CN104857509A - 牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法，其制备方法包括以下步骤：1、选取自然感染支原体肺炎且濒死的患牛，取病变肺脏、淋巴结和脾脏匀浆，通过过滤和离心，去除沉淀和油脂，得到抗原液；2、抗原液中加入甲醛灭活72h，按每毫升抗原液加入1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后得到灭活抗原液；3、按4:1比例将灭活抗原液与氢氧化铝佐剂混合得到灭活组织苗。本发明制备的疫苗应用安全，针对性强，对感染致牛肺炎的支原体有确实的免疫保护效果，能显著地降低感染牛的肺脏病变评分，提高料重比，能达到预防和控制疾病的良好效果。

Description

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法

技术领域

本发明涉及一种组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法，特别涉及一种预防牛支原体肺炎的组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法。

背景技术

牛支原体肺炎又称牛传染性胸膜肺炎或牛肺疫，是由丝状支原体引起牛的一种高度接触性传染病。该病以肺间质淋巴管、结缔组织和肺泡组织的渗出性炎症以及浆液纤维素性胸膜肺炎为主要特征。此外，还可引起关节炎、乳房炎、角膜炎以及生殖系统疾病。任何年龄和品种的牛都易感，给养牛业造成巨大的经济损失。支原体又称霉形体，其细胞结构介于病毒和细菌之间，常规抗菌药物和抗病毒药物对其作用甚微，并且目前尚无有预防该病的疫苗。患病犊牛死亡率高达90％-100％，经治疗后症状缓解的患牛一般发育迟缓，甚至成为废牛。

发明内容

本发明的目的在于公开牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法、配方及使用方法，通过该疫苗能有效预防牛支原体肺炎的发生，使免疫牛得到确实的免疫保护力，降低支原体肺炎给养牛业造成的经济损失。

本发明的技术方案是这样实现的：

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法，按以下方法制得：

1.1抗原液的制备

1.1.1选取自然感染支原体肺炎且濒死的患牛，无菌条件下取出病变肺脏、淋巴结和脾脏，现用或-20℃保存备用；

1.1.2将上述新鲜的病变组织或冻存的病变组织解冻，去除结缔组织，剪小后加入4℃预冷的灭菌生理盐水，经研磨后制得组织匀浆液；

1.1.3将1.1.2的组织匀浆液连续冻融3次；

1.1.4将经1.1.3处理的组织匀浆液用150目滤网真空抽滤，所得滤液于4℃静置过夜后，再经4℃离心处理，去除油脂和沉淀，得到抗原液；

1.2灭活抗原液的制备

向1.1.4所得的抗原液加入37％的甲醛，使抗原液中甲醛的终浓度为0.3％，4℃放置72h灭活。按每毫升抗原液加入1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后得到灭活抗原液；

1.3组织灭活疫苗的制备

1.3.1将8％AlCl3和4％NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min，备用；

1.3.2将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按4:1的体积比例混合，获得牛支原体肺炎组织灭活疫苗。

进一步，所述1.1.2中的组织匀浆液，是将去除结缔组织后的病变肺脏、淋巴结和脾脏剪成10mm的小块，按1:5(v/v)加入4℃预冷的生理盐水，在组织匀浆机中匀浆所得。

进一步，所述1.1.4中的抗原液，是将滤液于4℃静置过夜后，去除上部的油脂，再经4℃温度离心机4000rpm离心1h，去除沉淀所得。

进一步，所述疫苗4℃保存，6个月有效。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的配方，包含灭活抗原液和氢氧化铝佐剂，两者的比例为每毫升灭活抗原液含0.25毫升氢氧化铝佐剂。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的使用方法，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL牛支原体肺炎组织灭活疫苗，60日龄以2mL剂量加强免疫一次。

本发明制备的疫苗应用安全，针对性强，对感染致牛肺炎的支原体有确实的免疫保护效果，能显著地降低感染牛的肺脏病变指数，提高料肉比，能达到预防和控制疾病的良好效果，对犊牛的保护率可达85％以上。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例过程，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法

