KR20090016659A

KR20090016659A - 비로좀을 기제로 한 비강내 인플루엔자 백신

Info

Publication number: KR20090016659A
Application number: KR1020087025693A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더르 제이. 커르스턴; 리시아 헤레즈; 피터르 제이. 스훈; 요제프 제이.피. 나우타; 르헤이넥 레이시우스 도리너 에이치. 판
Original assignee: 솔베이 바이올로지컬스 비.브이.
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2009-02-17
Also published as: HRP20100144T1; ES2375436T3; WO2007107585A1; ATE451931T1; IL193840A; PT2158921E; EP2158921B1; ATE539766T1; SI2158921T1; SA07280116B1; MY142996A; JP2009530351A; AU2007228736B2; EP1996229A1; IL193840A0; EA014532B1; EP2158921A1; ES2375436T8; CA2646895A1; DK2158921T3

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물로서, 상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 조성물은 비강내 또는 흡입 투여를 위한 것이고, 상기 조성물은 사람에의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 상기 인플루엔자 항원에 대하여 전신적 면역 반응 및/또는 국부적 면역 반응 및/또는 세포독성 림프구 반응을 유도하는데 충분함을 특징으로 하고, 전신적 반응이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르고, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인, 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 조성물의 제조를 위한 재구성된 인플루엔자 비로좀의 용도 및 이에 따라 제조된 백신 제형을 또한 제공한다.

비로좀(virosome), 인플루엔자 바이러스, 재구성된 인플루엔자 바이러스 외피(envelope), 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 비강내 투여, 흡입 투여, CHMP 기준

Description

비로좀을 기제로 한 비강내 인플루엔자 백신{Intranasal influenza vaccine based on virosomes}

본 발명은, 예를 들면, 단일 비강내 또는 흡입 투여가 임상적 보호와 양의 상관관계가 있는(positively correlated) 전신적 면역 반응을 일으키는, 불활성화된 인플루엔자 백신을 위한 조성물 및 투여 경로에 관한 것이다.

비강 또는 구강인두 경로를 통해 그리고 불활성화된 인플루엔자 항원을 사용하여 인플루엔자에 대해 면역화시키기 위한 다양한 개념은 피하 또는 근육내 면역화에 대한 무바늘(needle-less) 대안으로서 연구되었다. 무바늘 접근법을 지지하는 실험 데이터가 동물 모델에서 생성되었다. 동물 데이터에 의해 지지되는 비강내 경로를 통한 면역화를 위한 불활성화된 인플루엔자 항원 (예: 화학적으로 불활성화된 전체 바이러스 입자, 또는 분할 바이러스(split virus)와 같은 추가로 프로세싱된 바이러스 성분, 또는 정제된 표면 항원 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다제 (NA))을 사용하는 개념은 불활성화된 인플루엔자 항원과 함께 애주번트(adjuvant) 또는 면역 자극제의 사용을 포함하거나, 수회의 백신접종을 필요로 한다. 애주번트는 이와 함께 혼합된 항원의 면역원성을 향상시키는 임의의 물질이다. 사람에서 비강내 경로를 통한 인플루엔자에 대한 성공적인 백신접종은 (a) 살아있는 (냉 적응된(cold adapted) 바이러스주(virus strain)) 인플루엔자 백신 (플루미스트(FluMist)™, 판매원: MedImmune Vaccines Inc) (참고문헌 1, 2, 3), (b) 이.콜라이(E. coli)의 열 불안정성 독소로 면역보강된(adjuvanted) 비로좀(virosome) 인플루엔자 백신 (NasalFlu, 판매원: Berna Biotech Ltd) (참고문헌 4) 또는 (c) 다량의 항원을 사용하고 백신접종을 반복하는 (참고문헌 5, 10, 11) 경우에만 보고되었다. 살아있는 백신은 만족스러운 면역 반응을 유도할 수 있지만, 살아있는 바이러스라는 이들의 특정한 성질은 추가적인 안전성 문제를 일으키고, 상기도 부위에서 요구되는 바이러스 복제로 인하여 부작용을 유도할 것으로 보인다. 또한 요구되는 저장 조건은 이러한 제품의 상업화를 제한하고 있다. 애주번트로서 이.콜라이 HLT를 갖는 비강내 인플루엔자 백신의 사용과 안면 마비 (벨 마비(Bell's Palsy)) 사이의 강한 관련성으로 인하여, HLT 면역보강된 비로좀 백신은 판매 중지되었다 (참고문헌 6).

일정한 집단에서 인플루엔자 백신의 효능은 백신접종 후 생성되는 항-인플루엔자 항체의 양과 관련이 있는 면역원성 매개변수를 평가하여 추정할 수 있다. 일반적으로 CHMP 기준이라고 하는 이러한 면역원성 매개변수는 불활성화된 인플루엔자 백신을 매년 재허가하는데 사용된다 (참고문헌 7). 현재까지, 백신의 예방 대상인 감염원으로부터 유래된 것이 아니고 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 목적으로 백신 제형에 첨가된 백신의 추가적인 성분인 애주번트의 첨가 없이, 불활성화된 백신의 1회 단일 비강내 투여에 의해, 이러한 면역학 요건 또는 CHMP 기준(참고문헌 7)을 충족하는 인플루엔자에 대한 사람의 성공적인 면역화는 기술되지 않았다. 그러므로, 단일 비강내 투여 후 만족스러운 전신적 면역 반응을 유도할 수 있고, 애주번트를 함유하지 않으며, 상기 단일 투여로 CHMP 기준(참고문헌 7)을 충족하는 불활성화된 인플루엔자 백신 조성물이 당업계에서 여전히 필요하다는 것이 인식된다.

