CN107375920B - 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体疫苗及其制备方法和用途。所述疫苗含有猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体抗原和稳定佐剂复合物，所述猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体是由猪繁殖与呼吸综合症病毒通过直接吸附或共价结合在猪流感病毒重构病毒体表面形成，其中，所述猪流感病毒重构病毒体是含有磷脂双分子层的微小囊泡，在磷脂双分子层表面结合有猪流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白。本发明制备得到的疫苗具有安全、高效、使用方便、效期长等特点。通过滴鼻免疫即可达到降低及/或清除呼吸综合征病毒及/或猪流感病毒目的。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗 及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗及其制备方法和用途。本发明属于生物医药或兽医生物制品技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是猪的慢性病，在全球养殖猪的国家流行，每年造成经济损失约400亿，是猪养殖和肉类产业最重要的传染病之一。

自PRRSV病毒发现以来，国内外开发了灭活和减毒修饰活疫苗(Modified live，PRRS-MLV)用于PRRSV控制。尽管如此，PRRS-MLV对易感猪有重组变异风险，活疫苗株也有毒力返祖的可能，对异型基因病毒攻击保护水平低，不能消除病毒感染或持续感染、排毒。灭活疫苗尽管安全性好，但免疫原性弱,免疫效果不佳。因此，急需研制出一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的非传染性PRRSV疫苗。

猪流感感染引起养猪业巨大的经济损失，是公共卫生和养猪业危害最大的疾病之一。猪流感是甲型流感病毒(Swine influenza A virus，SIAV)引起的一种急性呼吸道疾病，涉及鼻粘膜、扁桃体、气管、肺上皮细胞。目前猪群中主要流行H1N1、 H1N2、H3N2猪流感甲型病毒。猪流感病毒基因组为8片段的负链RNA，编码12–13 蛋白：PB2、PB1、PB1-F2、PB1-N40、PA、PA-X、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、 NS2/NEP。猪流感病毒感染引起猪高烧、嗜睡、食欲减退、呼吸困难、咳嗽。尽管病持续2–6天、死亡率低，多数猪恢复，但体重严重减小。猪流感与其他呼吸道病原共感染引起猪慢性呼吸病和复合呼吸病综合征，猪流感病毒感染母猪偶然引起流产。因为猪是人、禽甲型流感病毒混合器，因此会产生许多不同SIAV毒株，其中一些具有在人和动物之间传染的潜力。有效的免疫可预防养猪产业经济损失、限制猪甲型流感病毒向人传播。双价或多价完整病毒灭活疫苗虽然可保护同源病毒感染，但对异源毒株的保护有限。

在疫苗制造中，疫苗配方中常含有动物源性的蛋白、例如牛或人血清白蛋白、动物明胶以增强病毒类疫苗，特别是对环境敏感的病毒类疫苗的稳定性，但疫苗组份中的蛋白如果来源于动物传染病没有控制的猪、牛或马，则有传染病传播的潜在风险，也有引起变态反应或动物应激反应的风险。因此需要研制一种稳定的不含动物蛋白、多肽和寡肽的赋型剂，用于保护疫苗抗原的稳定性和完整性，特别是对于难以保存的包含灭活纯化全病毒的猪繁殖与呼吸道病毒疫苗和猪流感疫苗；也需要开发适合有效剂量低、总蛋白含量小的疫苗使用的赋型剂。高度纯化疫苗抗原，因为疫苗配方中含微量的残余杂质蛋白和核酸，排除了潜在的过敏反应，但另一方面会引起纯化灭活病毒降解、吸附或凝聚，从而使疫苗活性成分降低、效果降低，因此赋型剂中需含有稳定佐剂和抗原稳定剂，目前疫苗单独的铝稳定佐剂、双向油稳定佐剂很难保持灭活疫苗的免疫原性和安全性，因此有必要开发能够使疫苗效期长且可诱导特异性的体液免疫和细胞免疫的稳定佐剂。

发明内容

针对目前猪繁殖与呼吸综合征病毒现行疫苗存在的问题，本发明的目的在于采用病毒培养、纯化技术，病毒体制备技术，提供一种安全、高效、使用方便、效期长且能够实现对PRRSV和猪流感病毒感染保护的滴鼻疫苗。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，含有猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体抗原(PRRSKPWV-SwIVA-RV)以及稳定佐剂复合物，所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体抗原是由猪繁殖与呼吸综合症病毒通过直接吸附或是共价结合在猪流感病毒重构病毒体的表面形成的，其中，所述的猪流感病毒重构病毒体是含有磷脂双分子层的小囊泡，在磷脂双分子层的表面结合有猪流感病毒血凝素(haemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白。

在本发明中，优选的，所述的稳定佐剂复合物为含有2.0～10g/L必需和非必需氨基酸混合物、20～25g/L多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物(Poly ICLC)、0.1-0.5mg/L 卡介菌裂解物、30～100g/L双糖、30～100g/L多元醇、1.0～5.0g/L尿素或尿素衍生物、0.01～0.4g/L EDTA或EDTA盐、0.001～0.1g/L表面活性剂的10～100mM的缓冲溶液，pH值7.0～9.0，更优选为pH 7.2-8.0。

本发明的稳定佐剂复合物成分符合药典、兽药典、兽医学、医学要求，可用于人以及动物的疫苗的制备。特别是疫苗稳定佐剂的成份不能含有干扰损害疫苗抗原或活的病毒的成分，稳定佐剂复合物中发挥佐剂作用的为卡介菌裂解物和多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞。稳定佐剂复合物中抗生素、二价盐离子的含量、浓度都为兽药典要求许可，并不含对动物、人体以及食品安全有害的成份，这些成分进入机体后的药理、毒理作用已在多年临床使用中获得证实。说明疫苗从原辅材料的选择保证疫苗的安全性。

本发明的稳定佐剂复合物中具有佐剂作用的多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物是使用安全有效、药用级的诱导剂。在人的某些癌症治疗和作为抗病毒药物中使用，安全。多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物诱导不同动物细胞产生I类干扰素发挥抗病毒作用和免疫调节作用以及诱导特异性抗体生成的作用。颗粒抗原和稳定佐剂复合物配制的疫苗发挥其免疫作用调节、特异性抗体生成的促进作用以及在鼻内诱导干扰素局部抗病毒作用。

人用卡介苗的蛋白裂解物主要发挥细胞免疫和体液免疫的促进作用，能够使呼吸道黏膜对PRRSKPWV-SwIVA-RV吸收、递呈增强，从而增强局部和系统免疫反应，使疫苗免疫期延长、免疫效果明显提高，扩大对不同基因型、不同遗传谱系 PRRSV、SwIVA免疫谱。也就是提高了发明疫苗的安全、广谱、高效性。

在本发明的稳定佐剂复合物中含有非离子表面活性剂，能够使 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫原性或生物学活性稳定，病毒体保持完整，阻止 PRRSKPWV-SwIVA-RV吸附在容器壁上、阻止PRRSKPWV-SwIVA-RV凝聚、降解或结合。

非离子表面活性剂使疫苗组合中成分多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物在各种条件下稳定不易变性退火，不易丧失其活性也保证PRRSKPWV-SwIVA-RV抗原稳定。有助于其进入机体细胞发挥诱导内源性干扰素的作用，发挥内在免疫和过继免疫作用。

本发明的稳定佐剂复合物的pH值在7.0-9.0，根据PRRSV、SwIVA理化性质，优选的，缓冲液pH 7.2-8.0较为适宜病毒活性和结构完整。在这个范围 PRRSKPWV-SwIVA-RV颗粒稳定性保良好，特别对猪繁殖与呼吸综合症病毒较为稳定。

在本发明中，优选的，所述的必需和非必需氨基酸混合物至少包含精氨酸或精氨酸盐以及谷氨酸或谷氨酸盐；所述的双糖为双糖，优选麦芽糖、岩藻糖或蔗糖其中至少一种，所述的多元醇为多元醇，优选山梨糖醇或甘露糖醇或其组合，所述的表面活性剂为非离子表面活性剂，优选吐温-20或Pluronic F68；所述的缓冲溶液选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液的任意一种或一种以上按任意体积比例所组成的混合物。

在本发明中，优选的，所述的卡介菌裂解物按照以下方法制备：卡介菌用改良苏通综合培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，用制备型低速离心机收获菌体，PBS洗涤2次，悬浮于含EDTA、蛋白酶抑制剂、DNA酶、 RNA酶的PBS中，用玻璃珠破碎细菌，直到90％菌体破碎，离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液；上清液经0.2μM、低蛋白结合的膜过滤，获得全菌体裂解物，其中内毒素水平应不高于0.002μg/mg蛋白。

在本发明中，优选的，所述的疫苗中，猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体的含量为4-8μg/ml。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗方法，包括以下步骤：

(1)纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备；

(2)纯化灭活的猪流感病毒全病毒抗原的制备；

(3)猪流感病毒重构病毒体的制备

a磷脂分散液的制备

用含有pH 7.3，0.1M NaCl的0.01M Tris/HCl在匀质器上制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的 75％磷脂酰胆碱、20％的磷脂酰乙醇胺以及5％的胆固醇，其中所有磷脂占分散液的1-2％(w/v)，将胆酸钠加入分散液中，使其终浓度为1.3％(w/v)；

b猪流感病毒外膜蛋白的制备

向纯化的猪流感病毒病毒液中加入含0.1M八甘醇单正十二烷基醚、7.9mg/mlNaCl，4.4mg/ml柠檬酸钠、2.1mg/ml MES、1.2mg/ml N-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸的pH 7.3的水溶液，混合物在超速离心机离心，收取上清液，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；

c猪流感病毒重构病毒体的制备

将步骤b获得的上清液加入步骤a获得的磷脂分散液中，在4℃搅拌，上样Sephadex G-50层析柱，柱子放置在水浴中与超声仪相连，每分钟超声震荡10秒产生猪流感病毒重构病毒体，重构流感病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出，收集外水体积部分，将含猪流感病毒重构体的外水合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒重构体；

(4)猪繁殖与呼吸综合症病毒与猪流感病毒重构病毒体的偶联

将步骤(1)获得的灭活纯化的PRRSV全病毒抗原和步骤(2)获得的猪流感病毒重构体混合、轻轻摇动重悬，在20℃轻轻搅拌48小时使PRRSV通过范德华力吸附于猪流感病毒重构病毒体的表面，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体；或者

利用PRRSV表面已经存在二硫键与猪流感病毒重构病毒体进行共价结合病毒体。

进一步的，本发明还提出了另一种制备所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗方法，包括以下步骤：

(1)纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备

(2)PRRSV的硫醇化

灭活纯化的PRRSV溶于0.1M磷酸缓冲液中；N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)和乙醇混合，取混合液用注射器缓慢加入含有PRRSV的磷酸缓冲液，使SPDP与PRRSV的摩尔比15:1，同时保持乙醇浓度在5v/v％以下防止蛋白变性，混合物在20℃反应30分钟，反应结束后，分别用pH7.0的0.05M柠檬酸钠、pH7.0 的0.05M磷酸钠、pH7.0的0.05M氯化钠平衡Sephadex G-50的柱子进行三次纯化；得到硫醇化的PRRSV全病毒抗原PRRSV—SPDP；

(3)纯化灭活的猪流感病毒全病毒抗原的制备

(4)猪流感病毒重构病毒体的制备

a磷脂分散液的制备

将磷脂酰胆碱(PE)与N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)进行交联：15mg磷脂酰胆碱放入5ml玻璃瓶干燥，干燥后重新溶于氯仿中，然后加入含三乙胺(TEA)、SPDP的无水乙醇，混合物在通氮气条件下室温搅拌1-2小时直到反应完成，即没有单一磷脂酰胆碱，反应产物在旋转蒸发仪上干燥，产物重悬于氯仿，上样硅酸层析柱进行纯化，得到PE-SPDP；

用含有pH 7.3，0.1M NaCl的0.01M Tris/HCl在匀质器上制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的 75％的PE-SPDP、20％的磷脂酰乙醇胺以及5％的胆固醇，其中所有磷脂占分散液的1-2％(w/v)，将胆酸钠加入分散液中，使其终浓度为1.3％(w/v)；

b猪流感病毒外膜蛋白的制备

向纯化的猪流感病毒病毒液中加入含0.1M八甘醇单正十二烷基醚、7.9mg/mlNaCl，4.4mg/ml柠檬酸钠、2.1mg/ml MES、1.2mg/ml N-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸的pH 7.3的水溶液，混合物在超速离心机离心，收取上清液，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；

c猪流感病毒重构病毒体的制备

将步骤b获得的上清液加入步骤a获得的磷脂分散液中，在4℃搅拌，上样Sephadex G-50层析柱，柱子放置在水浴中与超声仪相连，每分钟超声震荡10秒产生猪流感病毒重构病毒体，重构流感病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出，收集外水体积部分，将含猪流感病毒重构体的外水合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒重构体；

(5)猪繁殖与呼吸综合症病毒与猪流感病毒重构病毒体的偶联

在0.2M柠檬酸磷酸缓冲液中将硫醇化PRRSV全病毒抗原PRRSV—SPDP的 pH用1MHCl调至5.5，加入二硫苏糖醇溶液，溶液放置30分钟，用PBS缓冲液平衡Sephadex G-50分离二硫苏糖醇，在有氮气环境中收集蛋白，得到还原后的硫醇化PRRSV全病毒抗原；将获得的重构猪流感病毒体和还原后的硫醇化PRRSV全病毒抗原在室温下搅拌过夜，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒。

在上述所述的方法中，所述的纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备包括以下步骤：

(1)病毒培养、三次冻溶、收获

猪繁殖与呼吸综合症病毒感染MARC-145细胞，收获病毒培养液，收集PRRSV 病毒液经三次冻溶，裂解液离心，上清液收集于无菌容器罐；

(2)灭活

取步骤(1)获得的PRRSV病毒液加入灭活剂β-丙内酯，获得PRRSV病毒灭活液；

(3)离子交换层析

将灭活后的病毒液用离子交换层析柱进行层析；

(4)超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为300KD膜超滤浓缩，同时用0.02 MTris-HCl(pH 7.5)透析；

