JP4176464B2 - 鳥卵からの伝達因子 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の属する技術分野）
本発明は一般に、抗原特異的伝達因子を生成する方法、そのような抗原特異的伝達因子を含む組成物、およびそのような組成物の使用方法に関する。本発明は詳細には、鳥類のホストで抗原特異的伝達因子を生成し、卵から抗原特異的伝達因子を得る方法に関する。
【０００２】
（関連技術の背景）
多くの死を招く病原体が動物界から人間に伝搬される。例えば猿は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ならびにサル痘（天然痘に類似する）を引き起こすＩ型ヒト免疫不全ウィルス（ＨＬＶ−Ｉ）の源であり；陸棲哺乳類はエボラウイルスの源であると考えられており；オオコウモリとブタはニパウイルスの源であり；ヘンドラ（Hendra）ウイルスは馬から由来し；「ホンコン風邪」はニワトリから端を発し；野鳥（特にあひる）は多くの死を招くインフルエンザウイルスの源である。多くの疾病も動物の保有宿主を有する。例えば、マウスはハンタ（Hanta ）ウイルスを保有し、ラットは黒死病を保有し、鹿はライム病を保有する。
【０００３】
（免疫系）
脊椎動物の免疫系は寄生動物、細菌、真菌およびウイルスのような病原体を認識し、それらの侵入から身体を防御するように装備されている。脊椎動物の免疫系は通常、細胞成分と、非細胞成分とを有する。
【０００４】
免疫系の細胞成分には、いわゆるリンパ球または白血球細胞が含まれ、それにはいくつかの種類がある。成熟した免疫系の細胞成分は一般に、侵入する病原体への一次の非特異的応答を開始し、同様に、病原体に対する二次の特異的応答にも関与する。
【０００５】
病原体による感染に対する一次すなわち初期の応答では、食細胞として知られている白血球細胞が、侵入する病原体を見つけて攻撃する。通常、食細胞は病原体を内部移行すなわち「摂食」し、その後病原体を消化する。さらに、白血球細胞は、病原体による感染に応答して、病原体を攻撃するかまたは病原体に対する攻撃を指示するのを支援するように意図された化学物質を生産および排出する。
【０００６】
侵入する病原体による感染が一次免疫応答を回避し続ける場合のみ、病原体に対する特異的な二次免疫応答が必要とされる。この二次免疫応答は通常遅れて起こるため、「遅延型過敏」としても知られている。哺乳類は、病原体に感染するようになってから約７日〜約１４日経つまで、通常は自身で病原体への二次免疫応答を誘発しない。二次免疫応答は特異的病原体への後天性免疫とも称される。病原体は「抗原」と称される１または複数の特有のタンパク質を有する。二次免疫応答では、Ｂリンパ球として知られる白血球細胞すなわち「Ｂ細胞」と、Ｔリンパ球すなわち「Ｔ細胞」とが、病原体の１または複数の抗原の認識を「学習」する。Ｂ細胞とＴ細胞は、病原体上の１または複数の特定の抗原に特異的な「抗体」と称されるタンパク質を生成すべく、共に作用する。
【０００７】
Ｔ細胞は、病原体または抗原性物質への二次すなわち遅延型過敏免疫応答を主に担う。Ｔ細胞にはヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および細胞毒性（「細胞を殺す」という意味）Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）またはキラーＴ細胞とも称される抗原特異的Ｔ細胞、の３つのタイプがある。ヘルパーＴ細胞とサプレッサーＴ細胞は、特定の抗原に対して特異的ではないが、感染した宿主からの病原体または抗原性物質の除去を支援する条件付け機能（例えば感染に通常伴う炎症）を遂行する。
【０００８】
抗体は、免疫系の非細胞成分の一部のみを構成するが、特異的抗原を認識するため、「抗原特異的」であるとされている。その後、生成された抗体は基本的に、白血球細胞が病原体を見つけてそれを身体から除去するのを支援する。通常は、一旦白血球細胞が病原体に対する抗体を生成すれば、白血球細胞とその前駆細胞はすべて、その抗体を生産し続ける。感染が除去された後は、認識された抗原に対応する少数のＴ細胞とＢ細胞が「休止」状態で保持される。対応する病原体または抗原性物質が再び宿主に感染すると、その「休止」しているＴ細胞とＢ細胞は活性化し、約４８時間以内に迅速な免疫応答を引き起こす。このように応答することにより、免疫系は病原体への二次免疫応答を開始し、免疫系はその病原体に対する「記憶」を有するとされる。
【０００９】
感染病原体に対する二次免疫応答の一部として、哺乳類の免疫系が「伝達因子」として知られるより小型のタンパク質を生産することも知られている。伝達因子は哺乳類の免疫系の別の非細胞部分である。抗原特異的伝達因子は抗体と構造が類似しているが、はるかにそれより小さな分子の大きさをしていると考えられている。抗原特異的伝達因子と抗体は、いずれも抗原特異的部位を有し、いずれもそれらのエフェクタ細胞上のレセプター部位と相互作用する高度に保存された領域を有している。伝達因子と抗体分子では、第３の「リンカー」領域が、抗原特異的部位と高度に保存された領域とをつないでいる。
【００１０】
（免疫系における伝達因子の役割）
伝達因子はリンパ球の低分子量の分離物である。狭義には、伝達因子は、１つの抗原に対する特異性を有し得る。いずれもKirkpatrick らに付与された米国特許第５，８４０，７００号および第５，４７０，８３５号（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら（これらをまとめて以下「Kirkpatrick 特許」と称する）は、特定の抗原に特異的な伝達因子の単離について開示している。より広義には、「特異的」伝達因子が、単一クローンのリンパ球の細胞培養物から産生されている。そのような伝達因子を１つの病原体に対して生成しても、該伝達因子はその病原体の種々の抗原部位に対する特異性を有している。従って、そのような伝達因子は、抗原特異的であるというよりも「病原体特異的である」とされている。同様に、特定の病原体で感染させた宿主から得られる伝達因子も病原体特異的である。そのような調製物は、特定の抗原が存在した時に二次免疫応答を誘発するその能力のため、「抗原特異的」として当該技術分野では称されることが多いが、異なる特異性を有する複数の伝達因子が存在する可能性もある。従って、いわゆる「抗原特異的」な病原体特異的伝達因子の調製物であっても、様々な抗原に対して特異的である可能性がある。
【００１１】
さらに、抗原特異的および病原体特異的な伝達因子は、宿主に、そのような伝達因子分子が特異的でない病原体または抗原への遅延型過敏免疫応答を誘発させ得ると考えられている。伝達因子は、感染病原体または抗原性物質に対する二次すなわち遅延型過敏免疫応答を促進するために、感染病原体または抗原性物質に少なくとも非特異的Ｔ細胞、インデューサーＴ細胞およびサプレッサーＴ細胞を「引き寄せる」。
【００１２】
一般に、伝達因子は、免疫学的に活性な哺乳類源から得られ、かつ約１０，０００ダルトン（Ｄ）未満の分子量を有する、タンパク質の単離物から成る。伝達因子は、哺乳類の免疫系にインビトロまたはインビトロのいずれで加えても、レシピエント哺乳類の免疫系の応答を改善または正常化することが知られている。
【００１３】
新生児（仔）の免疫系は、通常、侵入病原体から新生児（仔）を有効に防御するほど十分には発達すなわち「成熟」していない。さらに、誕生前には、多くの哺乳類がその母親により広範な病原体から保護されている。従って、生まれたての哺乳類の多くは、様々な病原体に対する二次応答を直接誘発することができない。正確に言えば、生まれたての哺乳類は通常、病原体に対する二次免疫を母親から与えられる。母親が新生児（仔）の免疫系を高めるよく知られている１つの方法は、新生児（仔）に１組の伝達因子を供給することによるものである。哺乳類では、伝達因子は母親により初乳として新生児（仔）に供給されるが、初乳は通常１、２日後には母親の乳と置き換えられる。伝達因子は基本的に、母親の獲得した特異的（すなわち遅延型過敏）免疫を新生児（仔）に伝える。新生児（仔）の免疫系が自身で病原体から新生児（仔）を防御できるようになるまで、この伝えられた免疫が、通常、抗原特異的様式で、かつ抗原または病原体非特異性な様式で、病原体に抗して応答するように新生児（仔）の免疫系の細胞を条件付けする。従って、伝達因子が存在する場合、新生児の免疫系は、通常の遅延型過敏応答で起こるような過敏応答で病原体に応答するように条件付けられる。従って、伝達因子は病原体に対する免疫系の応答性を「ジャンプスタート（jump-start、後押しして開始する）」すると言われている。
【００１４】
伝達因子に関する多くの研究が近年行われている。現在、伝達因子は約４４個のアミノ酸長さのタンパク質であると考えられている。伝達因子は、約４，０００〜約５，０００ダルトン（Ｄ）、すなわち約４ｋＤ〜約５ｋＤの範囲の分子量を有すると考えられている。伝達因子はまた、インデューサー部分、免疫サプレッサー部分、および抗原特異的部分の３つの機能的部分を含むと考えられている。当該技術分野における多くの者は、伝達因子が、タンパク質分子と接続可能であるかまたは分離可能な哺乳類免疫系に二次免疫応答を誘発させる伝達因子の能力を増強するヌクレオシド部分もさらに含むと考えている。ヌクレオシド部分は伝達因子のインデューサー部分またはサプレッサー部分の一部である可能性もある。
【００１５】
抗原特異的伝達因子の抗原特異的領域は、約８個〜約１２個のアミノ酸を含むと考えられている。約１０個のアミノ酸の第２の高度に保存された領域は、非常に親和性の高いＴ細胞受容体結合領域であると考えられる。残りのアミノ酸はこの２つの活性領域を結合するように機能し得るか、あるいはさらなる未発見の特性を有し得る。伝達因子分子の抗原特異的領域は、抗体の既知の抗原特異的構造と類似しているが、はるかに小さな分子量の大きさであり、超可変であるように思われ、１または複数の病原体上の特徴的なタンパク質を認識するように適合される。インデューサー部分と免疫サプレッサー部分は細胞が自身の環境内の病原体による刺激に対して十分に応答できるように免疫系の様々な細胞を条件付ける能力を、伝達因子に与えると考えられている。
【００１６】
（非細胞免疫系成分の源）
