CN102488899A - 一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，它是由人型轮状病毒为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞，通过病毒培养，收获病毒液，经纯化、超滤浓缩获得原液，注射到SPF母鸡体内，经此免疫后，取鸡蛋卵黄经分离提取、纯化得到卵黄免疫球蛋白。再加入卵磷脂制成注射液。注射卵黄免疫球蛋白可有效替代抗生素预防和治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。
Description
技术领域：
本发明涉及一种预防或治疗人类的肠道传染病生物新药的制备以及开发，特别是一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途。
背景技术：
近年来，国外已有报道证实当用病毒作抗原免疫产蛋母鸡时，蛋黄中能产生相应的抗该病毒的特异性多克隆卵黄免疫球蛋白(IgY)，且产量大，便于提纯，尤其卵黄免疫球蛋白稳定性好，其耐酸碱和热能力与免疫球蛋白(IgG)相似，能抵抗幼龄动物的胃酸屏障，卵黄免疫球蛋白可使实验动物获得对应病原体引起的胃肠道感染性疾病的免疫保护作用。因此，可用于防治经胃肠道感染的病毒性疾病，如轮状病毒引起的婴幼儿秋冬腹泻。并且，引起消化道感染性疾病的病原体大多分布在消化道粘膜表面，而卵黄免疫球蛋白抗体大部分经过消化道代谢，只有很少的一部分被吸收入血。因此，抗原特异性的卵黄免疫球蛋白有利于消化道局部大量病原体特异性的抗体，从而大大地提高治疗效果。在胃肠道感染性疾病治疗上有广阔的应用前景，引起了广泛的关注。IgY在食品、医药、生物等方面的应用越来越广泛.其作用机理逐渐被阐明和完善。IgY已被证明能有效替代抗生素预防和治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。
卵黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。
在免疫治疗方面，因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳定，可经用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时，IgY成为首选。
发明内容：
本发明的目的是要提供一种安全、可靠、经济简便、易于推广，适用面广的针对轮状病毒的卵黄IgY抗体缓释制剂及其制备方法与应用。
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，它是由人型轮状病毒为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞，通过病毒培养，收获病毒液，经纯化、超滤浓缩获得原液，注射到SPF母鸡体内，经此免疫后，取鸡蛋卵黄经分离提取、纯化得到卵黄免疫球蛋白。再加入卵磷脂制成注射液。用于预防或治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。
所用人型轮状病毒为Wa株和猴型SA11株的二联体。
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法：
(1)细胞培养
将MA-104细胞用旋转培养瓶连续传代培养，用胰蛋白酶处理细胞，加入病毒液，然后吸去病毒液，以维持液继续培养，至细胞病变达75％时收获病毒液。
(2)病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎，离心，上清中加入PEG6000，放置过夜，离心，沉淀用PBS重悬，上样至Sepharose GL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
(3)动物免疫
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂。待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。
(4)免疫鸡蛋的处理
免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，匀化后静置过夜。
(5)免疫球蛋白纯化
上清加入饱和硫酸铵梯度沉淀，静置，离心，沉淀用PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩。
(6)制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的用途：
(1)在疾病预防方面的应用
研究表明，IgY能抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。可以在动物饲料或婴幼儿食品添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY，以使其获得有效的被动免疫。
(2)在疾病治疗方面的应用
目前，卵黄抗体己被广泛应用于许多疾病的防治。IgY可能主要通过以下作用环节达到抗菌的作用：特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fc部分)留在肠内。用卵黄抗体治疗疾病，安全、高效且无公害。
(3)在疾病诊断方面的应用
卵黄抗体和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处，如它不与金色葡萄球菌A蛋白结合，不与哺乳动物Fc受体结合，对哺乳动物补体无固定作用等，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，所以卵黄抗体可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等。
本发明的优点在于：采用该方法制得的卵黄免疫球蛋白注射液预防或治疗由轮状病毒引起的疾病，特异性强，能抵抗体内胃酸屏障，可大大提高治疗效果。并且加入了卵磷脂制成缓释制剂，具有了药物有效成分缓慢释放，效果持久，降低药物用量的优点。
具体实施方式：
通过下面给出的本发明的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明的内容，但它们不是对本发明的限定。
实施例1：
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途包括如下步骤：
1.免疫原的制备
1.1材料的选择
采用标准人型轮状病毒Wa株、猴型SA11株二联体为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞。
1.2细胞培养
