JP4664901B2

JP4664901B2 - 不活性化ノダウイルスワクチン

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Publication number: JP4664901B2
Application number: JP2006501877A
Authority: JP
Inventors: ドス，サントス・ヌーノ; アイルランド，ジヤクリーヌ; バーンズ，アンドリユー・カートナー; ホーン，マイケル
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2024-02-18
Also published as: JP2006517943A; ATE437224T1; AU2004213566A1; US20060257425A1; ES2328141T3; SI1597359T1; WO2004074467A1; TW200425899A; DK1597359T3; TWI347364B; EP1597359B1; CA2512930C; CY1109344T1; AU2004213566B2; NO336878B1; CA2512930A1; NO20054219D0; US8124100B2; HK1085765A1; MY143785A

Description

本発明は、ノダウイルスの感染から魚を防御するためのワクチン、このようなワクチンを生産するためのプロセス、およびウイルス性神経壊死症の予防におけるこれらのワクチンの使用に関する。

ベータノダウイルスは一本鎖ＲＮＡのエンベロープを持たないビリオンであり、空胞が発生することを特徴とする脳障害および網膜症の疾患であって、感染した魚のニューロン内にウイルス様の粒子が存在する、ウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）すなわち魚の脳炎の病原体である。ＶＮＮは営利目的の養殖事業にとっての深刻な障壁を象徴する。というのは、この疾患の発生率が高く、死亡率が高レベル（１００％に近い）であり、温水および冷水で養殖された魚類の間に広く分布しているからである。

分離された一定の量の水の中のノダウイルスを駆除するための、塩素、ヨウ素またはアンモニウムに基づいた化学薬品による消毒は標準的な予防方法であるが、このような化学薬品が海洋の環境に与える影響に対する懸念から、ワクチンが好ましいだろう。現在のところ、ノダウイルスの感染から、特にＶＮＮから魚を防御するためのワクチンは市販されていない。本発明の一つの目的は、ノダウイルスの感染に対する商業的に顕著な防御力を、養殖された魚に付与するワクチンを提供することである。

（発明の要旨）
本発明の第一の側面においては、不活性化された魚類ノダウイルスを含む、ＶＮＮに対するワクチンが提供される。

本発明の第二の側面においては、アジリジン化合物を用いてウイルスを不活性化する工程を含む、魚類ノダウイルスワクチンを調製する方法が提供される。

本発明の第三の側面においては、不活性化された魚類ノダウイルスを含むワクチンをこのような治療が必要な魚に投与する工程を含む、ＶＮＮを予防するかまたは治療するための方法が提供される。

本発明の別の側面においては、ノダウイルスの感染またはＶＮＮを予防するかまたは治療するための薬剤の生産における不活性化されたノダウイルスの使用が提供される。

本発明のさらなる側面においては、不活性化された魚類ノダウイルスを含むワクチンが投与された魚が提供される。

本発明のさらに別の側面においては、２００３年６月４日にＥＣＡＣＣに受託番号０３０６０４０１にて寄託されたウイルス性神経壊死症ウイルスＭｔ／０１／Ｓｂａ株、または同様の特性が確認された株が提供される。同様の特性が確認された株は、寄託されたノダウイルスＭｔ／０１／Ｓｂａ株に対して産生される抗血清と血清学的に反応するものである。

（発明の詳細な説明）
魚用のノダウイルスワクチンを開発するための最近の研究方法は、組み換え生産されたウイルスタンパク質を頼みにしてきた。本発明者らは、二種のワクチン候補、一方はアジュバント処理されたノダウイルスの組み換え型カプシドタンパク質であり、他方は不活性化されたウイルス調製品である、を選択して比較した。バイナリーエチレンイミンを用いてこのウイルスを不活性化し、フロイント不完全アジュバントと混合して投与した。

組み換え型タンパク質ワクチンは、生ウイルスによるチャレンジ後に有意な防御を提供することができなかった。対照的に、死滅化ウイルスは、効果が高いこと（相対的な生存パーセント＝９１．６％）が分かった。このことは驚くべきことであった。本分野における一般的な見解は、不活性化されたワクチンはノダウイルスから魚、少なくともスズキ（ｓｅａｂａｓｓ）を防御することができないというものである（国際海洋探査委員会、海洋生物養殖委員会：海洋生物の病態および疾患に関する作業部会についての報告書、コペンハーゲン、デンマーク、２００２年３月１２から１６日）。