1、选取确诊为牛支原体肺炎且濒死的患牛，取出病变肺脏、淋巴结和脾脏，无菌条件下去除结缔组织，剪碎成10mm³左右的小块，按1:5(m/v)加入4℃预冷的生理盐水1000mL，在组织匀浆机中匀浆，制得组织匀浆液；

2、将组织匀浆液连续冻融3次；

3、将冻融3次的组织匀浆液经150目滤网过滤，得到过滤液约1500mL；

4、过滤液于4℃静置过夜后，去除上部的油脂，再经4℃温度离心机以4000rpm离心1h，去除沉淀，得到用作制备疫苗的抗原液；

5、向抗原液中加入37％的甲醛，使抗原液中甲醛的终浓度为0.3％，4℃放置72h灭活。抗原灭活后，按每毫升抗原液加入1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后得到灭活抗原液；

6、将8％AlCl3和4％NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min，备用；

7、无菌条件下将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按4:1的体积比例混合，分装于10mL灭菌安培瓶中，获得本发明预防牛支原体肺炎组的织灭活疫苗。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的配方包括灭活抗原液和氢氧化铝佐剂，两者的比例为每毫升灭活抗原液含0.25毫升氢氧化铝佐剂。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的使用方法，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL牛支原体肺炎组织灭活疫苗，60日龄以2mL剂量加强免疫一次。

疫苗的安全性检测

1、无菌检测：取0.2mL牛支原体组织灭活疫苗，涂布绵羊血琼脂平板3块，37℃倒置培养24h-48h，观察有无细菌生长。结果为阴性，说明无细菌污染。

2、动物毒性试验：

(1)将组织灭活疫苗经腹腔注射5周龄BALB/c小鼠10只，每只小鼠注射0.5mL；再取10只5周龄BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌生理盐水0.5mL，作为对照组。观察7天。观察期间，组织灭活疫苗注射组和对照组小鼠均活泼健康，说明组织灭活疫苗安全。

(2)随机选取30日龄健康荷斯坦公犊牛15头，分为三组，每组5头。疫苗一组：颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗；疫苗二组：两侧颈部三角区肌肉各注射2mL(共4mL)本发明的疫苗；对照组：颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水。观察30天。观察期间，疫苗一组、疫苗二组和对照组的犊牛均健康活泼，早晚体温、采食量和日增重差异均不显著，说明本发明的组织灭活疫苗安全。

疫苗免疫效果评价

随机选取体重相近、健康荷斯坦公犊牛90头，分为三组。疫苗组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗，60日龄再次注射本发明的疫苗2mL；对照组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水，60日龄再次注射灭菌生理盐水2mL；正常对照组：30头犊牛作为正常对照组，不注射。实验动物观察18个月，观察期所有实验动物都采用相同的饲养管理方法。

计算整个观察期间实验动物由支原体引起的发病率和死亡率；计算2-4月龄，5-8月龄，9-12月龄和13-18月龄的平均平均日增重。动物屠宰时由不知情人员对肺脏病变评分。

结果：犊牛免疫牛支原体组织灭活疫苗后，犊牛由支原体引起的发病率和死亡率显著降低，2-4月龄，5-8月龄，9-12月龄和13-18月龄的平均平均日增重显著增加，动物屠宰时实验动物的肺脏病变评分也显著降低。详细结果见表1、表2、表3和表4。

表1 牛支原体组织灭活疫苗接种程序及剂量

注：二免在第一次免疫后的第30天进行。

表2 牛支原体组织灭活疫苗免疫后牛支原体的发病率及引起的死亡率

表3 牛支原体组织灭活疫苗免疫后牛平均日增重

注：平均日增重用平均值±标准差表示；同列数据中，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表4 牛支原体组织灭活疫苗免疫后屠宰牛的肺脏病变评分