従来、伝達因子は、乳牛の初乳から得られていた。乳牛は一般に、比較的短期間に大量の初乳および従って大量の伝達因子を生産するが、乳牛は毎年約１日間か１日半しか初乳を生産しない。従って、乳牛は、伝達因子のコンスタントな供給源でなければ、伝達因子の効率的な供給源でもない。
【００１７】
伝達因子は種々の他の哺乳類源からも得られている。例えば、伝達因子を研究する際に、マウスが伝達因子の供給源として使用されている。抗原を一般にマウスに皮下投与し、その後、抗原に対する遅延型過敏応答が見られた後でマウスを殺処分する。その後、伝達因子をマウスの脾臓細胞から得る。
【００１８】
抗体の生産を生じさせるためには様々なメカニズムが一般に使用されているが、抗体の元々の供給源はやはり哺乳類であり得る。例えば、モノクローナル抗体は、マウス、ウサギ、または他の哺乳類に抗原を注射し、該哺乳類から抗体産生細胞を取得し、その後抗体産生細胞を不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞系統を生成することにより得られる。ハイブリドーマ細胞系統は細胞のいくつかの世代にわたって、すなわち従って長期間の間、モノクローナル抗体を生産し続けるだろう。
【００１９】
哺乳類病原体に対する抗体が、マウス、ウサギ、ブタ、ウシおよび他の哺乳類を始めとする広範な源から得られている。さらに、風邪などのいくつかのヒト疾病を引き起こす病原体は、鳥に端を発することが知られている。鳥類（すなわち鳥）の免疫系と哺乳類の免疫系が非常に類似していることが理解されるようになってきているため、研究者の中には抗体産生のための源を鳥に変えるものもいる。
【００２０】
Tokoroに付与された１９９２年１月１４日に発行された米国特許第５，０８０，８９５号（以下「’８９５特許」）は、新生仔の哺乳類に腸感染症を引き起こす病原体を雌鶏に注射することから成る方法を開示している。その後雌鶏はそのような病原体に対する特異的抗体を生産し、抗体は雌鶏が生んだ卵の中に存在する。’８９５特許はそのような病原体特異的抗体を含む組成物と、新生仔の子豚と子牛での腸疾患を治療および予防するための該組成物の使用方法とを開示している。さらに、’８９５特許は、病原体特異的伝達因子様物質が、雌鶏からその雌鳥の卵へと伝えられることを仮定している。にもかかわらず、’８９５特許は、そのような伝達因子様物質が実際に卵の中に存在することも、そのような伝達因子様物質を含むと仮定された卵由来の抗体を含まない組成物が実際に新生仔の哺乳類の腸疾患を治療または予防したことも開示していない。実際のところ、’８９５特許は、伝達因子を抗体から分離するのに約０．４５μｍ径の孔を備えたフィルタを使用することを開示している。しかしながら、当業者には理解されるだろうが、抗体、より大きな分子、ウイルス、およびいくつかの細菌さえもが、０．４５μｍのフィルタの孔を通り抜ける。実際、約１２，０００Ｄ未満の分子量を有するタンパク質分子がそのようなフィルタによって分離される可能性は低い。しかしながら、使用したフィルタの孔径に基づくと、抗体を始めとする個々のタンパク質分子がフィルタによって全く除去されなかった可能性がより高そうである。
【００２１】
哺乳類病原体に特異的な鳥類抗体は、卵に抗原を導入することによっても得られている。
しかしながら、哺乳類の免疫系は、抗体自体への免疫応答の誘発により、大きな鳥類の抗体分子に否定的に応答する可能性があるため、鳥類の抗体を用いて哺乳類の病原体感染を治療することは一般には望ましくない。さらに、哺乳類の免疫系は鳥類の抗体を、特定の病原体を認識するその能力に関して、またはそのような病原体の抗原に対する鳥類抗体の特異性に関して、有用であるとは認識しないため、鳥類抗体は哺乳類では所望の免疫応答を誘発しないことさえある。
【００２２】
本発明者は、非哺乳類源で伝達因子を生成する方法、鳥類源を始めとするそのような非哺乳類源から伝達因子を得る効率的な方法、または病原体による感染の治療および予防に際してそのような伝達因子を使用する方法を教示するいかなる先行技術も知らない。
【００２３】
（発明の開示）
本発明は、鳥類源で伝達因子の生産を生じさせ、該鳥類源から伝達因子を得る方法を包含する。さらに、鳥類の伝達因子を含む組成物と、そのような組成物を使用する方法も、本発明の範囲内にある。
【００２４】
本発明に従って生成し、取得し、使用する鳥類の伝達因子は、抗原非特異的であっても、抗原特異的（つまり１または複数の抗原に結合または認識するように構成される）であってもよい。別段の定めがない限り、用語「伝達因子」は、本明細書に使用する場合、病原体特異的伝達因子、抗原特異的伝達因子、ならびに特定の病原体または抗原性物質に非特異的な伝達因子を始めとする様々なタイプの各伝達因子を含む、先に論じた広い定義を包含している。伝達因子に関して本明細書で使用する場合、用語「非特異的」とは、特定の抗原に対して特異的でない伝達因子と、異なる抗原特異性を備えた複数の伝達因子を含む混合物との両方を指す。
【００２５】
非特異的伝達因子には、鳥類源動物が既に生産している伝達因子が含まれる。源動物により生成される個々の非特異的伝達因子分子は、源動物の環境中に存在する病原体を始めとする種々の抗原性物質に対する特異性を有し得る。それにもかかわらず、本発明のためには、単に源動物のその環境への応答により生成される伝達因子を、「非特異的」なものであると称する。
【００２６】
他方、抗原特異的伝達因子は、鳥類の源動物を１または複数の抗原に曝露することにより生成される。本発明者により、細菌、ウイルス、真菌および寄生動物を含むがそれらに限定されない様々な種類の病原体の抗原が、鳥類源での非特異的伝達因子の生成を引き起こすことが見出された。抗原特異的伝達因子は自然抗原（生の源、不活性化源、弱毒化源を含む）と合成抗原のいずれによっても鳥類源動物により生成された。
【００２７】
鳥類源での伝達因子の生産は、特定の病原体に特徴的な抗原を雌の鳥類源動物に導入することにより引き起こすことが可能である。本発明の範囲を制限しない使用可能な源動物の例証的な種類としては、鳥類、爬虫類、両生類および魚類が含まれる。好ましくは鳥類源動物は頻繁に卵を生む。従って、本発明のためには、鳥類源動物として雌鶏が特に有用である。このような鳥類源動物は伝達因子を生産し、その後、伝達因子は該源動物の卵に現われる。代わりに、鳥類源動物の卵を抗原性物質に（例えば抗原性物質を卵に注射することにより）曝露することにより、卵自体による伝達因子の生産を引き起こすようにしてもよい。
【００２８】
鳥類源動物によってまたは鳥類源動物の卵によって生成された伝達因子は、卵から回収され、抗体を含めたより大きな分子量のタンパク質を含む卵の他の成分から分離され得る。代わりに、伝達因子は、鳥類源動物の１または複数の卵から精製されてもよい。
【００２９】
その後、鳥類伝達因子は、哺乳類か鳥類の対象に投与するために組成物または装置に組み込まれるか、該対象に直接投与され得る。鳥類伝達因子または該鳥類伝達因子を含む組成物は、腸内（すなわち経口）または非経口（すなわち皮膚などを通じた注射を始めとする非経口経路により）投与され得る。非特異的および特異的の両方の鳥類伝達因子の投与が、様々な侵入病原体に対する哺乳類の早期の特異的（すなわち二次）免疫応答を開始することが分かった。従って、鳥類伝達因子は、そのような様々な病原体によって引き起こされる恐れのある疾病の治療および予防に有用であることが分かった。
【００３０】
本発明の他の特徴および利点が、当業者には、以下の説明、本発明の例証的実施形態を例証する添付図面、および特許請求の範囲を考慮することにより明らかとなるだろう。
【００３１】
（発明を実施するための最良の形態）
本明細書に上述したように、哺乳類の母親は伝達因子を初乳で生まれたての子供に伝えるが、初乳は約１日か２日後に母親の乳と置き換えられる。初乳の中にある伝達因子は、特定の抗原に対する遅延型過敏を子供に伝え、子供が特定の病原体に感染するようになった場合に、新生児（仔）の免疫系が特定の病原体に応答する能力を「ジャンプスタート」させる。
【００３２】
近年、鳥類（つまり鳥）の免疫系が哺乳類の免疫系と非常に似ていることが発見された。実際、免疫系の成分に関する初期の研究は鳥で行なわれていた。免疫系に関するそのような初期の研究の結果、本明細書で上述した白血球細胞の種類の１つであるＢ細胞は、鳥の嚢に由来するためそのように名付けられた。さらに、風邪やインフルエンザＡ型ウィルスを引き起こすいくつかのウイルスを含めた様々な伝染病原体が、鳥に端を発し、ヒトに伝えられることが知られている。
【００３３】
鳥類の免疫系は哺乳類の免疫系といくつかの類似点を有するため、本発明者は、伝達因子が鳥類の免疫系の成分であると共に他の非哺乳類の脊椎動物の免疫系でもあると考えている。さらに、本発明者は、非哺乳類の母親は生まれたての子供に初乳を与えないが、それでもそのような動物は伝達因子を介して子供に免疫を伝えるものと考えている。鳥および卵生脊椎動物では、母親が子供に伝達因子を供給する主な機会は卵の黄身にあり、黄身は成長中の胚に必要な栄養素を供給する。従って、本発明者は、卵から抗原非特異的および抗原特異的な伝達因子を得ることができる可能性を長い間考えていた。
【００３４】
図１は、伝達因子の非哺乳類源１０（この場合雌鶏）から所望の伝達因子を得る方法を概略的に例証している。非哺乳類源１０は環境中の抗原性物質１２ａに曝されるか、または特異的な抗原性物質１２ｂに曝され得る。当該技術分野で周知なように、非哺乳類源１０は注射により、経口的に、またはその他の様式で、特異的抗原性物質１２ｂに曝され得る。非哺乳類源１０は、アジュバントが共に存在するかまたはしない状態で、抗原性物質１２ｂに曝され得る。特異的抗原性物質１２ｂへのそのような露出は、１回起こってもよいし、または繰り返されても良い。簡単にするため、抗原性物質１２ａ，１２ｂをここでは抗原性物質１２または単に抗原とも称する。
【００３５】
代わりに、図２を参照すると、当該技術分野で周知のように、非哺乳類の動物の卵１４’を、注射によりまたはその他の様式で、１または複数の抗原性物質１２に直接曝してもよい。
【００３６】
図３を参照すると、１または複数の抗原性物質１２に直接曝した非哺乳類源１０または非哺乳類の卵１４’に、抗原性物質１２に対する二次または遅延型過敏免疫応答を誘発する適切な機会を与えた後で、卵１４が採集される。その後、卵１４の卵黄１６と卵白１８を互いに分離し、卵黄１６に種々の濾過プロセスを行って、伝達因子を含むその水可溶性分画２０を得る。抗体のようなより大きな分子量のタンパク質も、分子量に基づいて濾過したりそのような大きな分子量のタンパク質を溶液から（例えば冷エチルアルコール中で）沈殿させたりした後に水可溶性分画２０から（例えば濾過により）沈殿物２１を除去して実質的に抗体を含まない伝達因子含有溶液２２を提供する等の既知のプロセスにより、卵黄１６の水可溶性分画２０から除去することができる。代わりに、卵黄１６と卵白１８は分離しなくてもよい。
