ES2338382T3 - Vacuna intranasal antigripal basada en virosomas. - Google Patents
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Abstract
Uso de virosomas de influenza, formados a partir de envolturas reconstituidas de dicho virus, en la fabricación de una composición para una administración única intranasal a un ser humano y capaz de inducir una respuesta inmune sistémica y/o local contra los antígenos de influenza hemaglutinina y/o neuraminidasa o derivados de los mismos, donde dicha composición comprende virosomas de influenza formados a partir de envolturas reconstituidas de dicho virus, en donde: - las envolturas virales se obtienen íntegramente a partir de partículas virales de influenza, - no se añade ningún lípido de fuentes externas a los virosomas reconstituidos, - los virosomas comprenden la hemaglutinina y/o la neuraminidasa de influenza, o derivados de las mismas, - la dosis de hemaglutinina por cepa viral y por una administración única intranasal o inhalatoria es menor o igual que 30 μg, caracterizado por que no se añade ningún adyuvante ni/o potenciador de inmunidad separado a la composición.
Description
Vacuna intranasal antigripal basada en
virosomas.
La presente invención se refiere, por ejemplo, a
composiciones para vacunas antigripales inactivadas y a rutas de
administración de las mismas, donde una administración única
intranasal o inhalatoria proporciona una respuesta inmune sistémica
que está correlacionada positivamente con protección clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han investigado varias estrategias de
inmunización contra la gripe por vía nasal u orofaríngea y
utilizando antígeno de influenza inactivado como alternativas no
inyectables a la inmunización subcutánea o intramuscular. En
modelos con animales, se han obtenido datos experimentales que dan
respaldo a los métodos no inyectables. En los estrategias que usan
un antígeno de influenza inactivado (tales como virus enteros
químicamente inactivados, o componentes virales adicionalmente
procesados tales como los virus fraccionados o los antígenos de
superficie hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA)) para la
inmunización por vía intranasal, que están respaldadas por los
datos obtenidos con animales, en unos casos se usa un adyuvante o
potenciador de inmunidad en combinación con el antígeno de
influenza inactivado y en otros se requiere vacunación múltiple. Un
adyuvante es cualquier sustancia que aumenta la inmunogenicidad de
los antígenos con él mezclados. En seres humanos, sólo se ha
informado de vacunación antigripal exitosa por vía intranasal en el
caso de (a) vacunas antigripales de virus vivos (cepas adaptadas al
frío, FluMist^{TM} Medlmmune Vaccines Inc) (Refs 1, 2, 3), (b)
vacunas antigripales virosómicas adyuvadas por la toxina termolábil
de E. coli (NasalFlu, Berna Biotech Ltd), o (c) uso de
grandes cantidades de antígeno y vacunación repetida (Refs 5, 10,
11). Si bien las vacunas vivas son capaces de inducir una respuesta
inmune satisfactoria, su naturaleza específica como virus vivo causa
problemas de seguridad adicionales y es probable que cause efectos
secundarios debido a la necesaria replicación viral en el tracto
respiratorio superior. También las condiciones de almacenamiento
necesarias limitan la comercialización de estos productos. Una
fuerte asociación entre el uso de la vacuna antigripal intranasal
que contenía la toxina termolábil (HLT) de E. coli como
adyuvante y la parálisis facial (parálisis de Bell) condujo a
retirar del mercado la vacuna virosómica coadyuvada con HLT (Ref.
6).
La eficacia de las vacunas antigripales en una
población dada puede estimarse evaluando los parámetros de
inmunogenicidad que se refieren a la cantidad de anticuerpos
anti-influenza generados después de la vacunación.
Estos parámetros de inmunogenicidad, a los cuales se hace referencia
generalmente como criterios CHMP, son utilizados para renovar la
licencia anual de las vacunas antigripales inactivadas (Ref. 7).
Hasta la fecha, no se ha descrito ninguna inmunización exitosa de
seres humanos contra la gripe que cumpla estos requisitos
inmunológicos o criterios CHMP (Ref.7) con una administración única
intranasal de una vacuna inactivada y sin adición de un adyuvante,
siendo el adyuvante un ingrediente adicional de la vacuna que no se
deriva del agente infeccioso que la vacuna desea prevenir y que es
añadido a la formulación de vacuna con el propósito de aumentar la
respuesta inmune al antígeno. Por lo tanto, se reconoce que todavía
existe una necesidad en la técnica de una composición de vacuna
antigripal inactivada que sea capaz de inducir una respuesta inmune
sistémica satisfactoria después de una administración única
intranasal, que no contenga ningún adyuvante y que cumpla los
criterios CHMP (Ref.7) con dicha una administración
única.
