)相比，接受了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组A、B和C)肺病变发展较少、直肠温度降低、体重增重增加，从肺灌洗样品中分离的活牛支原体水平降低。结果显示两个剂量的牛支原体菌苗能够诱导血清学反应和对牛支原体实验性攻击的保护。
                         实施例4
在本实施例中，各种牛支原体菌苗制剂的功效是在年轻小牛中进行同源或异源攻击后评估的。83只健康的杂交小牛按年龄随机分配。
动物是通过皮下途径在第0日(左颈)和第21日(右颈)用2ml适当的疫苗或安慰剂进行免疫接种的。试验处理组和所用的疫苗显示于表1中。
                                表1
                             实验处理组
处理组 实睑性疫苗(2ml剂量) 动物数目
1 安慰剂(PBS) 16
2 牛支原体菌株2300(5×108CFU)+Amphigen+QuilA/胆固醇 17
3 牛支原体菌株3625(5×108CFU)+Amphigen+GPI-0100/胆固醇 16
4 牛支原体菌株3625(5×108CFU)+Amphigen+QuilA/胆固醇 17
5 牛支原体菌株5063(5×108CFU)+Amphigen+QuilA/胆固醇 17
如上所述将小牛在第二次免疫接种后约4周进行攻击。在连续3日内通过鼻内途径使每一头小牛接受12ml(每个鼻孔6ml)新鲜的牛支原体菌株5063培养物。
每一攻击接种物的活计数(CFU/ml)是在牛支原体实验性攻击完成后1个小时内确定的。
所有动物均在攻击前1日和实验性牛支原体攻击后约3周进行称重。平均每日体重增重的结果总结于表2中。与用安慰剂免疫接种的组(处理组1)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组2、3、4和5)平均每日体重增重增加。
            表2实验性牛支原体攻击后平均每日体重增重的总结
    平均每日体重增重(kg)
处理组 平均每日体重增重
 1  0.3
 2  0.5
 3  0.7
 4  0.6
 5  0.9
直肠温度是在攻击前时刻(第47日)和实验性牛支原体攻击后20日内的每个早晨进行测量的。结果总结于图3中。与用安慰剂免疫接种的动物(处理组1)相比，给予了两个剂量的牛支原体菌苗的小牛(处理组2、3、4和5)在52～67日具有较低的平均体温。
牛支原体特异性血清抗体反应(IgG)总结于表3中。平均光密度(OD)值百分比超过阳性对照血清的0.8080％的血清样品视为是牛支原体阳性的。所有小牛在进行免疫接种前均为牛支原体阴性的。接受实验性牛支原体菌苗的小牛(经处理组2、3、4和5)在免疫接种后显示抗体反应。处理组1中的动物(经安慰剂免疫接种的动物)是血清反应阴性的，这种阴性持续到实验性牛支原体攻击后3周。
                                    表3
                           牛支原体血清抗体(IgG)的总结
                     光密度值占阳性对照血清的平均百分比±标准偏差
  处理组  免疫接种前  第二次免疫接种前   攻击前  攻击后3周
    1  7.04±13.69  28.14±31.58  -5.33±52.24  183.67±51.32
    2  2.77±10.47  79.59±71.35  49.78±34.91  294.75±29.32
    3  7.40±13.20  98.21±102.30  69.77±27.44  298.29±21.13
    4  8.34±14.00  87.15±56.79  65.43±40.81  295.47±26.59
    5  5.54±10.02  62.40±72.18  68.31±20.88  300.13±22.91
所有动物均在实验性牛支原体攻击后约3周进行尸体剖检。将肺取出并总体评估因牛支原体感染所致的特征性病灶。肺损伤评分最小二乘方平均(LSM)百分比和肺病灶减少百分比总结于表4中。与用安慰剂免疫接种的动物(处理组1)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组2、3、4和5)具有较低的LSM肺损伤评分百分比。这些结果证明两个剂量的实验性牛支原体菌苗能够诱导实验性攻击后小牛中的保护作用。
             表4
   LSM肺损伤评分百分比的总结
       平均加权百分比
 处理组  LSM肺损伤百分比  减少百分比
 1  6.5  ------
 2  0.7  89.23
 3  0.9  86.15
 4  2.8  56.92
 5  2.9  55.38
将每一个肺用50ml的PBS进行灌洗。表5中概述了通过PCR对实验性牛支原体攻击后约21日的支气管灌洗样品中牛支原体存在情况的结果。与用安慰剂免疫接种的小牛(处理组1)相比，给予了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组2、3、4和5)经PCR测得肺灌洗样品中牛支原体的发生率较低。
                    表5
经PCR检测肺灌洗液中较低牛支原体存在情况的总结
处理组 牛支原体阳性动物的数目 阳性百分比
 1  14/16  87.5
 2  0/17  0
 3  4/12  25.0
 4  2/15  11.8
 5  1/16  5.9
总之，与用安慰剂给药的动物(处理组1)相比，接受了实验性牛支原体菌苗的小牛(处理组2、3、4和5)发展了较少的肺病变、直肠温度降低、平均每日体重增重增加，肺灌洗样品中牛支原体的发生率降低。结果显示两个剂量的牛支原体菌苗能够诱导血清学反应和对牛支原体实验性攻击的保护。此外，该结果揭示含有单一牛支原体菌株的疫苗能够在用显然不同的菌株对小牛进行攻击后保护小牛。

Claims (15)

1.一种用于对动物进行免疫接种的疫苗制剂，该制剂包含免疫学有效量的灭活的完整或部分牛支原体(Mycoplasma bovis)细胞和药物可接受的载体。
2.根据权利要求1的疫苗制剂，该制剂进一步包含佐剂。
3.权利要求1的疫苗制剂，其中有效量的牛支原体疫苗每个剂量含有约1×106～5×1010个菌落形成单位(CFU)。
4.根据权利要求1的疫苗制剂，其中牛支原体疫苗进一步包含病毒性或细菌性呼吸型、肠型或生殖型病原体抗原。
5.一种在动物中治疗或预防由牛支原体感染导致的疾病或病症的方法，该方法包括向该动物给予有效量的牛支原体疫苗。
6.根据权利要求13的方法，其中有效量的牛支原体疫苗每个剂量含有约1×106～5×1010个菌落形成单位(CFU)。
7.根据权利要求13的方法，其中给予的该疫苗的量为约0.5～约5.0ml。
8.根据权利要求13的方法，其中给予的该疫苗的量为约1.5～约2.5ml。
9.根据权利要求27的方法，其中将约2毫升的疫苗分两次给予小牛。
10.一种制备牛支原体疫苗的方法，该方法包括将牛支原体分离物在适当的培养基中培养生长；用二元吖丙啶处理牛支原体以使其灭活；及将灭活的牛支原体与适当的药物可接受的载体混合。
11.一种在至少一个容器中包含牛支原体菌苗和佐剂的试剂盒。
12.一种菌苗，其中每剂菌苗在药物可接受的载体中包含量约为5×108个菌落形成单位的灭活的牛支原体分离物。
13.根据权利要求12的菌苗，该菌苗中进一步包含佐剂。
14.根据权利要求13的方法，其中有效量的牛支原体疫苗以单剂的形式给药。
15.一种用于对动物进行免疫接种的疫苗制剂，该制剂包含免疫学有效量的灭活的完整或部分牛支原体细胞、QuilA、Amphigen和胆固醇。
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