【００３７】
さらには、卵黄１６の水可溶性分画２０中または溶液２２中に存在する抗原特
異的な非哺乳類の伝達因子を、いずれの開示もその全体が参照により本願に組み込まれるいずれもKirkpatrick らに付与された米国特許第５，８４０，７００号および第５，４７０，８３５号（これらをまとめて以下「Kirkpatrick 特許」と称する）に開示されているゲル透過技術やアフィニティクロマトグラフィー技術の使用のような既知の技術により、水可溶性分画２０または溶液２２の他の成分から実質的に精製することが可能である。Kirkpatrick 特許に開示された技術は、伝達因子および抗体のような生体分子を、１または複数の抗原または他の特異的結合物質に対するそれらの生体分子の特異性に基づいて、溶液の他の成分から分離するために使用される。従って、Kirkpatrick 特許に開示された技術を卵の黄身１６の抗体および伝達因子を含む水可溶性分画２０に対して使用した場合、伝達因子と抗体はいずれも水可溶性分画２０の残りから分離され、生じた溶液２４は抗体と伝達因子を両方とも含み得る。他方、Kirkpatrick 特許に開示された技術を抗体を実質的に含まず伝達因子を含む溶液に対して行った場合、生成物は１または複数の抗原に対する特異的伝達因子の実質的に純粋な溶液２６になるだろう。もちろん、粉末または凍結乾燥した全卵または卵黄を始めとする種々の卵調製物から伝達因子を得る方法を含めた、卵から伝達因子を得る他の方法もまた本発明の範囲内にある。
【００３８】
ここで図４を参照すると、マウス足蹠検定として知られている、溶液中での１または複数の抗原に特異的な非哺乳類伝達因子の存在を試験する例証的な方法が概略的に描かれている。
【００３９】
鳥類伝達因子が特異的に作用する特定の抗原または病原体に対する二次免疫応答をマウスに誘発する、鳥類伝達因子の有効性を試験する約７日前に、６匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの陽性対照集団を準備する。約９週〜約１０週齢の陽性対照集団の各マウス３０をイソフルランで麻酔する。フロイントアジュバントと試験する鳥類伝達因子が特異的に作用する特定抗原３６との５０／５０（ｗｔ／ｗｔ）混合物約０．０２ｍｌを、１箇所の注射を尾３８の根元３９の一側面とした２箇所の筋内注射により各マウス３０に投与する。この注射はマウス足蹠検定を行う約７日前に行うため、陽性対照集団のマウスは抗原３６に対する自身の二次すなわち遅延型過敏応答をに生成するようにされる。
【００４０】
マウス足蹠試験の約２４時間前に、やはり約９週〜約１０週齢（つまり陽性対照集団のマウスとほぼ同じ年齢）の６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを含む第１の試験集団を、同様にイソフルランで麻酔する。その後、蒸留水で再構成した、鳥類伝達因子と鳥類抗体の両方を含有する調製物を含む溶液２０，２４の約０．５ｍｌを、皮下注射により第１の試験集団の各マウス３０の首４０の後ろに投与する。それらのマウスから得られた結果を実質的に抗体を含まない調製物で処理した第２の試験集団のマウスから得られた結果と比較することにより、腫脹に対する伝達因子と抗体の相対的な寄与を決定することができる。抗体は二次免疫応答を誘発しないため、ここで説明する実験を行う前には、マウスの第１の試験集団と第２の試験集団における二次免疫応答の測定値は、非常に類似するであろうと考えられていた。
【００４１】
やはり約９週〜約１０週齢（つまり陽性対照集団および第１の試験集団のマウスとほぼ同じ年齢）の６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを含む第２の試験集団の各マウスを、同様にイソフルランで麻酔する。６匹の各マウス３０の首４０の後ろに、蒸留水で再構成した実質的に抗体を含まない凍結乾燥した抗原特異的鳥類伝達因子調製物を含む溶液２２，２６の約０．５ｍｌを皮下注射により与える。
【００４２】
陰性対照集団も、やはり約９週〜約１０週齢（つまり他の３つの集団のマウスとほぼ同じ年齢）の６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを含んでいる。
マウス足蹠検定を行うために、４つの集団の各マウスを麻酔し、各マウス３０の右後足の最大足蹠３２と左後足の最大足蹠３４の各々の両端の距離をＳｔａｒｒｅｔｔゲージなどにより測定する。その後、右後の足蹠３２に抗原３６を含む溶液を皮下注射する。左後の足蹠３４は対照として使用されるが、左後の足蹠３４には右後の足蹠３２に注射した溶液の量とほぼ同量の滅菌食塩希釈液のような対照溶液３７を注射する。
【００４３】
十分な時間（例えば約１６〜約２４時間）が経過した後、各マウス３０を再び麻酔し、右後の足蹠３２と左後の足蹠３４の両端の距離を再び測定する。マウス３０の右後の足蹠３２の両端の距離の増加によって決定される有意な量の腫脹は、その足蹠３２での遅延型過敏応答の発生を示す。
【００４４】
もちろん、種々の抗原に対する特異性を有する伝達因子を含む種々の溶液２４，２６を、そのような溶液がマウスに遅延型過敏免疫を伝える能力の差を検出するために、種々のセットの組に対して試験してもよい。さらに、各溶液の結果を、マウス３０の陽性対照と陰性対照の集団から得た結果と比較し得る。図３の溶液２２または溶液２６のような実質的に抗体を含まない溶液を投与したマウス３０の右後の足蹠３４に有意な腫脹が生じた場合、そのような腫脹を引き起こす遅延型過敏は、投与された伝達因子に起因する。
以下の実施例は、本発明の教示を組み込んだ、伝達因子を生成し、取得し、使用する方法の実施形態を単に例証するものである。
【００４５】
（実施例１）
０日、４２日、８４日目に、当該技術分野で周知のように、伝染性気管支炎／ニューカッスル病ウイルス（ＩＢＮＣ）ワクチンの粒子の粗いスプレーに生後１日齢のひよこを曝露することにより、ニューカッスル病ウイルスに特異的な伝達因子を生成した。この最初のＩＢＮＣワクチン注射の約１７５日目にそれらの５匹の雌鶏が生んだ卵を採集した。
【００４６】
（実施例２）
実施例１で生成した抗原特異的伝達因子を含有する卵の最初のサンプリングから得た卵黄を卵白から分離し、脱イオン水で約６〜約９倍（体積で）に希釈し（つまり１部の卵白を約５〜８部の水と混合する）、凍結した。それらの凍結した卵黄からの脂質層を、卵黄の水溶性画分から機械的に分離した。その後、この水溶性画分を約４℃〜約６℃の温度まで解凍し、５５ｍｍ径の磁器製のＢｕｅｃｈｎｅｒ漏斗を用いてＷｈａｔｍａｎ定性濾紙の使用により真空濾過した。次に、濾液を、再び５５ｍｍ径Ｂｕｅｃｈｎｅｒ漏斗を用いてガラスマイクロファイバーフィルタを通じて真空濾過した。
【００４７】
次に、タンパク質を集め溶液から脂質とリポタンパク質を除去するために、第３の濾過を行った。第３の濾過はＤＵＲＡＰＯＲＥ親水性膜により遂行した。タンパク質を含む画分（これは伝染性気管支炎病原体とニューカッスル病ウイルスに特異的な伝達因子と抗体との両方を含む）を、当該技術分野で周知のように収集、凍結、凍結乾燥、またはフリーズドライした。
【００４８】
（実施例３）
実施例２で先に説明したように、実施例１で集めた卵の第２のサンプリングからの希釈卵黄調製物の水溶性画分を、再びその脂質部分から機械的に分離、濾過した。
【００４９】
Klesius らに発行されたその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，１８０，６２７号で開示された方法に従い、適切な量のエチルアルコールアルコール（ＥｔＯＨ）すなわちエタノールをタンパク質含有画分に加え、アルコール−タンパク質画分溶液の全体量の約６０％の濃度になるまでエチルアルコールを希釈した。その後、溶液中に存在する抗体を含むより大きな分子量のタンパク質がこの溶液から沈殿するように、溶液を十分に長い期間（例えば一晩または約１０〜１２時間）、約４℃〜約６℃の温度まで冷却した。卵黄からの任意の伝達因子を含むより小さな分子量タンパク質（例えば約８，０００Ｄかそれ小さな分子量を有するタンパク質）は、溶液中に残った。
【００５０】
次に、より大きな分子量のタンパク質を含む沈殿物を、５５ｍｍ径のＢｕｅｃｈｎｅｒ漏斗に入れたＷｈａｔｍａｎガラスマイクロファイバーフィルタを通じて溶液を濾過することにより溶液から除去した。沈殿物が溶液の濾過中にフィルタを詰まらせるのを防止するために使用されるＣＥＬＩＴＥ（登録商標）、珪藻岩または珪藻土による濾過補助が、カリフォルニア州ロンポクのCelite Corporation社より利用可能である。その後、当該技術分野で周知のように、この実質的に沈殿物を含まない溶液を集め、凍結し、凍結乾燥した。
【００５１】
（実施例４）
約９週〜約１０週齢の３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを含む試験集団の各マウスを、ＩＢＮＶ特異的鳥類伝達因子がマウスに早期の二次すなわち遅延型過敏免疫応答を与えるか否かを決定するために試験した。各マウスをイソフルランで麻酔した。その後、各マウスの右後足の最大足蹠の両端の距離と左後足の最大足蹠の両端の距離をＳｔａｒｒｅｔｔゲージにより測定した。その後、各マウスの首の後ろに、蒸留水で再構成した約１６重量％のＩＢＮＶ特異的鳥類伝達因子を含む溶液の約０．５ｍｌを、皮下注射により与えた。
【００５２】
約２４時間後、各マウスを再びイソフルランで麻酔した。その後、各マウスの左後足の最大足蹠に滅菌食塩希釈液約０．０１ｍｌを注射し（この足蹠は対照として働く）、各マウスの右後足の最大足蹠に蒸留水約２５０ｍｌで再構成した約１０，０００用量のニューカッスル病−気管支炎ワクチンを含む溶液約０．０１ｍｌを注射した。
【００５３】
さらに２４時間が経過する前に、マウスの１匹（マウス番号１）は死亡した。残り２匹のマウスを再びイソフルランで麻酔し、後足の最大足蹠を再び測定した。結果は以下の通りである。
【００５４】
【表１】