本発明によれば、ノダウイルスに対するワクチンの生産についてのプロセスは、適切な培養細胞が当該ウイルスの毒性の強い株に感染することで開始される。この方法は、１）感受性の高い細胞系に魚類ノダウイルスを感染させる工程；２）細胞変性効果（ＣＰＥ）が生じるまで、成長を支持する培地中で当該ノダウイルスを培養する工程；３）当該ノダウイルス、死滅した細胞、細胞片および感染した細胞を含む当該成長を支持する培地を回収して回収物質を生産する工程；４）適切な不活性化物質で当該回収物質を不活性化する工程；ならびに５）当該不活性化された回収物質をアジュバント処理する工程、を含む。

魚類ノダウイルスは一般的に、ストライプド・スネークヘッドの細胞（ＳＮＮ−１）かまたはスズキ由来のＳＢＬで培養される。ＳＳＮ−１は英国ソールズベリーのＥＣＡＣＣから入手することができる。他に可能性があるものは、ＥＰ−Ａ−１００６１７８（ＧＦ−１）に開示されたハタ科の魚のＥｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｃｏｉｏｉｄｅｓの細胞系である。この細胞は混合した集団を含んでもよく、または細胞のクローンであってもよい（たとえばＩｗａｍｏｔｏら、（２０００）Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇａｎ．４３（２）：８１−９に記載されたＥ−１１細胞系）。この細胞系を、細胞の急成長を支える任意の培地および血清を用いた懸濁培養としてまたはマイクロキャリアビーズ上で、ルーボトル、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で培養することができる。この細胞を、好ましくは集密的な単層を形成するように培養し、次いでウイルスを接種し、次にウイルスの成長および複製に適した栄養培地で、細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られるまでインキュベートする。Ｆｒｅｒｉｃｈｓら、（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：２０６７−２０７１に記載されているようなＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）は適切な培地の一例である。細胞の成長にとって好ましい血清は、ウマ胎児血清、ウシ胎児血清または子ウシ血清である。ウイルスがこの最大力価に達した時、これは感染性、電子顕微鏡検査または当技術分野において通常用いられている他のテストによって様々に定められるが、この培養液を清澄してろ過する。多くの場合、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法などの遠心法を用いて細胞および細胞片を除去し、この後に上清液を限外ろ過によって濃縮してもよい。

精製によって得られる毒性の強いウイルスを不活性化する準備ができている。本明細書で用いられるような、「不活性化されたウイルス」という用語は、この免疫原性の特性は保持するが、不活性化、死滅化に至る処理を経験した、以前は強い毒性を持っていたウイルスか、または別のやり方で修飾されてこの有毒な特性が実質的に無効化されたウイルスを意味する。本発明によれば、モノマー（たとえばエチレンイミン）でもオリゴマーでもよいアジリジン化合物を添加することによって、ウイルスを不活性化することができる。好ましいアジリジン化合物はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である。他の例は、トリメリックエチレンイミン（ＴＥＩ）およびアセチル−エチレンイミンである。

不活性化の一つの方法によれば、約０．２Ｎの水酸化ナトリウム溶液に２−ブロモエチルアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）を溶解させて濃度を０．１Ｍとし、３７℃で１時間インキュベートすることによってＢＥＩを調製することができる。

次いで、環化によるこのやり方で形成されたＢＥＩを、好ましくはＢＥＩ濃度が約０．００１から約０．０１Ｍ、最も好ましくは約０．００３から約０．００５Ｍ、および最適値は約０．００４Ｍにて、ウイルスの懸濁液に添加し、不活性化のプロセスに一般的に必要な時間、少なくとも数時間をかける。不活性化の間に、培養液を通常の温度／室温に維持する。たとえば、０．００４ＭのＢＥＩ、２５℃にて７２時間の不活性化工程が好ましいだろう。ｐＨのさらなる調整を行わない場合、培地はやがてより酸性側に傾く。従って、不活性化プロセスの間は培地のｐＨを必要に応じて継続的に監視し、必要に応じてさらにアルカリを添加することによって、所望の弱アルカリ性のレベルまたは弱酸性のレベルを維持する。不活性化の後、回収物中に残存するあらゆるＢＥＩを、クエン酸溶液またはチオ硫酸ナトリウム溶液などの適切な試薬を過剰量添加することによって中和することができる。

２−アミノエチル酸性硫酸エステルを沸騰している水酸化ナトリウム溶液に添加することによって、エチレンイミンを調製することができ、さらには市販もされている。エチレンイミンの酸により誘導される重合によって、種々のオリゴマーエチレンイミンが生産される。選択されるオリゴマーを、反応混合物から分留によって単離することができる。不活性化を達成するために、ＢＥＩと同様のやり方で、エチレンイミンおよびこのオリゴマー体をウイルスの懸濁液と混合しインキュベートする。