상기 "CHMP 기준"은 다음과 같이 정의된다. CHMP (Committee for Medicinal Products for Human Use)의 문헌[참조: Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines]에는 불활성화된 인플루엔자 백신의 면역원성을 평가하기 위하여 다음의 혈청학적 매개변수가 정의되어 있다:

- 혈청보호율(seroprotection rate) (혈청보호는 적혈구응집 억제(HI) 역가 ≥ 40으로서 정의됨),

- 혈청전환율(seroconversion rate) (혈청전환은 백신접종전 HI 역가 < 10 및 백신접종후 HI 역가 ≥ 40 또는 백신접종전 HI 역가 ≥ 10 및 HI 역가가 4배 이상 증가함으로서 정의됨),

- 평균 배수 증가(mean fold increase) (개체내 증가의 기하평균) (즉, 백신접종후 HI 역가 / 백신접종전 HI 역가).

인플루엔자 백신 면역원성에 대한 CHMP 요건은 백신 내의 3개의 바이러스주가 각각 다음의 기준 중 하나 이상을 충족한다는 것이다:

본 발명은 소아에게도 적용되는데, 소아의 경우에 성인과 유사한 방식으로 면역학적으로 반응한다는 것이 밝혀졌다 (참고문헌 8). 본 발명은 노인에게도 적용된다. 노인은 60세 이상이다.

놀랍게도, 전임상 설치류 데이터 및 사람 임상 실험에 관한 문헌과는 정반대로, 본 발명자들은 재구성된 인플루엔자 외피(envelope)를 포함하는 불활성화된 인플루엔자 백신을 사용한 단일 비강내 백신접종 후 사람에서의 면역 반응이 18 내지 60세의 연령 그룹의 경우 인플루엔자 백신 효능에 대한 모든 3개의 CHMP 기준을 따랐다는 것을 밝혀내었다. 1회 단일 비강내 투여는, 불활성화된 인플루엔자 백신의 면역원성에 대한 앞서 언급한 CHMP 기준을 충족시키기 위하여 백신 제형의 투여를 반복할 필요가 없는 하나 또는 두 콧구멍을 통한 백신 제형의 접종이다. (비강, 흡입, 경구, 피하 또는 근육내 경로를 통한) 백신의 1회 단일 투여는 일반적으로 프라이밍(priming) 및 부스팅(boosting)으로서 당업계에 공지된 수일 또는 수주의 시간에 의해 분리된 백신의 수회 투여를 포함하지 않는 백신접종 스케줄이다. 비강내 또는 흡입 투여 제형으로서 설계된 제형은 비강내 또는 흡입 투여를 가능하게 하는 방식으로 제조된 하나 이상의 활성 성분 및 부형제의 혼합물을 포함한다.

본 발명은, 유리하게는 비로좀 인플루엔자 백신의 단일 비강내 또는 흡입 투여를 사용하여, CHMP 기준을 따르는 전신적 면역 반응 (순환하는 면역글로불린 또는 항체를 생산하는 B 세포)을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유리하게는 비로좀 인플루엔자 백신의 단일 비강내 또는 흡입 투여를 통해, 점막의 표면에서 IgA로서 공지된 분비성 면역글로불린의 증가를 포함하여, 국부적 또는 점막 면역 반응을 유도하는 방법을 또한 제공한다. 비강내 투여 후 특정한 IgG 및 IgA 반응의 유도는 비강내 림프 조직의 활동을 수반한다 (참고문헌 12). 이러한 조직은 비강-관련 림프 조직(NALT)으로서 공지되어 있고, 세포성 면역 반응을 위한 점막 유도성 부위인 것으로도 밝혀졌다 (참고문헌 13). 비로좀은 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 가능성이 있는 것으로 공지되어 있기 때문에 (참고문헌 14, 15), 본 발명은 특정한 세포독성 림프구(CTL)를 유도하는 방법을 또한 제공한다.

비로좀은 바이러스 당단백질을 함유하는 지질 이중층이다. 비로좀은 일반적으로 세제를 사용하여 외피보유(enveloped) 바이러스로부터 막 단백질 및 지질을 추출하고 나서, 상기 세제를 제거하여 특징적인 이중층을 재구성시킴에 의해 제조한다. 본 발명은 인플루엔자에 대하여 전신 및 국부 면역성을 달성하기 위하여, 하나 또는 두 콧구멍을 통해 비인두 또는 구강인두의 점막으로 투여되는 에어로졸을 통한 백신접종의 사용을 위한, 재구성된 (특히 지질을 추가로 첨가하지 않고, 면역자극제(일반적으로 애주번트라고 함)의 면역조절제를 첨가하지 않고 재구성된) 인플루엔자 바이러스 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 또한 제공한다. 흡입을 통한 단일 투여도 가능하다. 단일 구강 점막 투여도 가능하다.

재구성된 인플루엔자 비로좀은 불활성화된 바이러스로부터 제조될 수 있고, 이는 소수성 비드(bead)에의 흡착에 의해 제거되는 투석가능하지 않은 세제에 의해 가용화될 수 있다. 제제는 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 헤마글루티닌의 유도체 및 뉴라미니다제의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 항원의 정제된 현탁액을 포함할 수 있다. 바이러스 막 단백질인 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제는 낮은 수준의 내독소(endotoxin) 및 오브알부민(ovalbumin)을 함유하는 바이러스 지질로 구성된 막 안에 재구성될 수 있다 (참고문헌 9). 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제의 유도체는 변형된 아미노산 서열 및/또는 구조를 갖는 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 분자이다. 예를 들면, 아미노산이 결실되거나, 변화되거나, 서열에 부가될 수 있다. 글리코실화 패턴도 변화될 수 있다. 유도체는 숙주 속으로 도입되는 경우 면역 반응을 유도하는 능력을 유지한다.

재구성된 비로좀을 제조하는데 사용되는 인플루엔자 바이러스는, 예를 들면, 발육란(embryonated hens' egg) 상에서 성장시키거나, 부착성 세포 또는 현탁액 중의 세포 상에서 세포 배양에서 성장시킬 수 있다. 바이러스는, 예를 들면, 야생형 또는 재편성체(reassortant) 또는 유전자 변형된 바이러스주일 수 있다. 바이러스 타입은, 예를 들면, 유행성(pandemic) 바이러스주를 포함하는 임의의 인플루엔자 A 또는 B 서브타입(subtype)일 수 있다.