右足の足蹠（８５μｍと９０μｍの増加）のサイズの増加（すなわち腫脹）が左足の足蹠（それぞれ５０μｍと１５μｍの増加）のサイズの増加よりも大きいことは、ＩＢＮＶ特異的鳥類伝達因子を含む溶液が、ニューカッスル病気管支炎ワクチン導入後約２４時間以内にマウス番号２およびマウス番号３の右足に遅延型過敏応答を引き起こすことを示している。
【００５５】
残りの実施例では、実施例１〜３に開示したのと実質的に同じ方法を、麻疹、耳下腺炎、風疹、Ｂ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、およびH.pyloriを含めた異なる種類の抗原特異的鳥類伝達因子を生成するために使用した。
【００５６】
次に、早期の二次すなわち遅延型過敏免疫応答を哺乳類で引き起こすことに関するそれらの様々な種類の抗原特異的鳥類伝達因子の各々の有効性を、マウス足蹠検定により試験した。抗原特異的鳥類伝達因子の各種類を、図４を参照して先に説明したように準備した陽性対照集団、第１の試験集団、第２の試験集団、および陰性対照集団を含むマウスの４つの異なる集団を使用して試験した。抗原特異的伝達因子の各種類に対して、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるPetersen EA, Greenberg LE, Manzara T, and Kirkpatrick CH, 溺urine transfer factor I. Description of the model and evidence for specificity, J. Immunol., 126: 2480-84 (1981)に従ってマウス足蹠検定を行った。
【００５７】
各マウス足蹠検定では、マウスの４つの集団を、図４を参照しながら説明した方法で準備した。
陽性対照集団、第１の試験集団および第２の試験集団、ならびに陰性対照集団に対して種々のマウス足蹠検定を実施するに当たって、各マウスはイソフルランで麻酔し、各マウスの左後足の最大足蹠（この足蹠は対照として働く）には、滅菌食塩希釈液約０．０１ｍｌを注射し、各マウスの右後足の最大足蹠には、鳥類伝達因子が特異的に作用する抗原または病原体を含む溶液約０．０１ｍｌを注射した。
【００５８】
後足の足蹠注射後から約１６時間〜約２４時間後に、陽性対照集団、試験集団、陰性対照集団の各マウスを再びイソフルランで麻酔し、各マウスの左右の後足の足蹠のサイズをＳｔａｒｒｅｔｔゲージで再び測定した。
【００５９】
（実施例５）
実施例１〜３で説明したのと同じ手順を用いて、麻疹−耳下腺炎−風疹（ＭＭＲ）ワクチンに特異的な鳥類伝達因子と鳥類抗体を、雌鶏において生成した。実施例１に説明したように、各雌鶏は１５０日目、１６３日目、１９０日目、２２１日目、および２４９日目にＭｅｒｃｋ ＭＭＲ ＩＩワクチンを１回用量受けた。約１９２日目〜約２２３日の期間の間に３回目の接種をしたちょうど後に、これらの雌鶏から卵を集め、実施例１に説明したように調製した。この操作は、高レベルの伝達因子が卵に存在することを確実にするために、本実施例および以下の実施例で行った。伝達因子は最初の接種の約７日後に卵に存在すると考えられている。
【００６０】
図４を参照して本明細書で先に説明したように、マウス足蹠検定の開始の約７日前に、Ｍｅｒｃｋ ＭＭＲ ＩＩワクチンを陽性対照集団の各マウスに注射することによりマウスの陽性対照集団を準備した。
【００６１】
ＭＭＲワクチンに特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む溶液を、実施例２で説明したのと同様に凍結乾燥調製物を蒸留水で約８重量％の濃度に再構成することにより作成した。伝達因子と抗体を含む溶液を、図４を参照しながら説明した様式でマウスの第１の試験集団に投与した。
【００６２】
実施例３で説明したのと同様な方法により調製した麻疹、耳下腺炎および風疹に特異的な凍結乾燥鳥類伝達因子を、蒸留水で約８重量％の濃度に再構成した。その後、この再構成したＭＭＲ特異的鳥類伝達因子を、図４を参照しながら本明細書で先に説明した様式でマウスの第２の試験集団に投与した。
【００６３】
その後、図４を参照して説明したように、約０．１ｍｌ用量のＭｅｒｃｋ ＭＭＲ ＩＩワクチンを、陽性対照集団、第１の試験集団、第２の試験集団および陰性対照集団の各々の各マウスの右後足の最大足蹠に投与し、実質的に同量の滅菌食塩希釈液を各マウスの左後足の最大足蹠に投与した。
【００６４】
約１６時間〜約２４時間後に、マウスを再び麻酔し、各マウスの両後足の最大足蹠のサイズを上述したように測定した。結果は以下の通りである。
【００６５】
【表２】