única.
Dichos "criterios CHMP" se definen como
sigue. En el documento del CHMP (Comité para Productos Medicinales
para Uso Humano [en inglés Committee for Medicinal Products for
Human Use]) Guía para la Armonización de los Criterios para Vacunas
antigripales [Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for
Influenza Vaccines] se definen los siguientes parámetros
serológicos para evaluar la inmunogenicidad de las vacunas
antigripales inacti-
vadas:
vadas:
- -
- la tasa de seroprotección, definiéndose la seroprotección como un título de inhibición de hemaglutinación (HI)\geq 40,
- -
- la tasa de seroconversión, definiéndose la seroconversión como un título de HI pre-vacunación < 10 y un título de HI post-vacunación \geq 40, o un título de HI pre-vacunación \geq 10 y al menos un aumento cuádruple del título de HI,
- -
- factor de seroconversión (o número de veces que se incrementan los títulos), que es la media geométrica de los incrementos intra-individuales (es decir título HI post-vacunación/título HI pre-vacunación).
\newpage
La norma del CHMP en cuanto a la inmunogenicidad
de una vacuna antigripal es que, para cada una de las tres cepas
del virus en la vacuna, se cumpla al menos uno de los criterios
siguientes:
El documento WO2004/110486 describe una vacuna
que comprende virosomas de influenza que contienen la envoltura
reconstituida del virus. Las envolturas virales se obtienen a partir
de partículas virales de influenza. Los componentes lipídicos en
los virosomas pueden originarse a partir de lípidos naturales
(virales) o de fuentes exógenas, p.ej., lípidos sintéticos. Los
virosomas comprenden HA y/o neuraminidasa, y la composición es
adecuada para administración intranasal, oral o parenteral. En un
experimento de inmunización intranasal, se administraron 5 \mug
de proteínas de influenza a ratones Balb/c. Las composiciones del
documento WO2004/110486 contienen lipoproteínas como adyuvante
añadido.
La invención también se aplica a niños, para
quienes se demostró que responden inmunológicamente de un modo
equiparable a los adultos (Ref.8). La invención también se aplica a
los más mayores. Se entiende por más mayores las personas de más de
60 años.
La presente invención proporciona un uso de
virosomas de influenza según la reivindicación 1 y una composición
según la reivindicación 2. Las realizaciones preferidas de uso o
composición se redactan en las reivindicaciones dependientes. La
presente invención proporciona además una formulación de vacuna que
comprende dicha composición, y un dispositivo para la
administración intranasal o inhalatoria que comprende dicha
formulación de vacuna y un mecanismo para dar forma de aerosol a la
vacuna.
Sorprendentemente, y en contradicción con los
datos pre-clínicos en roedores y la literatura
científica sobre la experiencia clínica con seres humanos, se ha
encontrado que la respuesta inmune en seres humanos después de una
única vacunación intranasal con una vacuna antigripal inactivada que
comprende envolturas del virus de influenza reconstituidas cumplió
los tres criterios del CHMP que demuestran la eficacia de una vacuna
antigripal para el grupo de edad de 18-60 años. Una
administración única intranasal es una inoculación de la formulación
de vacuna vía una o ambas fosas nasales, sin necesidad de repetir
la administración de la formulación de vacuna para cumplir los
criterios del CHMP arriba mencionados de inmunogenicidad de una
vacuna antigripal inactivada. Una administración única de una
vacuna (por vía nasal, inhalación, oral, subcutánea o intramuscular)
es generalmente un plan de vacunación que no incluye
administraciones múltiples de la vacuna separadas entre sí por días
o semanas conocidas en la técnica como inducción (priming) y
refuerzo (boosting). Una formulación diseñada como formulación para
administración intranasal o inhalatoria comprende una mezcla de uno
o más componentes activos y excipientes preparados de modo que
permiten la administración intranasal o inhalatoria.