본 발명은 백신을 또한 제공한다. 백신이라는 용어는 면역활성 약제학적 제제를 지시하는 것으로서 이해된다. 특정 양태에서, 백신은, 예를 들면, 실제 병원체에 대한 방어를 개시하도록 면역계를 자극시키는, 병원성 미생물의 무해한 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 백신은, 예를 들면, 숙주에게 투여되면 적응성 면역을 유도한다. 백신은 병원체의 죽은 형태 또는 약독화된 형태, 또는 병원체의 성분, 예를 들면 병원체의 항원성 성분을 함유할 수 있다. 백신 제제는 백신을 투여하려고 하는 특정 방식을 위하여 설계될 수 있는 약제학적 담체, 예를 들면 비강내 또는 흡입 투여를 위하여 설계된 약제학적 담체를 추가로 함유할 수 있다. 인플루엔자 백신은 하나 이상의 비-변성된 인플루엔자 항원을 포함할 수 있고, 이들 중 하나 이상은 인플루엔자-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀을 포함하는 조성물로서, 비강내 또는 흡입 투여 제형으로서 설계된 조성물을 제공한다. 본 발명은 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 바이러스 외피가 완전히 바이러스 입자로부터 유래된 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않은 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않은 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 피험자에의 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 전신적 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 피험자에의 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 국부적 면역 반응을 또한 유도할 수 있는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 피험자에의 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 세포독성 림프구 반응을 또한 유도할 수 있는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 전신적 면역 반응 및/또는 국부적 면역 반응 및/또는 세포독성 림프구 반응을 유도할 수 있는 능력이 사람에서 나타나는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 면역 반응이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대하여 지시된 면역 반응을 포함하는 상기 조성물을 또한 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 면역 반응이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 상기 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 면역 반응이 혈청보호율 > 70% (성인의 경우) 및/또는 > 60% (노인의 경우), 혈청전환율 > 40% (성인의 경우) 및/또는 > 30% (노인의 경우), 및 평균 배수 증가 > 2.5 (성인의 경우) 및/또는 > 2.0 (노인의 경우) 중의 하나 이상을 제공하는 상기 조성물을 또한 제공한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인 상기 조성물을 또한 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 조성물이 비강내 또는 흡입 투여를 위한 약제학적 담체를 포함하는 백신 제형인 상기 조성물을 또한 제공한다.

본 발명은 비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명은 인플루엔자 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하는 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래된 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 조성물 중의 인플루엔자 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않은 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않은 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 피험자에의 상기 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 전신적 면역 반응을 유도하는데 충분한 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 상기 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 국부적 면역 반응을 또한 유도하는데 충분한 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 상기 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 세포독성 림프구 반응을 또한 유도하는 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 투여를 받는 피험자가 사람인 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 조성물이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대하여 지시된 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도하는 상기 용도를 또한 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 상기 조성물이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 면역 반응을 유도하는 상기 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 면역 반응이 혈청보호율 > 70% (성인의 경우) 및/또는 > 60% (노인의 경우), 혈청전환율 > 40% (성인의 경우) 및/또는 > 30% (노인의 경우), 및 평균 배수 증가 > 2.5 (성인의 경우) 및/또는 > 2.0 (노인의 경우) 중의 하나 이상을 제공하는 상기 용도를 또한 제공한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 투여되는 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인 상기 용도를 또한 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 제조된 조성물이 백신 제형인 상기 용도를 또한 제공한다.

따라서, 한가지 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물로서, 상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 조성물은 비강내 또는 흡입 투여 제형으로서 설계되고, 상기 조성물은 사람에의 상기 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 상기 인플루엔자 항원에 대한 전신적 및/또는 국부적 면역 반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하고, 상기 전신적 반응은 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르고, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인, 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 제공한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 용도로서, 상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 상기 인플루엔자 비로좀의 용도는 사람에의 상기 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 상기 인플루엔자 항원에 대한 전신적 및/또는 국부적 면역 반응을 유도하는데 충분함을 특징으로 하고, 상기 반응은 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르고, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인, 비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 용도를 제공한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 포함하는 백신 제형으로서, 상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 백신은 상기 백신이 사람에의 단일 비강내 또는 흡입 투여를 위하여 설계됨을 특징으로 하고, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인, 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 포함하는 백신 제형을 제공한다. 유리하게는, 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여는 상기 사람에서 전신적 및/또는 국부적 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 비강내 또는 흡입 투여를 위한 다량의 상기 백신 제형을 포함하는 장치가 또한 제공된다.

본 발명에 따라 투여되는 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량은 25㎍, 20㎍, 15㎍, 10㎍ 또는 5㎍ 이하일 수도 있다.

실시예 1

8주령 Balb /c 마우스에서의 LPP - 비로좀 백신; 차선의( suboptimal ) HA 용량 수준에서 다양한 HA / LPP 비의 비강내 비교

인플루엔자 혈청음성 암컷 Balb/c 마우스 10마리의 그룹에 LPP (리포펩타이드) - 비로좀 백신을 비강내 투여에 의해, 1:1.5, 1:0.7, 1:0.4, 1:0(즉, LPP 없음)의 HA/LPP 비로, 그리고 용량당 2㎍의 HA로 투여하였다. 또한, 암컷 마우스 10마리의 대조군 그룹에는 용량당 0㎍의 HA를 투여하였다 (비히클의 비강내 투여).

LPP-함유 비로좀의 4가지의 제제를 제조하였다. 간략히 설명하면, 30 내지 40% 수크로스 용액 중의 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 원심분리에 의해 침전시켰다. 바이러스를 세제 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르(OEG)를 함유하는 완충제 중에 재현탁시키고 가용화시켰다. 이어서, 바이러스 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 초원심분리에 의해 제거하였다. OEG-함유 상청액을 4개의 같은 용적으로 나누고, OEG-함유 완충제 중의 상이한 양의 리포펩타이드 P3CSK4를 첨가하였다 (P3CSK4: N-팔미토일-S-[2,3-비스(팔미토일옥시)-(2RS)-프로필]-[R]-시스테이닐-[S]-세릴-[S]-리실-[S]-리실-[S]-리실-[S]-리신). 용적을 OEG-함유 완충제로 조절하였다. OEG를 소수성 수지에의 흡착에 의해 제거하였다. 그 결과, LPP-함유 비로좀, 막에 HA 및 NA를 함유하고 (임의로) 막에 LPP를 함유하는 재구성된 바이러스 소포가 형성되었다. OEG 제거 후, 비로좀을 공극 크기가 0.22㎛인 PVDF 막을 통해 여과시켰다.