第２の測定値を得た時（つまり約１６〜約２４時間目）にはマウス番号６の片方または両方の後足の足蹠に咬傷の跡に生じたかさぶたがあったため、マウス番号６のデータは不正確であった可能性がある。にもかかわらず、マウス番号４を除き、第１の試験集団の残りの各マウスは、対照溶液を注射した足蹠でよりもＭＭＲＩＩワクチンを注射した足蹠で第２の足蹠測定値を得た時に、より大きな腫脹を示した。マウス番号４では、腫脹の大きさは左足の足蹠も右足の足蹠も共にほぼ同じだった。
【００６６】
全体として、表２のデータから見ることができるように、表示したマウスの第１の試験集団の右足の最大足蹠は、同じマウスの左足の最大足蹠の腫脹の量より平均で約６７．７３μｍ大きく腫れた。
【００６７】
【表３】

抗原と試料の注射から約２４時間後にマウス番号２とマウス番号５の足蹠に咬傷の跡に生じたかさぶたが見えたため、それらのマウスから得たデータは不正確であった可能性がある。さらに、マウス番号５の左足の最大足蹠は、マウス番号５の左足の対応する足蹠の３倍よりも大きく腫れており、他の試験マウスのどの足蹠で生じたよりも数倍大きく腫れていた。従って、マウス番号５から得た腫張データも、左足の足蹠でのこの腫脹は過度なものであったとして省略した。マウス番号４ではどちらの足蹠の腫脹の増加も測定されなかった。にもかかわらず、マウス番号１、マウス番号３およびマウス番号６の各々は、対照溶液を注射した（左）足蹠でよりも、第２の実質的に抗体を含まない伝達因子含有溶液を注射した（右）足蹠で、より大きな腫脹を示した。
【００６８】
表３に示したデータに基づくと、平均で、マウス番号１，３，６の右足の最大足蹠は、同じマウスの左足の最大足蹠よりも約９１．４μｍ大きく腫れていた。
【００６９】
【表４】