La presente invención proporciona un modo para
inducir una respuesta inmune sistémica (inmunoglobulinas que
circulan en la sangre o células B que producen anticuerpos) que está
de acuerdo con los criterios CHMP, ventajosamente con una
administración única intranasal o inhalatoria de vacuna antigripal
virosómica. La presente invención también proporciona un modo de
inducir una respuesta inmune local o mucosal, que comprende un
aumento de las inmunoglobulinas secretoras conocidas como IgA en la
superficie de las membranas mucosales, ventajosamente con una
administración única intranasal o inhalatoria de vacuna antigripal
virosómica. La inducción de respuestas de IgG e IgA específicas
después de la administración intranasal implica la actividad del
tejido linfoide de las fosas nasales (Ref.12). Tal tejido se conoce
como tejido linfoide nasal (nasal-associated
lymphoid tissue (NALT)) y se ha demostrado que también es un sitio
de la mucosa que induce respuestas inmunes celulares (Ref.13). Como
se sabe que los virosomas tienen el potencial de inducir respuestas
inmunes celulares (Refs.14, 15), la presente invención también
proporciona un modo de inducir linfocitos citotóxicos específicos
(CTL).
Los virosomas son bicapas lipídicas que
contienen glicoproteínas virales. Los virosomas se producen
generalmente por extracción con detergente de las proteínas y los
lípidos de la membrana de virus envueltos, seguida por la
reconstitución de las bicapas características por separación de
dicho detergente. La presente invención también proporciona una
composición de virosomas de influenza que comprende envolturas
virales de influenza reconstituidas (particularmente reconstituidas
sin adición extra de lípidos y sin adición de un inmunomodulador de
acción inmunoestimulante (al cual se hace referencia generalmente
como adyuvante)) para el uso de vacunación vía un aerosol que es
administrado a la mucosa de la nasofaringe u orofaringe vía uno o
ambos orificios nasales para lograr inmunidad sistémica y local
contra influenza. También es posible una administración única vía
inhalación. También es posible una administración única en la mucosa
oral.
Los virosomas de influenza reconstituidos pueden
prepararse a partir de un virus inactivado, que puede ser
solubilizado por un detergente no dializable que es separado
mediante adsorción sobre perlas hidrofóbicas. La preparación puede
comprender una suspensión purificada de uno o más antígenos de
influenza seleccionados entre hemaglutinina (HA), neuraminidasa
(NA), un derivado de hemaglutinina y un derivado de neuraminidasa.
Las proteínas de la membrana viral hemaglutinina y neuraminidasa
pueden ser reconstituidas en una membrana compuesta por lípidos
virales que contiene bajos niveles de endotoxina y ovalbúmina (vea
Ref.9). Los derivados de hemaglutinina y/o neuraminidasa son
moléculas de hemaglutinina y/o neuraminidasa con secuencias de
aminoácidos y/o estructuras modificadas. Por ejemplo, pueden se
pueden eliminar, modificar o añadir aminoácidos a las secuencias.
También se pueden modificar los patrones de glicosilación. Los
derivados retienen la capacidad para inducir una respuesta inmune
al ser introducidos en un huésped.
Los virus de influenza utilizados para preparar
los virosomas reconstituidos pueden cultivarse, por ejemplo, en
huevos de gallina embrionados o en cultivos celulares, ya sea sobre
células adherentes o sobre células en suspensión. El virus puede
ser, por ejemplo, de tipo natural o una cepa recombinante o una cepa
genéticamente modificada. El tipo del virus puede ser, por ejemplo,
cualquier subtipo A ó B del virus de influenza, incluyendo las
cepas pandémicas.
La presente invención también proporciona
vacunas. Se entiende que el término "vacuna" está dirigido a
una preparación farmacéutica inmunoactiva. En ciertas
realizaciones, las vacunas pueden comprender variantes inocuas o
derivados de microorganismos patógenos que, por ejemplo, estimulan
el sistema inmune para producir defensas contra el verdadero
patógeno. En ciertas realizaciones, la vacuna induce, por ejemplo,
inmunidad adaptativa al ser administrada a un huésped. Una vacuna
puede contener una forma muerta o atenuada de un patógeno o un
componente del patógeno, tal como un componente antigénico del
patógeno. La preparación de vacuna puede contener además un
excipiente farmacéutico, que puede ser diseñado para el modo
particular de administración deseado de la vacuna, tal como un
excipiente farmacéutico diseñado para administración intranasal o
inhalatoria. Una vacuna antigripal puede comprender uno o más
antígenos de influenza no desnaturalizados, de los cuales uno o más
son capaces de inducir una respuesta inmune específica contra
influenza.