시작 물질은 100㎍의 HA당 252 I.U.의 내독소를 함유하는, 인플루엔자 A/Wyoming/3/2003 X-147 (A/Fujian/411/200 (H3N2)-유사 바이러스주)로부터의 20mg의 HA였다. 가용화 후, 4개의 배치(batch)를 표 1에 요약한 바와 같이 제조하였다.

비히클은 5 mM Hepes, 145 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.4)로 구성되었다. 그룹 E의 경우 (표 2를 참조), 비히클을 공극 크기가 0.22㎛인 PVDF 막을 통해 여과시켰다. 제조된 비로좀의 4개의 배치를 200 ㎍/ml (비강내 면역접종의 경우) 및 67 ㎍/ml (근육내 면역접종의 경우)의 농도로 희석시키고, 표 2에 제시된 바와 같이 1ml 바이알(그룹당 2개) 안에 분취하였다. 이러한 백신 그룹을 표 4에 요약한 바와 같이 사용하였다.

제형의 분석

본 연구에 사용된 제형을 표 3에 제시된 다수의 변수에 대해 분석하였다.

^a 라우리 검정(Lowry assay), 원리: 단백질을 알칼리성 황산구리 및 폴린-시오칼토(Folin-ciocalteu) 페놀 시약으로 처리한 후 청색이 형성된다. 알부민 BSA 표준물질을 기준으로서 사용하여, 단백질 함량을 750nm에서의 흡광도로부터 측정한다.

Lowry, OH, NJ Rosebrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol . Chem . 193: 265. 1951.

Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal . Biochem . 89: 31. 1978.

Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).

^b유럽약전(PhEur): 단행본 2053 및 2.7.1 부문

^c원리: 각각의 인지질은 단일 인 원자를 함유하고, 이를 사용하여 인지질을 정량할 수 있다. 인지질을 과염소산으로 파괴하여 생성된 포스페이트를 몰리브데이트에 의해 착화시키고, 아스코르브산에 의해 환원시켜 청색 산물을 수득한다. 색을 분광광도계를 사용하여 812nm에서 측정한다. 포스페이트 보정물질(calibrator)을 포함시켜 샘플 중의 인지질의 양을 정량한다.

Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases. Meth . Enzymol . 1966; 8:115-118

Bottcher CJF, van Gent CM & Pries C. A rapid and sensitive sub-micro phosphorus determination. Anal . Chim . Acta 1961; 24:203-204

^d유럽약전. 2.6.14

^e 오브알부민 ELISA는 포획을 위하여 고정된 폴리클로날 항-오브알부민 항체를 사용하고 검출 시스템으로서 항-오브알부민-HRP 접합체를 사용하는 직접적인 샌드위치 효소 면역검정이다. 접합체 및 샘플을 동시에 항온처리한다. 비-결합된 성분을 세척 단계에 의해 제거한다. 기질(TMB 및 H₂O₂)을 웰에 첨가한다. 웰에서 특이적으로 결합한 접합체의 존재가 청색에 의해 나타난다. 설포산을 기질에 첨가하여 반응을 중지시키면, 산물의 색상이 황색으로 변화된다. 흡광도(OD)를 450nm에서 판독한다. 최적의 결과를 위하여 620nm에서 참조 필터를 사용한다. 검정에 포함된 오브알부민 표준물질(0.3 내지 20.0 ng/ml)의 반응으로부터 표준 곡선을 작성한다. 미공지 샘플의 농도를 표준 곡선으로부터 보간(interpolation)할 수 있다.

^f단행본 0869 및 2053에 따름: 1가 풀링된(pooled) 수거물의 순도를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검사한다. 전기영동: 유럽약전 2.2.31에 따름.

검사 시스템

검사 동물

암컷 Balb/c 마우스 (BALB/cAnNCrl) 10마리의 7개의 그룹을 각각 사용하였다.

처리 시작시, 마우스는 8 내지 9주령이고 체중은 17 내지 19g이었다.

동물을 1가 LPP 비로좀 인플루엔자 백신(A/Wyoming)으로 0일차 및 14일차에 비강내로 백신접종하고, 2차 백신접종 21일 후에 부검하였다.

비강내: 검사 물질을 앙와위(dorsal position)의 동물에 가벼운 이소플루란/O₂/N₂O 마취 하에서 비강내로(10㎕를 두 콧구멍에 배분) 접종하였다.

1차 백신접종 전 및 1차 백신접종 14일 후에, 안와 혈액 샘플을 이소플루란/O₂/N₂O 마취 하에서 채취하였다. 35일차에, 동물을 희생시켜 혈액 샘플을 채취하였다 (복부 대동맥 또는 심장 천공을 통해 O₂/CO₂ 마취 하에서 방혈). 모든 샘플로부터 혈청을 수거하여, 급속 동결시키고, 처리하기 전까지 -10℃ 미만에서 폴리프로필렌 관 안에 저장하였다.

