CN112940987A

CN112940987A - 一株兔金黄色葡萄球菌及其在制备灭活疫苗中的应用

Info

Publication number: CN112940987A
Application number: CN202110385713.4A
Authority: CN
Inventors: 王锦祥; 谢喜平; 孙世坤; 陈岩锋; 陈冬金; 桑雷
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-10
Filing date: 2021-04-10
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-04-10
Also published as: CN112940987B

Abstract

本发明公开了一株兔金黄色葡萄球菌及其在制备灭活疫苗中的应用。本发明从多例病死兔的化脓性肺炎肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品中，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出一株对兔具有强致病性的金黄色葡萄球菌SA472，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021200。本发明还公开了金黄色葡萄球菌SA472在制备灭活疫苗中的应用，包括：菌株扩大培养获得菌液，菌液灭活获得灭活菌液，加入佐剂混合均匀获得灭活疫苗。本发明的灭活疫苗安全性高，免疫后产生的抗体效价高，能有效地预防金黄色葡萄球菌感染兔的发生。

Description

一株兔金黄色葡萄球菌及其在制备灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一株兔金黄色葡萄球菌及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

兔葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌感染兔引起的一种传染性疾病。该病一年四季均有发生，尤其高温高湿的季节多发。该病对种公兔和种母兔的危害尤为严重，临床上主要表现为乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状。金黄色葡萄球菌感染导致的乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状不仅严重地影响种公兔和种母兔的生产性能还导致种公兔和种母兔的淘汰或死亡，给养兔场造成巨大的经济损失。研究调查发现，金黄色葡萄球菌在我国兔群中广泛流行，是危害我国兔产业发展的重要病原。目前，我国还没有针对兔葡萄球菌病的商品化疫苗，该病的防治主要还是依赖于药物，然而药物使用的种种弊端也日益凸显，如耐药金黄色葡萄球菌的产生（尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产生）和药物残留等。因此，进行兔葡萄球菌病疫苗的研制用于预防和控制该病具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的之一是提供一株兔金黄色葡萄球菌，该菌株对兔的致病性强，制备的灭活疫苗安全，且该灭活疫苗具有良好的免疫保护性。

所述的兔金黄色葡萄球菌是从多例病死兔的化脓性肺炎肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品中，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出的对兔具有强致病性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）SA472，该菌株于2021年3月3日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021200，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的目的之二是提供一种兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗，所述兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗，是通过以下技术方案来实现的：

兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌SA472。

兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗中金黄色葡萄球菌SA472的抗原含量不低于9.0×10¹⁰CFU/mL，体积终浓度为10%的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂。

1.灭活菌液的制备；

2.灭活疫苗的配制。

步骤1所述的灭活菌液的制备，包括以下步骤：将金黄色葡萄球菌SA472以1%（V/V）接种到脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时，获得菌液，向菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃ 100rpm灭活24小时，获得灭活菌液。

步骤2所述的灭活疫苗的配制，包括以下步骤：将灭活菌液和法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，获得灭活疫苗。

进一步地，将上述方法制备得到的疫苗应用于兔养殖过程中。

本发明的有益效果在于：本发明从多例病死兔的化脓性肺炎肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品中，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出一株对兔具有强致病性的金黄色葡萄球菌SA472，本发明的灭活疫苗制备方法简单，安全性好，能有效地预防金黄色葡萄球菌感染兔的发生。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌16S rRNA基因和nuc基因的PCR扩增结果，其中M：DL2000DNA Marker；1:16S rRNA基因（1549bp）; 2:nuc基因（279bp）; 3:16S rRNA基因阴性对照;4:nuc基因阴性对照；

图2为金黄色葡萄球菌SA472攻毒后引起试验兔的化脓性肺炎、乳房炎和脚皮炎，其中A：化脓性肺炎；B：乳房炎；C：脚皮炎。

具体实施方式

实施例1

兔金黄色葡萄球菌的分离、鉴定和筛选

1）无菌采集病死兔化脓性肺炎肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品，每份样品分别划线接种于5%（V/V）脱纤维绵羊血脑心浸液（Oxoid公司，货号：CM1135B）琼脂平板，37℃培养24小时，挑取圆形，中央稍隆起，淡黄色，完全溶血，边缘整齐的菌落，在5%（V/V）脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，获得纯化的培养物。