(5)分子排阻层析

浓缩PRRSV病毒液上样FF-Sepharose 6层析柱，获得病毒纯化液；

(6)超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为300KDa的膜，使用含有150mM NaCl,pH 7.5的 50mM磷酸缓冲液超滤透析，获得灭活纯化PRRSV全病毒液。

在上述所述的方法中，所述的纯化灭活的猪流感病毒全病毒抗原的制备包括以下步骤：

(1)病毒培养、三次冻溶、收获

猪流感病毒感染MDCK细胞，收获病毒培养液，收集猪流感病毒病毒液经三次冻溶，裂解液离心，上清液收集于无菌容器罐；

(2)灭活

取步骤(1)获得的猪流感病毒病毒液加入灭活剂甲醛溶液，获得猪流感病毒灭活液；

(3)离子交换层析

将灭活后的病毒液用离子交换层析柱进行层析；

(4)超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为700KD膜超滤浓缩，同时用0.02MTris-HCl(pH 7.5)透析；

(5)分子排阻层析

浓缩猪流感病毒病毒液上样FF-Sepharose 6层析柱，获得病毒纯化液；

(6)超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为700KDa的膜，使用含有150mM NaCl,pH 7.5的 50mM磷酸缓冲液超滤透析，获得灭活纯化猪流感病毒全病毒液。

更进一步的，本发明还提出了所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗在制备预防由猪繁殖与呼吸综合症病毒及/或猪流感病毒所导致的疾病的药物中的用途，优选的，所述的药物通过滴鼻的方式给药。

在PRRSV疫苗制备工艺中，按兽医生物制品或医学生物制品学要求，作为合规PRRSV疫苗抗原纯化方法是蔗糖密度梯度离心法，但耗时、纯化效果和产物纯度低，又难于放大和规模化使用。如PRRSV纯化采用肝素亲和层析，杂质去除率据报道为 96％，但重复性不佳。为建立高纯度、高产能PRRS全病毒颗粒纯化工艺，发明了符合cGMP验证的层析技术组合的PRRSV颗粒纯化工艺，用于PRRSV疫苗抗原的制备。目前尚无采用澄清、浓缩、层析组合技术纯化PRRSV的报道，且层析技术组合符合cGMP认证，已经在狂犬病等病毒类疫苗上使用，更易获准规模化生产。与密度梯度离心比较，病毒层析纯化工艺快速、产物一致性好、易于自动工业化。在已经商业化、符合cGMP认证的层析技术中，分子排阻层析能够去除PRRSV超滤浓缩液中大量的杂质，产率高并易于目标配方缓冲液的转换，该步收获率达75％。PRRSV 悬浮培养液经澄清去除PRRSV原液大片细胞碎片后，用离子交换层析进一步去除大量的核酸并浓缩PRRSV颗粒。离子交换层析所获PRRSV纯度高于蔗糖密度梯度离心所获PRRSV产物2倍。对于PRRSV这类大病毒，传统的离子交换介质不适合用于 PRRSV这类大病毒纯化。易于形成工艺、高产出率、容易验证、一段时间可促成产品上市、可商用生产抗原或疫苗的介质Q sepharose HP作为本发明所使用的离子交换层析介质：单位体积吸附外部表面积大，因此能够提供较好的结合性。同时省去传统疫苗该步需要的超滤浓缩这一步骤。

pH是发展离子交换步骤的重要参数，影响PRRSV的电荷强度。蛋白聚集强烈依赖pH，因此为避免PRRSV聚集和稳定，液体pH选择和维持在7.5。离子交换层析另一个重要参数为离子强度，影响PRRSV颗粒静电相互作用，为最大化分离效果的获得，优选最大结合病毒的离子强度病毒液上样离子交换柱以增加产能和可选性。结合Q sepharoseHP柱用线性梯度液洗脱，优选平衡液含0.1M NaCl。尽管经离子交换层析纯化后，PRRSV纯度提高，但其反应性没有提高，说明纯化未曾改变PRRSV的结构。层析缓冲液盐浓度影响PRRSV表面糖蛋白的糖基化，发明所选盐浓度适合保持PRRSV的糖基化膜蛋白稳定和不影响疫苗的免疫原性。离子交换层析适合大量去除病毒原液中的DNA片段或杂质。

与现有常规灭活疫苗技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)灭活纯化PRRS完整病毒与猪流感甲型病毒重构病毒体 (PRRSKPWV-SwIVA-RV)作为疫苗抗原，使疫苗对不同基因型PRRSV和不同亚型SwIVA感染产生保护性免疫应答；可为一种猪二联疫苗，用于预防PRRSV、 SwIVA感染，减小或清除PRRSV病毒血症、减小SwIVA感染引起的宏观、微观损伤、病理，减少猪发热以及临床症状；

(2)本发明所述疫苗中抗原为PRRSKPWV-SwIVA-RV颗粒，在稳定佐剂复合物作用下，能够高效诱导了Th1免疫反应，而一般PRRSV或SwIVA灭活疫苗只诱导 Th2反应。意味者发明疫苗可诱导综合、保护性体液和细胞免疫反应。

(3)灭活疫苗抗原一般通常需要佐剂增强免疫反应使疫苗有效。稳定佐剂的组分增强抗原单独引起的免疫反应。本发明所述的疫苗稳定剂中，进一步包括一或多种佐剂，佐剂可以是兽医学和药学接受的组合。优选的，所述的稳定佐剂组分包括BCG疫苗株全菌体蛋白裂解物和多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物，使疫苗具有高度安全性、免疫性和良好的免疫效果。

(4)本发明的稳定佐剂复合物与抗原制造工艺简单、造价低廉。

(5)本发明疫苗经鼻内滴注免疫小母猪、母猪、怀孕母猪可增强中和抗体的生成，减少PRRSV病毒血症持续时间，对同型基因、异型基因、不同遗传谱系猪繁殖与呼吸综合病毒感染引起症状或死亡具有保护作用，具有广谱免疫原性；且对怀孕母猪安全不影响其生殖，免疫期为120天。

(6)本发明的稳定佐剂复合物使PRRSKPWV-SwIVA-RV疫苗在2-8℃可保存2年，效期长达2年。

(7)本发明疫苗提供鼻内接种的方式，克服常规灭活疫苗肌肉注射途径引起的副反应，减少猪应激反应，对猪无侵袭性，激发内在免疫、过继性免疫反应。安全、有效、使用方便。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒以及疫苗的制备

1、毒株、细胞、培养液

本发明制备疫苗和PRRSV抗体毒株为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 HP-PRRSV-JXM-F5株在Marc-145细胞上传代的第25代病毒株 HP-PRRSV-JXM-F25。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV-JXM-F5株，其为HP-PRRSV-JXM在MARC-145细胞上传至5代的适应株，分类命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒，其微生物保藏号是：CGMCCNO.9453，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该病毒株已记载在申请日为2014年12月30日，申请号为201410842421.9，发明名称为“一种广谱粘膜免疫防控猪繁殖与呼吸综合症的疫苗组合物及其应用”的专利申请中。

无外源因子、符合PRRSV疫苗抗原生产的MARC-145工作库细胞为中农威特生物科技股份有限公司建库和鉴定，用于发明PRRSV疫苗抗原生产和体外滴度、生化分析检定，细胞维持液为含5v/v％小牛血清、100μg/ml链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM(购自美国Invitogen公司)培养液，病毒培养液为含0.1％的牛血清白或马血清MEM培养液。

2、纯化灭活PRRSV全病毒抗原制备

2.1 病毒培养、三次冻溶、收获

MARC-145细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含5v/v％胎牛血清、100μg/ml 链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM(Invitogen)培养液和微载体cytodex-3的生物反应器，体积30L，有效工作体积25L，37℃，5％CO₂环境培养3-4天，培养液 pH7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速。猪繁殖与呼吸综合症病毒 HP-PRRSV-JXM-F25病毒株以0.01MOI感染MARC-145细胞，分别在第7、11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液感染。收集PRRSV病毒液经三次冻溶，裂解液在4℃5000g低速连续流离心20分钟，上清液收集于无菌容器罐。总计获得 5000毫升PRRSV病毒原液。

2.2 灭活

取上述获得的PRRSV病毒液按4000ml加入1ml的灭活剂β-丙内酯，在22-25℃灭活18小时，37℃水解2小时，获得PRRSV灭活液。

灭活验证试验：1mL灭活液加入装有50mL培养液的150cm²细胞瓶，37℃培养1周，换新鲜培养液继续培养1周。同时接种1mL的未灭活病毒液到相同细胞瓶观察细胞病变效应。

2.3 离子交换层析

将灭活后的病毒液用含0.1M NaC的l20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液平衡后加入经平衡缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH＝7.5)平衡的离子交换层析柱(Q sepharoseHP介质100ml装入XK 16/20层析柱，购自GE Healthcare公司)，收集流穿液，用10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，然后依次用10倍柱体积的含0.1M、180mM、 490mM、900mM NaCl的20mMTris-HCl(pH 7.5)线性梯度液洗脱，收集每一个峰，检测OD₂₈₀吸收值。

第一洗脱峰收集液用含0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)溶液10倍稀释后上样离子交换层析柱，以NaCl浓度递增的洗脱缓冲液洗脱，所有步骤流速5ml/min。收集含PRRSV颗粒的洗脱峰并检测分析：除0.1M NaCl洗脱液，180mM NaCl、490 mM NaCl 900mMNaCl洗脱液中均含PRRSV颗粒，490mM NaCl洗脱液的SDS-PAGE 分析纯度与蔗糖梯度密度离心或肝素亲和层析柱纯化的PRRSV接近。总计收获1000 毫升的PRRSV病毒液。

2.4 超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为300KD膜超滤浓缩100倍，同时用0.02M Tris-HCl(pH 7.5)透析。

2.5 分子排阻层析

10ml浓缩PRRSV病毒原液上样FF-Sepharose 6层析柱(购自GE Healthcare公司)。层析柱的平衡液为0.02M Tris-HCl(pH 7.5)。用平衡液以0.8ml/min流速洗脱，同时检测洗脱液在OD₂₈₀的吸收值，收集洗脱第一峰。第一峰为纯化的PRRSV。 SDS-PAGE显示灭活浓缩PRRSV病毒液经分子排阻层析除去了大量杂蛋白，并与 PRRSV病毒分离。

第一峰所含蛋白经SDS-PAGE电泳显示：纯化PRRSV病毒N蛋白分子量15kDa, M蛋白分子量18–19kDa，GP5蛋白分子量25kDa,GP2蛋白分子量29kDa，GP4蛋白分子量31kDa，GP3蛋白分子量为42kDa。结果表明PRRSV纯化产物的分子量与 PRRSV主要结构蛋白大小一致。

透射电镜观察纯化PRRSV病毒液观察到内核直径为25-30nm、直径50-74nm圆形或卵圆形囊膜颗粒,也有一小部分直径大于60nm的圆形或卵圆形囊膜颗粒。经过该步获得病毒纯化液200毫升。

2.6 超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为300KDa的膜，使用磷酸缓冲液(50mM磷酸缓冲液，150mM NaCl,pH 7.5)超滤浓缩2倍透析，获得100毫升灭活纯化PRRSV全病毒液，用于重构病毒颗粒的制备。

3、猪流感病毒重构病毒体的制备与检测

3.1 毒株、细胞、培养液

毒株为猪流感病毒H1N2株(A/swine/LZ/001/2016)，H1N1 (A/swine/GS/009/2017)为中农威特生物科技股份有限公司自行分离和鉴定。

无外源因子、符合疫苗抗原生产的MDCK细胞为中农威特生物科技股份有限公司建库和鉴定，用于发明疫苗抗原生产和检定，细胞维持液为含5v/v％小牛血清、 100μg/ml链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM(购自美国Invitogen公司)培养液，病毒培养液为含0.1v/v％的牛血清白或马血清MEM培养液，病毒培养液含3μg/ml TCPK胰蛋白酶(购自美国Sigma-Aldrich公司)。

3.2 纯化灭活的猪流感全病毒抗原的制备

3.2.1 病毒培养、三次冻溶、收获

MDCK细胞用细胞工厂培养扩大，转入盛有含5v/v％胎牛血清、100μg/ml链霉素以及100IU/ml青霉素的DMEM(Invitogen)培养液和微载体cytodex 3的生物反应器，体积30L，有效工作体积25L，37℃，5％CO₂环境下培养3-4天，培养液pH7.2±0.2，氧饱和度25±0.1％，搅拌速度中速。猪流感病毒H1N2以0.01MOI感染，分别在第7、 11、15天收获病毒培养液，每收获一次，补加病毒液。在4℃5000g低速连续流离心20分钟，上清液经0.85μm的中空纤维滤器进行微滤，微滤后的病毒液收集于无菌容器罐。总计获得5000毫升的猪流感病毒原液。

3.2.2 灭活

取上述获得猪流感病毒液4000ml加入1ml的5v/v％甲醛溶液，在22-25℃灭活 48小时，获得猪流感病毒灭活液。

灭活验证试验：1mL灭活液加入装有50mL培养液的150cm²细胞瓶，37℃培养1周，换新鲜培养液继续培养1周。同时接种1mL的未灭活病毒液到相同细胞瓶观察细胞病变效应。

3.2.3 离子交换层析

将灭活后的病毒液用含0.1M NaC的l20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液平衡后加入经平衡缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH＝7.5)平衡的离子交换层析柱(Q sepharoseHP介质100ml装入XK 16/20层析柱，购自GE Healthcare公司)，收集流穿液，用10倍柱体积柱平衡缓冲液洗涤，然后依次用10倍柱体积含0.1M、180mM、 490mM、900mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)线性梯度液洗脱，收集每一个峰，检测OD₂₈₀吸收值。

