CN107802829A - 一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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陈岩锋
桑雷
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Abstract

本发明提供一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗及其制备方法，该疫苗按以下步骤制得：病料处理、病原增殖、抗原液制备、抗原液灭活、疫苗配置和疫苗分装。本发明的疫苗具有制备方法简单、针对性强和安全性高等特点，对感染致兔肺炎的金黄色葡萄球菌具有良好的保护效果，适于批量生产和应用。

Description

一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
兔葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）引起的一种多症状传染病。该病多发生在温暖潮湿的季节，各个年龄段、多品种的兔均可感染发病。兔葡萄球菌性肺炎以喷嚏、咳嗽和鼻腔浆液性或脓性分泌物为主要临床症状。病兔特征性病变为肺炎，少数病死兔则表现为化脓性肺炎。卫生条件和通风不良的养殖场，生产母兔和种公兔的发病率可高达 60% 以上，病兔死亡率 100%，日龄愈大发病率、死亡率愈高，给养兔业造成严重的经济损失。
兔葡萄球菌病是一种常见病。目前，主要应用抗生素对该病进行防治，抗生素的应用又导致了耐药菌株的产生，使该病在临床上持续存在。因此，提供一种高效的兔葡萄球菌疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗及其制备方法。
本发明实现上述目的，采用技术方案如下：
一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1. 病料处理
选取自然发病、呼吸道症状明显且经检测为金黄色葡萄球菌感染死亡或濒临死亡的患兔，无菌采集病变组织（气管、肺脏和肝脏），以病变组织和预冷灭菌生理盐水质量体积比（W/ V）为 1:1混合，制成组织匀浆并过滤，获得滤液。
2. 病原增殖
将步骤 1 所述滤液接种健康兔使其感染金黄色葡萄球菌，采集感染兔的相关组织（气管、肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结），现用或 -20℃ 冷冻保存。
3. 抗原液制备
3.1 将步骤 2 所述新鲜或冷冻的相关组织剔除脂肪和结缔组织，剪成约 1cm3 的小块，以相关组织和预冷灭菌生理盐水质量体积比（W / V）为 1:5 混合，制成组织匀浆。
3.2 将步骤 3.1 所得组织匀浆连续冻融三次，释放抗原。
3.3 采用两层灭菌纱布在无菌条件下将步骤 3.2 处理的组织匀浆过滤，获得的滤液于 4℃ 静置 24h，去除油脂。再以 4℃，2000rpm，将去除油脂的抗原液离心 1h，去除沉淀，上清即为用于制备疫苗的抗原液。
4. 抗原液灭活
向步骤 3.3 所得抗原液加入甲醛，使其达到 0.4% 的灭活浓度，每隔 3h 摇动一次，4℃ 灭活 72h，获得灭活的抗原液。
5. 疫苗配置
将步骤 4 所得灭活抗原液和氢氧化铝佐剂按体积比（V / V）为 1:1 混合，获得兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗。
6. 疫苗分装
将 5 步骤所得疫苗分装， 2℃～8℃ 冷藏保存，六个月有效。
本发明的优点在于：本发明的疫苗不仅具抗原的特异成分，还具有诱导机体产生天然免疫的非特异成分，能有效地诱导免疫机体产生特异和非特异免疫，有效的提高免疫保护力。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明的技术方案进行详尽地描述。所列举的仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。所描述以本发明的技术方案为基础的实施例，其他人员在无创新性成果前提下取得的所有成果，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1. 病料处理
选取自然发病、呼吸道症状明显且经检测为金黄色葡萄球菌感染死亡或濒临死亡的患兔，无菌条件下采集病变组织（气管、肺脏和肝脏），剔除脂肪和结缔组织，取 50g 病变组织，剪碎成约 1cm3 的小块，加入 50mL 4℃ 预冷的灭菌生理盐水，应用高速组织匀浆机制成组织匀浆。将组织匀浆用一层灭菌纱布过滤，获得滤液。
2. 病原增殖
选取体重约 1.5kg、抗金黄色葡萄球菌抗体阴性的健康兔，经鼻腔（每个鼻孔各接种150μL）接种步骤 1 所得滤液，使其感染金黄色葡萄球菌。30d 后，无菌条件下采集感染兔的气管、肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结，现用或 -20℃ 冷冻保存。
3. 抗原液制备
3.1 将步骤 2 所述新鲜或冷冻的相关组织剔除脂肪和结缔组织，取 200g 组织，剪成约 1cm3 的小块，加入 1000mL 4℃ 预冷的灭菌生理盐水，在高速组织匀浆机中制备成组织匀浆。
3.2 将步骤 3.1 所得组织匀浆连续冻融三次，释放抗原和相关免疫因子。
3.3 采用两层纱布在无菌条件下将步骤 3.2 处理的组织匀浆过滤，获得的滤液于 4℃ 静置 24h，去除油脂。再以 4℃，2000rpm，将去除油脂的抗原液离心 1h，去除沉淀，上清即为用于制备疫苗的抗原液。经上述步骤，所得的抗原液约 1050mL。
4. 抗原液灭活
向步骤 3.3 所得疫苗原液加入甲醛，使其达到 0.4% 的灭活浓度，每隔 3h 摇动一次，4℃ 灭活 72h，获得灭活的抗原液。
5. 疫苗配置
将 4 步骤所得灭活抗原液和氢氧化铝佐剂按 1:1 的体积比（V / V）混合，获得兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗。
6. 疫苗分装
将 5 步骤所得疫苗分装，2℃～8℃ 冷藏保存。
7. 疫苗的安全性检测
7.1 无菌检测：取 0.2mL 兔金黄色葡萄球菌组织灭活疫苗，涂布脱纤绵羊血琼脂平板3 块，37℃ 倒置培养 72h，观察有无细菌生长。结果为阴性，说明无细菌污染。
7.2 动物毒性试验：
7.2.1 小鼠毒性试验：
选取10只5周龄BALB/c小鼠，每只小鼠经腹腔注射0.5mL兔金黄色葡萄球菌组织灭活疫苗，为试验组；取10只5周龄 BALB/c小鼠，每只小鼠经腹腔注射0.5mL灭菌生理盐水，为对照组。观察14d。试验期间，试验组和对照组小鼠均活泼健康，说明组织灭活疫苗安全。
7.2.2 兔毒性试验
选取20只45日龄、抗金黄色葡萄球菌抗体阴性的健康兔，随机平均分为两组。试验组兔经颈背部皮下分两点各注射1.5mL疫苗；对照组兔经颈背部皮下分两点各注射1.5mL灭菌生理盐水。观察14d。试验组和对照组兔均活泼健康、采食量无明显变化，说明组织灭活疫苗安全。
8. 疫苗免疫效果评价
8.1 选取90只45日龄、抗金黄色葡萄球菌抗体阴性的健康兔，随机平均分为三组。试验组：30只兔于45日龄经颈背部皮下注射1.0mL 疫苗，60日龄再次注射本发明的疫苗1.0mL，75日龄经鼻腔接种300μL（每个鼻孔各接种150μL）步骤1所得滤液，观察30d。对照组：30只兔于45日龄经颈背部皮下注射1.0mL灭菌生理盐水，60日龄再次注射灭菌生理盐水1.0mL，75日龄经鼻腔接种300μL（每个鼻孔各接种150μL）步骤1所得滤液，观察30d。正常对照组：30只45日龄兔作为正常对照组，不做任何处理。
8.2 统计 75～105 日龄兔由金黄色葡萄球菌感染引起的发病率和死亡率，试验结束时剖解试验动物，观察呼吸道病变。
8.3 结果：试验兔免疫金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗后，由金黄色葡萄球菌引起的发病率、死亡率和呼吸道病变均显著降低。详细结果见表 1。
表 1 兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗免疫后由金黄色葡萄球菌感染引起的发病率、死亡率和肺脏病变
注：发病率的判定依据为，试验动物呼吸道有病变且病变组织中金黄色葡萄球菌阳性；死亡率的判定依据为，试验动物呼吸道有病变且病变组织中金黄色葡萄球菌阳性，同时无其他引起试验动物死亡的病原（如兔瘟、巴氏杆菌、波氏杆菌等）。

