WO2013004020A1 - 一种绿脓杆菌pa-msha菌株igy及其制备方法和应用 - Google Patents

一种绿脓杆菌pa-msha菌株igy及其制备方法和应用 Download PDF

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祁振强
卢超
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Definitions

  • the present invention relates to mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa, and more particularly to a mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa (PA-MSHA) strain IgY, a preparation method thereof, related health care products and biological products, and applications.
  • PA-MSHA mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa
  • the PA-MSHA strain is a specific Pseudomonas aeruginosa isolated and cultivated by Professor Yan Xia in 1984, and the accession number is CGMCC0190, and its patent number is CN 1090602A.
  • the inactivated vaccine of this strain has been certified as a national biological product in 1996 as a national second-class new drug. Clinically, the inactivation Vaccine has been widely used as a kind of adjuvant therapy for broad-spectrum antibacterial and tumor.
  • Passive immunization is the direct application of specific antibodies to neutralize pathogenic microorganisms and their production of toxins.
  • the main sources include human immunoglobulins, bovine colostrum, egg-producing egg yolk immunoglobulin (IgY) and monoclonal antibodies.
  • egg laying poultry such as chicken egg yolk immunoglobulin are distinguished by their simplicity of preparation, low cost, and non-toxicity.
  • IgY In the natural state, IgY is transported from the hen's blood to the egg yolk to protect future chicks from various infectious diseases. Laying hens that are artificially immunized with antigens are the main source of large-scale production of polyclonal antibodies.
  • Chicken IgY is similar in structure and function to mammalian IgG. At present, there are many research reports and patent applications using chicken IgY to prevent and treat various infectious diseases and tumors, such as pediatric rotavirus diarrhea and digestive tract. Infection, respiratory infections, stomach cancer, liver cancer, etc.
  • IgY has been reported for the use of vaccines to immunize laying hens to obtain chicken IgY patents, but IgY, which can achieve broad-spectrum antibacterial effects and can act as a broad-spectrum immunoadjuvant in tumors, has not been reported. Summary of the invention
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a PA-MSHA strain IgY and a preparation method and application thereof, in view of the fact that the existing egg-producing IgY does not have a broad-spectrum antibacterial effect and an anti-tumor auxiliary effect.
  • the present invention provides a method for preparing a PA-MSHA strain IgY, which comprises the following steps:
  • the step (S1) comprises: activating the prepared mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa with the accession number CGMCC0190 and culturing in the LB solid medium. ⁇ 20h, the culture temperature was 37 ° C, and then inoculated in the soybean enzymatic hydrolysis medium, and the antigen of the PA-MSHA strain was prepared after collecting the culture solution.
  • the step (S3) comprises: a) taking an immune egg to remove the yellow color, removing the protein component adhered to the egg yolk membrane, and draining the thorn Broken egg yolk film, collecting egg yolk;
  • the egg laying poultry is a hen.
  • the present invention also provides a PA-MSHA strain IgY, which is prepared by the method described above.
  • the present invention also provides a PA-MSHA strain IgY health supplement and biological product consisting of the PA-MSHA strain IgY as described above.
  • the present invention also provides a PA-MSHA strain IgY health supplement and biological product comprising the PA-MSHA strain IgY as described above.
  • the present invention also provides an application of the PA-MSHA strain as described above for preparing a health care product or a biological product for preventing primary diseases caused by Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pneumococcal, Streptococcus mutans, and Helicobacter pylori .
  • the invention also provides the application of the PA-MSHA strain IgY health care product and biological product as described above, for preparing the auxiliary function for improving the body immune function in the treatment of breast cancer, liver cancer, lymphatic cancer, lung cancer, bladder cancer and leukemia. Treated health care products or biological products.