将MA-104细胞连续传代培养至2500ml旋转培养瓶(DMEM培养基，含10％新生小牛血清，1％抗生素和1.5％碳酸氢钠)，37℃旋转培养24小时，以20ug/ml的胰蛋白酶处理细胞30分钟，而后加入病毒液5ml吸附1h，而后吸去病毒液，以维持液(无血清培养基，含2ug/ml胰蛋白酶)继续培养48～72h，至细胞病变达75％时收获病毒。
1.3病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎2min，6000rpm离心15min，上清中加入8％PEG6000，4℃过夜，8500rpm 4℃离心20min，沉淀用0.05MPBS重悬，上样至SepharoseGL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
2.动物免疫
2.1动物的选择及给药处理
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡(标准II级清洁级动物房，三级空气过滤)，每只鸡于胸、腹及大腿内侧多点肌内注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂1.5-2.0ml(Wa+SALL或Wa+WC3，CPE 2×10-5各0.5ml，与等量不完全福氏佐剂混合乳化)。
2.2动物免疫
分别在第二周、第四周加强免疫一次，定期检测卵黄免疫球蛋白中和效价，待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。当卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.免疫球蛋白制备
3.1免疫鸡蛋的处理
超免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶6加入pH4.0-5.0的酸化无菌去离子化，匀化后4℃静置过夜。
3.2免疫球蛋白纯化
上清液加入20％的饱和硫酸铵梯度沉淀，4℃静置6h，8000rpm离心20min，沉淀用0.05M的PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)。
3.3制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
实施例2：
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途包括如下步骤：
1.免疫原的制备
1.1材料的选择
采用标准人型轮状病毒Wa株、猴型SA11株二联体为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞。
1.2细胞培养
将MA-104细胞连续传代培养至2500ml旋转培养瓶(DMEM培养基，含10％新生小牛血清，1％抗生素和1.5％碳酸氢钠)，37℃旋转培养24小时，以20ug/ml的胰蛋白酶处理细胞30分钟，而后加入病毒液5ml吸附1h，而后吸去病毒液，以维持液(无血清培养基，含2ug/ml胰蛋白酶)继续培养48-72h，至细胞病变达75％时收获病毒。
1.3病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎2min，6000rpm离心15min，上清中加入8％PEG6000，4℃过夜，8500rpm 4℃离心20min，沉淀用0.05MPBS重悬，上样至SepharoseGL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
2.动物免疫
2.1动物的选择及给药处理
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡(标准II级清洁级动物房，三级空气过滤)，每只鸡于胸、腹及大腿内侧多点肌内注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂1.5-2.0ml(Wa+SALL或Wa+WC3，CPE 2×10-5各0.5ml，与等量不完全福氏佐剂混合乳化)。
2.2动物免疫
分别在第二周、第四周加强免疫一次，定期检测卵黄免疫球蛋白中和效价，待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。当卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.免疫球蛋白制备
3.1免疫鸡蛋的处理
超免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶6加入pH4.0-5.0的酸化无菌去离子化，匀化后4℃静置过夜。
3.2免疫球蛋白纯化
上清液加入35％的饱和硫酸铵梯度沉淀，4℃静置6h，8000rpm离心20min，沉淀用0.05M的PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)。
3.3制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
实施例3：
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途包括如下步骤：
1.免疫原的制备
1.1材料的选择
采用标准人型轮状病毒Wa株、猴型SA11株二联体为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞。
1.2细胞培养
将MA-104细胞连续传代培养至2500ml旋转培养瓶(DMEM培养基，含10％新生小牛血清，1％抗生素和1.5％碳酸氢钠)，37℃旋转培养24小时，以20ug/ml的胰蛋白酶处理细胞30分钟，而后加入病毒液5ml吸附1h，而后吸去病毒液，以维持液(无血清培养基，含2ug/ml胰蛋白酶)继续培养48-72h，至细胞病变达75％时收获病毒。
1.3病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎2min，6000rpm离心15min，上清中加入8％PEG6000，4℃过夜，8500rpm 4℃离心20min，沉淀用0.05MPBS重悬，上样至SepharoseGL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
2.动物免疫
2.1动物的选择及给药处理
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡(标准II级清洁级动物房，三级空气过滤)，每只鸡于胸、腹及大腿内侧多点肌内注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂1.5-2.0ml(Wa+SALL或Wa+WC3，CPE 2×10-5各0.5ml，与等量不完全福氏佐剂混合乳化)。
2.2动物免疫