第一洗脱峰收集液用含0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)溶液10倍稀释后上样离子交换层析柱，以NaCl浓度递增的洗脱缓冲液洗脱，所有步骤流速5ml/min。收集含猪流感病毒颗粒的洗脱峰并检测分析：除0.1M NaCl洗脱液，180mM NaCl、 490mM NaCl、900mMNaCl洗脱液中均含SwIVA颗粒,490mM NaCl洗脱液 SDS-PAGE分析纯度与蔗糖梯度密度离心或肝素亲和层析柱纯化的猪流感病毒接近。总计收获1000毫升的猪流感病毒液。

3.2.4 超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为700KD膜超滤浓缩100倍，同时用0.02M Tris-HCl(pH 7.5)透析。

3.2.5 分子排阻层析

10ml浓缩猪流感病毒原液上样FF-Sepharose 6层析柱column(购自GEHealthcare公司)。层析柱的平衡液为0.02M Tris-HCl(pH 7.5)。用平衡液以0.8ml/min 流速洗脱，同时检测洗脱液在OD₂₈₀的吸收值，收集洗脱第一峰。第一峰为纯化的猪流感病毒。

3.2.6 超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为700KDa的膜，使用磷酸缓冲液(50mM磷酸缓冲液，150mM NaCl,pH 7.5)超滤浓缩2倍透析，获得100毫升灭活纯化的猪流感全病毒液，用于重构病毒颗粒的制备。

4、猪流感病毒重构体的制备以及与PRRSV抗原的非共价结合

4.1 磷脂分散液的制备

用含有0.1M NaCl的0.01M Tris/HCl(pH 7.3)在匀质器上混合制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的75％磷脂酰胆碱(卵磷脂,购自美国SIGMA公司)、20％的磷脂酰乙醇胺(脑磷脂，购自美国SIGMA公司)以及5％的胆固醇(购自美国SIGMA公司)分散液，其中所有磷脂占1-2％(w/v)。将胆酸钠(从丙酮/水(4：1，V/V)重结晶获得)作为酸加入磷脂分散液中，终浓度至少为1.3％(w/v)以便拆解未超声磷脂分散液的多层结构。

4.2 猪流感病毒重构体的制备

向纯化的猪流感病毒H1N2株病毒液中加入700ml含0.1M八甘醇单正十二烷基醚(octaethyleneglycol mono(n-dodecyl)ether)(C.sub.12E.sub.8)(购自日本NikkoChemicals公司)、7.9mg/ml NaCl,4.4mg/ml柠檬酸钠、2.1mg/ml MES、1.2mg/ml N-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸(N-hydaxylethyl-piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid) 水溶液(pH 7.3)。混合物在超速离心机上以170000g离心30min，收取上清，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。将获得的上清液加入上述获得的磷脂分散液，在4℃搅拌悬浮液至少1小时，上样Sephadex G-50层析柱(80×15 cm)。柱平衡液和柱洗脱液与2.2.3节相同，流速为320ml/h。柱子放置在水浴中与超声仪相连(频率50kHz+-10％)，每分钟超声震荡10秒产生微小单层流感病毒重构体。重构流感病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出。收集外水体积部分，将含猪流感病毒重构体的合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒重构体，平均直径150nm。第一次Sephadex G-50层析，1％的胆固醇滞留于柱上，磷脂/胆固醇摩尔比>50。第二次Sephadex G-50层析后在4℃透析12小时，胆固醇量减少至检测极限以下，磷脂/胆固醇摩尔比>500。

4.3 猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒的制备

将上述获得的灭活纯化的PRRSV悬液和猪流感病毒重构体混合、轻轻摇动重悬，在20℃轻轻搅拌48小时使PRRSV通过范德华力吸附于猪流感病毒重构病毒体的表面。得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒。

5 共价结合制备猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒

5.1 硫醇化PRRSV的制备

5.1.1 纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备按照上述方法进行。

5.1.2 PRRSV的硫醇化

5ml灭活纯化PRRSV溶于0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)使其浓度为5mg/ml。 N-succinimidylpyridyl dithiopropionate(SPDP,购自美国热电公司)和乙醇混合使浓度为6mg/ml，取150μl轻微搅拌，用注射器缓慢加入5ml含有PRRSV的磷酸溶液，使SPDP与PRRSV的摩尔比15:1，同时保持乙醇浓度在5％以下防止蛋白变性。混合物室温(20℃)反应30分钟。反应结束后，分别用0.05M柠檬酸钠、0.05M磷酸钠、0.05M氯化钠(pH7.0)平衡Sephadex G-50的柱子进行三次纯化。

5.2 猪流感病毒重构体的制备

猪流感病毒重构体的制备按照4.1以及4.2的方法进行，不同在于：在使用磷脂酰胆碱前，将磷脂酰胆碱(PE)与SPDP进行交联：15mg PE(20μmol)放入5ml 玻璃瓶干燥(通过分子筛干燥)。干燥后的PE重新溶于2ml的氯仿，然后加入含 30μmol triethylamine(TEA)(3mg)、30μmol SPDP(10mg)的1毫升无水乙醇。混合物在通氮气条件下室温搅拌1-2小时直到反应完成(没有单一卵磷脂)。反应产物在旋转蒸发仪上干燥。产物重悬于氯仿，上样硅酸层析柱。

硅酸层析柱制备方法：2g硅酸溶于10ml氯仿，装入10ml填满玻璃纤维塑料注射器，使其干燥并在注射器上口安置塑料一次性三向龙头。

硅酸层析方法：上样后，柱子先用4毫升氯仿洗涤，再用4毫升系列氯仿-甲醇混合物洗脱，第一次采用氯仿：甲醇比例4:0.25(v/v)混合物，第二次采用氯仿：甲醇比例4:0.75(v/v)混合物，最后采用氯仿：甲醇比例4:1(v/v)混合物。收集洗脱液、合并、在减压条件下用旋转蒸发仪浓缩。得到PE-SPDP。

检测方法：收集2ml毫升洗脱液，用硅酸胶薄层层析和氯仿-甲醇-水(体积比 65:25:4)检测纯化物比卵磷脂跑得快，斑点用可用钼磷酸或碘染色可视。

5.3 猪流感病毒体和PRRSV抗原偶联

5.3.1 硫醇化PRRSV全病毒抗原的还原

硫醇化PRRSV全病毒抗原还原方法：在0.2M柠檬酸磷酸缓冲液中将硫醇化 PRRSV全病毒抗原(PRRSV—SPDP)的pH用1M HCl调至5.5，按每毫升病毒抗原溶液加入10微升2.5M二硫苏糖醇溶液(2.5M DTT)。溶液放置30分钟，用 PBS(pH7.0)缓冲液平衡Sephadex G-50分离DTT。为防止二硫键氧化，所有缓冲液用氮气制泡去除氧气，在有氮气环境中收集蛋白。

5.3.2 猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒的制备

将上述获得的重构猪流感病毒体和还原后的硫醇化PRRSV全病毒抗原在室温下搅拌过夜。得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒颗粒。

5.4 猪流感病毒体和PRRSV抗原偶联

PRRSV-猪流感病毒体的制备如上述第4.3节，但做以下调整：PRRSV抗原不与SPDP结合，PRRSV表面GP5、GP4、GP3、GP2已经存在二硫键作为自由二硫键进行如下反应:用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)制成5ml PRRSV溶液，终浓度5 mg/ml。每毫升PRRSV蛋白溶液加入10微升2.5M DTT溶液，室温放置30min， PBS缓冲液(pH 7.0)平衡Sephadex G-50柱分离纯化。1mg灭活纯化PRRSV悬液，加入猪流感病毒体中(0.002M流感病毒膜磷脂)，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒 -猪流感病毒重构病毒体。

6 猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪流感重构病毒体疫苗的制备

猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体用PBS(pH 7.4)稀释至含 0.2-0.5微克/ml PRRSV抗原的疫苗原液，经0.2μm的膜(Millipore)除菌过滤，与耐热稳定佐剂复合物混合制成疫苗半成品。

实施例2 稳定佐剂复合物、猪繁殖与呼吸综合症全病毒-猪流感重构病毒体疫苗配制和质控方法

1、卡介菌裂解物的制备和检定

菌种卡介菌(BCG)D2BP302S11，由中国药品和生物制品检定研究院提供，按生物制品生产检定用菌种管理规程建立种子批。工作种子批至菌体收集不应超过 12代，在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、为黄色的菌膜。毒力试验、无有毒卡介菌试验结果阴性。冻干菌种于2-8℃保存，液体菌种-70℃以下保存。

卡介菌D2BP302S11用改良苏通综合培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，用制备型低速离心机收获菌体，PBS(pH 7.4)洗涤2次，按2 g/ml悬浮于含8mM EDTA、蛋白酶抑制剂、DNA酶、RNA酶的PBS中，用玻璃珠破碎细菌，期间快速染色观察破碎状况，直到90％菌体破碎，3000g离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液获得全菌体裂解物(WCL)，上清液经0.2μM、低蛋白结合的膜过滤，按3.0g/L加入苯酚。BCG的裂解物WCL原液中含水溶性蛋白、脂类以及碳水化合物，内毒素水平应不高于0.002μg/mg蛋白，于2-8℃保存。BCG的裂解物WCL原液在2-8℃保存可保存5年。

2、多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物的制备

化合物polyICLC由本实验合成，多聚赖氨酸Poly-L-Lysine(分子量 1000-4000Da，Cat.No.P0879)、poly IC(Cat.No.P0913)和羟甲基纤维素(carboxymethylcellulose,低粘度，Cat.No.C5678)均购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,Mo)。Poly IC(平均分子量200000-500000Da，500mL；4.0mg/mL)、多聚赖氨酸(poly-L-lysine，250ml；6.0mg/mL)和2％羟甲基纤维素(carboxymethylcellulose， 250mL)由无热源0.85％NaCl制备。多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物(Poly ICLC) 制备方法为：poly IC在71℃加热1小时重新退火慢慢冷却，加入含6.0mg/mL多聚赖氨酸和2％羟甲基纤维素的等体积的生理盐水，得到多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物，即稳定佐剂复合物，调整其混合液中的最终浓度为1mg/mL，4℃备用。

3、稳定佐剂复合物的制备

按临床试验推算为20mg/100kg，疫苗有效剂量5mL。

具体方法：向100ml 50mM磷酸缓冲液中，加入0.6g精氨酸和谷氨酸的等重量比例混合物，2.2g多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物(Poly ICLC)，0.03mg卡介菌裂解物、5g麦芽糖、6.5g山梨糖醇、0.4g尿素、0.02g EDTA、0.005g吐温-20，调节pH值8.0，制备得到稳定佐剂复合物。

4.猪繁殖与呼吸综合症全病毒-猪流感病毒重构体疫苗配制和质控方法

4.1 疫苗配制

将按照实施例1方法获得的灭活纯化猪繁殖与呼吸综合症全病毒-灭活纯化猪流感病毒重构体纳加入所制备得到的稳定佐剂复合物中，制成疫苗半成品，每剂5 毫升：含猪繁殖与呼吸综合症全病毒-猪流感病毒重构体抗原30μg。

4.2 质控方法：

4.2.1 灭活纯化PRRSV全病毒含量检测方法

4.2.1.1 亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合症病毒多克隆抗体制备

灭活纯化全病毒颗粒超免兔子，获取高滴度的抗体血清，血清经饱和硫酸铵、 G蛋白层析、猪繁殖与呼吸综合症纯化病毒偶联的Sephorose-4B柱层析纯化，获得亲和层析纯化的抗体，经检验标明该抗体和猪繁殖与呼吸综合症病毒反应特异、敏感。

灭活纯化猪繁殖与呼吸综合症病毒全病毒颗粒抗原含量测定：以亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合症病毒多克隆抗体为基础建立间接ELISA法定量猪繁殖与呼吸综合症病毒的含量。利用平行线法测定猪体中和抗体的水平和纯化全病毒抗原量的关系，纯化的猪繁殖与呼吸综合症病毒为20μg可产生保护性中和抗体，定为20单位，通过间接ELISA法可估算灭活猪繁殖与呼吸综合症疫苗的效价。

4.2.1.2 总蛋白检测

总蛋白浓度浓度采用Bradford蛋白分析试剂盒按生产商提供的操作指南进行，牛血清白蛋白作为标准品。

4.2.1.3 PRRSV颗粒数检测：采用工艺各步PRRSV样品进行实时荧光系统检测 PCR(Bio-Rad iQ5Real Time PCR Detection System),20μL(iQ SYBR Green Supermix； Bio-Rad)反应体积包含10μL混合物，1μL猪血清样本cDNA提取物，8.5μL不含RNA 酶的水，采用引物猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5的引物、正向引物 5’-TCTTGCTTCTGGTGGCTTTT-3’；反向引物 5’-CATGTTTGATGGTGACGAGG-3’，各2.5μL，每次反应设立PRRSV1：10稀释的标准曲线。反应条件：94℃5min，40个循环，每次循环，94℃变性30s，55℃退火 30s，45℃延伸45s。每次反应评估的PRRSV含量转化成循环阈值Ct,由Bio-Rad iQ5 qPCR软件和标准曲线相关系数确定病毒含量(拷贝/毫升)。

4.2.1.4 PRRSV结构蛋白检测方法：

SDS-PAGE电泳用于检测PRRSV纯化效果，每步纯化液样品20微升加入5×5微升上样缓冲液，在100℃加热10分钟变性蛋白，10-20微升各样品上样15％聚丙烯酰胺胶电泳，电泳结束后要用考马斯液(0.04％Serva蓝、25％异丙醇、10％醋酸)染色 10min，用10％醋酸洗至蛋白带清晰可见。

电镜检测：50微升纯化PPRSV放置于铜网格上静止1min。用滤纸去除残留液体，用3％phosphotungstic acid染色1min。室温干燥，在投射电镜下观察。