组别	正常对照组	对照组(生理盐水)	疫苗组
				肺脏病变评分	55	50	10

注：肺脏病变评分参考Goodwin评价法，无病变为0，轻度病变为1-10，中度病变为10-15，重度病变为15-20，极重度病变为＞20。

实施例2

1、选取确诊为牛支原体肺炎且濒死的患牛，取出病变肺脏、淋巴结和脾脏，-20℃保存备用；

2、将步骤1所得的器官解冻，无菌条件下去除结缔组织，剪碎成10mm3左右的小块，按1:5(m/v)加入4℃预冷的灭菌生理盐水1000mL，在组织匀浆机中匀浆，得到组织匀浆液；

3、将组织匀浆液连续冻融3次；

4、将冻融3次的组织匀浆液经150目滤网过滤，得到过滤液约1500mL；

5、过滤液于4℃静置过夜后，去除上部的油脂，再经4℃温度离心机以4000rpm离心1h，去除沉淀，得到用作制备疫苗的抗原液；

6、向抗原液中加入37％的甲醛，使抗原液中甲醛的终浓度为0.3％，4℃放置72h灭活。抗原灭活后，按每毫升抗原液加入1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后得到灭活抗原液；

7、将8％AlCl3和4％NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min，备用；

8、无菌条件下将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按4:1的体积比例混合，分装于10mL灭菌安培瓶中，获得本发明预防牛支原体肺炎组的织灭活疫苗。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的配方包括灭活抗原液和氢氧化铝佐剂，两者的比例为每毫升灭活抗原液含0.25毫升氢氧化铝佐剂。

牛支原体肺炎组织灭活疫苗的使用方法，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL牛支原体肺炎组织灭活疫苗，60日龄以2mL剂量加强免疫一次。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，按以下方法制得：

1.1抗原液的制备

1.1.1选取自然感染支原体肺炎且濒死的患牛，无菌条件下取出病变肺脏、淋巴结和脾脏，现用或-20℃保存备用；

1.1.2将上述新鲜的病变组织或冻存的病变组织解冻，去除结缔组织，剪小后加入4℃预冷的灭菌生理盐水，经研磨后制得组织匀浆液；

1.1.3将1.1.2的组织匀浆液连续冻融3次；

1.1.4将经1.1.3处理的组织匀浆液用150目滤网真空抽滤，所得滤液于4℃静置过夜后，再经4℃离心处理，去除油脂和沉淀，得到抗原液；

1.2灭活抗原液的制备

向1.1.4所得的抗原液加入37％的甲醛，使抗原液中甲醛的终浓度为0.3％，4℃放置72h灭活。按每毫升抗原液加入1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后得到灭活抗原液；

1.3组织灭活疫苗的制备

1.3.1将8％AlCl3和4％NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min，备用；

1.3.2将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按4:1的体积比例混合，获得牛支原体肺炎组织灭活疫苗。

2.如权利要求1所述的牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述1.1.2中的组织匀浆液，是将去除结缔组织后的病变肺脏、淋巴结和脾脏剪成10mm的小块，按1:5(m/v)加入4℃预冷的生理盐水，在组织匀浆机中匀浆所得。

3.如权利要求1所述的牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述1.1.4中的抗原液，是将滤液于4℃静置过夜后，去除上部的油脂，再经4℃温度离心机以4000rpm离心1h，去除沉淀所得。

4.如权利要求1所述的牛支原体肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗4℃保存，6个月有效。

5.牛支原体肺炎组织灭活疫苗的配方，其特征在于，包含灭活抗原液和氢氧化铝佐剂，两者的比例为每毫升灭活抗原液含0.25毫升氢氧化铝佐剂。

6.牛支原体肺炎组织灭活疫苗的使用方法，其特征在于，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL牛支原体肺炎组织灭活疫苗，60日龄以2mL剂量加强免疫一次。