  • the PA-MSHA strain IgY of the present invention and the preparation method thereof have the following beneficial effects: Inventing the mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa to immunologically lay eggs, and then extracting and purifying the eggs
  • PA-MSHA strain IgY can be further made into health care products and biological products, on the one hand can be used to control a wide range of opportunistic infections such as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, pneumococcal, Streptococcus, Helicobacter pylori, etc. It can also be used as a good adjuvant treatment for a variety of cancers, such as breast cancer, liver cancer, lymphoma, lung cancer, bladder cancer, and leukemia. This product has good activity and specificity, and is suitable for broad-spectrum antibacterial and anti-cancer, especially for primary and passive immunotherapy of tumors. detailed description
  • the object of the present invention is to extract and purify IgY products from immune eggs after immunizing egg-producing poultry such as hens with mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa (PA-MSHA) as an antigen, and formulating the health products and biological products using the product. Used for broad-spectrum antibacterial and adjuvant therapy in cancer therapy.
  • Pseudomonas aeruginosa PA-MSHA
  • the mannose-sensitive Pseudomonas aeruginosa (PA-MSHA) strain used in the present invention is a specific Pseudomonas aeruginosa isolated and cultivated by ⁇ in 1984, and the accession number is CGMCC0190, and the patent number thereof is CN 1090602Ao.
  • -MSHA strain IgY is a product of broad-spectrum antibacterial and anti-cancer yolk immunoglobulin, specifically.
  • This product can be obtained by inoculating LB semi-solid medium with the above-preserved PA-MSHA strain and culturing overnight at 37 ° C to obtain an activated PA-MSHA strain.
  • the activated PA-MSHA strain was inoculated on the slope of the LB solid medium, cultured at 37 ° C for 18 to 20 hours, and then inoculated into the soybean enzymatic hydrolysis medium, and the antigen of the PA-MSHA strain was prepared after collecting the culture solution.
  • the culture is injected into laying hens, especially hens, to produce large amounts of antibodies which are delivered to the yolk for storage. Injection sites include muscle, subcutaneous, intradermal, vascular, and genital sac.
  • the eggs produced by the immunized hens after 5 to 20 days contain the corresponding IgY.
  • PA-MSHA strain IgY antibody is added in proportion to the corresponding excipients, and prepared into any pharmaceutically acceptable dosage form including tablets, injections, oral liquids and sprays to obtain various PA-MSHA strains IgY health products. And biological products.
  • the PA-MSHA strain IgY health care products and biological products can be used for controlling primary diseases caused by Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, pneumococci, anabacteria, Helicobacter pylori, and for breast cancer, liver cancer, lymphoma, Adjuvant therapy to improve immune function in patients with lung cancer, bladder cancer, and leukemia.
  • the excipients described herein include trehalose.
  • Example 2 ELISA method for detecting the titer of egg yolk immunoglobulin
  • 96-well plates were coated with Pseudomonas aeruginosa antigen at 10 g/ml, overnight at 4 ° C, washed 3 times with PBS pH 7.4 for the next day, blocked with 5% calf serum for 12 h, washed and air dried.
  • the purified yolk immunoglobulin was diluted with sterile PBS (starting from 1:10, a total of 8 concentration groups), and each well was incubated with 100 ⁇ l, 37 for 1 h; after washing and air drying, horseradish peroxidase-labeled goat antibody was added.
  • chicken immunoglobulin HRP-IgG, at a concentration of l: 10 5) 100pl, 37 ° C incubated for lh.
  • the egg yolk immunoglobulin was sterilized by filtration, and the small test tubes were dispensed at 10 mg/ml, and stored at -20 ° C for freezing, 4 ° C and room temperature, and the potency was periodically checked.
  • the experimental results show that: egg yolk immunoglobulin is stored frozen at -20 °C, its stability can be maintained for at least 12 months; at 4 ° C, its stability can be maintained for at least 6 months; it is stable at room temperature. Sex can be kept for at least 2 months.
  • Example 4 Effect of oral IgY on intestinal infection in burned rats
  • the animal model of intestinal infection of Pseudomonas aeruginosa in burned rats was used to treat the intestinal infection of severely burned rats by oral administration of IgY to burn rats.
  • Healthy SD rats were randomly divided into normal control group, ceftazidime treatment group and IgY treatment group. After fasting for 8 hours, the rats were anesthetized with 1% sodium pentobarbital (30 mg/kg), and 1.5% NaHC0 3 ml was injected into the stomach tube. After one minute, 10 8 CFU/ml of Pseudomonas aeruginosa was injected. Bacterial suspension (lml/lOOg), free to eat. Eight hours after the bacterial suspension treatment, 1% sodium pentobarbital (30 mg/kg) was anesthetized by intraperitoneal injection, and the back 10% Na 2 S hair removal treatment was performed under anesthesia. The normal group does not do any processing.