La presente invención proporciona una
composición que comprende virosomas de influenza que comprenden
envolturas reconstituidas de dicho virus, donde la composición está
diseñada como una formulación para administración intranasal o
inhalatoria. La invención también proporciona dicha composición,
donde los virosomas comprenden los antígenos de influenza
hemaglutinina y/o neuraminidasa o derivados de los mismos. La
invención también proporciona dicha composición, donde las
envolturas virales se obtienen completamente a partir de partículas
virales. La invención también proporciona dicha composición, donde
no se añade ningún lípido de una fuente externa a los virosomas
reconstituidos. La invención también proporciona dicha composición,
donde no se añade ningún adyuvante ni/o potenciador de inmunidad
separado a la composición. La invención también proporciona dicha
composición, donde una administración única intranasal o inhalatoria
de la formulación a un sujeto es capaz de inducir una respuesta
inmune sistémica. La invención también proporciona dicha
composición, donde una administración única intranasal o
inhalatoria de la formulación a un sujeto también es capaz de
inducir una respuesta inmune local. La invención también
proporciona dicha composición, donde la una administración única
intranasal o inhalatoria de la formulación a un sujeto también es
capaz de inducir una respuesta de los linfocitos citotóxicos. La
invención también proporciona dicha composición, donde la capacidad
de inducir una respuesta inmune sistémica y/o una respuesta inmune
local y/o una respuesta de los linfocitos citotóxicos se manifiesta
en un ser humano. La invención también proporciona dicha
composición, donde la respuesta inmune comprende una respuesta
inmune dirigida contra los antígenos de influenza hemaglutinina y/o
neuraminidasa o derivados de los mismos. En una realización
preferida, la invención también proporciona dicha composición,
donde la respuesta inmune está de acuerdo con los criterios CHMP
para una vacuna antigripal. La invención también proporciona dicha
composición, donde la respuesta inmune proporciona una o más de las
características siguientes: una tasa de seroprotección > 70%
para adultos y/o > 60% para personas más mayores, una tasa de
seroconversión > 40% para adultos y/o > 30% para personas más
mayores y un factor de seroconversión > 2,5 para adultos y/o
> 2,0 para personas más mayores. En una realización
particularmente preferida, la invención proporciona también dicha
composición, donde la dosis administrada de hemaglutinina por cepa
viral por administración intranasal o inhalatoria es igual o menor
que 30 \mug. Finalmente, la invención también proporciona dicha
composición, donde la composición es una formulación de vacuna que
comprende un excipiente farmacéutico para administración intranasal
o inhalatoria.
La presente invención proporciona además el uso
de virosomas de influenza que comprende envolturas reconstituidas
de dicho virus para la fabricación de una composición para
administración intranasal o inhalatoria. La invención también
proporciona dicho uso, donde los virosomas de influenza comprenden
los antígenos de influenza hemaglutinina y/o neuraminidasa o
derivados de los mismos. La invención también proporciona dicho uso,
donde las envolturas virales se obtienen íntegramente a partir de
partículas virales de influenza. La invención también proporciona
dicho uso, donde no se añade ningún lípido de una fuente externa a
los virosomas de influenza de la composición. La invención también
proporciona dicho uso, donde no se añade ningún adyuvante ni/o
potenciador de la inmunidad separado a la composición. La invención
también proporciona dicho uso, donde una administración única
intranasal o inhalatoria de la composición a un sujeto es
suficiente para la inducción de una respuesta inmune sistémica. La
invención también proporciona dicho uso, donde una administración
única intranasal o inhalatoria de la composición también induce una
respuesta inmune local. La invención también proporciona dicho uso,
donde una administración única intranasal o inhalatoria de la
composición también induce una respuesta de linfocitos citotóxicos.