인플루엔자 바이러스는 적혈구(RBC)를 응집시키는데, 이는 바이러스에 대한 충분한 특이적인 항체의 존재 하에서 방지된다. 이러한 현상은 적혈구응집 억제(HI) 검정을 위한 기초를 제공하고, 이를 사용하여 혈청 중의 특이적인 항바이러스 항체를 검출하고 정량한다. 혈청을 인플루엔자 바이러스 및 칠면조 RBC에 첨가하였다. 다수의 희석률을 검사하였다 (적정). HI 역가는 적혈구응집을 여전히 억제하는 가장 높은 희석률의 역수로서 정의된다. 기하 평균 역가(GMT)를 다음과 같이 계산하였다:

1) 2개의 중복시료(duplicate)의 산술 평균으로서 개개의 log(역가)를 계산한다:

[log(역가₁) + log(역가₂)] / 2

2) 개개의 log(역가)의 산술 평균을 계산한다

3) GMT_(그룹) = 10 EXP (그룹 평균 log(역가))

통계

HI 역가를 기하 평균 역가를 사용하여 백신접종 그룹 및 일자별로 요약하였다. 그룹들의 log-변형된 35일차 HI 역가를 선형 회귀를 사용하여 분석하여, 백신 중의 LPP의 양과 GMT 사이의 용량-반응 관계를 조사하였다.

결과

HI 역가 분석

GMT를 표 5에 제시한다.

0일차에는 마우스에서 HA-특이적 항체를 검출할 수 없었다 (즉, 모든 HI 역가 < 10). 14일차에는 비강내 경로(i.n.)에 의해 백신접종된 대부분의 마우스에서 HA-특이적 항체를 검출할 수 없었다. 그룹 A의 1마리 마우스 (HI 역가: 80), 그룹 C의 1마리 마우스 (HI 역가: 35) 및 그룹 D의 1마리 마우스 (HI 역가: 160)를 제외하고는, 모든 HI 역가는 10 이하였다.

35일차에, HA-특이적 항체의 생성에서 용량-반응이 관찰되었다, 즉 백신에 더 많은 LPP가 첨가될수록 항체 역가가 더 높아졌다.

(log-변형된) 35일차 HI 역가를 선형 회귀를 사용하여 그룹 간에 비교하였다. 적합된 회귀 기울기는 매우 유의적이었다 (P < 0.0001). 따라서, 백신 중의 LPP의 양과 GMT 사이에 관찰된 용량-반응 관계는 통계적으로 유의적이었다.

결론

비-면역보강된 재구성된 인플루엔자 비로좀으로 마우스를 반복 비강내 백신접종한 결과, 측정가능한 전신적 면역 반응이 유도되지 않았다. 동일한 HA 용량 수준(2 ㎍ HA/용량)에서 LPP의 용량을 상승시키면서, LPP 면역보강된 재구성된 인플루엔자 비로좀을 사용하여 반복 비강내 백신접종한 결과, LPP-용량 의존적 방식으로 전신적 면역 반응이 나타났다. 본 발명과 뚜렷한 대조를 이루어 (아래의 실시예 2를 참조), 이러한 데이터는 이전에는 당업계의 일치된 견해를 지지하는 것으로 생각되었는데, 그 견해는 인플루엔자 항원(HA)이 재구성된 비로좀에서 제시되더라도, 면역자극제(이 경우에는 LPP)를 사용하는 것이 불활성화된 인플루엔자 백신을 사용한 비강내 백신접종에 필수적이라는 것이었다.

실시예 2

18세 이상 40세 이하의 건강한 젊은 성인에서 비강 전달 후 리포펩타이드 애주번트의 안전성 및 당해 애주번트가 비로좀 서브유닛( subunit ) 인플루엔자 백신의 효능에 미치는 영향을 조사하기 위한 이중 맹검 , 무작위화된 , 병렬 그룹 연구

바이러스주당 150 mcg HA/mL 및 315 mcg LPP/mL을 함유하는 0.2ml의 투여 용적에서(콧구멍당 0.1ml) LPP(리포펩타이드) 면역보강된 재구성된 인플루엔자 비로좀을 사용하여 건강한 사람 지원자를 비강내로 백신접종하였다. 바이러스주당 150 mcg HA/mL을 함유하는 0.2ml의 투여 용적에서(콧구멍당 0.1ml) LPP가 부재하는 재구성된 인플루엔자 비로좀을 사용하여 유사한 그룹을 비강내로 백신접종하였다. 본 연구의 목적은, 불활성화된 인플루엔자 백신을 사용한 비강내 백신접종 후 만족스러운 전신적 면역 반응을 얻기 위해서는 애주번트(예: LPP)를 사용하는 것이 필요하다는 마우스에서 밝혀진 개념의 증거를 사람에서 확인하는 것이었다.

연구 설계

본 연구는 18세 이상 40세 미만의 건강한 젊은 피험자에서의 이중 맹검, 무작위화된, 병렬 그룹 연구였다. 본 연구는 하나의 연구 센터 (Swiss Pharma Contract Ltd., Basel, Switzerland)에서 수행되었다. 연구 책임자는 엠. 세이버링(M. Seiberling) 박사였다. 본 연구는 두 파트로 이루어졌다. 파트 I에서는 LPP 면역보강된 비로좀 서브유닛 인플루엔자 백신의 안전성을 12명의 피험자에서 평가하였다. 9명의 피험자를 LPP-RVM (LPP-재구성된 바이러스 막; 인플루엔자 백신 -표면 항원, 불활성화됨, 비로좀-, LPP로 면역보강됨)으로 백신접종하고, 3명의 피험자를 RVM (인플루엔자 백신 -표면 항원, 불활성화됨, 비로좀-)으로 백신접종하였다. 본 연구의 파트 II에서는 LPP-RVM의 효능 및 안전성을 100명(그룹당 50명)의 피험자에서 평가하였다.

본 연구는 건강한 피험자에서 수행하였다. 또한, 본 연구의 파트 II에 참여하는 피험자는 본 연구의 시작 전에 3년 동안 인플루엔자에 대해 백신접종을 받지 않았다. 이는 인플루엔자에 대한 선재하는 항체를 갖는 피험자의 수를 최소화시켜 파트 II에서 연구 집단의 동질성을 증가시킨다.

파트 I

백신접종 전 14일 동안 (1차 방문), 피험자가 고지(告知)에 입각하여 동의한 후, 피험자를 포함 및 배제 기준에 대해 스크리닝하고 신체 검사를 실시하였다. 당해 방문시, 비강 상피 세포의 샘플을 세포검사를 위하여 수거하고, 기저선 섬모 운동을 사카린 검사로 측정하였다.