陽性対照集団のマウス番号２とマウス番号３は左後足と右後足の両方の最大足蹠に実質的に同じ量の腫張を示したが、他の各マウスは、ずっと腫張が少ない左後足の最大足蹠の腫張の量よりも、右後足の最大足蹠の方がより大きく腫張しており、右後足の最大足蹠に導入したＭＭＲワクチンに対する二次免疫応答を示した。
【００７０】
表４に示したデータに基づくと、それらのマウスの右後足の最大足蹠の腫張の平均量は、同じマウスの左後足の最大足蹠の腫脹よりも約５９．２７μｍ大きかったことがわかる。
【００７１】
【表５】

陰性対照集団のマウスのうちの２匹、すなわちマウス番号３とマウス番号５は、いずれの後足の最大足蹠にも腫脹を示さなかった。マウス番号６の両後足の最大足蹠はほぼ同じ量だけ腫れていた。マウス番号１とマウス番号２の左後足の最大足蹠は腫れておらず右後足の足蹠はわずかに腫れており、マウス番号４の右後足の最大足蹠は腫れておらず左後足の最大足蹠はほんのわずかに腫れていた。実際、これらのマウスの右後足の最大足蹠の腫張の平均量は、マウスの陰性対照集団の左後足の最大足蹠で測定した腫脹の量よりもわずかに約８．４７μｍ大きいだけだった。従って、表５のデータは、陰性対照集団のマウスがＭＭＲワクチンに対する二次免疫応答を誘発しなかったことを示している。
【００７２】
まとめると、表２〜５のデータは、二次すなわち遅延型過敏免疫応答が、第１の試験集団、第２の試験集団および陽性対照集団の各々の大多数のマウスに生じたが、そのような二次免疫応答は陰性対照集団では見られなかったことを示している。従って、表２，３のデータは、ＭＭＲワクチンに特異的な鳥類伝達因子が、ＭＭＲワクチンに特異的な鳥類抗体と同様に、哺乳類での早期二次免疫応答を引き起こすことができることを示している。
【００７３】
（実施例６）
本明細書で実施例１〜３に先に説明した手順を繰り返し、商標名ＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂで販売されている合成Ｂ型肝炎抗原ワクチンを使用して、Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な鳥類伝達因子と鳥類抗体を作成した。実施例１に説明したように、各雌鶏は１５０日目、１６３日目、１９０日目、２２１日目、２４９日目にＢ型肝炎ワクチンを１回用量受けた。実施例１に上述したように、約１９２日目〜約２２３日の期間の間のある時にこれらの雌鳥から卵を集め、実施例１に上述したように調製した。
【００７４】
マウス足蹠検定の実施の約７日前に、図４を参照した様式で陽性対照集団の各マウスに合成Ｂ型肝炎ワクチンＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂを注射することにより、マウスの陽性対照集団を準備した。
【００７５】
Ｂ型肝炎ワクチンに特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む第１の溶液を、実施例２に説明したのと同様に凍結乾燥調製物を蒸留水で１６重量％の濃度に再構成することにより作成した。この伝達因子と抗体を含む溶液を、図４を参照して説明した様式でマウスの第１の試験集団に投与した。
【００７６】
さらに、実施例３に説明したのと同様の様式で調製したＢ型肝炎ワクチンに特異的な凍結乾燥鳥類伝達因子を、蒸留水で約１６重量％濃度に再構成した。その後、図４を参照して本明細書で先に説明したように、この再構成した伝達因子含有溶液を第２の試験集団の各マウスに投与した。
【００７７】
適切な時に、図４を参照して本明細書で先に説明したように、陽性対照集団、第１の試験集団、第２の試験集団および陰性対照集団の各々の各マウスの右足の最大足蹠に合成Ｂ型肝炎ワクチンを投与した。本明細書で先に説明したように、４つの集団の各マウスの左足の最大足蹠には、同量の滅菌食塩希釈液を実質的に同時に注射した。
【００７８】
本明細書で先に説明したように、約１６時間〜約２４時間後に、４つの集団の各マウスを再び麻酔し、各マウスの両後足の最大足蹠のサイズを再び測定した。結果は以下の通りである。
【００７９】
【表６】

マウス番号１を除き、第１の試験集団の各マウスは、右後足の最大足蹠により大きな腫脹を示した。平均で、第１の試験集団のマウスの右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠よりも約４２．１７μｍ大きく腫れていた。従って、表６のデータは、合成Ｂ型肝炎ワクチンに特異的な伝達因子と抗体を含む調製物中の鳥類伝達因子が、それらの各マウスでの早期二次免疫応答を引き起こしたことを示している。
【００８０】
【表７】

平均で、マウスの第２の試験集団の右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠よりも約３８．１０μｍ大きく腫れた。マウス番号４を除き、表７のデータは、Ｂ型肝炎ワクチンに特異的な鳥類伝達因子の投与が、各マウスの右後足の最大足蹠に早期の二次すなわち遅延型過敏免疫応答を引き起こしたことを示している。
【００８１】
【表８】

マウスの陽性対照集団では、マウス番号５だけが合成Ｂ型肝炎ワクチンに対する二次免疫応答を誘発しなかった。陽性対照集団の他の各マウスの右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠よりも、平均で約４２．３３μｍ大きく腫れた。
【００８２】
【表９】

陰性対照集団の３匹のマウスは、左後足と右後足の両方の最大足蹠に実質的に同量の腫張を示した。残りの３匹のマウスのうち、マウス番号３だけが左後足でよりも右後足の最大足蹠に著しい腫張の増大量を示した。平均で、陰性対照集団のマウスの右後足と左後足の最大足蹠間の腫張の差はわずかに約１６．３３μｍにすぎなかった。
【００８３】
まとめると、表６〜９に示したデータは、実施例６の結果が、合成Ｂ型肝炎ワクチンに特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方が、Ｂ型肝炎ウイルスによっても示される合成Ｂ型肝炎ワクチンの抗原に対する早期の二次免疫応答を哺乳類で誘発することを示している。
【００８４】
（実施例７）
実施例１〜３で上記に概説したのと実質的に同じ手順を再び使用して、H.pylori細菌に特異的な鳥類伝達因子と鳥類抗体を雌鶏において生成した。雌鶏の各々を、実施例１に説明したのと同様の様式で、１５０日目、１６３日目、１９０日目、２２１日目および２４９日目にH.pylori EIA抗原で感染させた。実施例１に上述したように、約１９２日目〜約２２３日の期間の間にこれらの雌鳥から卵を集め、実施例１に上述したように調製した。
【００８５】
先の実施例と同様に、マウス足蹠検定の実施の約７日前に、実施例４に関して説明したように陽性対照集団の各マウスに組換えすなわち合成H.pylori EIA抗原を注射することにより、マウスの陽性対照集団を準備した。
【００８６】
H.pylori EIA抗原に特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む溶液を、実施例２に説明した調製物と同様に、鳥類抗体と鳥類伝達因子を含む凍結乾燥調製物を蒸留水で約１６重量％の濃度に再構成することにより作成した。この溶液を、図４を参照して本明細書に先に説明したように、マウスの第１の試験集団に投与した。
【００８７】
H.pyloriに特異的な鳥類伝達因子を含む実質的に抗体を含まない溶液を、実施例３に説明したのと同様の様式で得た凍結乾燥調製物を蒸留水で約１６重量％の濃度に再構成することにより調製した。その後、図４を参照して本明細書で先に説明したように、この実質的に抗体を含まない鳥類伝達因子含有溶液を第２の試験集団の各マウスに投与した。
【００８８】
図４を参照して本明細書で先に説明した様式で、陽性対照集団、第１の試験集団、第２の試験集団および陰性対照集団の各々の各マウスの右足の最大足蹠をH.Pylori EIA抗原で感染させ、同量の滅菌食塩希釈液をそれらの各マウスの左足の最大足蹠に投与した。
【００８９】
本明細書で先に説明したように、適切な時に、H.pyloriによるマウスの右足の最大足蹠の感染の約１６時間〜約２４時間後に、マウスを再び麻酔し、各マウスの両後足の最大足蹠のサイズを測定した。結果は以下の通りである。
【００９０】
【表１０】

表１０のデータ、特にマウス番号２、マウス番号４およびマウス番号６のデータは、H.pyloriに特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む溶液の投与が、第１の試験集団のマウスに早期の二次免疫応答を引き起こしたことを示している。マウス番号１は左後足と右後足の最大足蹠に実質的に等しい量の腫張を示したが、マウス番号３は、左後足の最大足蹠よりも右後足の最大足蹠にわずかに大きな腫脹を示し、マウス番号５は右後足の最大足蹠よりも左後足の最大足蹠にわずかに大きな腫脹を示した。平均で、第１の試験集団のマウスの右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠よりも約５９．２７μｍ大きく腫れた。
【００９１】
【表１１】

表１１に示した結果は、表１０の結果に類似していた。マウスのうち２匹、すなわちマウス番号５およびマウス番号６は、左後足の最大足蹠よりも右後足の最大足蹠にずっと大きな腫脹を示した。マウス番号１、マウス番号２およびマウス番号４の右後足の最大足蹠の腫脹量は、同じマウスの左後足の最大足蹠より大きかったが、差はほんのわずかであった。マウス番号３は、右後足の最大足蹠よりも左後足の最大足蹠でわずかに大きな腫脹量を実際に示した。にもかかわらず、これらのマウスの右後足の最大足蹠の平均腫脹は、平均で、同じマウスの左後足の最大足蹠のそれよりも約５０．８０μｍ大きかった。表１１のデータはH.pyloriに特異的な鳥類伝達因子が腫脹の増大を引き起こしたことを示している。
【００９２】
【表１２】