最良の結果を出すためには、約１５から約３５℃、好ましくは約２０から約２７℃、より好ましくは約２４から２６℃の温度範囲で、必要に応じて約２５℃でウイルス不活性化工程を実施する。

不活性化を確認するために、たとえば実施例に記載のように、およびＣＰＥについて観察されるように、不活性化されたウイルス調製品を感受性の高い宿主細胞と数日間インキュベートする。

チメロサールなどの保存料を不活性化された液体に添加することができ、この不活性化された物質をアジュバント処理してもよい。アジュバント処理後、グリセリン／ＥＤＴＡなどの安定剤を添加して抗原の安定性を改善することができる。このウイルス液を、限外ろ過法、ポリエチレングリコール沈殿法またはポリエチレンオキシド吸着法を利用してさらに濃縮してもよい。これらの濃縮された抗原を−７０℃以下の温度で、必要に応じて長期間保存することができ、要求があった場合、適切な緩衝剤で希釈し、必要に応じてアジュバントを添加してワクチンを作製することができる。

好ましい実施態様においては、不活性化されたウイルスの上清を医薬適合性の担体と共に、必要に応じてアジュバントと共に混合する。

本発明のワクチンの主要な標的は極めて多種多様なものであり、魚類ベータノダウイルスに感染しやすいあらゆる海洋種または淡水種である。網羅的ではないリストには：スズキ（ＤｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓｌａｂｒａｘＬ．）、タイ（Ｓｐａｒｕｓａｕｒａｔａ）、ウンブリナ（Ｕｍｂｒｉｎａｃｉｒｒｏｓａ）、タイセイヨウオヒョウ（Ｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓｈｉｐｐｏｇｌｏｓｓｕｓ）、ウインターフラウンダー（Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、タイセイヨウタラ（Ｇａｄｈｕｓｍｏｒｈｕａ）、ハドック（Ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｕｓａｅｇｌｅｆｉｎｕｓ）、シタビラメ（Ｓｏｌｅａｓｏｌｅａ）、イシビラメ（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ）、シマアジ（Ｊａｃｋｆｉｓｈ）（たとえばシマアジ、Ｐｓｅｕｄｏｃａｒａｎｘｄｅｎｔｅｘ）、ハタ類（Ｇｒｏｕｐｅｒ）（たとえばマハタ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔｕｓ、キジハタ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｋａａｒａ、ヒトミハタ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｔａｕｖｉｎａ、アカマダラハタ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｆｕｓｃｏｇｕｔａｔｕｓ、サラサハタ／Ｃｒｏｍｉｌｅｐｔｅｓａｌｔｉｖｅｌｉｓ、ヤイトハタ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｍａｌａｂａｒｉｃｕｓ、クエ／Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｍｏａｒａおよびスジハタ／Ｐｌｅｃｔｒｏｐｏｍｕｓｍａｃｕｌａｔｅｓ）、ウォルフィッシュ（Ａｎａｒｈｉｃａｓｍｉｎｏｒ）、バラマンディ（Ｌａｔｅｓｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕｒｕｂｒｉｐｅｓ）、ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、イシガキダイ（Ｏｐｌｅｇｎａｔｈｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）ならびにイシダイ（Ｏｐｌｅｇｎａｔｈｕｓｆａｓｃｉａｔｕｓ）が含まれる。

本発明に従って調製されたワクチンは、あらゆる不活性化された魚類ノダウイルスを含むことができ、あらゆる魚類ノダウイルスに対して防御を達成することができる。好ましくは、本発明の不活性化されたワクチンを調製するために用いられるウイルスは、防御が求められるウイルスと同一の株または同一の遺伝子型のものが選択される（もっとも、異なる遺伝子型間で良好な交差防御が存在する可能性が高い）。魚類ノダウイルスを、コートタンパク質の部分配列に基づいて複数の遺伝子型に分けることができる。限定されない魚類ノダウイルスの例は：ＳＪＮＮＶ（シマアジの神経壊死症ウイルス）、ＲＧＮＮＶ（キジハタの神経壊死症ウイルス）、ＴＰＮＮＶ（トラフグの神経壊死症ウイルス）、ＢＦＮＮＶ（マツカワの神経壊死症ウイルス）、ＦＥＶ（魚の脳炎ウイルス）、ＭＧＮＮＶ（マラバリカス・グルーパーの神経壊死症ウイルス）、ＤＧＮＮＶ（ドラゴン・グルーパーの神経壊死症ウイルス）、タイセイヨウオヒョウのノダウイルス、スズキの脳炎ウイルス、Ｌａｔｅｓｃａｌｃａｒｉｆｅｒの脳炎ウイルス、マルタ島のスズキノダウイルス、およびＧＧＮＮＶ（ヒトミハタの神経壊死症ウイルス）である。