2차 방문시 (1일차), 표준 혈액학 분석을 위하여 4 내지 6mL의 혈액 샘플을 채취하고, 표준 생화학 분석을 위하여 6 내지 10mL의 혈액 샘플을 채취하고, 바이탈 사인(vital sign)을 평가하였다. 무작위화 후, 피험자를 2개의 백신 제형 중 하나로 백신접종하고, 백신접종 후 처음 24시간 동안 당해 장소에 머무르면서 즉각적인 국부적 및 전신적 반응 및 부작용을 모니터하였다. 바이탈 사인을 백신접종 4시간 및 24시간 후 평가하였다. 또한, 24시간 후, 2개의 혈액 샘플을 표준 혈액학 (4 내지 6mL) 및 생화학 (6 내지 10mL) 분석을 위하여 채취하고; 세포검사를 위하여 비강 상피 세포의 샘플을 수거하고, 백신접종 후 섬모 운동을 사카린 검사로 측정하였다. 피험자는 질문지(질문지 I)를 받고 집으로 가져가서, 다음날(3일차)에 국부적 및 전신적 반응을 평가하였다.

피험자는 귀가 2일 후 연구 장소로 복귀해야 했다: 3차 방문 (4일차). 당해 방문시, 국부적 및 전신적 반응을 평가하고, 이전의 방문과 본 방문 사이에 발생한 임의의 자발적인 부작용을 기록하였다. 또한, 2개의 혈액 샘플을 표준 혈액학 (4 내지 6mL) 및 생화학 (6 내지 10mL) 분석을 위하여 채취하고 바이탈 사인을 평가하였다.

피험자는 1차 백신접종 2주 후(15일차에) 연구 장소로 복귀하였다 (4차 방문). 당해 방문시, 세포검사를 위하여 비강 상피 세포의 샘플을 수거하고, 섬모 운동을 사카린 검사로 측정하고, 3차 방문과 4차 방문 사이에 발생한 부작용을 기록하였다.

파트 II

1차 혈액 및 비강 세척 샘플채취 전 14일 동안 (1차 방문), 피험자가 고지에 입각하여 동의한 후, 피험자를 포함 및 배제 기준에 대해 스크리닝하고 피험자의 건강상태를 신체 검사에 의해 확인하였다.

2차 방문시 (-1일차; 당해 방문은 1차 방문과 합쳐질 수 있다), 기저선 적혈구응집 억제(HI) 역가 측정을 위하여 6 내지 10mL의 혈액 샘플을 채취하고, 혈액 샘플을 표준 혈액학 (4 내지 6mL) 및 표준 생화학 (6 내지 10mL) 분석을 위하여 채취하였다. 기저선 비강 IgA 항체 역가의 측정을 위하여 비강 세척 샘플을 수거하였다.

다음날, 3차 방문시(1일차) 바이탈 사인의 평가 후, 피험자를 무작위화하여 비강 인플루엔자 백신의 2개의 제형 중 하나의 단일 용량으로 백신접종하였다. 백신접종 후 1시간 동안 당해 장소에서 임의의 즉각적인 국부적 반응, 전신적 반응 및 부작용을 모니터하였다. 그 후, 바이탈 사인을 재평가하고, 피험자는 질문지를 받고 집으로 가져가서, 백신접종 후 처음 7일 동안 국부적 및 전신적 반응을 매일 기록하였다.

2주 후 (4차 방문; 15일차), HI 역가 측정을 위하여 6 내지 10mL의 혈액 샘플을 채취하고, 2개의 추가적인 혈액 샘플을 표준 혈액학 (4 내지 6mL) 및 생화학 (6 내지 10mL) 분석을 위하여 채취하고, 비강 IgA 항체 역가를 위하여 비강 세척 샘플을 채취하였다.

효능 평가

효능을 평가하기 위하여, 혈액 샘플 및 비강 세척 샘플을 -1일차 (기저선) 및 15일차에 수거하였다.

혈액 샘플

6 내지 10mL의 혈액을 채취하여 적혈구응집 억제(HI) 항체 역가를 측정하였다[참조: Palmer DF, Dowdle WR, Coleman MT, Schild GC. Hemagglutination Inhibition Test. Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis. U.S. Dept. Hlth. Ed. Welfare, P.H.S. Atlanta; 1975:25-62]. 혈액 채취 및 응고 (실온에서 30분 이상) 후, 혈청을 분리하여 적정할 때까지 동결 보관하였다 (-20℃). 항체 적정을 2중으로 수행하였다. 샘플에 부여된 역가는 두 측정치의 기하 평균이었다. 백신접종 전후의 혈청을 동시에 적정하였다.

비강 세척 샘플

비강 세척 샘플의 채취를 위하여, 6mL의 예비 가온된 식염수(37℃)를 하나의 콧구멍에서 비경검사(rhinoscopy) 제어 하에 가하였다. 피험자에게 피험자의 머리를 60° 각도로 기울게 하여 세척액이 흐를 수 있게 하였다. 수거된 세척액을 동일한 조건 하에서 세척한 두번째 콧구멍에 가하였다. 샘플에 보존 용액을 첨가하였다 (샘플 용적의 1/100). 보존 용액은 100 mM Tris-HCl 완충제 (pH 8) 중에 용해된 10 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하였다. 샘플을 저속 원심분리(800 x g에서 10분)에 의해 바로 정화시키고, 분취하여 (이후에 샘플 해동을 반복하는 것을 방지하기 위하여), -80℃로 옮기기 전에 드라이아이스 상에 놓았다.