実施例７の陽性対照集団の各マウスは、それらのマウスの左後足の最大足蹠での腫脹に対する同じマウスの右後足の最大足蹠での腫脹の量の有意差によって示されるように、H.pyloriに対する遅延型過敏免疫応答を誘発した。平均で、腫脹の差は約１１０．０７μｍであった。
【００９３】
【表１３】

表１３のデータにより示されるように、マウス番号３、マウス番号５およびマウス番号６の左後足と右後足の最大足蹠の腫張量は実質的に同じであった。マウス番号２の右後足の最大足蹠の腫張量はマウス番号２の左後足の最大足蹠の腫張量よりも大きかったが、マウス番号１の左後足の最大足蹠はマウス番号１の右後足の最大足蹠よりも有意に大きく腫れていた。マウス番号４の右後足の最大足蹠は、マウス番号４の左後足の最大足蹠よりもほんのわずかに腫れていた。陰性対照集団のマウスの右後足と左後足の最大足蹠の腫脹の平均差は、約４．２３μｍにすぎなかった。
表１０〜１３のデータは、H.pyloriに特異的な鳥類伝達因子が哺乳類での早期の二次免疫応答を促進することを示している。
【００９４】
（実施例８）
実施例１〜３で本明細書に先に説明したのと実質的に同じ手順を再び使用して、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の組換え核内抗原であるＥＢＮＡ−ｌ抗原に特異的な鳥類伝達因子および鳥類抗体を雌鶏において生成した。雌鶏の各々は、実施例１に説明したのと同様の様式で、１５０日目、１６３日目、１９０日目、２２１日目および２４９日目にＥＢＮＡ−１の１回用量を受けた。実施例１に上述したように、約１９２日目〜約２２３日の期間の間にこれらの雌鳥から卵を集め、実施例１に上述したように調製した。
【００９５】
ＥＢＮＡ−ｌに特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む溶液を、実施例２に説明したのと同様に凍結乾燥調製物を蒸留水で再構成することにより作成した。ＥＢＮＡ−１抗原に特異的な鳥類抗体と鳥類伝達因子の両方を含む凍結乾燥調製物は、約１６重量％の濃度に希釈した。その後、この溶液を、図４を参照して説明した様式でマウスの第１の試験集団に投与した。
【００９６】
さらに、ＥＢＮＡ−１に特異的な鳥類伝達因子を含むがＥＢＮＡ−ｌに特異的な鳥類抗体を実質的に含まない溶液も、蒸留水で約１６重量％の濃度に再構成した。この溶液を、図４を参照して本明細書で先に説明したように、第２の試験集団のマウスに投与した。
【００９７】
マウス足蹠検定の実施の約７日前にマウスにＥＢＮＡ−ｌを注射することにより、マウスの陽性対照集団を準備した。
その後、組換えＥＢＮＡ−ｌ抗原を、第１の試験集団、第２の試験集団、陽性対照集団および陰性対照集団を含む４つの集団の各々の各マウスの右後足の最大足蹠に投与した。実質的に同量の滅菌食塩希釈液を、各マウスの左後足の最大足蹠に投与した。投与方法は、本明細書に先に説明したのと同じ様式で行った。
【００９８】
約１６時間〜約２４時間後に、マウスを再び麻酔し、測定した各マウスの両方の後足の最大足蹠のサイズを上述のように測定した。結果は以下の通りである。
【００９９】
【表１４】

表１４では、マウスのうちの３匹が、その左後足の最大足蹠でよりもその右後足の最大足蹠に有意に大きな腫脹を示したことが理解される。マウス番号２も左後足の最大足蹠より右後足の最大足蹠に大きな量の腫脹を有したが、その差はほんのわずかであった。マウスのうちの２匹、すなわちマウス番号１とマウス番号６は、左後足と右後足の両方の最大足蹠に実質的に同量の腫脹を有していた。にもかかわらず、第１の試験集団のマウスの右後足の最大足蹠の腫脹量は、平均して約５５．０３μｍだけ同じマウスの左後足の最大足蹠の腫脹量より大きかったため、表１４に示したデータは、ＥＢＮＡ−１に特異的な鳥類抗体と伝達因子の両方を含む溶液中の鳥類伝達因子が、第１の試験集団のマウスに、組換えＥＢＮＡ−１に対する早期の二次免疫応答を誘発することを示す傾向がある。当該技術分野においてよく知られているように、抗体は二次免疫応答に対しては受動的であり、一般に腫脹にはほとんど寄与しない。
【０１００】
【表１５】

鳥類伝達因子を含む溶液で処理した第２の試験集団のマウスも、組換えＥＢＮＡ−１に対する早期の二次免疫応答を示した。この結果は、特にマウス番号３とマウス番号５で明らかであり、これらのマウスはその左後足の最大足蹠で測定したよりその右後足の最大足蹠に有意に大きな腫脹を示した。マウス番号１の右後足の最大足蹠の腫脹量もマウス番号１の左後足の最大足蹠の腫脹量よりは大きかったが、その差はわずかと思われる。さらに、マウス番号２とマウス番号４はその左後足の最大足蹠に大きな腫脹量を示したが、それについて測定した腫脹量は、同じマウスの右後足の最大足蹠で測定した腫脹量よりわずかに大きいにすぎなかった。平均で、上記マウスの右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠で測定した腫脹量よりも約１６．９３μｍ大きかった。
【０１０１】
ＥＢＮＡ−１に特異的な伝達因子は対応する抗体から分離した時に不安定になり、マウスの第１の試験集団で測定した二次免疫応答全体に対して第２の試験集団ではより低い二次免疫応答の測定値が生じている可能性があると考えられる。
【０１０２】
【表１６】

陽性対照集団の各マウスの左後足の最大足蹠よりも同じマウスの右後足の最大足蹠で腫張量がより大きいことによって示されるように、陽性対照集団の６匹すべてのマウスは、組換えＥＢＮＡ−１抗原に対する遅延型過敏免疫応答を示した。これらの各マウスの右後足の最大足蹠の測定腫張量は、同じマウスの左後足の最大足蹠の測定腫張量よりも平均で約９３．１３μｍ大きかった。
【０１０３】
【表１７】