  • ceftazidime treatment group and the IgY treatment group were exposed to the epilation area with a 100 °C stainless steel block for 20 seconds, resulting in a 25% TBSA third degree burn.
  • normal saline 3 mg/100 g
  • Ceftazidime treatment group tail vein injection Antibiotic lml.
  • IgY treatment group immediately received IgY 2ml (1mg/ml) after burn, repeated every 12 hours, and stopped feeding IgY after 24h. Animals are managed in a single cage, free to drink water, and eat freely after 24 hours.
  • IgY treatment group 2.31 ⁇ 0.25 2 ⁇ 38 ⁇ 0 ⁇ 28 Table 2 Changes in endotoxin content in vena cava blood (pg/ ml)
  • a mouse model of liver cancer was established by cell suspension injection of Bel7404 liver cancer cell line in logarithmic growth phase.
  • Bel7404 in logarithmic growth phase was formulated into 1 x 10 7 /ml cell suspension with sterile PBS.
  • nude mice were 6 weeks old and weighed about 20 g, 0.2 ml of cell suspension was injected into the right axilla of nude mice.
  • lung cancer model mice were formed after about 7 days.
  • Model mice were randomly divided into 4 groups of 6 mice each. The groups were followed by a negative control group, a cisplatin treatment group, an IgY group, a combination treatment group of cisplatin and IgY, and a blank control group of normal mice. Different treatments are given to different groups.
  • the negative control group did not receive any treatment; cisplatin treatment group: daily injection of cisplatin 1mg/kg; IgY treatment group: daily administration of IgY 2ml; IgY group combination treatment group: 1g/kg after cisplatin administration, tube feeding IgY 2ml .
  • the drug was administered continuously for two weeks, and the nude mice were sacrificed on the second day after the administration was stopped. The size and weight of the tumors of each group were examined. Measurement.

Abstract