2）取上述纯培养物，均匀地涂布在载玻片上制备成涂片，经革兰氏染色后显微镜观察细菌形态。选取单个、成双或成串排列的革兰氏阳性球菌，用于进一步鉴定。

3）提取步骤2）筛选的菌株的基因组DNA，利用16S rRNA和nuc基因引物分别扩增分离菌的16S rRNA基因和nuc基因。16S rRNA基因上游引物为fD1，引物序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16S rRNA基因下游引物为rP1，引物序列为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。nuc基因上游引物为nuc-F，引物序列为：5’-GCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAA-3’；nuc基因下游引物为nuc-R，引物序列为5’-AGCCAAGCCTTGACGAACT-3’。

PCR反应体系为50 μL：包含25 μL 2×PCR Mix，基因组DNA 1 μL，上下游引物各2μL，灭菌双蒸水补齐至50 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、57.5℃ 30秒、72℃ 90秒，35个循环；72℃延伸10分钟。金黄色葡萄球菌为16S rRNA基因和nuc基因阳性，16S rRNA基因和nuc基因PCR扩增的目的片段分别为1549bp和279bp（图1），PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，回收的目的片段送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。选取16S rRNA基因和nuc基因序列分别与GenBank中的金黄色葡萄球菌的相应序列相似性高于99%的菌株，用于进一步的动物回归试验，筛选出对兔具有强致病性的菌株。

4）将步骤3）鉴定的兔金黄色葡萄球菌做动物回归试验。肺炎组：以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，计算发病率和死亡率；乳房炎组：以1.0×10³ CFU活菌数经乳导管接种12只哺乳期母兔，观察30天，计算发病率和死亡率；脚皮炎组：以1.0×10³ CFU活菌数经试验兔后脚踏地部皮下接种12只35日龄健康兔，观察30天，计算发病率和死亡率。观察期间，同一组的每2只试验兔饲养于1个铁丝笼中，自由采食和饮水。统计试验结果，金黄色葡萄球菌SA472表现的致病性最强，人工攻毒后能导致试验兔的化脓性肺炎、乳房炎和脚皮炎（图2）。该菌攻毒引起肺炎组试验兔的发病率为100%（12/12），死亡率为41.67%（5/12）；该菌攻毒引起乳房炎组试验兔的发病率为100%（12/12），死亡率为16.67%（2/12）；该菌攻毒引起脚皮炎组试验兔的发病率为100%（12/12），死亡率为8.33%（1/12）；因此，在本发明中选取金黄色葡萄球菌SA472作为疫苗株制备兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗。

实施例2

兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备和安全性检测

1.兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备

将兔黄色葡萄球菌SA472以体积比为0.1%接种到500 mL脑心浸液培养基，37℃180rpm培养24小时；加入甲醛至体积终浓度为0.3%，37℃ 100rpm灭活24小时，得到灭活菌液；向灭活菌液中加入法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂至体积终浓度为10%，混合均匀，获得灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。

2.兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗的安全性检测

1）无菌检测：取0.2 mL步骤1制备的灭活疫苗，均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，37℃倒置培养72小时。结果为阴性，说明步骤1制备的灭活疫苗无细菌污染。

2）动物安全性试验：

a.取20只健康的5周龄BALB/c小鼠，平均分为2组，每组10只，公母各半。试验组：经腹腔注射0.5 mL步骤1制备的灭活疫苗；对照组：经腹腔注射0.5 mL灭菌脑心浸液培养基。试验期14天。试验期间，试验组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常，说明步骤1制备的灭活疫苗安全。

b.取35日龄健康兔30只，平均为3组，每组10只，公母各半。疫苗一组：颈背部皮下注射步骤1制备的灭活疫苗1 mL；疫苗二组：颈背部皮下分2点注射步骤1制备的灭活疫苗各1.5 mL，共3 mL；对照组：颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。试验期30天。试验期间，疫苗一组、疫苗二组和对照组的试验兔均健康活泼，采食和饮水正常，也未观察到疫苗注射引起的局部的和全身的不良反应，说明步骤1制备的灭活疫苗安全可靠。