비강 세척 샘플 중의 IgA 수준을 ELISA에 의해 측정하고, 윌콕슨(Wilcoxon) 검사로 통계적으로 분석하였다. 인플루엔자 백신을 96-웰 플레이트에서 피복 항원으로서 사용하였다. 차단 완충제와 함께 항온처리하여, 비특이적 결합 부위를 차단시켰다. 인플루엔자 특이적 항체가 96-웰 플레이트 상의 항원에 흡수되도록, 비강 세척액을 차단 완충제 중에 2배 희석시켜(샘플당 12개의 희석액) 가하였다. 96-웰 플레이트를 효소 접합된(양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제 접합된) 항-사람 항체와 함께 항온처리하기 전에 세척하였다. 비-결합된 항-사람 항체를 세척에 의해 제거하고, 효소 반응을 위한 기질을 첨가한 후 광학 밀도를 측정하여 인플루엔자 바이러스주 특이적 항체의 양을 측정하였다.

백신 제형

2개의 상이한 인플루엔자 백신 제형을 본 연구에서 사용하였다. 두 제형은 2005년에 남반구에 대해 WHO에 의해 권장된 바와 같이 0.2ml의 용량당 바이러스주당 30mcg의 용량 수준으로 바이러스 항원을 함유하였다[참조: WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2005 influenza season. Weekly Epidem Rec. 2004;79:369-376].

- A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-유사 바이러스주

- A/Wellington/1/2004 (H3N2)-유사 바이러스주

- B/Shanghai/361/2002-유사 바이러스주

간략히 설명하면, 30 내지 40% 수크로스 용액 중의 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 원심분리에 의해 침전시켰다. 바이러스를 세제 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르(OEG)를 함유하는 완충제 중에 재현탁시키고 가용화시켰다. 이어서, 바이러스 뉴클레오캡시드를 초원심분리에 의해 제거하였다. OEG-함유 상청액을 OEG-함유 완충제 중의 리포펩타이드 P3CSK4로 조절하거나, LPP-무함유 재구성된 바이러스 막의 경우에만 OEG-함유 완충제로 조절하였다 (P3CSK4: N-팔미토일-S-[2,3-비스(팔미토일옥시)-(2RS)-프로필]-[R]-시스테이닐-[S]-세릴-[S]-리실-[S]-리실-[S]-리실-[S]-리신). OEG를 소수성 수지에의 흡착에 의해 제거하였다. 그 결과, LPP-함유 또는 LPP-무함유 재구성된 바이러스 막이 형성되었다 (막에 HA 및 NA를 함유하고, 임의로, 막에 LPP를 함유하는 재구성된 바이러스 소포). OEG 제거 후, 비로좀을 공극 크기가 0.22㎛인 PVDF 막을 통해 여과시켰다.

각각의 바이러스주의 경우에, LPP가 존재하거나 부재하는 별도의 제제를 제조하였다 (표 6). 첨가된 LPP의 양은 1:0.7(w/w)의 HA/LPP 비에 상응하였다.

^a 라우리 검정, 원리: 단백질을 알칼리성 황산구리 및 폴린-시오칼토 페놀 시약으로 처리한 후 청색이 형성된다. 알부민 BSA 표준물질을 기준으로서 사용하여, 단백질 함량을 750nm에서의 흡광도로부터 측정한다.

Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal . Biochem . 89: 31. 1978.

Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).

^b유럽약전: 단행본 2053 및 2.7.1 부문

^c원리: 각각의 인지질은 단일 인 원자를 함유하고, 이를 사용하여 인지질을 정량할 수 있다. 인지질을 과염소산으로 파괴하여 생성된 포스페이트를 몰리브데이트에 의해 착화시키고, 아스코르브산에 의해 환원시켜 청색 산물을 수득한다. 색을 분광광도계를 사용하여 812nm에서 측정한다. 포스페이트 보정물질을 포함시켜 샘플 중의 인지질의 양을 정량한다.

^d유럽약전. 2.6.14

^e 오브알부민 ELISA는 포획을 위하여 고정된 폴리클로날 항-오브알부민 항체를 사용하고 검출 시스템으로서 항-오브알부민-HRP 접합체를 사용하는 직접적인 샌드위치 효소 면역검정이다. 접합체 및 샘플을 동시에 항온처리한다. 비-결합된 성분을 세척 단계에 의해 제거한다. 기질(TMB 및 H₂O₂)을 웰에 첨가한다. 웰에서 특이적으로 결합한 접합체의 존재가 청색에 의해 나타난다. 설포산을 기질에 첨가하여 반응을 중지시키면, 산물의 색상이 황색으로 변화된다. 흡광도(OD)를 450nm에서 판독한다. 최적의 결과를 위하여 620nm에서 참조 필터를 사용한다. 검정에 포함된 오브알부민 표준물질(0.3 내지 20.0 ng/ml)의 반응으로부터 표준 곡선을 작성한다. 미공지 샘플의 농도를 표준 곡선으로부터 보간할 수 있다.

^f단행본 0869 및 2053에 따름: 1가 풀링된 수거물의 순도를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검사한다. 전기영동: 유럽약전 2.2.31에 따름.

효능

바이러스주 마다, 15일차의 log-변형된 HI 항체 역가와 15일차의 비강 IgA 항체 역가를, 양측 유의성 수준 0.05에서, 윌콕슨 순위합(rank-sum) 검사를 사용하여 두 백신접종 그룹 간에 비교하였다.

바이러스주 및 백신접종 그룹 마다 다음의 3개의 매개변수를 계산하여, 15일차의 HI 항체 역가를 또한 분석하였다:

- 혈청보호율 (혈청보호는 HI 역가 ≥ 40으로서 정의됨),

- 혈청전환율 (혈청전환은 백신접종전 HI 역가 < 10 및 백신접종후 HI 역가 ≥ 40 또는 백신접종전 HI 역가 ≥ 10 및 백신접종후 HI 역가가 4배 이상 증가함으로서 정의됨),

- 평균 배수 증가 (즉, HI 역가의 배수 증가의 기하 평균)

효능 데이터를 계획서순응(per-protocol) 원칙 및 처리의향(intent-to-treat) 원칙 둘 모두에 따라 분석하였다. 하지만, 본 연구는 소위 원리증명(proof-of-principle) 연구라는 점에서, 계획서순응 분석을 주요하게 고려하였다. 처리의향 샘플은 어느 정도의 백신접종후 효능 데이터가 있는 백신접종된 피험자에 의해 구성되었다. 계획서순응 샘플은 프로토콜을 완료하고 어떠한 주요 프로토콜 위반도 발생하지 않은 백신접종된 피험자에 의해 구성되었다. 주요 위반에는 (특히) 포함 또는 배제 기준의 위반 및 금지된 약제의 사용이 포함되었다. 또한, 실험실 확인된 병발성(intercurrent) 인플루엔자 감염이 있는 피험자 및 1차 효능 데이터가 없는 피험자도 계획서순응 샘플로부터 제외하였다. 연구 데이터베이스를 맹검해제(unblinding)하기 전에, 피험자를 계획서순응 샘플로부터 제외할지를 결정하였다.