提供了一种甘露糖敏感性绿脓杆菌PA-MSHA菌株IgY及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：（1)制备PA-MSHA菌株的抗原；（2)利用该抗原对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋；（3)取免疫蛋的蛋黄，提取PA-MSHA菌株IgY。PA-MSHA菌株的IgY可进一步制成保健品和生物制品，一方面可用于防治广谱的机会感染菌群，如大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎球菌、变形球菌、幽门螺旋杆菌等，另一方面还可以对多种癌症起到良好的辅助治疗效果，如乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病等，尤其适用于肿瘤的主、被动免疫治疗。

Description

说 明 书 一种绿脓杆菌 PA-MSHA菌株 IGY及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及甘露糖敏感性绿脓杆菌，更具体地说，涉及一种甘露糖敏感性 绿脓杆菌 （PA-MSHA) 菌株 IgY及其制备方法、 相关保健品和生物制品以及 应用。 背景技术
1、 肿瘤临床治疗中的局限性
目前每年全球癌症死亡人数约为 700万人， 特别值得注意的是其中 24% 发生在中国， 而缺乏积极有效的药物对恶性肿瘤进行针对性治疗是其主要原 因。 恶性肿瘤患者一般中晚期在体内会释放远高于正常水平的免疫抑制因子， 抑制细胞活性并且直接抑制各种淋巴细胞因子的分泌，从而降低机体的细胞免 疫和体液免疫作用。 目前对恶性肿瘤的治疗依然是以手术和化疗为主。手术除 了能有效地切除部分的肿瘤组织以外，另一方面也会对机体产生新的伤口并再 次对机体的免疫环境造成破坏。而临床上广为使用的化疗药物，在杀死癌细胞 的同时，会部分杀死患者体内的正常细胞，包括数量已经有所减弱的免疫细胞， 因此本已低下的免疫功能会再次遭到损害，从而导致一方面未杀死的癌细胞更 易得以增殖，另一方面病人虚弱的免疫系统会极大加剧其他病毒或病菌感染的 概率。 因此， 很大程度上来说对于手术或化疗后的患者而言， 其体内因缺失足 量有效的免疫抗体是其病情进一步恶化，同时引起各种病菌的机会性感染的根 本原因。
2、 PA-MSHA菌苗的广谱抗菌特性以及对肿瘤的辅助治疗特性
PA-MSHA菌株是牟希亚教授于 1984年分离培育得到的一种特异性绿脓 杆菌， 保藏号为 CGMCC0190, 其专利号为 CN 1090602A。 该菌株的灭活菌苗 已作为一种生物制品在 1996年获得国家二级新药的认证。 在临床上， 该灭活 菌苗作为一种广谱抗菌和肿瘤的辅助治疗产品已经得到广泛应用。
3、 产蛋禽类 IgY
被动免疫是直接应用特异抗体中和致病微生物及其产生的毒素，其来源主 要包括人类免疫球蛋白、 牛初乳、 产蛋禽类卵黄免疫球蛋白 （IgY) 和单克隆 抗体。相比较而言， 产蛋禽类例如鸡卵黄免疫球蛋白具有制备简单、 成本低廉 以及无毒性的显著特点。
在自然界状态下， IgY从母鸡血液转运到蛋黄中以保护未来的小鸡免受各 种感染性疾病。用抗原来人工免疫后的蛋鸡是大规模生产多克隆抗体的主要来 源。鸡 IgY在结构和功能上与哺乳动物 IgG相似， 目前国内外已有不少利用鸡 IgY来预防和治疗各种感染性疾病以及肿瘤的研究报道和专利申请， 如小儿轮 状病毒腹泻、 消化道感染、 呼吸道感染、 胃癌、 肝癌等。 利用菌苗来免疫蛋鸡 从而收获得到鸡 IgY的专利已有申请，但能达到广谱性抗菌作用以及在肿瘤中 能起到广谱免疫辅助治疗作用的鸡 IgY尚未见报道。 发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有产蛋禽类 IgY未具有广谱性抗菌 作用以及抗肿瘤辅助作用的缺陷，提供一种 PA-MSHA菌株 IgY及其制备方法 和应用。
为解决上述技术问题， 本发明提供一种 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法， 其中包括以下步骤：
(51) 制备 PA-MSHA菌株的抗原；
(52) 利用所述 PA-MSHA抗原， 对产蛋禽类进行多点皮下注射免疫， 检 取免疫禽类所产的免疫蛋；
(53) 取所述免疫蛋的蛋黄， 提取 PA-MSHA菌株 IgY。