ノダウイルスの株は、オルフスにあるデンマーク獣医学研究所の魚病についての基準検査機関を含む世界中の寄託機関および研究所から入手することができる。具体例としては、ＧＮＮＶのＭＴ９４１０株、ＳＪＮＮＶのＳＪＮａｇ９３株、ＲＧＮＮＶのＳＧＷａｋ９７株、ＲＧＮＮＶのＳＧＭｉｅ９５株、ＴＰＮＮＶのＴＰＫａｇ９３株、ＢＦＮＮＶのＪＦＩＷａ９８株、Ｈａｌｉｂｕｔの神経壊死症ウイルス単離株ＡＨＮｏｒ９６およびＡＨ９９ＮｏｒＡ、Ｕｍｂｒｉｎａｃｉｒｒｏｓａのノダウイルスの単離株Ｕｃ−１、タイセイヨウオヒョウのノダウイルスの単離株ＡＨ９５ＮｏｒＡ、およびヒラメの神経壊死症ウイルスの単離株ＪＦ−Ｈ１９３がある。マルタ島のノダウイルスの単離株Ｍｔ／０１／Ｓｂａが、本発明での使用にとって好ましい株である。ブダペスト条約に基づいて、英国ウィルトシャー州ソールズベリーのポートンダウンＳＰ４０ＪＧにあるヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に２００３年６月４日にこの株を寄託し、受託番号０３０６０４０１が指定された。この株の源はスターリング大学の養殖研究所である。本発明における使用に好ましい同様の特性が確認されたノダウイルス株を、Ｍｔ／０１／Ｓｂａ株に対して産生した抗血清または精製ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体との特異的な交差反応によって同定することができる。

本発明のワクチンは、ノダウイルスの感染および関連する疾患に対する、商業的に顕著であって養殖業界にとって価値がある程度の防御を提供する。ノダウイルスの感染によって、野外で感染したすべての魚のほぼ１００％が死亡することが一般的であることを考えれば、相対的な生存パーセント（ＲＰＳ）を増加させる結果となるあらゆる処理は、従来の処理方法を超える改善である。商業上の点から見れば、有意な防御とは通常、予防接種された魚についてのＲＰＳが少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、たとえば少なくとも７０％であることを意味する。本発明のワクチンを予防的に用いてもよく、または感染を解消するおよび／または回復率を向上させるための治療として、ノダウイルスが感染した魚に投与してもよい。

いくつかの例においては、特定の種または特定の年齢の魚の一集団は、ノダウイルスにさらされた時に症状を現さないかもしれない。しかしながら、これらはこのウイルスについてのキャリアとしての役割を果たすだろうし、これらがウイルスを攻撃されやすい魚に移動させるかもしれないというリスクは依然として残っている。本明細書に開示された不活性化されたウイルスを用いて、無菌の種親の魚にノダウイルスに対する予防接種を行ってこれらがキャリアになるのを防止することも、本発明の一つの側面である。

特定の実施態様においては、本発明は、同時に養殖される（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）サケ科の魚（たとえば、ギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｋｉｓｕｔｃｈ）、マスノスケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、ヤマメ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍａｓｏｕ）、カラフトマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ）およびタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒ））を予防接種することによって、タイセイヨウタラにおけるＶＮＮを予防するかまたは治療するためのワクチンの生産における、不活性化された魚類ノダウイルスの使用を提供する。同時に養殖されるサケ科の魚に不活性化された魚類ノダウイルスを含むワクチンを投与する工程を含む、タイセイヨウタラにおけるＶＮＮを予防する方法も提供される。

一つの実施態様においては、スズキの稚魚などの魚類の幼魚および／または稚魚に本発明のワクチンを投与する。また、このワクチンを成魚すなわち成熟した魚に投与することができる。

ワクチンの標準的な投与経路は、（より大型の魚については）腹腔内への注射、筋肉内への注射、餌内への経口投与によるものか、または海水もしくは淡水内への浸漬によるものである。本発明のワクチンを注射により投与するためには、魚の体重が５グラム以上であることが推奨される。適切な注入量は約１０から約２００μＬであり、好ましくは、約５０から約１００μＬである。浸漬または経口投与のためには、少なくとも１グラムの体重が好ましい。