La invención también proporciona dicho uso, donde el sujeto que
recibe la administración es un ser humano. La invención también
proporciona dicho uso, donde la composición induce una respuesta
inmune que comprende una respuesta inmune dirigida contra los
antígenos de influenza hemaglutinina y/o neuraminidasa o derivados
de los mismos. En una realización preferida, la invención también
proporciona dicho uso, donde la composición induce una respuesta
inmune que está de acuerdo con los criterios de CHMP para una vacuna
antigripal. La invención también proporciona dicho uso, donde la
respuesta inmune proporciona una o más de las características
siguientes: una tasa de seroprotección > 70% para adultos y/o
> 60% para personas más mayores, una tasa de seroconversión >
40% para adultos y/o > 30% para personas más mayores y un factor
de seroconversión > 2,5 para adultos y/o > 2,0 para personas
más mayores. En una realización particularmente preferida, la
invención proporciona también dicho uso, donde la dosis administrada
de hemaglutinina por cepa viral por administración intranasal o
inhalatoria es igual o menor que 30 \mug. Finalmente, la invención
también proporciona dicho uso, donde la composición fabricada es
una formulación de vacuna.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
en una realización una composición de virosomas de influenza que
comprende envolturas reconstituidas de dicho virus, donde las
envolturas virales se obtienen íntegramente a partir de partículas
virales de influenza, donde no se añade ningún lípido de una fuente
externa a los virosomas reconstituidos, donde los virosomas
comprenden los antígenos de influenza hemaglutinina y/o
neuraminidasa o derivados de los mismos, donde no se añade ningún
adyuvante ni/o potenciador de la inmunidad separado a la
composición, y donde la composición está diseñada como una
formulación para administración intranasal o inhalatoria, donde
dicha composición se caracteriza porque una administración única
intranasal o inhalatoria de la misma a un humano es capaz de
inducir una respuesta inmune sistémica y/o local contra dichos
antígenos de influenza, en donde dicha respuesta sistémica está de
acuerdo con los criterios CHMP para una vacuna antigripal, y donde
la dosis de hemaglutinina por cepa viral por administración
intranasal o inhalatoria es menor o igual que 30 \mug.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención proporciona el uso de virosomas de influenza que
comprenden envolturas reconstituidas de dicho virus para la
fabricación de una composición para administración intranasal o
inhalatoria, donde las envolturas virales se obtienen íntegramente a
partir de partículas virales de influenza, donde no se añade ningún
lípido de una fuente externa a los virosomas reconstituidos, donde
los virosomas comprenden los antígenos de influenza hemaglutinina
y/o neuraminidasa o derivados de los mismos, y donde no se añade
ningún adyuvante ni/o potenciador de la inmunidad separado a la
composición, donde dicho uso de dichos virosomas de influenza para
la fabricación de una composición para administración intranasal o
inhalatoria se caracteriza porque una administración única
intranasal o inhalatoria de la composición a un ser humano es
suficiente para la inducción de una respuesta inmune sistémica y/o
local contra dichos antígenos de influenza, donde dicha respuesta
está de acuerdo con los criterios CHMP para vacunas antigripales, y
donde la dosis de hemaglutinina por cepa viral por administración
intranasal o inhalatoria es menor o igual que 30 \mug.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención proporciona una formulación de vacuna que comprende una
composición de virosomas de influenza que comprende envolturas
reconstituidas de dicho virus, donde las envolturas virales se
obtienen íntegramente a partir de las partículas virales de
influenza, donde no se añade ningún lípido de una fuente externa a
los virosomas reconstituidos, donde los virosomas comprenden los
antígenos de influenza hemaglutinina y/o neuraminidasa o derivados
de los mismos, donde no se añade ningún adyuvante ni/o potenciador
de la inmunidad separado a la composición, donde dicha vacuna se
caracteriza porque está diseñada para una administración única
intranasal o inhalatoria a un ser humano y donde la dosis de
hemaglutinina por cepa viral por una administración única
intranasal o inhalatoria es menor o igual que 30 \mug.
Ventajosamente, dicha administración única intranasal o inhalatoria
de la formulación es capaz de inducir una respuesta sistémica y/o
local inmune en dicho ser humano. De acuerdo con la presente
invención también se proporciona un dispositivo que comprende una
cantidad de dicha formulación de vacuna para una administración
única intranasal o inhalatoria.
La dosis aplicada de acuerdo con la presente
invención de hemaglutinina por cepa viral por administración
intranasal o inhalatoria también puede ser menor o igual que 25
\mug, 20 \mug, 15 \mug, 10 \mug ó 5 \mug.
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characteristics of influenza virus at 25ºC [Adaptación y
características de cultivos de virus de influenza a 25ºC],
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Grupos de 10 ratones BALB/C hembra
influenza-seronegativos recibieron una vacuna
virosómica con lipopéptido (LPP) mediante administración
intranasal, a relaciones HA/LPP de 1:1,5, 1:0,7, 1:0,4, 1:0 (es
decir sin LPP) y con 2 \mug de HA por dosis. Además, un grupo de
control de 10 ratones hembra recibió una dosis de 0 \mug de
HA/dosis (administración intranasal del vehículo).
Se prepararon 4 preparaciones de virosomas que
contenían LPP. Brevemente, virus de influenza inactivado en una
solución de sacarosa al 30-40% se sedimentó mediante
centrifugación. El virus se resuspendió y se solubilizó en una
solución tampón que contenía el detergente éter monododecílico de
octaetilenglicol (OEG). Subsecuentemente, la nucleocápside viral se
separó mediante ultracentrifugación. El sobrenadante que contenía
OEG se dividió en 4 volúmenes iguales y se añadieron diferentes
cantidades del lipopéptido P3CSK4 en tampón que contenía OEG
(P3CSK4:
N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-[R]-cisteinil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina).