实施例3

灭活疫苗的免疫效果评价

1.灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

选取金黄色葡萄球菌阴性和抗金黄色葡萄球菌抗体阴性的健康兔40只，平均分为2组。免疫组：20只试验兔，公母各10只，35日龄时颈背部皮下注射本发明的疫苗1 mL，50日龄时第二次免疫本发明的疫苗1 mL，约230日龄（母兔空怀期）时第三次免疫本发明的疫苗1mL；对照组：20只试验兔，公母各10只，35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄时第二次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，约230日龄（母兔空怀期）时第三次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL。分别于第二次免疫后和第三次免疫后第7天、14天、21天、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月经耳缘静脉采集试验兔全血，分离血清，以灭活的金黄色葡萄球菌SA472菌悬液为检测抗原通过微量凝集试验测定实验兔血清中的抗体效价。结果显示，第二次免疫后试验兔血清中抗金黄色葡萄球菌的抗体效价较快上升，免疫后第28天至第5个月的抗体效价能维持在7.0 log₂以上的较高水平；第三次免疫后试验兔血清中的抗兔金黄色葡萄球菌的抗体效价较平稳地上升，免疫后第21天至免疫后第5个月的抗体效价能维持在7.0 log₂以上的较高水平。详细结果见表1。

表1 兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗免疫后的抗体消长规律

注：“－”为阴性。

2.灭活疫苗的免疫保护效力

选取健康兔150只，平均分为3组，每组50只，公母各25只。疫苗组： 35日龄时颈背部皮下注射本发明的疫苗1 mL，50日龄时第二次免疫本发明的疫苗1 mL，约230日龄（母兔空怀期）时第三次免疫本发明的疫苗1 mL；对照组： 35日龄时颈背部皮下注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，50日龄时第二次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL，约230日龄（母兔空怀期）时第三次注射灭菌脑心浸液培养基1 mL；正常对照组：50只健康兔，不做任何处理。试验期15个月，试验期间所有试验兔都单笼单只饲养，自由采食和饮水。母兔于150日龄初配，采用本交和42天繁殖周期模式，即妊娠期30天，分娩后第12天再次配种。公兔于180日龄初配，本交，隔一天使用一次，每次使用仅配种一次。计算整个试验期间试验兔由金黄色葡萄球菌感染引起的发病率（乳房炎、脚皮炎或呼吸道疾病）和死亡率。结果显示，疫苗组试验兔发病率为2%（1/50），死亡率为0（0/50）；对照组试验兔发病率为46%（23/50），死亡率为26%（13/50）；正常对照组试验兔发病率为50%（25/50），死亡率为26%（13/50）。结果表明，本发明的兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗对兔金黄色葡萄球菌的感染具有良好的预防效果。详细结果见表2和表3。

表2 兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗接种程序和剂量

注：第一次免疫于试验兔35日龄时进行；第二次免疫于试验兔50日龄时进行；第三次免疫于试验兔230日龄时进行。

表3 兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗免疫后由兔金黄色葡萄球菌感染引起的发病率及死亡率

注：发病的判定依据为：发病兔有乳房炎、脚皮炎或呼吸道症状，如同一只发病兔具有乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状的一种、两种或三种只计为1只试验兔发病，发病兔的病变组织和器官中金黄色葡萄球菌阳性，同时该发病兔的病变组织和器官以及其他组织和器官中无引起试验兔发病的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等）；死亡的判定依据为：死亡兔有乳房炎、脚皮炎或呼吸道症状，如同一只死亡兔具有乳房炎、脚皮炎和呼吸道症状的一种、两种或三种只计为1只试验兔死亡，死亡兔的病变组织和器官中金黄色葡萄球菌阳性，同时该死亡兔的病变组织和器官以及其他组织和器官中无引起试验动物死亡的其他病原（如兔病毒性出血症病毒、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株兔金黄色葡萄球菌及其在制备灭活疫苗中的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggaggtga tccagcc 17

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgattgatg gtgatacggt taaattaa 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agccaagcct tgacgaact 19

Claims

1.一株兔金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）SA472，保藏编号为CCTCC NO：M 2021200，该菌株于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种如权利要求1所述金黄色葡萄球菌在制备兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗中的应用。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗中金黄色葡萄球菌SA472的抗原含量不低于9.0×10¹⁰ CFU/mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）扩大培养金黄色葡萄球菌SA472，获得菌液；

2）向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活，获得灭活菌液；

3）将灭活菌液与佐剂混合均匀，获得灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤1）中所述的扩大培养具体包括：将金黄色葡萄球菌SA472以0.1%V/V的接种量接种到脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤2）中所述菌液灭活具体包括：向金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的灭活剂，37℃ 100rpm灭活24小时，所述灭活剂包括甲醛。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤3）中所述的佐剂为：法国赛比克公司的商品化MONTANIDE^TM GEL 02 PR佐剂，所述佐剂在混合液中的体积终浓度为10%。

8.一种利用权利要求1所述的兔金黄色葡萄球菌制备得到的兔金黄色葡萄球菌灭活疫苗。

9.如权利要求8所述的灭活疫苗在兔养殖过程中的应用。