ワクチンの有効量は、対象の大きさおよび種類によって変化してもよく、投与方法に従う。獣医師または養殖の専門家による試行錯誤を通して、最適量を決定することができる。ウイルスの適切な投与範囲は、単位投与量（ｕｎｉｔｄｏｓｅ）当たり約１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０（接種された培養物の５０％組織培養感染価（ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｏｓｅ））であり、好ましくは単位投与量当たり約１０^４から１０^８ＴＣＩＤ_５０であり、より好ましくは単位投与量当たり約１０^６から１０^７ＴＣＩＤ_５０であり、最も好ましくは単位投与量当たり約１０^７ＴＣＩＤ_５０である。好ましくは、単一の投与単位を処理されるべき魚に投与する。より小型の魚は、たとえば約６０秒間の接触時間にて、約１０^４から１０^７ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの投与量での浸漬（浸すことによる）投与から、利益を受けることができる。

一般的に、注射または水への送達に適した溶液、エマルションまたは懸濁液としてワクチンを調製する。たとえば、魚が保持される貯水タンクまたは貯水槽に添加するために、液体のエマルションまたは乳剤を調製することができる。液体の媒体への溶解若しくは懸濁に適した、または固体の餌との混合に適した固体（粉末など）の形態を投与前に調製してもよい。このワクチンは、滅菌した希釈液で再構成するためのいつでも使える形態である凍結乾燥した培養液であってもよい。たとえば、０．９％の食塩水で凍結乾燥細胞を再構成してもよい（包装されたワクチン生成物の一部として必要に応じて提供する）。注射可能なワクチンの好ましい製剤はエマルションである。ペン、タンクまたは槽に添加する前に、ワクチンの液体の形態または再構成された形態のものを、少量の水（たとえば１から１００倍量）で希釈してもよい。速放性または徐放性の形態で本発明の医薬用ワクチン組成物を投与してもよい。

不活性化されたウイルスと混合することができる医薬適合性の担体または媒体としては、従来の賦形剤が挙げられ、具体的には、水、食塩水またはＰＢＳ、油、Ｄ−グルコース、グリセリン、湿潤剤または乳化剤、充填剤、安定剤、抗酸化剤、コーティング剤、バインダー、フィラー、崩壊剤、希釈剤、潤滑剤、ｐＨ緩衝剤などの水性の溶媒であり得る。ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、油、油性エマルション、サポニン、硫酸デキストラン、グルカン、サイトカイン、ブロックコポリマー、免疫活性化オリゴヌクレオチドおよび当技術分野において公知の他のものなどのアジュバントを、不活性化されたウイルスの上清と混合してもよい。好ましいアジュバントはフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）である。添加されるアジュバントの量は、アジュバント自体の性質に依存する。ＦＩＡは、不活性化されたウイルスの上清と約１：１の体積比で有利に乳化できる。

いくつかの例においては、ＶＮＮまたは魚が罹りやすい多数の疾患を治療または予防するために、個別に、連続的にまたは同時に投与するための組み合わせワクチンまたは両成分を含むキットにおいて、本発明のワクチンと他の抗原とを組み合わせることが望ましいだろう。不活性化されたノダウイルスと組み合わせてもよい他の抗原としては、イリドウイルス属、ＶＨＳＶ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄａｍｓｅｌａｅｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏｓｐｐ．、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒｓｐｐ．およびＮｏｃａｒｄｉａｓｐｐ．に由来する抗原が挙げられる。

不活性化されたウイルスワクチンの調製
ＳＳＮ−１細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加したＬ１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２８℃で培養する。これらの細胞を継代培養するために、集密的な単層（４から７日齢）を、ＰＢＳダルベッコ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で二回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収する。細胞の一つのフラスコを定期的に分割して、３つの娘フラスコ（分割比は１：３）を生産する。

この研究についてウイルスを増殖させるために、コンフルエントな７５ｃｍ^２フラスコのＳＳＮ−１細胞を継代培養して１７５ｃｍ^２のフラスコおよび２５ｃｍ^２のフラスコを生産する。細胞が７０から８０％のコンフルエントになるまで（通常は１日齢）、これらを２８℃でインキュベートした。次いで、調製済みの培地を無菌的に除去して保持し、５ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加えてマルタ島のスズキの幼魚からの３ｍＬのノダウイルス（Ｍｔ／０１／Ｓｂａ）を、上記１７５ｃｍ^２のフラスコに添加する。上記２５ｃｍ^２のフラスコをニセモノ（ネガティブコントロール）として用い、このフラスコには１ｍＬの条件培地および１ｍＬのＨＢＳＳ＋２％のＦＢＳのみが添加される。これらのフラスコを２５℃で３０分間インキュベートし、次いで次のように再添加する。

