CN116284357A - 牛冠状病毒、牛轮状病毒和k99-f41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99‑F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体及制备方法，包括：收集牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99‑F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗免疫的蛋鸡所产的鸡蛋，用0.1％新洁尔灭溶液浸泡，清洗后提取卵黄，放入容器中备用；采用酸化水纯化法提取卵黄中的IgY抗体；之后采用中空纤维过滤系统进行过滤即得IgY抗体粗提物。与现有技术相比，本发明对BCoV、BRV或K99‑F41兼性大肠杆菌引起的犊牛腹泻有特效，治愈率达到85％以上，预防效果达到95％以上，比抗生素或者中草药治疗成本低廉，而且见效快不复发。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，特别是一种牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体及制备方法。
背景技术
犊牛腹泻是养牛业的一种常见病，一年四季均有发生，尤其以冬季和早春多发，约占犊牛疾病的80％，是造成犊牛生长发育不良和死亡的主要疾病之一，出生1个月内发病率和死亡率最高，被称为新生犊牛的杀手。主要病原包括BCoV、BRV和大肠杆菌(含K99或/和F41菌毛抗原)等，而且BCoV和BRV多呈原发性感染，引起肠黏膜上皮细胞损伤，此时更利于大肠杆菌的附着和感染，导致犊牛发生的腹泻更严重，死亡率可达50％～100％。尤其黑龙江省养牛业快速发展，规模化和集约化程度越来越高，而且冬季寒冷更有利于爆发BCoV感染，引起新生犊牛腹泻或者成母牛爆发“冬痢”和牛呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratory disease complex，BRDC)造成的损失更加严重，已成为危害我省养牛业的重要病毒性病原病之一。目前主要使用提高免疫力的中草药治疗犊牛腹泻，起效慢，用药时间长，治愈率低，而且价格高昂；然而，我国尚无有效的疫苗或抗体制剂防控BCoV、BRV和大肠杆菌感染，主要障碍之一就是BCoV和BRV毒株体外分离十分困难，尤其是获得具有良好的体外细胞适应性，优良的抗原性得毒株更加困难，因此，阻碍了我国犊牛腹泻疫苗的研发进程。
大肠杆菌(E.coil)耐药性强，不同菌株之间耐药普差异较大，临床很难选择出有效抗生素，而且长期使用抗生素治疗会进一步诱导耐药菌株的产生，对犊牛生长发育会造成严重不良影响；以及对环境和人类健康造成严重危害。
因此，亟待开发一种牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种安全、无毒副作用、成本低廉、能够特异性抗BCoV、BRV和致病性大肠杆菌的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体及制备方法，能够有效预防和治疗犊牛腹泻，提高犊牛成活率。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、收集牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗免疫的蛋鸡所产的鸡蛋，用0.1％新洁尔灭溶液浸泡，清洗后提取卵黄，放入容器中备用；
S2、采用酸化水纯化法提取卵黄中的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体；
S3、将得到的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体采用中空纤维过滤系统进行过滤即得牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体粗提物。