4.2.1.5 PRRSV定量分析：

各步病毒液用不含牛血清DMEM10倍稀释(10^-0-10^-5)，每个样品MARC-145 细胞铺满的在96孔板上重复三次滴定。各稀释度样品加入四个孔，每孔100微升。 96孔板在37℃、5％CO₂孵箱孵育1h,倒掉液体，每孔加入200微升细胞维持液，在37℃、5％CO₂孵箱孵育4天直到出现细胞病变效应。logTCID₅₀/mL按Reed–Muench 公式计算。

4.2.2 猪繁殖与呼吸综合症全病毒-猪流感病毒重构体颗粒 (PRRSKPWV-SwIVA-RV)大小、形态以及纳米颗粒效率检测

用扫描电镜(电镜Hitachi S-3500N)测定、观察纳米颗粒大小、形态。待测冻干纳米颗粒使用离子包被仪置于金铂包被的粘附片上，在电镜上10KV观察。纳米包埋蛋白效率：冻干PRRSKPWV-SwIVA-RV 10mg加入0.1N NaOH，37℃处理1小时，涡旋收获上清，用0.1NNaOH配制BSA和BCA蛋白检测试剂盒(购自美国Pierce公司)检测蛋白浓度。

PRRSKPWV-SwIVA-RV特征检测：扫描电镜观察PRRSKPWV-SwIVA-RV为光滑圆球状，大小在200-300nm之间。以PRRSKPWV蛋白使用量为准， PRRSKPWV-SwIVA-RV纳米颗粒的产率为57.3±2.1％，纳米颗粒NP表面静电荷-34 mV。以SwIVA蛋白量为准，纳米颗粒中平均蛋白含量0.50-0.55％(w/w)，代表病毒体生成效率50-55％。

聚焦显微镜下PRRSKPWV-SwIVA-RV的纳米颗粒特征：从3头4-6周龄、健康的SPF猪支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，灌洗液)中分离收集巨噬细胞(灌洗液-MNC)，接种24孔板，接种浓度1×10⁶细胞/mL。24孔板含包被多聚L- 赖氨酸的盖玻片，灌洗液-MNC板37℃5％CO₂孵育1小时，倒去没有结合的细胞液，盖玻片用PBS轻轻洗涤。将冻干的PRRSKPWV-SwIVA-RV重悬于含10％FBS的 DMEM中，使其浓度达到0.2微克/mL。加入含灌洗液-MNC的培养板，37℃孵育3小时。未感染PRRSV或以0.1MOI感染PRRSV(HP-PRRSV-JXM-F5)灌洗液-MNC板在37℃5％CO₂孵箱孵育12小时，用3％多聚甲醛在冰上固定15分钟，用0.1％Triton X-100浸透15分钟，室温下用含5％BSA、0.2％triton X-100PBS封闭1小时。接着细胞加入抗PRRSV核衣壳特异性单克隆抗体mAb SDOW17(美国农村技术有限公司产品)和内源交叉反应的抗猪人抗体(溶于含1％BSA、0.1％triton X-100的PBS，购自美国Santa-Cruz公司)，室温放置1小时，加入羊抗鼠IgG Alexa Flour488和驴抗羊抗体Alexa flour 633(购自美国Invitrogen公司)，室温孵育1小时。在加入抗体步骤之间细胞洗涤且用含2.5％DABCO(购自美国Sigma公司)的液体处理。染色的盖玻片移到玻片在Leica聚焦显微镜下观察，图像使用Leica聚焦软件分析。用U型底的96孔板，每孔含1×10⁶细胞。灌洗液-MNC板也可用上述类似处理，获得类似可比结果。

流式细胞仪确定CD80/86细胞体外吸收灭活纯化PRRSV全病毒-猪流感病毒重构病毒体(PRRSKPWV-SwIVA-RV)纳米颗粒：抗原递呈细胞CD80/86接种24孔板，接种浓度1×10⁶细胞/mL。分别向CD80/86中加入灭活纯化PRRSV全病毒 (PRRSKPWV)或灭活纯化PRRS全病毒-猪流感病毒重构病毒体 (PRRSKPWV-SwIVA-RV)，使PRRSV蛋白含量分别达到2微克/mL、0.2微克/mL、 0.02微克/mL。在37℃5％CO2孵箱孵育3小时。以0.1MOI感染 PRRSV(HP-PRRSV-JXM-F5)，在37℃、5％CO₂孵箱孵育12小时。以未感染PRRSV 的CD80/86板细胞作为对照。洗涤后用生物素结合人CTLA4鼠免疫球蛋白融合蛋白 (购自美国Ancell公司)、PE-结合CD172(购自美国Southern Biotech公司)和 Streptavidin PerCP-Cy5.5依次染色，用1％多聚甲醛固定，使用FACS Aria II流式细胞仪(购自BD Biosciences公司)分析。

上述体外试验显示在正常生理条件下，灭活纯化PRRSV全病毒-猪流感病毒重构病毒体(PRRSKPWV-SwIVA-RV)在数周内间歇释放PRRSV抗原，能够被猪肺泡巨噬细胞以及抗原递呈细胞CD80/86有效吸收。

4.2.3 卡介菌全菌体蛋白水解物(WCL)中的蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法(中国药典三部，2005年版附录VI B)；WCL中内毒素水平依法检测(中国药典三部，2005年版附录XII E)；多糖含量测定、无有毒卡介菌试验、鉴别试验、致敏效应试验按中国药典三部(2005年版)p254-p255的方法进行；核酸含量测定采用紫外-可见分光光度法(中国药典三部(2005年版)附录II A；无菌检测按中国药典三部(2005年版)附录XII A的方法；异常毒性检测按中国药典三部 (2005年版)附录XII F依法检查。

实施例3 猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗稳定性与效期

3.1 疫苗半成品液体冷冻状态下稳定性

猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗原液按照实施例1 方法制备，稳定佐剂复合物以及疫苗抗原制备方法按照实施例2中方法制备。

疫苗半成品贮存在聚丙烯瓶中放置在-35℃、-70℃，每隔3月检测灭活纯化猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒，结果如下表1。

表1 疫苗半成品贮存在冷冻状态下稳定性

表1结果显示，猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗半成品在-35℃、-70℃贮存12月后，无降解现象，经激光动力光栅(DLS)分析，颗粒大小主要分布在200-300nm范围，不含降解片段，保持猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体纳米颗粒完整，也无病毒凝聚现象。说明猪繁殖与呼吸综合症灭活纯化纳米颗粒疫苗半成品在冷冻条件下，可贮存1年稳定，也说明本发明稳定佐剂复合物在疫苗制备过程中对疫苗有效抗原的保护作用。

3.2 疫苗半成品在5-25℃稳定性

稳定佐剂猪繁殖与呼吸综合症疫苗半成品若干批次的液体贮存于5℃、25℃，每隔30天检测猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒蛋白含量，结果如下表2所示：

表2 3批半成品不同温度贮存猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒蛋白含量

上述试验结果表明稳定佐剂复合物加入使猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体在4-8℃保持颗粒完整，至少3月，疫苗在5℃贮存至少3月，25℃贮存30天稳定。也说明本发明稳定佐剂复合物在疫苗贮存、冷链中对灭活纯化猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒这一疫苗有效抗原的保护作用。

3.3 猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗成品的稳定性

中和抗体检测法：抗血清倍比稀释，分别和2×10³TCID50/mL的病毒液混合，37℃孵化1小时，移入长满单层MARC-145细胞96孔板，分析7天后细胞病变效应，阻止 50％细胞病变效应的血清稀释度的倒数则为中和抗体滴度，结果如表3所示。疫苗诱导母猪保护性中和抗体滴度32-68为有效。

表3 3批疫苗贮存于不同温度下的效果(2-128/mL)和效力(U/mL)

表3中结果显示，猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗在 5℃保存的效期为2年，在常温下贮存3月不失效，37℃的效期为1月。显示疫苗良好的稳定性，也说明本发明稳定佐剂复合物良好的稳定性。

因此，疫苗原液、加入稳定佐剂复合物的半成品和成品在不同温度下贮存都保持稳定，表明由磷酸缓冲液、必需和非必需氨基酸混合物、麦芽糖、山梨糖醇、EDTA、尿素、吐温-20多聚赖氨酸羟甲基纤维素、卡介菌裂解物组成的稳定佐剂复合物能有效地保护在猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体颗粒抗原在液体、冷冻状态下的完整性、稳定性以及发明的猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体、半成品、成品的稳定性。疫苗效期可达2年，在极端高温下，效期1个月。半成品、成品在常温以及4-8℃在较长时间保持稳定，便于规模化制备和转运。

实施例4 猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗对仔猪、母猪的安全性、免疫程序、免疫效果

方法：

4.1 猪繁殖与呼吸综合症病毒培养

攻击毒用毒株JX0708-F12，由中国农业科学院兰州兽医研究所景志忠研究员分离、提供。感染攻击毒蓝耳病病毒青海株QH-08(基因登记号KU201579.1在Marc145 细胞传代50代)中国农科院兰州兽医研究所张杰研究员分离。攻击毒用MARC-145 细胞、方瓶培养，三次噬斑克隆纯化。培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养条件为37℃、5％CO2条件下培养4天。用原代肺泡巨噬细胞培养法测定病毒滴度，小母猪攻毒时用含4％小牛血清的MEM稀释到3.0logTCID50/ml,鼻腔滴注2ml。母猪攻毒时稀释到5.0TCID50/ml，鼻腔滴注2ml。

4.2 分组、免疫、攻毒、观察

本发明的猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV，实施例2方法制备)、不加稳定佐剂复合物的疫苗原液(PRRSKPWV-SwIVA-RV，实施例1制备)、商用灭活疫苗，鼻腔粘膜滴注接种。鼻腔粘膜接种的疫苗(HP-PRRSV-JXM-F5)用时用注射用水稀释到5毫升。

用试剂盒检测筛选PRRSV抗体阴性6周龄小母猪450头，分成8组，1-3组鼻内接种发明的猪繁殖与呼吸综合症完整病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗 (PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物)，1组剂量为1剂，2组剂量为2剂，间隔2周，3组剂量为3剂，4组鼻内接种疫苗原液(PRRSKPWV-SwIVA-RV)， 3剂，间隔2周。5组鼻内滴注免疫注射用水，滴注3次，每次5毫升。6组鼻内滴注PRRSV商用灭活疫苗，7-9组鼻内滴注接种发明的疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物)，7组免疫剂量1剂，8组剂量为2剂，间隔2周，9组剂量为3剂，间隔2周。各组因感染攻击毒和时间的不同而分亚组。试验设计和分组见表4。

表4 小母猪试验设计

小母猪最后1剂完成后30、60、90、120、150天攻毒。免疫前后观察猪的健康状况、体重变化、体温变化，在免疫前和最后一剂免疫完成后2周取血，检测血清的中和抗体滴度，观察攻毒感染后猪的健康状况。在各组免疫后30、60、90、120、 150、180天分别进行攻毒感染，分别攻击感染JX0708-F12强毒、QH-08强毒。观察攻毒感染后猪的健康状况、病毒血症是否出现和发生时间，检测攻毒2周后血清的中和抗体、观察猪攻毒后2周内的体温以及临床症状，死亡和生存情况。

选用不同体重年龄至少在6月龄的母猪，用试剂盒检测筛选PRRSV抗体阴性的猪80头分成三组。一组在分娩前1周鼻腔滴注一个剂量灭活纯化纳米颗粒疫苗 (HP-PRRSV-JXM-F5株)，间隔2周进行第2次、第3次鼻腔滴，1剂疫苗抗原量和稳定佐剂量为小母猪的10倍，体积为5毫升。二组超声检测确证已经怀孕母猪，在怀孕期的30-45天鼻内滴注3剂发明的疫苗，三组用注射用水分别在0、14 天、48天鼻内滴注。

母猪免疫前后观察猪的健康状况、体重变化、体温变化，在免疫前和最后一剂免疫完成后2周取血，检测血清的中和抗体滴度，观察免疫后猪体副反应。攻毒用中国高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒QH-08强毒，观察攻毒感染后猪的健康状况、病毒血症是否出现和发生时间，免疫母猪在60天、90天、120天感染攻击。通过观察仔猪的健康状况评估母猪的生殖行为。通过比较免疫母猪和未免母猪分娩 28天后产生仔猪的存活数测定疫苗的效果。

感染攻毒后病毒检测采用采用RT-PCR法，总RNA由商用试剂盒提取，采用引物猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5的引物：

正向引物5’-TCTTGCTTCTGGTGGCTTTT-3’

反向引物5’-CATGTTTGATGGTGACGAGG-3’

第一轮扩增该法的灵敏度10²TCID50，扩增499bp的DNA片段，在以第一轮的产物为模板进行第二轮扩增，每次35次循环，，每次循环，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45，可检测到1-10拷贝/毫升血清病毒。

PRRSV特异性抗体ELISA法：从猪体收集分离血清贮存于-20℃备用，用商用 ELISA试剂盒检测抗体(

PRRS 2XR，IDEXX),按说明书在室温下操作，在650nm处测定光吸收值(Bio-Rad 680微板读数仪)，通过阳性和阴性样品的比值确定PRRSV抗体是否阳性。阳性OD/阴性OD大于2.1为阳性值。

血清中和抗体检测法：血清倍比稀释，分别和2×10³TCID50/mL的病毒液混合， 37℃孵化1小时，移入长满单层MARC-145细胞96孔板，分析7天后细胞病变效应，阻止50％细胞病变效应的血清稀释度的倒数则为中和抗体滴度。

结果：

所有滴鼻3剂、2剂、1剂免疫的仔猪体温正常、平均增重大于注射用水滴注的仔猪，没有观察到系统和局部的副反应。说明发明疫苗不影响仔猪的生长发育，鼻腔滴注疫苗对小母猪安全。