１７５ｃｍ^２のフラスコ−８ｍＬの条件培地に加えて８ｍＬのＬ１５培地のみ（ＦＢＳはなし）。

２５ｃｍ^２のフラスコ−２ｍＬの条件培地に加えて２ｍＬのＬ１５培地のみ（ＦＢＳはなし）。

従って、最終的な培地の組成は、Ｌ１５＋約５％のＦＢＳである。血清濃度の低下によって細胞の成長が鈍化し、ウイルスの複製が最適化される。細胞を２５℃でインキュベートし、細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生について常に監視する。完全なＣＰＥが明らかな時、細胞培養上清を回収して１０００ｇで１５分間４℃にて遠心分離し、細胞片をペレット化する。次いで、ウイルスを含むこの清澄化された上清をバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）で処理する。

ウイルスの不活性化
（１）２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドのバイナリーエチレンイミンへの環化。２．１ｇの２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドを１００ｍＬの０．１７５ＮのＮａＯＨに添加してバイナリーエチレンアミン（ＢＥＡ）の０．１Ｍ溶液を得る。この溶液を３７℃の水槽内に１から２時間置き、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を得る。

（２）ウイルス抗原の不活性化。４ｍＬの０．１ＭのＢＥＩを９６ｍＬの生ウイルスの抗原に添加し、十分に混合して、このサンプルをロッキングプラットフォーム上で２５℃で７２時間インキュベートする（最終的なＢＥＩの濃度は４ｍＭ）。「生」ウイルス＋ＨＢＳＳのみを含むポジティブコントロール、およびＨＢＳＳ＋ＢＥＩからなるネガティブコントロールもこの段階で調製する。

（３）ＢＥＩの中和。７２時間後、１ｍＬの不活性化されたウイルスの抗原あたり４０μＬの２Ｍの冷チオ硫酸ナトリウムを添加し、不活性化テストを続けて実施する。

不活性化テスト
ウイルスの不活性化が成功したかどうかをテストするために、および「生」ウイルス（すなわちＢＥＩで処理されていないポジティブコントロールサンプル）のＴＣＩＤ_５０（接種された培養物の５０％組織培養感染価）を決定するために、９６ウェルプレート内で次のサンプルを用いて、ＳＳＮ−１細胞についての逆滴定を実施する：
（ａ）ニセモノ＝ＨＢＳＳのみ
（ｂ）ニセモノ＝ＨＢＳＳ＋チオ硫酸ナトリウム
（ｃ）ニセモノ＝ＨＢＳＳ＋ＢＥＩ＋チオ硫酸ナトリウム
（ｄ）ウイルス＝生ウイルス＋ＨＢＳＳのみ
（ｅ）ウイルス＝生ウイルス＋チオ硫酸ナトリウム
（ｆ）不活性化ウイルス＝ウイルス＋ＢＥＩ＋チオ硫酸ナトリウム
（ｇ）不活性化ウイルス＝ウイルス＋ＢＥＩ＋チオ硫酸ナトリウム
（ｈ）不活性化ウイルス＝ウイルス＋ＢＥＩ＋チオ硫酸ナトリウム
サンプル（ａ）から（ｃ）はネガティブコントロールとしての役割を果たし、これらの化学物質が細胞に与えるかもしれない影響を実証する。サンプル（ｄ）および（ｅ）はポジティブコントロールであり、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を利用してＴＣＩＤ_５０を計算することを可能にする。サンプル（ｅ）も、チオ硫酸ナトリウムのみがウイルスへの影響を有するかどうかを示す。サンプル（ｆ）から（ｈ）は不活性化されたウイルスの複製であり、ウイルスがもはや生存能力が無いことを調べることを可能とする。

９６ウェルプレートを２５℃でインキュベートし、毎日監視する。７から１０日のインキュベート後に、最終的な読み取りを行い、ＴＣＩＤ_５０を計算する。

上記のサンプルも、Ｌ１５培地と５％ＦＢＳ中のＳＳＮ−１細胞の２５ｃｍ^２のフラスコ内に同時に接種し、２５℃でインキュベートする。７日のインキュベート後、これらの細胞培養物を１日齢のＳＳＮ−１細胞（予め単層が形成された）上に継代する。接種材料として既に継代したフラスコから７日目の上清を用いて、さらに二種の予め形成された継続的な継代を実施する。フラスコのすべてを合計２１日間監視してＣＰＥについて調べる。ＢＥＩ処理されたウイルスを含むすべてのフラスコは、ＣＰＥについてはネガティブのままである（他のすべてのコントロールは予想通りである）。従って、このウイルスを不活性化することに成功したと推定することができる。