进一步地，所述牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗免疫的蛋鸡的免疫程序为100日龄，120日龄加强免疫，140日龄进行第三次免疫。
进一步地，所述步骤S2具体包括：向卵黄中加入3倍体积酸化水，其中，酸化水是由1L纯化水中69g无水乙酸钠和20mL冰醋酸配置而成；容器内加入转子，磁力搅拌30min；搅拌后加入整个酸水及卵黄混合液体积4％的正辛酸，继续搅拌1min后静置过夜；利用油布加棉布过滤静置后的液体，得到黄色澄清液体；用pH计测量所得液体的pH，用NaOH调节液体pH值至中性，得到牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体样本。
进一步地，所述步骤S3中的中空纤维过滤系统的滤孔孔径小于等于0.45μm。
与现有技术相比，本发明的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体具有以下有益效果：
1.对BCoV、BRV或产肠毒素性E.coil引起的犊牛腹泻有特效，治愈率达到85％以上，预防效果达到95％以上。
2.本发明安全、无毒副作用，促进犊牛发育，不会出现并发症或者后遗症。
3.比抗生素或者中草药治疗成本低廉，而且见效快不复发。
4.犊牛出生后预防保健用，可以预防犊牛发生腹泻，减少了人工费用、治疗费用，降低了病原传播扩散的生物安全风险。
附图说明
图1为不同佐剂疫苗对免疫鸡产蛋率的影响。
图2为BCoV-BRV二联IgY免疫佐剂优化。
图3为BCoV-BRV二联疫苗抗原剂量筛选结果。
图4为用BCoV-BRV二联疫苗制备IgY免疫程序优化结果。
图5为BCoV-BRV-E.coil三联IgY制备疫苗组合的优化结果。
图6为酸化水A方法制备度三联IgY。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
以下实施例所用材料的来源：
佐剂与试剂MontanideTM ISA61VG油佐剂和ISA50V2油佐剂购自法国Seppic公司；
培养基DMEM购自GIBICO；胎牛血清(BI)。
Minca培养基配方：KH2PO4 1.36g Na2HPO4.2H2O 10.1g，酪蛋白A 1.0g，葡萄糖1.0g，微量盐混合液1.0mL，琼脂12g，蒸馏水1000mL，调pH 7.5，高压灭菌115℃10min。
微量盐溶液：MgSO4·7H2O 10g，MnCl·4H2O 1.0g，FeCl3·6H2O 0.135g，CaCl2·2H2O 0.4g，蒸馏水1000mL，高压灭菌。
LB液体培养基：取5g酵母浸粉，10g胰蛋白陈，10g NaCl溶于800mL蒸馏水中，调pH至7.2，定容1L，121℃灭菌20min,室温保存。
麦康凯琼脂：称取成品54g，加热溶解于1000mL去离子水中，121℃：高压灭菌15min，室温保存。
实验动物BALB/c小白鼠购自哈尔滨医科大学动物学部；100-120日龄左右SPF海兰白蛋鸡来自哈药生物疫苗有限公司。
实施例1
在制备牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体之前，首先要制备BRV-BCoV-K99/F41兼性E.coil三联灭活疫苗。按照传统方法扩增BCoV、BRV和K99/F41 E.coil，灭活、佐剂乳化和检验等程序制备疫苗。BCoV病毒液中病毒滴为108.3TCID50/mL，BRV病毒液的病毒滴度为108.3TCID50/mL，K99/F41抗原浓度为1.5mg/mL。
(1)BCoV-BRV ISA 50V2佐剂二联灭活疫苗，水相：BCoV:BRV为1:1混合病毒液；油相:水相＝1:1。
(2)K99/F41 E.coil ISA 50V2佐剂亚单位疫苗，水相：K99/F41菌毛1mg/mL，油相:水相＝1:1。
(3)BCoV-BRV-K99/F41 E.coil ISA50V2佐剂三联灭活疫苗，水相：BCoV:BRV:K99/F41＝1:1:1；油相:水相＝1:1。
(4)BCoV-BRV ISA 61VG佐剂二联灭活疫苗，水相：BCoV:BRV为1:1混合病毒液；油相:水相＝64:36。