所有3剂、2剂鼻内滴注免疫的母猪和1剂鼻内滴注免疫怀孕母猪平均体温正常、平均增重大于注射用水的母猪，滴鼻免疫母猪没有观察到发热和鼻腔症状，也无其他副反应。

3剂鼻内滴注免疫已经怀孕的10头母猪，平均每窝产仔9.8头，分娩28天后，仔猪体温、增重正常，无死胎和仔猪发育不全现象，发明的疫苗3剂鼻内滴注免疫使用，对怀孕母猪妊娠和产仔没有影响，对猪胚胎也无影响。

以上试验结果表明发明疫苗三次鼻内滴注接种对小母猪、母猪、怀孕母猪安全。

1组仔猪在攻毒前，5/10产生了PRRSV特异性抗体，2/10的小母猪产生中和抗体，免后30天，JX0708-F12攻毒，有10/10产生病毒血症，平均病毒血症时间为17天，4/10小母猪产生中和抗体，平均滴度为32，1/10小母猪死亡；免疫后60 天攻毒，有10/10产生病毒血症，平均病毒血症时间为18天，2/10小母猪产生中和抗体，平均滴度为16，2/10小母猪死亡；1组中，1剂免后90天用JX0708-F12 攻毒感染小母猪，有10/10产生病毒血症，平均病毒血症时间为21天，1/10小母猪产生中和抗体，滴度为16，3/10小母猪死亡；7组小母猪1剂鼻腔滴注免疫后30 天进行QH-08攻毒。疫苗滴注免疫后有6/10小母猪产生了猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体，1/10的小母猪产生了QH-08中和抗体，抗体滴度平均为8。QH-08攻毒后， 2/10的小母猪可检测到中和抗体，平均滴度为16，维持到60天。10/10小母猪产生了病毒血症，平均发生时间为18天，4头小母猪死亡；免疫后60天用QH-08感染攻毒，2/10小母猪产生了中和抗体，滴度为32。10/10的小母猪产生了病毒血症，发生时间为21天，2头小母猪死亡；免疫后90天攻毒，10/10的小母猪有病毒血症，发生时间为22天，3头母猪死亡，3/10的小母猪死亡。

2剂鼻内滴注免疫小母猪中有9/10产生PRRSV特异性抗体，有8/10的小母猪产生JX0708-F12的中和抗体，抗体平均滴度16，在免疫后90天JX0708-F12攻击感染，全部小母猪出现病毒血症，时间平均为15天，7/10小母猪产生高滴度 JX0708-F12中和抗体，平均中和抗体滴度32，10/10小母猪全部存活；免后120天 JX0708-F12感染，病毒血症平均时间为16天，6/10小母猪中和抗体水平仍保持在 16，仍为中和抗体阳性。

2剂鼻内滴注免疫、QH-08攻毒的小母猪中，完成2剂滴注免疫的小母猪都产生了特异性PRRSV抗体，有3/10小猪产生了对QH-08中和抗体，平均滴度16。免后60天进行QH-08攻毒的小母猪，其中9/10的小母猪有病毒血症发生，平均时间为15天，5/10的小母猪死亡，5/10的小母猪产生中和抗体、平均滴度为16。2剂鼻内滴注免疫120天后感染QH-08，6/10小母猪中和抗体水平仍保持在32，病毒血症发生时间平均为17天，2/10小母猪死亡。免疫后150天QH-08感染攻毒后，5/10 的小母猪产生抗体。3/10的小母猪死亡。

注射用水免疫的小母猪免疫后的血清中和抗体滴度小于8，PRRSV特异抗体检测为阴性，同步和其他免疫2剂、3剂的小母猪在免疫后60天和90天分别用 HP-PRRSV-JXM-F5攻击。60天后被攻击小母猪，10/10发生病毒血症，平均时间为25天，8/10的小母猪死亡，同样注射用水滴注90后天被攻击的小母猪，10/10 头发生病毒血症，平均时间26天，9/10的小母猪死亡。

3剂鼻内滴注免疫小母猪中有10/10产生PRRSV特异性抗体，有9/10的小母猪产生JX0708-F12的中和抗体，抗体平均滴度8。在免后90天，JX0708-F12攻击感染后，全部小母猪出现病毒血症，时间平均为18天，8/10小母猪产生JX0708-F12 中和抗体，平均中和抗体滴度64，10/10小母猪全部存活；免后120天，JX0708-F12 感染攻击后，病毒血症平均时间为19天，6/10小母猪中和抗体水平仍保持在16，仍为中和抗体阳性，8/10小母猪存活；免后150天用JX0708-F12感染攻毒组的小母猪，10/10有病毒血症发生，平均时间为20天，4/10的小母猪有中和抗体检出，平均滴度为16，5/10小母猪存活。

3剂鼻内滴注免疫、异型基因PRRSV QH-08攻毒的小母猪中，完成3剂滴注免疫的小猪都产生了特异性PRRSV抗体，有4/10小猪产生了对QH-08中和抗体，平均滴度8。3剂鼻内滴注免疫60天后攻毒组中，9/10的小母猪有病毒血症发生，平均时间为16天，2/10的小母猪死亡，5/10的小母猪产生中和抗体、平均滴度为64。 120天攻毒感染QH-08，6/10小母猪中和抗体水平仍保持在32，病毒血症发生时间平均为18天，2/10小母猪死亡。免疫后150天QH-08感染攻毒后，4/10的小母猪产生中和抗体。5/10的小母猪死亡。

3剂鼻内滴注疫苗原液、HP-PRRSV-JXM-F5感染攻毒的小母猪中，有2/10产生了特异性PRRSV抗体，并无中和抗体产生，30天攻毒组中，10/10的小母猪有病毒血症发生，平均时间为27天，8/10的小母猪死亡；

商用灭活PRRSV疫苗3剂鼻内接种免疫、HP-PRRSV-JXM-F5感染攻毒的小母猪中，有1/10头猪产生了特异性PRRSV抗体，无HP-PRRSV-JXM-F5中和抗体可检测到30天攻毒组中，10/10的小母猪有病毒血症发生，平均时间为26天，6/10 的小母猪死亡；

3剂滴鼻免疫的效果与2剂滴鼻免疫效果相同，无显著性差异。2剂、3剂滴鼻免疫攻毒后的猪的病毒血症、临床症状以及感染后的死亡数与注射用水组两两比较差异显著。

鼻内滴注疫苗原液免疫组免疫效果和3剂滴鼻免疫组免疫效果以及3剂滴鼻免疫组免疫后的特异性PRRSV抗体生成、诱导中和抗体方面，差异显著；免疫后不同时间攻毒，病毒血症发生个数、中和抗体产生、以及攻毒后死亡个数差异显著。

根据以上结果，2剂和3剂滴注免疫，发明疫苗对小母猪免疫保护期在90-120 天，超过150天后，感染死亡的仔猪明显上升，因此该发明的疫苗，接种途径为鼻腔滴注，免疫程序为3剂，间隔2周，一个月完成免疫。免疫保护期期为120天。

鼻内滴注免疫发明的疫苗3剂免疫小母猪，都能诱导血清中和抗体生成，减少猪繁殖与呼吸综合症病毒感染病毒血症发生，减少小母猪感染死亡，对同基因型 PRRSV感染引起的死亡保护率为80％，对异型PRRSV感染引起死亡的保护率为 60％，免疫保护期为120天。

一组鼻内滴注免疫3剂发明疫苗(抗原量和稳定佐剂复合物组分量10倍于小母猪用量，体积为5毫升)都产生了特异性PRRSV抗体，有2/10母猪产生了对 JX0708-F12中和抗体，平均滴度32。免疫60天后JX0708-F12攻毒后，6/10的母猪有病毒血症发生，平均时间为16天，10/10的母猪存活，6/10的母猪产生 JX0708-F12中和抗体、平均滴度为64。120天攻毒感染JX0708-F12，6/10母猪中和抗体水平保持在32，有6/10的母猪发生了病毒血症，时间平均为17天，无母猪死亡。免疫后150天JX0708-F12感染攻毒后，4/10的母猪产生中和抗体。1/10母猪死亡。

二组超声检测确证已经怀孕的母猪10头，在怀孕期的30-45天鼻内滴注3剂发明的疫苗，免疫完成后2周，10头怀孕母猪都产生了特异性PRRSV抗体，有3/10 母猪猪产生了对HP-PRRSV-JXM-F5中和抗体，平均滴度64。60天 HP-PRRSV-JXM-F5攻毒组中，5/10的母猪有病毒血症发生，平均时间为18天，10/10 的母猪存活，6/10的母猪产生HP-PRRSV-JXM-F5中和抗体、平均滴度为128。120 天攻毒感染HP-PRRSV-JXM-F5，6/10母猪中和抗体水平保持在128，有5/10的母猪发生了病毒血症，时间平均为18天，无母猪死亡。免疫后150天 HP-PRRSV-JXM-F5感染攻毒后，3/10的母猪产生HP-PRRSV-JXM-F5中和抗体， 1/10母猪死亡，8/10的母猪有病毒血症，平均病毒血症时间为20天。

三组用注射用水分别在0、14、28天鼻内滴注免疫10头无PRRSV抗体的怀孕母猪，10头怀孕母猪都没有特异性PRRSV抗体检出，也无中和抗体检出，均为阴性，在免疫后30天用QH-08攻毒感染，有1/10母猪产生了对QH-08中和抗体，滴度为4；10/10的母猪产生了病毒血症，病毒血症持续时间平均为25天，9/10有高热症状或死亡，60天QH-08攻毒组中，10/10的母猪有病毒血症发生，平均时间为 25天，8/10的母猪死亡或有症状，1/10的母猪产生QH-08中和抗体、滴度为8。120 天攻毒感染QH-08，1/10母猪有中和抗体，滴度为8，有10/10的母猪发生了病毒血症，时间平均为23天，10/10母猪死亡或有呼吸道疾病症状、体温升高。免疫后150天QH-08感染攻毒后，10/10的母猪有病毒血症。9/10母猪有体温升高和死亡，8/10的母猪有病毒血症，平均病毒血症时间为24天。

一组和二组的结果与三组结果比较，一组和三组、二组和三组免疫、攻毒效果差异显著。3剂疫苗鼻内滴注免疫母猪和怀孕母猪，其中在怀孕期间完成3剂鼻内免疫的猪，即二组和三组从免疫效果和疾病症状保护率方面差异不显著。因此发明的疫苗鼻内滴注免疫怀孕母猪和母猪安全、有效。发明疫苗对异型基因PRRSV JX0708-F12感染有减少病毒血症时间、减少死亡或发病的效果，减少发病和死亡效果为70％。

以上表明，本发明的疫苗可做成2种规格，一规格使用小母猪，接种途径为鼻内滴鼻，间隔2周，一月内三次接种，免疫保护期为120天，一规格使用于母猪和怀孕母猪，接种途径为鼻内滴鼻，间隔2周，一月内三次接种，免疫保护期为120 天。

实施例5 PRRSV-KPWV-SwIVA-RV疫苗抗猪流感效果和作用

方法：

5.1.试验设计与样本收集

健康、确证无SwIAV H1N1和H1N2血凝抑制抗体仔猪(n＝40)，所选仔猪免疫程序如实施例4，在一个月内完成二次滴鼻免疫，按疫苗配方和不同分成4个试验组(n＝10头/组)，第1组为PBS模拟滴鼻免疫猪，不攻毒；第2组为PBS模拟滴鼻免疫猪。攻毒；第3组为PRRSVKPWV-SwIVA-RV免疫猪，攻毒；第4组为 PRRSVKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂疫苗免疫猪，攻毒，按中国农业科学院兰州兽医研究所制定的试验动物福利办法饲养和试验操作。

每次免疫剂量如实施例4，疫苗中灭活H1N2抗原量为灭活前10⁷TCID₅₀H1N2，疫苗的体积为5毫升。攻击毒为毒力较强异源SwIAV H1N1 2mL(6×10⁶TCID50/2 mL)，1mL滴入鼻内，1mL滴入气管。在疫苗原液、疫苗接种时或尸检时取血浆样本。攻毒后每天检测肛门温度，攻毒后4天收集鼻咽拭子浸入2mL，在攻毒后6天(DPC)麻醉猪，检测肺部的损伤并打分。

收集支气管肺泡灌洗液(Broncho-alveolar lavage，BAL)用于病毒滴度滴定；收集右上肺叶组织1g悬浮于3mL DMEM,匀浆均质后，收集上清用于检测抗体反应。肺组织用福尔马林固定进行组织病理和免疫化学评估。在攻击时0和攻击后6天采用密度梯度介质淋巴细胞制备SepMate-50管(购自加拿大Stemcell公司)分离外周单核淋巴细胞进行淋巴细胞增殖和流式细胞分析。

5.2 细胞增殖和流式细胞仪分析

SwIAV抗原特异淋巴细胞增殖分析用PBMCs、细胞滴度96液相非放射增殖分析试剂盒(购自美国Promega公司)按厂家提供操作指南进行。无菌U型底96孔板每孔接种1百万年细胞，同样二个孔，用以0.1MOI活SwIAV H1N2刺激或培养液为对照，37℃、5％条件下孵育72小时，加入MTS+PMS溶液反应4小时，在ELISA读板仪OD490nm处检测读数。刺激指数(Stimulation index，SI)为刺激外周单核细胞 (PBMCs)OD除以同一猪的对照细胞OD。DPC0天分离的PBMCs流式细胞分析确定不同T细胞亚群。在攻毒后6天(DPC 6)分离PBMCs用用0.1MOISwIAV H1N2 或H1N1刺激72小时，免疫染色后用流式细胞仪分析确定激活(IFNγ⁺)T细胞亚群的频率。抗猪CD3ε、抗猪CD4α、抗猪CD8α抗猪CD8β,抗猪δ-链、抗猪IFN-γ(购自美国BD biosciences公司)。