不活性化されたウイルスを１：１にてフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）で乳化し、１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの濃度とする。

組み換え型抗原
オヒョウのノダウイルスＶ９９５４株からのカプシドタンパク質の完全なコード配列をｐＥＴ−３０ＥＫ／ＬＩＶベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングすることによって、組み換え型抗原を調製する。ＩＰＴＧで宿主細胞の培養を誘導した後、組み換え型カプシドタンパク質を不溶性の生成物（封入体）として回収する。組み換え型タンパク質を続いて可溶化し、次いで数ラウンドの透析を実施してリフォールディングさせる。最後の組み換え型抗原を、１：１にてフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）で乳化し、最終的なタンパク質濃度を０．６７５ｍｇ／ｍＬとする。

それぞれワクチンまたはコントロールを含む、滅菌した１５ｍＬのファルコンチューブ内に、ボルテックス・ミキサーをかけながらＦＩＡを（１秒あたり約１滴で）滴下することによって、乳化されたワクチンおよびコントロールを作製する。

予防接種
平均重量が１８ｇのスズキ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓｌａｂｒａｘ）を、それぞれ約４０Ｌのタンク内で飼育する。タンクに対して６０匹または６５匹の魚がいる。このタンクには、ＵＶおよび（必要な時には）オゾン処理した塩水（３５パーミル）を２３±１℃で循環させるシステムが備わっており、市販のスズキ用の餌（ＳＯＲＧＡＬＳ．Ａ．，Ｏｖａｒ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）が与えられる。

新しい維持システム内で７日間かけて順応させ、２４時間絶食させた後、魚を麻酔して二群とし、次の処理のうちの一つを用いて、腹腔内注射（１００μＬ／魚）によって免疫化する。ＦＩＡと組み換え型抗原とが１：１のもの；ＦＩＡとＢＥＩで不活性化されたウイルスとが１：１のもの、ＦＩＡとＰＢＳとが１：１のもの（コントロール）；ＦＩＡとＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液／ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とが１：１のもの（コントロール）。

チャレンジ
２４日目（５５２度日（ｄｅｇｒｅｅｄａｙ））に、２４時間の絶食期間後に魚をチャレンジする。毒性の強いノダウイルスの接種材料を、養殖されたスズキの稚魚が起源のマルタ島のノダウイルスの単離株（Ｍｔ／０１／Ｓｂａ）から得る。もともとの回収物の組織培養物を、５％のＦＢＳを添加したＬ−１５培地を利用して同時にＳＳＮ−１細胞に接種し、２５℃でインキュベートする。ＣＰＥが完結した時、組織培養物を１５００ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化し、高濃度のウイルスを得るために、ウイルスを含む上清を、ＳＳＮ−１系に再度接種（予備的接種）する。完全なＣＰＥの後、組織培養物を遠心分離（１５００ｇにて１５分間）し、使用するまで−７０℃で保存する。次いで、ＳＳＮ−１細胞を添加し、ウイルスと共に２５℃でインキュベートする。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ（１９３１）の方法に従って、ＴＣＩＤ_５０（接種された培養物の５０％組織培養感染価）を計算する。

解凍後、チャレンジする接種材料を２％のＦＢＳを添加したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈して、魚あたり１０^７ＴＣＩＤ_５０のチャレンジ投与量を得る。麻酔の間に、それぞれの魚に１００μＬの接種材料を腹腔内接種する。タンクの水の温度を、チャレンジから三日後に２６℃に上昇させ、天然のウイルスの発生を模倣する。脳の組織サンプルを死んだ魚から取り出し、ウイルスの存在を確認する。

結果
チャレンジから６日後に、すべての群において比死亡率が上昇し始め、７から８日目にピークに達し、チャレンジから１４日後に下降する。この試験はチャレンジから３１日後に終了する。得られたデータについてＰ＜０．０５の有意水準を用いる２−プロポーションＺ−検定を行う。

それぞれのコントロール群と比較した時、ＢＥＩで不活性化されたウイルスで予防接種を受けた群では有意な防御が得られる。一方、組み換え型カプシドタンパク質で予防接種を受けた群は防御されない。