在本发明所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法中， 所述步骤 (S1)包括： 将制备的保藏号为 CGMCC0190的甘露糖敏感性绿脓杆菌进行活化后在 LB固 体培养基中培养 18~20h， 培养温度均为 37°C， 然后接种于大豆酶解液培养基 内培养， 收集培养液后即制备得到所述 PA-MSHA菌株的抗原。 在本发明所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法中， 所述步骤 (S3)包括： a) 取免疫蛋去壳取黄， 除去粘附于蛋黄膜上的蛋白组分， 沥干后刺破蛋 黄膜， 收集蛋黄；
b) 将上述收集的蛋黄充分搅拌均匀后， 加入蛋黄匀浆 5倍体积 O.lmol/L PH7.2 磷酸盐-海藻糖稀释液， 制成稀释蛋黄液， 在该稀释蛋黄液中海藻糖的 重量百分比为 25%;
c) 将上述稀释蛋黄液置于 -20°C冰冻 3 小时， 然后取出于温室复融并以 800r/min 低速离心后沥出收集上清液， 然后再向沉淀物中加入 3 倍体积的 O.lmol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，混匀溶解沉淀物，依上法再次冻融收集 上清液， 如此反复冻融 3次， 合并收集各次得到的上清液备用；
d) 向上述收集上清液中按比例加入硫酸铵、 硫酸钠、 PEG、 硫酸葡聚糖、 藻酸钠或辛酸沉淀剂中的任一种或其复合物， 离心收集其沉淀物， 该沉淀物中 即含有 IgY;
e) 将上述沉淀物用蒸馏水复溶后透析或超滤浓縮或凝胶层析， 进一步纯 化得 IgY。
在本发明所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法中，所述产蛋禽类为母鸡。 本发明还提供了一种 PA-MSHA菌株 IgY, 采用如上所述的方法制备。 本发明还提供了一种 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品，由如上所述 的 PA-MSHA菌株 IgY组成。
本发明还提供了一种 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品，包含如上所 述的 PA-MSHA菌株 IgY。
本发明还提供了一种如上所述的 PA-MSHA菌株的应用，用于制备防治大 肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎球菌、 变形球菌、 幽门螺旋杆菌所引起的原发病的保 健品或生物制品。
本发明还提供了一种如上所述的 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品的 应用， 用于制备在乳腺癌、 肝癌、 淋巴癌、 肺癌、 膀胱癌、 白血病治疗时提高 机体免疫功能的辅助治疗的保健品或生物制品。
实施本发明的 PA-MSHA菌株 IgY及其制备方法， 具有以下有益效果：本 发明将甘露糖敏感性绿脓杆菌免疫产卵家禽，再从禽卵中提取提纯后可得到该
PA-MSHA菌株 IgY， 可进一步制成保健品和生物制品， 一方面可用于防治广 谱的机会感染菌群， 如大肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎球菌、 变形球菌、 幽门螺旋 杆菌等， 另一方面还可以对多种癌症起到良好的辅助治疗效果， 如乳腺癌、肝 癌、 淋巴癌、 肺癌、 膀胱癌、 白血病等。 本产品具有良好的活性和特异性， 适 用于广谱抗菌以及抗癌， 尤其适用于肿瘤的主、 被动免疫治疗。 具体实施方式
本发明的目的在于以甘露糖敏感性绿脓杆菌 （PA-MSHA) 作为抗原免疫 产蛋禽类例如母鸡后，在免疫蛋中提取纯化得到 IgY产品，并应用该产品配制 保健品和生物制品， 用于广谱抗菌以及肿瘤治疗中的辅助治疗。