陰性対照集団では、マウスのうちの２匹、すなわちマウス番号２とマウス番号４が、その後足の最大足蹠に異なる腫張量を示した。マウス番号２の右後足の最大足蹠の腫張量は左後足の最大足蹠で示される腫張量よりも大きかったが、マウス番号４の左後足の最大足蹠はマウス番号４の右後足の最大足蹠よりも大きく腫れていた。実際、陰性対照集団のマウスの右後足の最大足蹠は、同じマウスの左後足の最大足蹠より、平均で約４．２３μｍだけ腫れが小さかった。
【０１０４】
表１４〜１７のデータもやはり、ＥＢＮＡ−１に特異的な鳥類伝達因子が、哺乳類に、ＥＢＮＡ−ｌおよびウイルスならびにこの抗原を提示する他の病原体に対する早期の二次免疫応答（つまり、哺乳動物が自身の二次免疫応答を誘発するのにかかる期間が、通常の７〜１４日の期間と比較して約２４時間以内である）を誘発することを示している。
【０１０５】
上述の実施例は、病原体か抗原性物質に対する二次免疫応答を哺乳類が自身で誘発するのには７〜１４日の期間かかるのとは対照的に、本発明の教示を組込んだ鳥類伝達因子を投与した場合、哺乳類ホストは約２４時間以内に二次免疫応答を誘発し得ることを示している。
【０１０６】
各検定の第１および第２の試験群の各マウスの試験足蹠と対照足蹠から得た測定値の間の差の類似性は、二次すなわち遅延型過敏免疫応答は主として抗体ではなく伝達因子により誘発され、抗体は二次免疫応答に対しては受動的で、通常腫脹にはほとんど寄与しないことを示している。
【０１０７】
鳥類伝達因子が哺乳類での早期の二次免疫応答を生成する能力を有することは、実施例１〜８およびそれによって得られたデータから明らかである。当業者には容易に理解できるように、鳥類伝達因子は、様々な種類の鳥類だけでなく、爬虫類、両生類、および他の動物の非哺乳類種で早期の二次免疫応答を生成するだろう。
【０１０８】
鳥類伝達因子はマウスでの早期の遅延型過敏免疫応答を開始するため、伝達因子がヒトを含む他の哺乳類でも同じ効果を有すると当業者が仮定するのは理に適っている。
【０１０９】
伝達因子は上述の実施例では注射によってマウスに投与したが、他の経路で哺乳類に鳥類伝達因子を投与することも本発明の範囲内にある。例えば、鳥類伝達因子を、経口的に、非経口注射により、または経皮等の注射以外の非経口的方法により、肺経由のエーロゾルにより、もしくは当該技術分野で周知の他の方法により、投与することが可能である。哺乳類への鳥類伝達因子の経口投与は、哺乳類の母親が、新生児（仔）が経口受容する初乳を介して生まれたての子供に伝達因子を供給するという事実によって支援される。伝達因子が哺乳類の新生児（仔）の血流に吸収されるところでは、伝達因子は胃と小腸の両方の条件から耐えて残る。従って、伝達因子は哺乳類の胃管に耐えて残ることが知られている。伝達因子が哺乳類の消化管の条件に耐える能力は、その開示全体が参照により組み込まれるKirkpatrick CH, 鄭ctivities and characteristics of transfer factors Biotherapy, 9:13-16 (1996)に立証されている。
【０１１０】
以上の説明は多くの詳細を含んでいるが、それらは本発明の範囲の限定として解釈されるべきではなく、現時点で好ましい実施形態のいくつかの例を提供するにすぎないと解釈すべきである。同様に、本発明の精神または範囲から逸脱しない本発明の他の実施形態を考案することが可能である。異なる実施形態からの特徴を組み合わせて使用することが可能である。従って本発明の範囲は、以上の説明によってではなく特許請求の範囲とその法的均等物によってのみ示されかつ限定される。特許請求の範囲の意味と範囲内にある、本明細書に開示したような本発明への追加、削除、および改変はすべて包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 非哺乳類源動物中で非哺乳類伝達因子を生成するための例証的方法を示す略図。
【図２】非哺乳類源動物の卵の中で非哺乳類伝達因子を直接生成するための例証的方法を示す略図。
【図３】卵から非哺乳類伝達因子を得るための例証的方法を示す略図。
【図４】溶液中での伝達因子の存在を試験し、かつ病原体による感染を防止するか病原体による感染を治療すべく伝達因子を使用するための、例証的方法を示す略図。

Claims (29)

1. 伝達因子を得る方法であって、
   鳥類源動物を、該鳥類源動物にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発させる少なくとも１つの抗原性物質に曝露する工程；
   前記鳥類源動物に前記少なくとも１つの抗原性物質に対する前記Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発させる工程；および
   前記Ｔ細胞媒介性免疫応答後に、前記鳥類源動物から少なくとも１個の卵を採集する工程であって、前記少なくとも１個の卵はインビボで哺乳類に細胞性免疫を伝える約４，０００Ｄａ〜約５，０００Ｄａの分子量を有する伝達因子を含む工程；
   から成る方法。
2. 約８，０００Ｄａより大きな分子量を有するタンパク質またはペプチドから伝達因子を実質的に精製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記鳥類源動物を曝露する工程は、前記少なくとも１つの抗原性物質に雌鶏を曝露することから成る、請求項２に記載の方法。
4. 前記少なくとも１つの抗原性物質に前記鳥類源動物を曝露する工程は、前記鳥類源動物をその自然環境に曝露することから成る、請求項１に記載の方法。
5. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物をニューカッスル病ウイルスに曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物をＭＭＲワクチンに曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物をＢ型肝炎ワクチンに曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物をエプスタイン−バーウイルスの抗原に曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を組換えエプスタイン−バーウイルスワクチンに曝露することから成る、請求項８に記載の方法。
10. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物をH.pyloriの抗原に曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を合成H.pyloriワクチンに曝露することから成る、請求項１０に記載の方法。
12. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を複数の抗原に同時に曝露することから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を生ワクチン、弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組換え抗原、および自然抗原の少なくとも１つに曝露することから成る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記少なくとも１個の卵を採集する工程は、前記曝露する工程の少なくとも７日後に遂行される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記少なくとも１個の卵の卵黄の水溶性分画を集める工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記実質的に精製する工程は、前記水溶性分画から実質的にすべての抗体を除去することから成る、請求項１５に記載の方法。
17. 伝達因子を得る方法であって、
    鳥類源動物に病原体への二次免疫応答を誘発させるために、鳥類源動物を少なくとも１つの抗原性物質に曝露する工程；
    前記鳥類源動物に前記少なくとも１つの抗原性物質に対する二次免疫応答を誘発させ、該二次免疫応答により前記病原体に対して特異的な伝達因子を生産する工程；および
    前記二次免疫応答後に、前記鳥類源動物の少なくとも１個の卵から前記病原体に対して特異的な伝達因子を集める工程；
    から成る方法。
18. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を全身性病原体の少なくとも１つの抗原性物質に曝露することから成る、請求項１７に記載の方法。
19. 前記集める工程は、約８，０００Ｄａより大きな分子量を有する前記少なくとも１個の卵の他のタンパク質またはペプチドから前記伝達因子を実質的に精製することから成る、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記実質的に精製することは、前記他のタンパク質またはペプチドを溶液から沈殿させることから成る、請求項１９に記載の方法。
21. 前記曝露する工程は、麻疹ウィルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスの少なくとも１つに対する二次免疫応答を該鳥類源動物に誘発させるために、前記鳥類源動物を少なくとも１つの抗原性物質に曝露することから成る、請求項１７または１８に記載の方法。
22. 前記曝露する工程は、前記鳥類源動物を、ＭＭＲワクチン、ニューカッスル病ウイルスワクチン、組換えエプスタイン−バーウイルスワクチン、実質的に精製されたエプスタイン−バーウイルス抗原、および組換えＢ型肝炎ワクチンの少なくとも１つに曝露することから成る、請求項１７または１８に記載の方法。
23. 哺乳類または鳥類の動物種の少なくとも１つで二次免疫応答を誘発するための組成物であって、
    担体；および
    請求項１、２、または１７に記載の方法によって得られた少なくとも１種類の鳥類の伝達因子を含む鳥卵調製物；を含む組成物。
24. 哺乳類（ヒトを除く）で二次免疫応答を誘発する方法であって、
    一定量の請求項１、２、または１７に記載の伝達因子を得る方法と、
    哺乳類に、一定量の前記伝達因子を得る方法によって得られた少なくとも１種類の鳥類の伝達因子を投与する工程から成る方法。
25. 前記投与する工程は、哺乳類が少なくとも１つの病原体に感染するようになる前に遂行される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記投与する工程は、哺乳類が少なくとも１つの病原体に曝露される前に遂行される、請求項２４に記載の方法。
27. 前記投与する工程は、哺乳類が少なくとも１つの病原体に曝露された後で遂行される、請求項２４に記載の方法。
28. 前記投与する工程は、哺乳類が前記少なくとも１つの鳥類の伝達因子
    が特異的に作用する少なくとも１つの病原体に曝露された後で遂行される、請求項２４に記載の方法。
29. 伝達因子を得る方法であって、
    卵を、該卵にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発させる少なくとも１つの抗原性物質に曝露する工程；
    前記卵に前記少なくとも１つの抗原性物質に対する前記Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発させ、該前記Ｔ細胞媒介性免疫応答により前記少なくとも１つの抗原性物質に対して特異的な伝達因子を生産する工程；および
    前記Ｔ細胞媒介性免疫応答後に、前記卵から、インビボで哺乳類に細胞性免疫を伝え、前記少なくとも１つの抗原性物質に対して特異的で、約４，０００Ｄａ〜約５，０００Ｄａの分子量を有する伝達因子を含む、少なくとも１つの伝達因子を集める工程；
    から成る方法。

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