5.3 病毒滴度检测

鼻拭子、支气管肺泡灌洗液用含TPCK-胰蛋白酶(1μg/mL)DMEM 10倍系列稀释。移入铺满MDCK细胞96孔板，在37℃、5％CO₂孵箱中培养48小时，甲型流感病毒NP蛋白单抗作为第一抗体(#M058,购自美国CalBioreagents公司)，AlexaFluor 488结合羊抗鼠IgG(H+L)抗体(购自美国Life technologies公司)作为第二抗体，使用荧光显微镜(日本Olympus公司产品)记录荧光，采用Reed和Muench法计算病毒感染滴度。

5.4 抗体滴度检测

所有猪血清(H1)用20％高林土或H3血清用受体损坏酶(Receptor destroyingenzyme RDE)处理。50％鸡红细胞去除非特异抑制处理。所有血清都用PBS 5倍稀释，按OIE手册指定方法测定四个代表性猪流感血凝抑制。

8HA单位/50μl、1％鸡RBCs用于滴定。HI抗体阳转且HI滴度为基础滴度4 倍时、HI滴度1：40为保护性抗体。

5.5 血清中和抗体检测

所有血清56℃灭活30min，血清：MEM＝1：5稀释后，在96孔板上用含3μg/ml TCPK胰蛋白酶(购自美国Sigma-Aldrich公司)MEM 2倍系列稀释，猪流感病毒

100TCID50加入孔中反应，移入MDCK细胞板37℃、5％CO2中孵育1h，完全中和50％的血清最高稀释度为中和抗体滴度。细胞用4％福尔马林溶液固定，使用甲流病毒核蛋白单抗、辣根过氧化物酶结合兔抗鼠IgG、AEC (chromogenaminoethylcarbazole)底物(购自美国热电公司)检测病毒抗原。中和抗体滴度大于或等于1:40为保护性反应。

各组未稀释的鼻拭子和1:200稀释BAL液体、血清、肺中的IgG和IgA反应比较，各组猪BAL液体中和抗体检测并比较。

5.6 病理和免疫组化检测

攻击感染后5天，所有猪麻醉尸检，肺宏观损伤特征多病灶mottled-tan和固化，记录为百分比。收集肺顶部、靠近心部、隔膜部肺叶组织用10％福尔马林中固定，包埋于固体石蜡中切成4μm厚的切片用于病理分析和苏木精、伊红染色。损伤严重程度以损伤分布和外周单核细胞(PMN)浸润分0-3级。在肺部SwIAV特异性抗原和气道表皮细胞上病毒性抗原用免疫组化方法检测：SwIAV核蛋白特异抗体染色后，按制造商提供的指南用VECTASTAINelite ABC试剂(#PK-7100,购自美国 Vector Labs)处理显示信号。

5.7 统计学

每组数据以平均数表示，HI和VN滴度以几何平均滴度±95％CI表示。病毒滴度做对数处理和分析，在GraphPad Prism 5软件上(购自美国GraphPad Software公司) 进行非参数Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s post hoc检验比较，P<0.05为统计上显著。

结果：

1.PRRSV-KPWV-SwIVA-RV物理特征

扫描电镜观察大多数PRRSVKPWV-SwIVA-RV形态为圆形，颗粒大小在200-300 nm，光栅确证PRRSV-KPWVSwIVA-RV重构病毒体颗粒直径为235±50nm。灭活纯化PRRS全病毒与SwIAV H1N2形成病毒体效率60％。

2.二次滴鼻免疫诱导的细胞和体液免疫反应

从免疫猪后的30天(DPV90/DPC4)天分离PBMCs，用疫苗株病毒(SwIAV H1N2) 刺激，对淋巴细胞增殖评估:PRRSVKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物疫苗滴鼻免疫猪的平均刺激指数为2.3±0.8，单独PRRSVKPWV-SwIVA-RV抗原滴鼻免疫猪的平均刺激指数为1.51±0.5，生理盐水模拟滴鼻免疫猪平均刺激指数为0.75±0.9。

疫苗3次免疫猪的刺激指数显著高于生理盐水模拟滴鼻免疫猪平均刺激指数(p＜0.001。疫苗3次免疫猪的刺激指数显著高于单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪的刺激指数(p＜0.01。疫苗二次滴鼻免疫猪Th/Tm(CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺) 的频率为9.2±0.6％，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪Th/Tm (CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)平均频率6.5±1.8％，生理盐水模拟滴鼻免疫猪Th/Tm (CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)平均频率5.3±1.0％。疫苗二次滴鼻免疫猪Th/Tm (CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)的频率显著高于生理盐水模拟滴鼻免疫猪Th/Tm (CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)频率(p＜0.01。说明稳定佐剂复合物的诱导细胞免疫的作用。单独PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪Th/Tm(CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)频率与模拟免疫猪Th/Tm(CD3⁺CD4⁺CD8αα⁺)无显著差异(p＜0.05。

疫苗二次滴鼻免疫猪淋巴细胞毒细胞(CTLs)(CD3⁺CD4^-CD8aβ⁺)的频率平均为11.8±3.6％，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪淋巴细胞毒细胞(CTLs) (CD3⁺CD4^-CD8aβ⁺)的频率平均为8.1±2.6％，生理盐水模拟滴鼻免疫猪淋巴细胞毒细胞(CTLs)(CD3⁺CD4^-CD aβ⁺)的频率平均为7.5±2.1％。疫苗二次滴鼻免疫猪淋巴细胞毒细胞(CTLs)(CD3⁺CD4^-CD8aβ⁺)的频率显著高于生理盐水模拟滴鼻免疫猪淋巴细胞毒细胞(CTLs)(CD3⁺CD4^-CDaβ⁺)的频率(p＜0.01。说明疫苗和稳定佐剂诱导CTL 的作用。

疫苗二次滴鼻免疫后30天攻毒DPC 0，疫苗免疫猪血浆HI滴度平均29.5±14，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆HI的滴度平均11.9±4.7，而生理盐水模拟滴鼻免疫猪血浆HI滴度平均2.5±0.1，疫苗免疫猪、单独 PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪HI抗体水平均显著高于模拟免疫的猪(p ＜0.001，p＜0.01疫苗免疫猪、单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪HI抗体水平显著差异。说明稳定佐剂复合物具有增强特异性抗体生成的作用。也说明疫苗抗原和稳定佐剂复合物具有诱导特异性体液反应的能力。

疫苗二次滴鼻免疫后30天攻毒DPC 4，采用疫苗株病毒攻毒(H1N2)，疫苗免疫猪血浆IgG OD450nm平均1.7±1.3，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆IgG OD450nm平均0.8±1.6，而生理盐水模拟滴鼻免疫猪血浆IgG OD450nm平均0.3±0.7。疫苗免疫猪、单独PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆IgG水平均显著高于模拟免疫的猪(p＜0.001。疫苗免疫猪、单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV 抗原滴鼻免疫猪血浆IgG水平显著差异(p＜0.01。说明稳定佐剂复合物具有增强特异性抗体生成作用。也说明疫苗抗原和稳定佐剂复合物具有诱导特异性体液反应的能力。

疫苗二次滴鼻免疫后30天，采用异源猪流感病毒攻毒，疫苗免疫猪血浆IgGOD450nm平均0.9±0.5，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆IgG OD450nm平均0.6±0.4，而生理盐水模拟滴鼻免疫猪血浆IgG OD450nm平均0.2±0.5。疫苗免疫猪、单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆IgG水平显著高于模拟免疫的猪。疫苗免疫猪、单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆 IgG水平显著差异。说明稳定佐剂复合物具有增强特异性抗体生成作用。也说明疫苗抗原和稳定佐剂诱导对异源猪流感病毒特异性体液反应的能力。

3.临床病例变化

猪的体温为104℉认为发烧。模拟免疫攻毒猪和猪繁殖与呼吸综合征灭活纯化完整病毒抗原-猪甲流病毒重构病毒体(PRRSKPWV-SwIVA-RV)滴鼻免疫猪的发烧病程为1-4天，疫苗滴鼻免疫猪发热病程1天。

模拟滴鼻免疫和攻毒猪：攻毒后第一天体温平均为105.2±0.4℉，攻毒后第二天体温平均为104.2±0.4℉，攻毒后第二天体温平均为104.8±0.4℉，攻毒后第四天体温平均为104.2±0.4℉，攻毒后第五天体温平均为103.6±0.4℉，攻毒后第六天体温平均为102.8±0.2℉。

PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪：攻毒后第一天体温平均为104.6±0.2℉，攻毒后第二天体温平均为103.8±0.2℉，攻毒后第二天体温平均为104.2±0.6℉，攻毒后第四天体温平均为104.4±0.8℉，攻毒后第五天体温平均为103.4±0.4℉，攻毒后第六天体温平均为102.6±0.4℉。

疫苗滴鼻免疫攻毒猪：攻毒后第一天体温平均为104.2±0.2℉，攻毒第二天后体温平均为103.6±0.2℉，攻毒第二天后体温平均为102.8±0.1℉，攻毒第四天后体温平均为102.4±0.1℉，攻毒第五天后体温平均为102.5±0.1℉，第六天后体温平均为 102±0.1℉。

模拟滴鼻免疫和未攻毒猪：攻毒后第0天体温平均为102.2±0.2℉，攻毒后第一天体温平均为102.8±0.1℉，攻毒后第二天体温平均为104.8±0.4℉，攻毒第四天后体温平均为104.2±0.4℉，攻毒第五天后体温平均为103.6±0.4℉，第六天后体温平均为 102.8±0.2℉。

PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪体温与疫苗滴鼻免疫攻毒猪体温无显著差异(p＜0.05。尽管宏观肺损伤分值也无显著差异(p＜0.05，但也涉及肺部小局部损伤。攻毒后6天模拟滴鼻免疫和攻毒猪肺固化平均为22.6±15.2％， PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪肺固化平均为23.1±7.5％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪肺固化平均为17.3±16.5％。说明疫苗减小猪流感病毒引起的肺部损伤。

攻毒后6天模拟滴鼻免疫和攻毒猪肺炎症(H&E)分值平均为1.3±1.6， PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪肺炎症(H&E)分值平均为1.4±0.2，疫苗滴鼻免疫攻毒猪肺炎症(H&E)分值平均为1.6±0.2，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪肺炎症(H&E)分值平均为0.2±0.1。

SwIAV抗原免疫组化分值：攻毒后6天，模拟滴鼻免疫和攻毒猪流感病毒抗原反应性平均为1.9±1.7，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪流感病毒抗原反应性平均为1.5±0.6，疫苗滴鼻免疫攻毒猪流感病毒抗原反应性平均为0.1±0.5，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪流感病毒抗原反应性平均为0.1±0.6。疫苗滴鼻免疫攻毒猪流感病毒抗原反应性和模拟滴鼻免疫和攻毒猪流感病毒抗原反应性比较显著减小(p＜ 0.01，说明疫苗引起肺部的抗甲流保护性免疫，肺部病毒显著减少，疫苗减小肺部感染。

感染攻击后4天，鼻拭子的猪甲型流感病毒滴度：模拟滴鼻免疫和攻毒猪鼻拭子猪甲型流感病毒滴度TCID50/mL(log10)平均为5.9±0.1，PRRSKPWV-SwIVA-RV 免疫攻毒猪鼻拭子猪甲型流感病毒滴度TCID50/mL(log10)平均为6.1±0.1，疫苗滴鼻免疫攻毒猪鼻拭子猪甲型流感病毒滴度TCID50/mL(log10)平均为4.3±0.1。与肺免疫组化分值一致，在攻毒后的第4天，疫苗免疫猪鼻中病毒比单独 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒、模拟滴鼻免疫和攻毒猪鼻的病毒低6-8倍。

攻毒后6天，模拟滴鼻免疫和攻毒猪鼻支气管肺泡灌系液(BAL)中猪甲型流感病毒滴度TCID50/mL(log10)平均为5.7±1.1，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪鼻支气管肺泡灌系液(BAL)中猪甲型流感病毒滴度TCID50/mL(log10)平均为 3.1±0.8，疫苗滴鼻免疫攻毒猪鼻支气管肺泡灌系液(BAL)中猪甲型流感病毒滴度 TCID50/mL(log10)平均为3.3±2。与模拟滴鼻免疫和攻毒猪鼻支气管肺泡灌系液 (BAL)中病毒滴度比较，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪鼻支气管肺泡中病毒和疫苗滴鼻免疫攻毒猪鼻支气管肺泡灌系液(BAL)中猪甲型流感病毒分别下降 40-37倍，揭示在免疫猪的通气表皮细胞中病毒复制或散落很少。说明疫苗粘膜免疫的作用。

4.猪流感病毒攻击后血液中激活回忆性IFNγ分泌淋巴细胞反应

为评估猪流感病毒攻击后血液中激活回忆性IFNγ分泌淋巴细胞反应，分离的PBMCs分别用疫苗株病毒H1N2、攻击毒H1N1SwIAV病毒颗粒刺激评估激活IFNγ淋巴细胞亚群。

H1N2刺激，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为6.2±1.8％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为5.0±0.7％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为8.1±5.1％，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪 CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为3.6±1.3％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.05、疫苗滴鼻免疫攻毒猪 CD3⁺IFNγ⁺细胞占比高于PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比 (p＜0.05、疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比高于生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.05，但无显著差异。

H1N1刺激，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为6.3±5.1％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为4.9±4.1％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为9.6±5.3％，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比平均为3.9±1.3％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比高于 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.05，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜ 0.0，但均无显著差异。

无论H1N1、H1N2刺激，发明疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物) 免疫猪比PRRSKPWV-SwIVA-RV单独免疫猪激活CD3⁺IFNγ⁺细胞的频率显著提高。