本发明采用的甘露糖敏感性绿脓杆菌 （PA-MSHA)菌株为牟希亚于 1984 年分离培育得到的一种特异性绿脓杆菌， 保藏号为 CGMCC0190, 其专利号为 CN 1090602Ao本发明提供的 PA-MSHA菌株 IgY为具有广谱抗菌及抗癌的卵 黄免疫球蛋白的产品， 具体而言。 是一种抗大肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎球菌、 变形球菌、 幽门螺旋杆菌以及在乳腺癌、 肝癌、 淋巴癌、 肺癌、 膀胱癌、 白血 病等疾病治疗中起辅助作用的卵黄免疫球蛋白， 可用于制备保健品和生物制 品。 该产品可通过以下步骤获得： 用保存的上述 PA-MSHA菌株接种 LB半固 体培养基， 37°C过夜培养， 从而得到活化的 PA-MSHA菌株。 在 LB固体培养 基斜面接种活化的 PA-MSHA菌株， 37°C培养 18~20h， 然后接种于大豆酶解 液培养基内培养， 收集培养液后即制备得到 PA-MSHA菌株的抗原。将培养液 注射给产蛋禽类， 尤其是母鸡， 使其产生大量抗体并被输送到蛋黄中储存。其 中注射部位包括肌肉、 皮下、 皮内、 血管和生殖腔囊。 待 5〜20天后的免疫母 鸡所产生的鸡蛋中即含有相应的 IgY。
下面结合实施例更为具体地描述本发明的详细内容，但本发明的内容不仅 限于此。
实施例 具有广谱抗菌及抗癌的卵黄免疫球蛋白的产品的获得方法 通过上述过程获得了 PA-MSHA菌株的抗原， 注射后得到免疫蛋，例如鸡 蛋。下面对免疫蛋中提取出具有广谱抗菌以及抗癌的卵黄免疫球蛋白的制备过 程进行描述。该卵黄免疫球蛋白的提取纯化方法是采用水稀释法、反复冻融法 或硫酸铵、 硫酸钠、 PEG、 硫酸葡聚糖、 藻酸钠或辛酸沉淀或浸提、 萃取、 浓 縮、膜过滤的方法从鸡蛋黄中提取该抗体， 然后将该纯化的抗体添加相应辅料 包括海藻糖而制备成药剂学上的任意剂型包括片剂、 针剂、 口服液和喷雾剂。 其具体步骤包括：
a) 取鸡蛋去壳取黄， 除去粘附于蛋黄膜上的蛋白组分， 然后将蛋黄置于 灭菌蒸馏水中， 反复洗涤三次， 进一步除去蛋黄膜上的蛋白组分， 沥干后刺破 蛋黄膜， 收集蛋黄。
b) 将上述收集蛋黄充分搅拌均匀后， 加入蛋黄匀浆 5 倍体积 O.lmol/L PH7.2 磷酸盐-海藻糖稀释液， 制成稀释蛋黄液。 在该稀释蛋黄液中海藻糖的 重量百分比是 25%。
c)将上述稀释蛋黄液置于冰盒（-20°C )冰冻 3小时， 然后取出于温室复 融并低速离心 （800r/min) 后沥出收集上清液， 然后再向沉淀物中加入 3倍体 积的 O.lmol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液， 充分混匀溶解沉淀物， 依上法再 次冻融收集上清液， 如此反复冻融 3次， 合并收集各次得到的上清液备用。
d) 向上述收集上清液中按比例加入硫酸铵、 硫酸钠、 PEG、 硫酸葡聚糖、 藻酸钠或辛酸沉淀剂中的任一种或其复合物， 离心收集其沉淀物， 该沉淀物中 即含有目标产品中的卵黄免疫球蛋白。
e) 将上述沉淀物用蒸馏水复溶后透析或超滤浓縮或凝胶层析， 进一步纯 化。 由此获得 PA-MSHA菌株 IgY。
f) 向上述纯化的 PA-MSHA菌株 IgY抗体按比例添加相应辅料， 将其制 备成药剂学上的任意剂型包括片剂、 针剂、 口服液和喷雾剂， 得到各种 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品。 该 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物 制品可用于用于防治大肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎球菌、 变形球菌、 幽门螺旋杆 菌所引起的原发病， 以及用于乳腺癌、 肝癌、 淋巴癌、 肺癌、 膀胱癌、 白血病 治疗时提高机体免疫功能的辅助治疗。在此所述的辅料包括海藻糖。上述比例 为本领域技术人员熟知的生产保健品和生物制品所采用的比例。 实验结果表明： 批量制备的每个鸡蛋大约可提取 52mg~148mg 的蛋黄免 疫球蛋白 （IgY)， 平均每个鸡蛋可提取 82mg。 实施例 2: ELISA法检测蛋黄免疫球蛋白的效价
用绿脓杆菌抗原以 lO g/ml包被 96孔板， 4°C过夜， 次日用 pH7.4的 PBS 洗涤 3遍， 5%小牛血清封闭 12h， 洗涤后风干。 用无菌 PBS倍比稀释提纯的 卵黄免疫球蛋白 （从 1 :10开始，共 8个浓度组)，每孔加 100μ1，37 孵育 l h; 洗 涤风干后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白 (HRP-IgG， 浓度为 l:105)100pl， 37°C孵育 l h。 邻苯二胺 37°C避光显色 15min， 2mol/L硫酸终止 反应， 在酶标仪上读取 A450值。 设置无菌 PBS为空白对照。检测结果证实提 纯得到的蛋黄免疫球蛋白效价为 1:105。 实施例 3 : 蛋黄免疫球蛋白稳定性试验