ＳＳＮ−１細胞系において存在するレトロウイルスの考えられる防御効果をコントロールするために、第二の実験を実施する。第一の実験と同じやり方で、ＢＥＩで不活性化されたノダウイルスを、第一の実験のようなＰＢＳコントロールと、およびＦＩＡとＢＥＩで不活性化され乳化されたレトロウイルスとが１：１のものからなる追加のコントロールと比較する。表２は、この第二の実験の結果を示す。

第一の実験におけるＨＢＳＳでのもの（９１．９５％）と比較すると、第二の実験におけるＢＥＩで不活性化されたノダウイルスワクチンについてのＲＰＳはより小さい（７７％）が、チャレンジはより強い（第一の実験におけるＰＢＳコントロールの死亡率は４５．５％であり、これと比較して第二の実験においては５９．２６％であった）。

これらのチャレンジ実験は、すべての予想とは反対に、アジリジン化合物（ＢＥＩ）を用いて不活性化された魚類ノダウイルスは、ノダウイルスの感染に関わるスズキの死亡率を抑えることに著しく効果的であり得ることを示す。異なる物質を用いるウイルスの不活性化の具体的なメカニズムは、未だにほとんど理解されていない。とりわけアジリジン化合物を用いる不活性化がノダウイルスの免疫原性に与える影響は、この分野における知識が少ないことを考えれば、予想することもできていない。不活性化されたノダウイルスが、ＶＮＮに対する防御を魚に与えられないという報告を考えれば、本実施例の知見は特に驚くべきものである。

Claims

魚におけるノダウイルスの感染を予防するかまたは治療するための、不活性化された魚類ノダウイルスおよび医薬適合性の賦形剤を含むワクチン組成物であって、前記不活性化されたノダウイルスが分離株Ｍｔ／０１／Ｓｂａ（受託番号０３０６０４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されている）由来であり、アジリジン化合物を用いて不活性化されたものである、前記ワクチン組成物。
前記ノダウイルスが魚におけるウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）の病原体である、請求項１に記載のワクチン組成物。
アジュバントを含む、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
前記アジュバントがフロイント不完全アジュバントである、請求項３に記載のワクチン組成物。
単位投与量当たり１０ ^５から１０ ^８ＴＣＩＤ_５０の不活性化されたノダウイルスを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
前記アジリジン化合物がバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である、請求項１から５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
バイナリーエチレンイミンを用いて処理することによって前記ノダウイルスを不活性化して、不活性化されたノダウイルスを生産する工程、および前記不活性化されたノダウイルスを医薬適合性の賦形剤と混合する次の工程を含む、請求項１に記載の不活性化された魚類ノダウイルスワクチン組成物を調製する方法。
前記不活性化工程を２５℃で実施する、請求項７に記載の方法。
前記不活性化工程において０．００４Ｍの濃度でＢＥＩを用いる、請求項７または８に記載の方法。
魚におけるノダウイルスの感染を予防するかまたは治療するための医薬の製造における不活性化された魚類ノダウイルスの使用であって、前記不活性化されたノダウイルスが、分離株Ｍｔ／０１／Ｓｂａ（受託番号０３０６０４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されている）由来であり、アジリジン化合物を用いて不活性化されたものである使用。
魚におけるウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）を予防するかまたは治療するための医薬の製造における不活性化された魚類ノダウイルスの使用であって、前記不活性化されたノダウイルスが、分離株Ｍｔ／０１／Ｓｂａ（受託番号０３０６０４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されている）由来であり、アジリジン化合物を用いて不活性化されたものである使用。
前記魚がスズキ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓｌａｂｒａｘ）である、請求項１０または１１に記載の使用。
前記魚がタイセイヨウタラ（Ｇａｄｈｕｓｍｏｒｈｕａ）であり、前記医薬が同時に養殖されるサケ科の魚を予防接種するためのものである、請求項１０または１１に記載の使用。
前記魚がノダウイルスの感染の潜在的なキャリアである、請求項１０に記載の使用。
アジリジン化合物を用いて不活性化した不活性化ノダウイルスを含むワクチン組成物を魚に投与することを含む、魚における魚類ノダウイルスの感染またはウイルス性神経壊死症（ＶＮＮ）を予防するかまたは治療するための方法であって、前記不活性化されたノダウイルスが、分離株Ｍｔ／０１／Ｓｂａ（受託番号０３０６０４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されている）由来である、前記方法。
不活性化された魚類ノダウイルスを含むワクチン組成物が投与された魚。