乳化方法：先把油相放入50mL离心管内，使用手持式均质仪进行搅拌3000r/min，再把水相缓慢加入油相，待完全加入后提高转速到8000r/min，乳化1min，然后继续提高转速至12000r/min，乳化3min。
进一步，为了确定最佳的免疫佐剂，进行以下免疫试验：
选择120日龄的SPF海兰白蛋鸡30只，分成5组。
(1)第1组6只，免疫ISA 61VG佐剂BCoV-BRV二联灭活疫苗。
(2)第2组6只，免疫ISA50V2佐剂BCoV-BRV二联灭活疫苗。
(3)第3组6只，免疫疫ISA 61VG佐剂与PBS乳化后的对照组。
(4)第4组6只，免疫ISA50V2佐剂与PBS乳化后的对照组。
(5)第5组6只，不注射任何疫苗。
首次免疫每只鸡0.5mL疫苗，间隔14d加强免疫每只鸡1mL，再间隔14d进行第3次免疫。
临床症状观察免疫后记录鸡群精神状态、采食量变化和死亡等情况。同时记录3免后1W～8W产蛋率。观察结果为：所有免疫组和未免疫对照组的鸡相比，在每次免疫后1d内均出现采食量下降，一般5-7d恢复采食量。3免后1周到8周未免疫组平均产蛋率82.5％，ISA61VG佐剂组平均产蛋率67.9％，ISA50V2佐剂组平均产蛋率77.5％。3免后4周产蛋率达到高峰，三免7周以后两种佐剂疫苗免疫鸡产蛋率恢复至相似水平76％-77％，见图1。ISA50V2佐剂组比ISA61VG佐剂组平均产蛋率高了9.6％，说明ISA61VG组对鸡的应激比较大。
免疫效果监测收集1免1W和2W，2免后1W和2W，3免后1W、2W和3W的鸡蛋，通过氯仿法提取卵黄抗体，用于BCoV和BRV的抗体检测。BCoV抗体检测通过IHA实验，BRV抗体检测通过病毒中和实验检测。BCoV抗体效价检测结果显示，ISA50V2佐剂疫苗抗体产生速度快比ISA61VG佐剂要快，2免后1周抗体水平明显升高达到1:32，3免后2周达到高峰1:64。206VG佐剂2免后2周时抗体高峰比ISA61VG佐剂要高，可达1:128，具体结果见表3和图2a。BRV中和抗体效价检测结果显示，ISA50V2佐剂产生抗体相对ISA61VG要快，3免2周后达到高峰1:64，ISA61VG佐剂3免后1周达到高峰1:64，之后两者效价维持相当水平，具体结果见表1和图2b。
表1
进一步，为了确定最佳的免疫剂量，进行以下免疫试验：
使用ISA 61VG佐剂BCoV-BRV二联灭活疫苗，采取胸部肌肉注射途径免疫。分成5组，每组免疫6只120日龄的SPF海兰白蛋鸡，同时设对照组。首次免疫后间隔15d加强免疫，再间隔15d进行三免。具体分组和每组免疫剂量见表2，并监测免疫效果。
表2
对3次免疫的剂量进行优化结果表明，BCoV的HI价在三免1周后趋于维持在稳定水平，T2组IgY效价最高达到1:28，具体结果见表3和图3a。BRV的NT中和抗体效价在三免后1周趋于稳定，T2组IgY效价最高达到1:27，具体结果见表3和图3b。
表3
根据以上实验结果选择T1组免疫剂量为最佳免疫组。
进一步，为了确定最佳的免疫程序，进行以下免疫试验：
使用ISA 61VG佐剂BCoV-BRV二联灭活疫苗，采取胸部肌肉注射途径免疫。每组免疫5只120日龄的SPF海兰白蛋鸡，同时设对照组。首次免疫每只鸡0.3mL，第二次免疫0.5mL，第3次免疫1mL。加强免疫日龄分组见表4，并观察临床症状和监测免疫效果。
表4
由表4可知，T1组加强免疫间隔时间为14d，T2组加强免疫时间为21d，对上述免疫程序免疫鸡的IgY监测结果表明，BCoV的HI价在二免后2周即可达到较高水平1:27～1:28。三免后2周达到峰值，T1组BCoV的HI价1:28，T2组BCoV的HI价1:29，具体结果见表5和图4a。BRV的NT中和抗体效价趋势与BCoV的HI价趋势相似，三免后2周BRV的NT中和抗体效价达到峰值，T1组BRV的NT中和抗体效价1:26，T2组BRV的NT中和抗体效价1:27，具体结果见表5和图4b。
表5
进一步，为了确定最佳的免疫组合，进行以下免疫试验：