Claims (10)

1.一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）选取自然发病、呼吸道症状明显且经检测为金黄色葡萄球菌感染死亡或濒临死亡的患兔，无菌采集病变组织，制成组织匀浆并过滤，获得滤液，现用；
（2）病原增殖
将步骤（1）所述滤液接种健康兔使其感染金黄色葡萄球菌，采集感染兔的相关组织，现用或 -20℃ 冷冻保存；
（3）抗原液制备
将步骤 （2）所述新鲜或冷冻的相关组织剔除脂肪和结缔组织，剪成小块，加入 4℃ 预冷的灭菌生理盐水，制成组织匀浆；组织匀浆连续冻融三次，释放抗原；将处理的组织匀浆过滤，获得的滤液置于 4℃，除去油脂，再离心除去沉淀，获得抗原液；
（4） 抗原液灭活
向步骤 （3）所得抗原液加入甲醛，使抗原液与甲醛达到体积比为 0.4% 的灭活浓度，4℃ 灭活 72h，获得灭活抗原液；
（5） 疫苗配置
将步骤（4）所得灭活抗原液和氢氧化铝佐剂按体积比为 1:1 混合，获得兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗；
（6） 疫苗分装
将步骤（5）所得组织灭活疫苗分装，冷藏保存。
2.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤 （1）中，所述呼吸道症状为咳嗽、喷嚏、鼻腔流出浆液性分泌物、鼻腔流出脓性分泌物的一种或几种。
3.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述病变组织为气管、肺脏、肝脏的一种或几种。
4.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，健康兔为精神状态良好、食欲正常、抗金黄色葡萄球菌抗体阴性的一种或几种。
5.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤 （2）中，相关组织为感染兔的气管、肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结的一种或几种。
6.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤 （3）中，所述过滤为采用两层灭菌纱布在无菌条件下过滤。
7.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤 （3）中，所述离心为 4℃，2000rpm，离心1h。
8.根据权利要求 1 所述一种兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗，其特征在于，步骤 （6）中，冷藏保存温度为 2℃～8℃。
9.一种如权利要求 1 至 8 任一项所述的制备方法制备出的兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗。
10.一种如权利要求 9 所述的兔金黄色葡萄球菌性肺炎组织灭活疫苗在兔养殖过程中的应用。
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