蛋黄免疫球蛋白经过滤除菌， 以 10mg/ml分装小试管中， 分别于 -20°C冰 冻、 4°C和室温保存， 定期进行其效价检测。 实验结果表明： 蛋黄免疫球蛋白 于 -20°C冰冻保存， 其稳定性至少可保持 12个月以上； 于 4°C保存， 其稳定性 至少可以保持 6个月以上； 于室温保存， 其稳定性至少可以保存 2个月以上。 实施例 4: 口服 IgY对烧伤大鼠肠源性感染的影响
采用烧伤大鼠绿脓杆菌肠源性感染动物模型，用给烧伤大鼠口服 IgY的方 法， 考察其对严重烧伤大鼠肠源性感染的影响。
将健康 SD大鼠随机分为对照用的正常组， 头孢他啶治疗组及 IgY治疗组。 大鼠禁食 8小时后用 1%戊巴比妥钠 (30 mg/ kg) 腹腔注射麻醉,胃管内注入 1.5% NaHC03 lml， 待一分钟后注入 108CFU/ml的绿脓杆菌的菌悬液 （lml/lOOg), 自由进食。 菌悬液处理 8小时后， 1 %戊巴比妥钠 (30 mg/ kg)腹腔注射麻醉，在 麻醉的情况下进行背部 10%Na2S脱毛处理。正常组不做任何处理。头孢他啶治 疗组及 IgY治疗组用 100 °C不锈钢块接触脱毛区 20秒，造成 25%TBSA三度烧伤。 伤后立即腹腔注射生理盐水（3mg/100g)抗休克。头孢他啶治疗组尾静脉注射 抗生素 lml。 IgY治疗组烧伤后立即管饲 IgY 2ml ( lmg/ml)，每 12小时重复一次， 24h后停止管饲 IgY。 动物单笼管理， 自由饮水， 24小时后自由进食。 三组动物 均于烧伤处理后 24小时及 48小时活杀，解剖，分别检测腔静脉血中的细菌数量、 腔静脉血内毒素含量。 结合表 1和表 2的结果说明 IgY治疗组和头孢他啶治疗组 在抑菌的治疗效果方面无显著差异 （P>0.05 )
表 1 腔静脉血中的细菌数量 （lg lO cf / ml)
组别 24h 48h
正常组 2.25 ±0.32 2·43 ±0·21
头孢他啶治疗组 2·28 ±0·27 2.41 ±0.31
IgY治疗组 2.31 ±0.25 2·38±0·28 表 2 腔静脉血中内毒素含量的变化 （pg/ ml)
组别 24h 48h
正常组 32.3 ±9.6 33·4± 8·2
头孢他啶治疗组 36·1 ± 8·9 41·2 ± 11·8
IgY治疗组 37.3 ± 10.4 40·8± 11·5
实施例 5: 蛋黄免疫球蛋白动物水平对肝癌的治疗效果
将处在对数生长期的 Bel7404肝癌细胞株通过细胞悬液注射法建立肝癌 小鼠模型。 用灭菌的 PBS将对数生长期的 Bel7404配成 1 X 107/ml的细胞悬， 在裸鼠 6周龄， 体重约为 20g时， 向裸鼠的右侧腋窝注射 0.2ml细胞悬液， 约 7d后形成肺癌模型鼠。 将模型小鼠随机分成 4组， 每组 6只小鼠。 组别依次 为阴性对照组， 顺铂治疗组， IgY组， 顺铂与 IgY的联合治疗组， 同时设置正 常小鼠的空白对照组。分别对不同小组给予不同处理。阴性对照组不作任何治 疗处理； 顺铂治疗组： 每天注射顺铂 lmg/kg; IgY治疗组： 每天管饲 IgY 2ml; IgY组联合治疗组： 在顺铂给药 lmg/kg后管饲 IgY 2ml。 两周持续给药， 停止 给药后第二天处死裸鼠取瘤，对处理后各组小鼠的瘤块大小和重量分别加以检 测。表 3中瘤块大小和重量的结果表明治疗组均优于阴性对照组 (P<0.05)， 顺 铂治疗组效果要优于 IgY 抗体治疗组 （P<0.05)， 且均不及联合治疗组 (P< 0.05)。
表 3 肿瘤体积和重量的变化
组别 肿瘤体积 （mm3 ) 肿瘤重量 (g)
阴性对照组 45831.9±387.3 3.7±0.3
顺铂治疗组 2683.8 ±232.1 3.0±0.2
IgY治疗组 3912.3 ±342.3 3.4±0.3
联合治疗组 1897.7±265.3.1 2.2±0.2 实施例 6: 临床上蛋黄免疫球蛋白对肺癌的联合治疗效果