H1N2刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为0.7±0.1％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为0.41±0.20％， PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为0.81±1.9％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为0.3±0.1％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比显著低于PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比(p＜ 0.001、生理盐水模拟免疫和攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比显著低于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占(p＜0.01H1N1刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为0.8±0.2％。模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为 0.5±0.30％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比平均为 1.8±1.4％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比显著低于PRRSKPWV-SwIVA- RV免疫攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占比(p＜0.001、生理盐水模拟免疫和未攻毒猪 CD3^-IFNγ⁺细胞占比显著低于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-IFNγ⁺细胞占(p＜0.01)。无论H1N1、H1N2刺激，PRRSKPWV-SwIVA-RV单独免疫猪内在CD3^-IFNγ⁺非T显著高于发明疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物)免疫猪内在的 CD3^-IFNγ⁺非T细胞。

H1N2刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.2±0.2％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 0.5±0.3％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.8±0.4％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 1.3±0.6％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比显著高于 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.01，也显著高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.01，也显著高于生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.01

无论H1N1、H1N2刺激，发明疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物) 免疫猪和PRRSKPWV-SwIVA-RV单独免疫猪与模拟对照猪比较都能使激活CTL (CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺IFNγ⁺)细胞频率显著升高。

H1N2刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为1.0±0.1％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为1.8±2.2％， PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为1.1±0.2％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为2.4±1.3％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪 CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比显著高于PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺ IFNγ⁺细胞占比(p＜0.01，也显著高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.001，也显著高于生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比(p ＜0.001，

H1N1刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 1.0±0.1％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为1.8±2.2％， PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为1.1±0.2％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比平均为2.4±1.3％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪 CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比显著高于PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3⁺CD4⁺ IFNγ⁺细胞占比(p＜0.01，也显著高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.001，也显著高于生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞占比(p ＜0.001，

无论H1N1、H1N2刺激，发明疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物) 免疫猪比PRRSKPWV-SwIVA-RV单独免疫猪激活CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺细胞频率显著提高。

H1N2刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.2±0.2％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 0.1±0.1％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.4±0.7％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.08±0.01％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比显著低于PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.001。 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比高于模拟滴鼻免疫和攻毒猪疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.05，也高于生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.05，

H1N1刺激，生理盐水模拟免疫和未攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.3±0.3％，模拟滴鼻免疫和攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 0.3±0.4％，PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为0.7±0.6％，疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比平均为 0.07±0.01％。疫苗滴鼻免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比显著低于 PRRSKPWV-SwIVA-RV免疫攻毒猪CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺细胞占比(p＜0.001。

无论H1N1、H1N2刺激，PRRSKPWV-SwIVA-RV单独免疫猪内在 CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺NK细胞频率显著高于发明疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+ 稳定佐剂复合物)免疫猪内在的CD3^-CD4^-CD8α⁺IFNγ⁺NK细胞频率。

5.免疫猪攻毒后的体液免疫反应

猪二次滴鼻免疫后30天攻毒，对猪特异性的系统、局部免疫反应进行检测和分析。

猪鼻拭子特异性IgA抗体：二次疫苗滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm为0.96±0.30，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm为0.47±0.20，生理盐水模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm为0.04±0.20，不免只攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm为 0.18±0.22。二次疫苗滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平显著高于生理盐水模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体(P＜0.001，也显著高于单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV 抗原滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平(P＜0.01，也显著高于不免只攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体水平((P＜0.001，说明发明疫苗诱导了局部粘膜免疫反应，稳定佐剂复合物能够促进局部粘膜特异性抗体生成。

肺裂解液中IgA：二次疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为 1.52±0.63，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.16±0.20，生理盐水模拟免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为 0.05±0.23，不免只攻毒猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.25±0.57。二次疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中水平显著高于生理盐水模拟免疫猪肺裂解液中IgA水平(P＜0.001, 也显著高于单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪肺裂解液中P＜0.001，也显著高于不免只攻毒猪肺裂解液中IgA水平(P＜0.001，说明发明疫苗诱导猪肺组织产生高水平IgA，稳定佐剂复合物能够增强粘膜局部IgA生成。

猪血浆IgG抗体反应：二次疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体平均OD450nm为0.76±0.4，单独PRRSV-KPWVSWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体平均 OD450nm为0.73±0.5，生理盐水模拟免疫猪血浆特异性IgG抗体平均OD450nm为 0.25.±0.7，不免只攻毒猪血浆特异性IgG抗体平均OD450nm为0.22±1.1。二次疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体水平显著高于生理盐水模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA 抗体(P＜0.01,也显著高于单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体水平(P＜0.01，说明发明疫苗诱导了系统体液免疫反应，稳定佐剂复合物具有系统特异性抗体增强作用。

猪血浆血凝抑制滴度：二次疫苗滴鼻免疫猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2 (81±75，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆血凝抑制滴度平均为 Log 2(63±10)，生理盐水模拟免疫猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(4.8±3.5)，不免只攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(43.7±31.9)。二次疫苗滴鼻免疫猪血浆血凝抑制滴度显著高于生理盐水模拟免疫猪血浆血凝抑制滴度(P＜0.01,也显著高于单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪血浆血凝抑制滴度水平(P＜ 0.01，也显著高于不免只攻毒猪血浆血凝抑制滴度水平(P＜0.01，说明发明疫苗诱导了高水平猪血浆血凝抑制抗体，稳定佐剂复合物能够增强猪血浆血凝抑制抗体生成。

BAL液IgA：二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为2.1±0.38，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为0.41±0.20，生理盐水模拟免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为0.21±0.20，不免只攻毒猪BAL液 IgA OD450nm平均为0.81±0.30。二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA水平显著高于生理盐水模拟免疫猪BAL液IgA水平(P＜0.001,也显著高于单独 PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液IgA水平(P＜0.01，也显著高于不免只攻毒猪BAL液IgA水平(P＜0.01，说明发明疫苗诱导猪高水平粘膜局部IgA水平，稳定佐剂复合物能够增强粘膜局部IgA生成。

BAL液IgG：二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgG OD450nm平均为0.93±0.84，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液IgG OD450nm平均为0.15±0.25，生理盐水模拟免疫猪BAL液IgG OD450nm平均为0.18±0.12，不免只攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.49±0.95。二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgG水平显著高于生理盐水模拟免疫猪BAL液IgG水平(P＜0.001,也显著高于单独 PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液IgA水平(P＜0.001，也显著高于不免只攻毒猪BAL液IgG水平(P＜0.01，说明发明疫苗诱导猪高水平粘膜局部IgG 水平，稳定佐剂复合物能够增强粘膜局部IgG生成。

BAL液中和抗体：二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液中和抗体平均为Log 2(64.5±25)，单独PRRSVKPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液中和抗体平均为Log 2 (27.3±21.6)，生理盐水模拟免疫猪BAL液中和抗体平均为Log 2(0.12±0.1)，不免只攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(34.5±35.6)。二次疫苗滴鼻免疫猪BAL 液IgG水平显著高于生理盐水模拟免疫猪BAL液IgG水平(P＜0.001,也显著高于单独 PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液IgA水平(P＜0.001，也显著高于不免只攻毒猪BAL液IgG水平(P＜0.01，说明发明疫苗诱导猪肺组织高水平中和抗体，稳定佐剂复合物能够增强肺组织中和抗体生成。

BAL液中血凝抑制滴度：二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液中血凝抑制滴度平均为 Log 2(79.5±56.5)，单独PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻免疫猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(42.1±48.6)，生理盐水模拟免疫猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(4.7±0.5)，不免只攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(23.2±21.3)。二次疫苗滴鼻免疫猪BAL液中血凝抑制滴度显著高于生理盐水模拟免疫猪BAL液中血凝抑制滴度(P＜0.001，也显著高于单独PRRSV-KPWV-SWIVA-RV抗原滴鼻 BAL液中血凝抑制滴度(P＜0.01，也显著高于不免只攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度 (P＜0.001，说明发明疫苗诱导猪产生高水平猪抑制抗体，稳定佐剂复合物能够增强猪肺组织产生凝抑制抗体生成。

实施例6.本发明的疫苗(PRRSKPWV-SwIVA-RV+稳定佐剂复合物)对猪流感病毒免疫期.

6.1 试验设计与样本收集

健康、确证无SwIAV H1N1和H1N2血凝抑制抗体仔猪(n＝60)，所选仔猪免疫程序如实施例5，在一个月内完成二次滴鼻免疫，攻击时间不同分成4试验组(n＝ 10头/组)和4对照组(n＝10头/组)，分组如表5，按中国农业科学院兰州兽医研究所制定的试验动物福利办法饲养和试验操作。样本收集、病毒滴度检测、抗体滴度检测、中和抗体检测以及统计分析按实施例6。

表5 分组情况

6.2 滴鼻免疫后不同时间攻毒体液免疫反应

6.2.1 滴鼻免疫后60天攻毒，对猪特异性的系统、局部免疫反应进行检测和分析。

猪鼻拭子特异性IgA抗体：疫苗滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm 达1.4±0.2，PBS滴鼻免疫只攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体平均OD450nm为0.29±0.3。疫苗滴鼻免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平显著高于PBS模拟免疫猪鼻拭子特异性 IgA抗体(P＜0.001。说明发明疫苗免疫60天后，H2N1感染诱发了高水平的鼻粘膜 IgA抗体，抗体水平与二次疫苗免疫30天后感染攻击的抗体水平无显著差异。

肺裂解液中IgA：疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为1.50±0.60，PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.29±0.65。疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA水平(P＜0.001。

BAL液IgA：疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为2.0±0.28，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA OD450nm平均为0.30±0.18。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA水平(P＜0.001)。

猪血浆IgG抗体反应：疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为0.49±1.0，PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为0.26±0.48。疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG 抗体水平((P＜0.01)。说明发明疫苗在免疫后60天，H1N2攻毒诱导了系统体液免疫反应。

BAL液IgG：疫苗滴鼻免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.80±0.68，PBS 模拟免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.10±0.3。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgG 水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG水平(P＜0.001)，说明发明疫苗在免疫60天后猪粘膜局部IgG水平可抗HN2感染。

BAL液中血凝抑制滴度：疫苗滴鼻免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为 Log 2(58.9±40.2)，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2 (20.1±14.6)。疫苗滴鼻免疫猪攻毒后BAL液中血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度(P＜0.001)，说明发明疫苗免疫后60天，在猪肺部仍有足够抗体，HIN2感染激发高水平血凝抑制抗体。

猪血浆血凝抑制滴度：疫苗滴鼻免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(79.2±50.1)，PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(50.4±1.8)。疫苗滴鼻免疫猪血浆血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度 (P＜0.001),说明发明疫苗免疫诱导了高水平猪血浆血凝抑制抗体，可维持到60天，受H1N2感染后激发高水平血浆血凝抑制抗体生成。

BAL液中和抗体：疫苗免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(76.9±19.3)， PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(21.2±19.3)。疫苗免疫猪BAL液中和抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体水平(P＜0.001)。说明发明疫苗免后60天仍有较高水平中和抗体，H1N2感染攻击仍诱导猪肺组织产生高水平中和抗体。

6.2.2 滴鼻免疫后90天，H1N1攻毒，对猪特异性系统、局部免疫反应进行检测和分析。

猪鼻拭子特异性IgA抗体：疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均 0.95±0.32，PBS滴鼻免疫攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均为0.16±0.19。疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平显著高于PBS模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体(P＜0.001)。说明发明疫苗免疫90天后猪体仍有保护性IgA抗体，H1N1感染诱发了高水平的鼻粘膜IgA抗体，抗体水平与疫苗免疫60天后感染攻击的抗体水平无显著差异。

肺裂解液中IgA：疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.84±0.41，PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.34±0.51。疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA水平(P＜0.01)。

BAL液IgA：疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为1.2±0.11，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA OD450nm平均为0.14±0.15。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA水平(P＜0.001)。

猪血浆IgG抗体反应：疫苗免疫猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为2.3±0.86，PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为0.17±0.23。疫苗免疫猪血浆特异性IgG抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体水平(P＜ 0.01)。说明发明疫苗在免疫后90天，仍有抗H1N1感染的系统体液保护性免疫反应。

BAL液IgG：疫苗免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.69±0.42，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.23±0.4。疫苗免疫猪BAL液IgG水平显著高于 PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG水平(P＜0.01，说明发明疫苗在免疫90天后保持粘膜局部IgG水平抗H1N1感染。

BAL液中血凝抑制滴度：疫苗免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(41.5±20.5)，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(15.3±8.4)。疫苗免疫猪攻毒后BAL液中血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度(P＜0.01)，说明发明疫苗免疫后90天，在猪肺部仍有足够抗体，高水平血凝抑制抗体抗HIN1感染。

猪血浆血凝抑制滴度：疫苗免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2 (46.6±20.3)，PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(10.3±1.5)。疫苗免疫猪血浆血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度(P ＜0.001)，说明发明疫苗免疫，保护性血凝抑制抗体，在猪血中可维持到90天，抗 H1N1感染。

BAL液中和抗体：疫苗免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(33.5±5.5)， PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(9.0±6.5)。疫苗免疫猪BAL液中和抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体水平(P＜0.01)。说明发明疫苗免后90天在肺组织维持较高水平中和抗体抗H1N1感染。

6.2.3 滴鼻免疫后120天，H1N2攻毒，对猪特异性系统、局部免疫反应进行检测和分析。

猪鼻拭子特异性IgA抗体：疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均达0.8±0.2，PBS免疫只攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均为0.26±0.2。疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平显著高于PBS模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体(P ＜0.01)。说明发明疫苗免疫120天后，鼻粘膜维持高水平IgA抗体有效保护H1N2 感染。

肺裂解液中IgA：疫苗免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.65±0.34，PBS 模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.24±0.35。疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA水平(P＜0.01。

BAL液IgA：疫苗免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为0.81±0.22，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA OD450nm平均为0.35±0.21。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪IgA水平(P＜0.01)。

猪血浆IgG抗体反应：疫苗免疫猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为 0.85±0.61，PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为0.29±0.48。疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性 IgG抗体水平(P＜0.01)。说明发明疫苗免疫猪120天后猪血浆仍有保护性抗IgG抗体，抗H1N2感染。