为了评价BCoV-BRV二联灭活疫苗与K99/F41 E.coil的单苗和BCoV-BRV-K99/F41E.coil 206VG佐剂三联灭活疫苗免疫效果差异。使用BCoV-BRV ISA61VG佐剂灭活疫苗、K99/F41 E.coil ISA 61VG佐剂灭活疫苗和BCoV-BRV-K99/F41 E.coil ISA 61VG佐剂三联灭活疫苗分别进行免疫，具体分组见表6。
表6
免疫途径为胸部肌肉注射，免疫程序为100日龄，120日龄加强免疫，130日龄进行第三次免疫。IgY监测程序依然按照1.2.2方法采样，BCoV抗体采用血凝抑制试验(HI)，BRV抗体采用病毒中和试验(NT)，K99/F41抗体检测采用反向间接血凝抑制试验(RPHI)，具体方法见表6。
使用BCoV-BRV-K99/F41 E.coil三联灭活疫苗一次免疫组(T2)和使用BCoV-BRV二联灭活疫苗与K99/F41 E.coil亚单位疫苗免疫2点免疫组(T1)相比，两者均在3免后1周抗体达到高峰，3免后2周抗体水平趋于稳定，具体见表7和图5。考虑到2点免疫操作复杂，应激反应大，选择BCoV-BRV-K99/F41 E.coil三联灭活疫苗一次免疫方式进行免疫。
表7
实施例2
在上述实施例的基础上，本实施例即可制备牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体，具体步骤如下：
S1、收集牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗100日龄首免，120日龄加强免疫，140日龄进行第三次免疫的SPF海兰白蛋鸡所产的鸡蛋，用0.1％新洁尔灭溶液浸泡，清洗后提取卵黄，分成3份等量卵黄放入容器中备用；
S2、向其中1份卵黄中加入3倍体积酸化水A，其中，酸化水A是由1L纯化水中69g无水乙酸钠和20mL冰醋酸配置而成；容器内加入转子，磁力搅拌30min；搅拌后加入整个酸水及卵黄混合液体积4％的正辛酸，继续搅拌1min后静置过夜；利用油布加棉布过滤静置后的液体，得到黄色澄清液体；用pH计测量所得液体的pH，用NaOH调节液体pH值至中性，得到牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体样本A；
S3、将得到的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体使用10％的甲醛溶液进行灭活(甲醛溶液的添加体积为牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的0.5％)，之后采用中空纤维过滤系统(滤孔孔径小于等于0.45μm)进行过滤即得牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体粗提物。
实施例3
与实施例2的不同在于，再取1份卵黄，按照卵黄与酸化水1:9的比例加入酸化水B(pH值2.5的盐酸溶液(纯化水加入盐酸配置)，使加入十倍卵黄体积后，溶液pH为5.0-5.2)，搅拌均匀。4℃静置6h后，4℃6000r/min离心25min，弃掉沉淀，收集上清液，得到IgY样本B。
实施例4
与实施例2的不同在于，最后1份卵黄中，先将卵黄用力搅拌20min，再按照卵黄与酸化水1:10的比例加入酸化水C(pH值3.0的盐酸溶液(纯化水加入盐酸配置)，使加入十倍卵黄体积后，溶液pH为6.0-6.2)，4℃静置过夜后提取上清液，得到IgY样本C。
通过对牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体粗提物的颜色、气味和透明度观察发现，A组IgY颜色微黄，有酸味，颜色清凉，见图6，B组和C组无色无味，颜色清凉，见表8；将得到的三组IgY样本进行微量血凝抑制实验，得到三组样本的HI抗体效价。通过数据分析可知，利用酸化水A方法制备的样本HI抗体效价最高1:28，酸化水B方法制备的样本HI抗体效价最低1:26，见表8。
表8
应用实例
022年8月18日，应用于林甸县谋奶牛场。
牛群背景
该牛场存栏奶牛1500头，2022年6月28日犊牛开始出现腹泻，到7月10日以后犊牛出生后第2天就发生腹泻，发病率100％，死亡率20％。经实验室确诊为BCoV感染性犊牛腹泻。