选择临床上有转移的晚期肺癌患者 15例， 随机分为化疗组、 化疗及 IgY 抗体联合治疗组。两组同期进行化疗， 联合治疗组加用 IgY抗体联合治疗， 隔 日一次进行 IgY口服给药。于三周期化疗后， 分别抽取外周血， 采用流式细胞 术（FcM)检测 CD3+总 T淋巴细胞、 CD4+辅助 T细胞、 CD8+杀伤 /抑制 T细胞， 计算 CD4+/CD8+比值， 同时对血清中的 IgG抗体的亚型 IgGI和 IgG2a的数量 分别加以统计。结果表明化疗组的患者外周血中淋巴细胞总数要少于联合治疗 组 (P<0.05)。 其中， 化疗组 CD4+T、 CD8+T数量以及 CD4+/CD8+比值均低于联 合治疗组 （P<0.05)。另夕卜，化疗组患者的血清中 IgG抗体的亚型 IgGI和 IgG2a 的数量也要低于联合治疗组 (P<0.05)。 IgGI抗体数量的增加反映了体液免疫的 增强， IgG2a抗体数量的增加反映了细胞免疫的增强。 这一结果说明， 在临床 上采用 IgY 抗体联合治疗肿瘤将能有效地从细胞免疫和体液免疫双方面提高 患者的免疫机能。
本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱 离本发明范围时， 可进行各种变化和等同替换。此外， 为适应本发明技术的特 定场合或材料， 可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。 因此， 本发明 并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施 例。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
(51) 制备 PA-MSHA菌株的抗原；
(52) 利用所述 PA-MSHA抗原， 对产蛋禽类进行注射免疫， 检取免疫禽 类所产的免疫蛋；
(53) 取所述免疫蛋的蛋黄， 提取 PA-MSHA菌株 IgY。
2、根据权利要求 1所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 (S1)包括：将制备的保藏号为 CGMCC0190的甘露糖敏感性绿脓杆菌 进行活化后在 LB固体培养基中培养 18~20h， 培养温度均为 37°C， 然后接种 于大豆酶解液培养基内培养，收集培养液后即制备得到所述 PA-MSHA菌株的 抗原。
3、 根据权利要求 1或 2所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (S3)包括：
a ) 取免疫蛋去壳取黄， 除去粘附于蛋黄膜上的蛋白组分， 沥干后刺破蛋 黄膜， 收集蛋黄；
b) 将上述收集的蛋黄充分搅拌均匀后， 加入蛋黄匀浆 5倍体积 O.lmol/L PH7.2 磷酸盐-海藻糖稀释液， 制成稀释蛋黄液， 在该稀释蛋黄液中海藻糖的 重量百分比为 25%;
c) 将上述稀释蛋黄液置于 -20°C冰冻 3 小时， 然后取出于温室复融并以 800r/min低速离心后沥出收集上清液， 然后再向沉淀物中加入 3 倍体积的 O.lmol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，混匀溶解沉淀物，依上法再次冻融收集 上清液， 如此反复冻融 3次， 合并收集各次得到的上清液备用；
d) 向上述收集上清液中按比例加入硫酸铵、 硫酸钠、 PEG、 硫酸葡聚糖、 藻酸钠或辛酸沉淀剂中的任一种或其复合物， 离心收集其沉淀物， 该沉淀物中 即含有 IgY;
e) 将上述沉淀物用蒸馏水复溶后透析或超滤浓縮或凝胶层析， 进一步纯 化得 IgY。
4、 根据权利要求 1或 2所述的 PA-MSHA菌株 IgY的制备方法， 其特征 在于， 所述产蛋禽类为母鸡。
5、一种 PA-MSHA菌株 IgY, 其特征在于， 采用权利要求 1-4中任意一项 所述的方法制备。
6、 一种 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品， 其特征在于， 由根据权 利要求 5所述的 PA-MSHA菌株 IgY组成。
7、 一种 PA-MSHA菌株 IgY保健品和生物制品， 其特征在于， 包含根据 权利要求 5所述的 PA-MSHA菌株 IgY。
8、一种根据权利要求 5所述的 PA-MSHA菌株 IgY的应用，其特征在于， 用于制备防治大肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎球菌、 变形球菌、 幽门螺旋杆菌所引 起的原发病的保健品或生物制品。
9、一种根据权利要求 5所述的 PA-MSHA菌株 IgY的应用，其特征在于， 用于制备在乳腺癌、 肝癌、 淋巴癌、 肺癌、 膀胱癌、 白血病治疗时提高机体免 疫功能的辅助治疗的保健品或生物制品。
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