결과

결론

예상외로, 국제공개공보 제WO 04/110486호 및 임상 데이터[참조: Gluck U, Gebbers JO, Gluck R, Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult volunteers. J Virol. 1999 Sep; 73(9):7780-6]에 기술된 바와 동일한 백신 배치(실시예 I)를 사용하여 얻어진 전임상 데이터와는 정반대로, 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 만족스러운 전신적 면역 반응이 비-면역보강된 재구성된 비로좀 인플루엔자 백신으로 1회만 백신접종된 사람 그룹에서 관찰되었다.

Claims

인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피(envelope)를 포함하는 인플루엔자 비로좀(virosome)을 포함하는 조성물로서,

상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트(adjuvant) 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 조성물이 비강내 또는 흡입 투여 제형으로서 설계되고, 상기 조성물은 사람에의 상기 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대하여 전신적 및/또는 국부적 면역 반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는,

인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주(virus strain)당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제형의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 세포독성 림프구 반응을 또한 유도할 수 있는 조성물.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 조성물.
제4항에 있어서, 면역 반응이 혈청보호율(seroprotection rate) > 70% (성인의 경우) 및/또는 > 60% (노인의 경우), 혈청전환율(seroconversion rate) > 40% (성인의 경우) 및/또는 > 30% (노인의 경우), 및 평균 배수 증가(mean fold increase) > 2.5 (성인의 경우) 및/또는 > 2.0 (노인의 경우) 중의 하나 이상을 제공하는 조성물.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 25㎍ 이하인 조성물.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 20㎍ 이하인 조성물.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 15㎍ 이하인 조성물.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이 러스주당 헤마글루티닌의 용량이 10㎍ 이하인 조성물.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 5㎍ 이하인 조성물.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 비강내 또는 흡입 투여를 위한 약제학적 담체를 포함하는 백신 제형인 조성물.
비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 용도로서,

상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 조성물은 사람에의 상기 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대하여 전신적 및/또는 국부적 면역 반응을 유도하는데 충분함을 특징으로 하는,

비강내 또는 흡입 투여용 조성물의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 용도.
제12항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 30㎍ 이하인 용도.
제12항 또는 제13항에 있어서, 조성물의 단일 비강내 또는 흡입 투여가 세포독성 림프구 반응을 또한 유도하는 용도.
제12항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 용도.
제15항에 있어서, 면역 반응이 혈청보호율 > 70% (성인의 경우) 및/또는 > 60% (노인의 경우), 혈청전환율 > 40% (성인의 경우) 및/또는 > 30% (노인의 경우), 및 평균 배수 증가 > 2.5 (성인의 경우) 및/또는 > 2.0 (노인의 경우) 중의 하나 이상을 제공하는 용도.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 25㎍ 이하인 용도.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 20㎍ 이하인 용도.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 15㎍ 이하인 용도.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 10㎍ 이하인 용도.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 5㎍ 이하인 용도.
제12항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 제조된 조성물이 백신 제형인 용도.
인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 포함하는 백신 제형으로서,

상기 바이러스 외피가 완전히 인플루엔자 바이러스 입자로부터 유래되고, 상기 재구성된 비로좀에 외부 공급원으로부터 어떠한 지질도 첨가되지 않고, 상기 비로좀이 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 조성물에 어떠한 별도의 애주번트 및/또는 면역 자극제도 첨가되지 않고, 상기 백신은 상기 백신이 사람에의 단일 비강내 또는 흡입 투여를 위하여 설계됨을 특징으로 하고, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌 의 용량이 30㎍ 이하인,

인플루엔자 바이러스의 재구성된 외피를 포함하는 인플루엔자 비로좀의 조성물을 포함하는 백신 제형.
제23항에 있어서, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 25㎍ 이하인 백신 제형.
제23항에 있어서, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 20㎍ 이하인 백신 제형.
제23항에 있어서, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 15㎍ 이하인 백신 제형.
제23항에 있어서, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 10㎍ 이하인 백신 제형.
제23항에 있어서, 단일 비강내 또는 흡입 투여당 바이러스주당 헤마글루티닌의 용량이 5㎍ 이하인 백신 제형.
제23항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 제형의 단일 비강내 또는 흡 입 투여가 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대한 전신적 면역 반응, 인플루엔자 항원 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 또는 이의 유도체에 대한 국부적 면역 반응 및 세포독성 림프구-매개된 면역 반응 중의 하나 이상을 포함하는 면역 반응을 사람에서 유도할 수 있는 백신 제형.
제29항에 있어서, 면역 반응이 인플루엔자 백신에 대한 CHMP 기준을 따르는 백신 제형.
제30항에 있어서, 면역 반응이 혈청보호율 > 70% (성인의 경우) 및/또는 > 60% (노인의 경우), 혈청전환율 > 40% (성인의 경우) 및/또는 > 30% (노인의 경우), 및 평균 배수 증가 > 2.5 (성인의 경우) 및/또는 > 2.0 (노인의 경우) 중의 하나 이상을 제공하는 백신 제형.
제23항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 백신 제형 및 백신의 에어로졸화를 위한 기구를 포함하는 비강내 또는 흡입 투여를 위한 장치.
제32항에 있어서, 장치가 단일 비강내 또는 흡입 투여를 위한 다량의 백신 제형을 함유하는 장치.
제32항 또는 제33항에 있어서, 장치가 1회용인 장치.