1.2治疗和预防实验
治疗实验：选择新出生发生腹泻的犊牛5头，发生腹泻后立即口服BCoV-BRV-E.coil三联IgY抗体治疗，每天口服1次100mL，连用3天。
预防实验：选择新生犊牛5头，待出生后2h内立即口服BCoV-BRV-E.coil三联IgY50mL，每天口服1次50mL，连用3天。
对照组：选择新出生犊牛3头，出生后不给予BCoV-BRV-E.coil三联IgY和任何抗生素治疗，观察其发病情况1周。
犊牛饲养管理
为了保证犊牛能够自然发病，对发病母牛群未进行特殊处理，包括消毒、卫生、药物保健等，犊牛饲养按照正常程序进行脐带消毒、饲喂初乳。在犊牛岛中饲养，犊牛岛使用前1周进行彻底卫生消毒处理。犊牛舍温度保持平时的室温和通风。饲喂方式为人工饲喂巴氏消毒后的酸化牛奶，每日饲喂3遍，根据体重每次2-3L。
治疗效果评价
临床评分标准将犊牛腹泻程度进行评分：0＝正常，1＝软粪便，2＝中等腹泻，轻微脱水，3＝严重腹泻，严重脱水，10＝死亡。每天评分2次，上午和下午各一次。连续观察7d，计算每头牛7d的总分数。
排毒检测每天采集犊牛粪便，通过RT-PCR方法检测粪便中的BCoV变化。
防治效果观察
治疗实验：连续观察1周，实验组4头犊牛未发生腹泻(临床评分0分)，1头犊牛第3天发生轻微腹泻(临床评分2分)，用了2次抗生素后康复。
预防实验：连续观察1周，实验组5头犊牛均未发生腹泻(临床评分0分)。
对照组：3头对照组犊牛出生后第2天开始腹泻(临床评分1分)，随着时间延长腹泻加重，第3天出现血便(临床评分3分)，其中1头第4天死亡(临床评分10分)，2头第7天死亡(临床评分10分)。
排毒检测结果治疗组中1头腹泻犊牛第3天到底7天均可检测到BCoV，预防组犊牛粪便军检测不出BCoV；对照组从第2开始腹泻一直到死亡均可检测到BCoV。以上结果表明BCoV-BRV-E.coil三联IgY对犊牛BCoV腹泻具有很好的预防和治疗效果。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、收集牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗免疫的蛋鸡所产的鸡蛋，用0.1％新洁尔灭溶液浸泡，清洗后提取卵黄，放入容器中备用；
S2、采用酸化水纯化法提取卵黄中的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体；
S3、将得到的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体采用中空纤维过滤系统进行过滤即得牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体粗提物。
2.根据权利要求1所述的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联灭活疫苗免疫的蛋鸡的免疫程序为100日龄，120日龄加强免疫，140日龄进行第三次免疫。
3.根据权利要求1所述的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：向卵黄中加入3倍体积酸化水，其中，酸化水是由1L纯化水中69g无水乙酸钠和20mL冰醋酸配置而成；容器内加入转子，磁力搅拌30min；搅拌后加入整个酸水及卵黄混合液体积4％的正辛酸，继续搅拌1min后静置过夜；利用油布加棉布过滤静置后的液体，得到黄色澄清液体；用pH计测量所得液体的pH，用NaOH调节液体pH值至中性，得到牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体样本。
4.根据权利要求1所述的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的中空纤维过滤系统的滤孔孔径小于等于0.45μm。
5.一种如权利要求1-4任一所述的方法制备的牛冠状病毒、牛轮状病毒和K99-F41兼性大肠杆菌三联高免卵黄抗体。
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