BAL液IgG：疫苗免疫猪BAL液IgG OD450nm平均为0.47±0.31，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.13±0.21。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgG水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG水平(P＜0.01)，说明发明疫苗在免疫120天后猪粘膜局部IgG水平可抗HN2感染。

BAL液中血凝抑制滴度：疫苗免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(33.6±13.5)，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(21.1±11.7)。疫苗免疫猪攻毒后BAL液中血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度(P＜0.01)，说明发明疫苗免疫后120天，在猪肺部仍有足够血凝抑制抗体，抗HIN2感染。

猪血浆血凝抑制滴度：疫苗免疫猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(46.8±32.1)，PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(33.7±2.7)。疫苗免疫猪血浆血凝抑制滴度显著高于PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度(P＜0.01)，说明发明疫苗免疫诱导了高水平猪血浆血凝抑制抗体并维持到120天，抗H1N2在肺部感染。

BAL液中和抗体：疫苗免疫猪BAL液中和抗体平均为Log 2(34.5±9.7)，PBS 模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(20.9±12.6)。疫苗免疫猪BAL液中和抗体水平显著高于PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体水平(P＜0.01)。说明发明疫苗免后120天猪肺部仍有较高水平中和抗体抗H1N2感染攻击。

6.2.4 滴鼻免疫后150天，H1N2攻毒，对猪特异性系统、局部免疫反应进行检测和分析。

猪鼻拭子特异性IgA抗体：疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均达 0.31±0.3，PBS模拟免疫攻毒猪鼻拭子特异性IgA抗体OD450nm平均为0.24±0.21。疫苗免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平与PBS模拟免疫猪鼻拭子特异性IgA抗体水平无显著差异(P＜0.05)。说明疫苗免疫150天后，猪鼻粘膜IgA抗体水平不能有效保护H1N2感染攻击产生的肺部损伤、病理和临床呼吸疾病症状。

肺裂解液中IgA：疫苗免疫猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.31±0.34，PBS 模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA OD450nm平均为0.27±0.25。疫苗滴鼻免疫猪肺裂解液中IgA水平和PBS模拟免疫攻毒猪肺裂解液中IgA水平无显著差异(P＜0.05)。说明疫苗免疫150天后，猪肺细胞产生IgA抗体水平不能有效保护H1N2感染攻击产生的肺部损伤、病理和临床呼吸疾病症状。

BAL液IgA：疫苗免疫猪BAL液IgA OD450nm平均为0.36±0.15，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgA OD450nm平均为0.37±0.11。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgA水平和PBS 模拟免疫攻毒猪IgA水平无显著区别(P＜0.05)。

猪血浆IgG抗体反应：疫苗免疫猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为 0.32±0.34，PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体OD450nm平均为0.31±0.21。疫苗滴鼻免疫猪血浆特异性IgG抗体水平与PBS模拟免疫攻毒猪血浆特异性IgG抗体水平无差别((P＜0.05)。说明疫苗免疫猪120天后，猪血浆保护性抗IgG抗体已经下降无法抵抗H1N2感染。

BAL液IgG：疫苗免疫猪BAL液IgG OD450nm平均为0.20±0.19，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液IgG OD450nm平均为0.18±0.13。疫苗滴鼻免疫猪BAL液IgG水平与PBS 模拟免疫攻毒猪BAL液IgG水平无差异(P＜0.05)，说明发明疫苗免疫猪150天后，猪粘膜局部IgG水平已经不能抗HN2感染。

BAL液中血凝抑制滴度：疫苗免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(22.3±9.4)，PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度平均为Log 2(24.1±7.6)。疫苗免疫猪攻毒后BAL液中血凝抑制滴度与PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中血凝抑制滴度无显著差异(P＜0.05)，说明发明疫苗免疫诱导肺分支气管肺泡中血凝抑制抗体经150天已经消失，在猪肺部已经无足够血凝抑制抗体，抵抗抗HIN2感染。

猪血浆血凝抑制滴度：疫苗免疫猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(29.5±11.0)，PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度平均为Log 2(26.7±10.1)。疫苗免疫猪血浆血凝抑制滴度与PBS模拟免疫攻毒猪血浆血凝抑制滴度无显著差异(P＜0.0)。说明发明疫苗免疫诱导了猪高水平血浆血凝抑制抗体并维持到120天，150天已经消失，在猪肺部已经无足够血凝抑制抗体，抵抗抗HIN2感染。

BAL液中和抗体：疫苗免疫猪BAL液中和抗体平均为Log 2(22.3±4.3)，PBS 模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体平均为Log 2(23.2±5.1)。疫苗免疫猪BAL液中和抗体水平和PBS模拟免疫攻毒猪BAL液中和抗体水平无显著差异(P＜0.05)说明发明疫苗免后150天猪肺部已经无高水平中和抗体抗H1N2感染攻击。

综上，该疫苗二次滴鼻免疫，免疫期为120天。

Claims (10)

1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗，其特征在于，含有猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体抗原和稳定佐剂复合物，所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体是由猪繁殖与呼吸综合症病毒通过直接吸附或是共价结合在猪流感病毒H1N2重构病毒体表面形成，其中，所述的猪流感病毒H1N2重构病毒体是含有磷脂双分子层的小囊泡，在磷脂双分子层的表面结合有猪流感病毒H1N2血凝素( haemagglutinin，HA) 和神经氨酸酶( neuraminidase，NA)蛋白；

其中，所述的稳定佐剂复合物为含有2.0～10g/L精氨酸和谷氨酸的等重量比例混合物、20～25g/L多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物（Poly ICLC）、0.1-0.5mg/L卡介菌裂解物、30～100g/L麦芽糖、30～100g/L山梨糖醇、1.0～5.0g/L尿素、0.01～0.4g/L EDTA 或 EDTA盐、0.001～0.1g/L吐温-20的10～100 mM的磷酸缓冲溶液，pH值7.0～9.0。

2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的稳定佐剂复合物的pH 值为7.2-8.0。

3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的卡介菌裂解物按照以下方法制备：卡介菌用改良苏通综合培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，用制备型低速离心机收获菌体，PBS洗涤2次，悬浮于含EDTA、蛋白酶抑制剂、DNA酶、RNA酶的PBS中，用玻璃珠破碎细菌，直到90%的菌体破碎，离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液；上清液经0.2 μM、低蛋白结合的膜过滤，获得全菌体裂解物，其中内毒素水平应不高于0.002μg/mg蛋白。

4.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的疫苗中，猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体抗原含量为4-8μg/ml。

5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备；

（2）纯化灭活的猪流感病毒H1N2全病毒抗原的制备；

（3）猪流感病毒H1N2重构病毒体的制备

a 磷脂分散液的制备

用含有pH 7.3，0.1M NaCl的0.01M Tris/HCl在匀质器上制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的75%磷脂酰胆碱、20% 的磷脂酰乙醇胺以及5%的胆固醇，其中所有磷脂占分散液的1-2% (w/v)，将胆酸钠加入分散液中，使其终浓度为1.3% (w/v)；

b 猪流感病毒H1N2外膜蛋白的制备

向纯化的猪流感病毒H1N2病毒液中加入含 0.1M 八甘醇单正十二烷基醚、7.9 mg/mlNaCl，4.4 mg/ml 柠檬酸钠、2.1 mg/ml MES、1.2 mg/ml N-羟乙基- 哌嗪-N'-2-乙磺酸的pH 7.3的水溶液，混合物在超速离心机离心，收取上清液，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA) 和神经氨酸酶( NA)；

c 猪流感病毒H1N2重构病毒体的制备

将步骤b获得的上清液加入步骤a获得的磷脂分散液中，在4℃搅拌，上样Sephadex G-50 层析柱，柱子放置在水浴中与超声仪相连，每分钟超声震荡 10秒产生猪流感病毒H1N2重构病毒体，猪流感病毒H1N2重构病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出，收集外水体积部分，将含猪流感病毒H1N2重构体的外水合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒H1N2重构体；

（4）猪繁殖与呼吸综合症病毒与猪流感病毒H1N2重构病毒体的偶联

将步骤（1）获得的灭活纯化的PRRSV全病毒抗原和步骤（3）获得的猪流感病毒H1N2重构体混合、轻轻摇动重悬，在20℃轻轻搅拌48小时使PRRSV通过范德华力吸附于猪流感病毒H1N2重构病毒体的表面，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体；或者

利用PRRSV表面已经存在二硫键与猪流感病毒H1N2重构病毒体进行共价结合。

6.一种制备如权利要求1-4任一项所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备

（2）PRRSV的硫醇化

灭活纯化的PRRSV溶于0.1M磷酸缓冲液中；N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯（SPDP）和乙醇混合，取混合液用注射器缓慢加入含有PRRSV的磷酸缓冲液，使SPDP 与PRRSV的摩尔比15:1，同时保持乙醇浓度在5v/v%以下防止蛋白变性，混合物在20℃反应30分钟，反应结束后，分别用pH7.0的0.05M柠檬酸钠、pH7.0的0.05M磷酸钠、pH7.0的0.05M氯化钠平衡Sephadex G-50的柱子进行三次纯化；得到硫醇化的PRRSV全病毒抗原PRRSV—SPDP；

（3）纯化灭活的猪流感病毒H1N2全病毒抗原的制备

（4）猪流感病毒H1N2重构病毒体的制备

a 磷脂分散液的制备

将磷脂酰胆碱（PE）与N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯（SPDP）进行交联：15 mg 磷脂酰胆碱放入5 ml 玻璃瓶干燥，干燥后重新溶于氯仿中，然后加入含三乙胺(TEA)、SPDP的无水乙醇，混合物在通氮气条件下室温搅拌1-2小时直到反应完成，即没有单一磷脂酰胆碱，反应产物在旋转蒸发仪上干燥，产物重悬于氯仿，上样硅酸层析柱进行纯化，得到PE-SPDP；

用含有pH 7.3，0.1M NaCl的0.01M Tris/HCl在匀质器上制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的75%的PE-SPDP、20% 的磷脂酰乙醇胺以及5%的胆固醇，其中所有磷脂占分散液的1-2% (w/v)，将胆酸钠加入磷脂分散液中，使其终浓度为1.3% (w/v)；

b 猪流感病毒H1N2外膜蛋白的制备

向纯化的猪流感病毒H1N2病毒液中加入含 0.1M 八甘醇单正十二烷基醚、7.9 mg/mlNaCl，4.4 mg/ml 柠檬酸钠、2.1 mg/ml MES、1.2 mg/ml N-羟乙基- 哌嗪-N'-2-乙磺酸的pH 7.3的水溶液，混合物在超速离心机离心，收取上清液，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA) 和神经氨酸酶( NA)；

c 猪流感病毒H1N2重构病毒体的制备

将步骤b获得的上清液加入步骤a获得的磷脂分散液中，在4℃搅拌，上样Sephadex G-50 层析柱，柱子放置在水浴中与超声仪相连，每分钟超声震荡 10秒产生猪流感病毒H1N2重构病毒体，重构流感病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出，收集外水体积部分，将含猪流感病毒H1N2重构体的外水合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒H1N2重构体；

（5）猪繁殖与呼吸综合症病毒与猪流感病毒H1N2重构病毒体的偶联

在0.2M柠檬酸磷酸缓冲液中将硫醇化PRRSV全病毒抗原PRRSV—SPDP的 pH用1M HCl调至5.5，加入二硫苏糖醇溶液，溶液放置30分钟，用PBS缓冲液平衡Sephadex G-50分离二硫苏糖醇，在有氮气环境中收集蛋白，得到还原后的硫醇化PRRSV全病毒抗原；将获得的猪流感病毒H1N2重构病毒体和还原后的硫醇化PRRSV全病毒抗原在室温下搅拌过夜，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒颗粒。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述的纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备包括以下步骤：

（1）病毒培养、三次冻溶、收获

猪繁殖与呼吸综合症病毒感染MARC-145细胞，收获病毒培养液，收集PRRSV病毒液经三次冻溶，裂解液离心，上清液收集于无菌容器罐；

（2）灭活

取步骤（1）获得的PRRSV病毒液加入灭活剂β-丙内酯，获得PRRSV病毒灭活液；

（3）离子交换层析

将灭活后的病毒液用离子交换层析柱进行层析；

（4）超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为300 KD 膜超滤浓缩，同时用0.02 MTris-HCl (pH 7.5)透析；

（5）分子排阻层析

浓缩PRRSV病毒液上样FF-Sepharose 6 层析柱，获得病毒纯化液；

（6）超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为300KDa的膜，使用含有150 mM NaCl，pH 7.5的50 mM磷酸缓冲液超滤透析，获得灭活纯化PRRSV全病毒液。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述的纯化灭活的猪流感病毒H1N2全病毒抗原的制备包括以下步骤：

（1）病毒培养、三次冻溶、收获

猪流感病毒H1N2感染MDCK细胞，收获病毒培养液，收集猪流感病毒H1N2病毒液经三次冻溶，裂解液离心，上清液收集于无菌容器罐；

（2）灭活

取步骤（1）获得的猪流感病毒H1N2病毒液加入灭活剂甲醛溶液，获得猪流感病毒H1N2灭活液；

（3）离子交换层析

将灭活后的病毒液用离子交换层析柱进行层析；

（4）超滤浓缩、透析

从离子交换层析柱洗脱的病毒液用截留值为700 KD膜超滤浓缩，同时用0.02 M Tris-HCl (pH 7.5)透析；

（5）分子排阻层析

浓缩猪流感病毒H1N2病毒液上样FF-Sepharose 6 层析柱，获得病毒纯化液；

（6）超滤浓缩、透析

将病毒纯化液采用截留值为700KDa的膜，使用含有150 mM NaCl，pH 7.5的50 mM磷酸缓冲液超滤透析，获得灭活纯化猪流感病毒H1N2全病毒液。

9.权利要求1-4任一项所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒H1N2重构病毒体疫苗在制备预防由猪繁殖与呼吸综合症病毒及/或猪流感病毒H1N1或H1N2所导致的疾病的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的药物通过滴鼻的方式给药。