分别在第二周、第四周加强免疫一次，定期检测卵黄免疫球蛋白中和效价，待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。当卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.免疫球蛋白制备
3.1免疫鸡蛋的处理
超免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶6加入pH4.0-5.0的酸化无菌去离子化，匀化后4℃静置过夜。
3.2免疫球蛋白纯化
上清液加入40％的饱和硫酸铵梯度沉淀，4℃静置6h，8000rpm离心20min，沉淀用0.05M的PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)。
3.3制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
实施例4：
一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途包括如下步骤：
1.免疫原的制备
1.1材料的选择
采用标准人型轮状病毒Wa株、猴型SA11株二联体为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞。
1.2细胞培养
将MA-104细胞连续传代培养至2500ml旋转培养瓶(DMEM培养基，含10％新生小牛血清，1％抗生素和1.5％碳酸氢钠)，37℃旋转培养24小时，以20ug/ml的胰蛋白酶处理细胞30分钟，而后加入病毒液5ml吸附1h，而后吸去病毒液，以维持液(无血清培养基，含2ug/ml胰蛋白酶)继续培养48-72h，至细胞病变达75％时收获病毒。
1.3病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎2min，6000rpm离心15min，上清中加入8％PEG6000，4℃过夜，8500rpm 4℃离心20min，沉淀用0.05MPBS重悬，上样至SepharoseGL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
2.动物免疫
2.1动物的选择及给药处理
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡(标准II级清洁级动物房，三级空气过滤)，每只鸡于胸、腹及大腿内侧多点肌内注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂1.5-2.0ml(Wa+SALL或Wa+WC3，CPE 2×10-5各0.5ml，与等量不完全福氏佐剂混合乳化)。
2.2动物免疫
分别在第二周、第四周加强免疫一次，定期检测卵黄免疫球蛋白中和效价，待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。当卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.免疫球蛋白制备
3.1免疫鸡蛋的处理
超免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶6加入pH4.0-5.0的酸化无菌去离子化，匀化后4℃静置过夜。
3.2免疫球蛋白纯化
上清液加入50％的饱和硫酸铵梯度沉淀，4℃静置6h，8000rpm离心20min，沉淀用0.05M的PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩(PELLICON CASSETTE，100000NMWL，MILLIPORE)。
3.3制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
Claims (4)
1.一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，其特征是：卵黄免疫球蛋白缓释制剂采用人型轮状病毒为免疫原，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞，通过病毒培养，收获病毒液，经纯化、超滤浓缩获得双价病毒液，经灭活后注射到SPF母鸡体内，经此免疫后，取鸡蛋卵黄经分离提取、纯化得到卵黄免疫球蛋白，再加入卵磷脂制成注射液。
2.一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，如权利要求1所述，其特征是：所用人型轮状病毒为Wa株和猴型SA11株的二联体。
3.一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，如权利要求1所述，其特征是：卵黄免疫球蛋白缓释制剂的用途为：可有效替代抗生素预防和治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。
4.一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，如权利要求1所述，其特征是：抗轮状病毒卵黄抗体的制备方法如下步骤：
(1)细胞培养
将MA-104细胞用旋转培养瓶连续传代培养，用胰蛋白酶处理细胞，加入病毒液，然后吸去病毒液，以维持液继续培养，至细胞病变达75％时收获病毒液；
(2)病毒培养液的纯化
病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎，离心，上清中加入PEG6000，放置过夜，离心，沉淀用PBS重悬，上样至Sepharose GL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定；
(3)动物免疫
采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂，待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取；
(4)免疫鸡蛋的处理
免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，匀化后静置过夜；
(5)免疫球蛋白纯化
上清加入饱和硫酸铵梯度沉淀，静置，离心，沉淀用PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩；
(6)制剂制备
加入卵磷脂制成注射液。
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| CN114081944A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-02-25 | 吉林市国科医工科技发展有限公司 | 一种用于治疗幽门螺旋杆菌感染的胃漂浮剂 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120613 |