El volumen se ajustó con tampón que contenía OEG. El OEG se separó
mediante adsorción a una resina hidrofóbica. Esto dio como
resultado la formación de virosomas que contenían LPP, vesículas
virales reconstituidas que contenían HA y NA y (opcionalmente) LPP
en sus membranas. Después de la separación del OEG, los virosomas
se filtraron a través de una membrana de PVDF con un tamaño de poro
de 0,22 \mum.
El material de partida fueron 20 mg de HA de
A/Wyoming/3/2003 X-147 de influenza (una cepa
similar a (A/Fujian/411/200 (H3N2)) que contenían 252 UI de
endotoxina/100 \mug de HA. Después de la solubilización se
prepararon 4 partidas según lo indicado en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El vehículo estaba compuesto de Hepes 5 mM, NaCl
145 mM, EDTA 1 mM (pH 7,4). Para el grupo E (vea Tabla 2) se filtró
el vehículo a través de una membrana de PVDF con un tamaño de poro
de 0,22 \mum. Los 4 lotes preparados de virosomas se diluyeron a
una concentración de 200 \mug/ml para inmunización intranasal y 67
\mug/ml para inmunización intramuscular, y se subdividieron en
alícuotas en frasquitos de 1 ml (2 por grupo) según lo indicado en
la tabla 2. Estos grupos de vacunas se utilizaron según lo indicado
en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* Vehículo: Hepes 5mM, NaCl 145 mM, EDTA mM (pH
7,4), filtrado a través de una membrana de PVDF con un tamaño de
poro de 0,22 \mum.
\newpage
Las formulaciones utilizadas para este estudio
se sometieron a análisis de diversas variables según lo indicado en
la tabla 3.
^{a} Principio del ensayo de Lowry: las
proteínas forman un color azul después del tratamiento con sulfato
de cobre alcalino y reactivo fenólico de
Folin-Ciocalteu. El contenido de proteína se
determina a partir de la absorbancia a 750 nM, utilizando un patrón
de albúmina de suero bovino (BSA) como referencia.
Lowry, OH, N.J.Rosebrough, AL Farr, y RJ
Randall. J. Biol. Chem. 193:265. 1951.
Oostra, GM, NS Mathewson, y GN Catravas. Anal.
Biochem 89:31,1978.
Stoscheck, GM, Quantitation of Protein. Methods
in Enzymology 182:50-69 (1990).
Hartree, EF. Anal Biochem
48:422-427 (1972).
^{b} PhEur: monografía 2053 y sección
2.7.1.
^{c} Principio: Cada fosfolípido contiene un
solo átomo de fósforo que puede utilizarse para la cuantificación
de fosfolípidos. Los fosfolípidos se destruyen mediante ácido
perclórico y con el fosfato generado se forma un complejo con
molibdeno que se reduce mediante ácido ascórbico para proporcionar
un producto de color azul. El color se determina mediante un
espectrofotómetro a 812 nm. La cantidad de fosfolípido en una
muestra se cuantifica mediante la inclusión de un calibrador de
fosfato.
Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total
phosphate and phosphatases. Meth. Enzymol. 1966;
8:115-118.
Böttcher CJF, van Gent CM & Pries C. A rapid
and sensitive sub-micro phosphorus determination.
Anal. Chim. Acta 1961;
24-203-204.
^{d} Ph.Eur. 2.6.14
^{e} El ensayo ELISA para ovalbúmina es un
ensayo inmunoenzimático directo tipo sandwich que utiliza
anticuerpos anti-ovalbúmina policlonales
inmovilizados para la captación y un conjugado
anti-ovalbúmina-HRP como sistema de
detección. El conjugado y las muestras se incuban simultáneamente.
No se separan componentes ligados por lavado. A los pocillos se
añade substrato (TMB y H_{2}O_{2}). La presencia de un conjugado
específicamente ligado en los pocillos es indicada mediante el
desarrollo de un color azul. Se añade ácido sulfúrico al substrato
para detener la reacción, lo que resulta en un cambio de color del
producto a amarillo. Las absorbancias (OD) se leen a 450 nm. Para
resultados óptimos se utiliza un filtro de referencia a 620 nm. Se
establece una curva patrón a partir de la respuesta de patrones de
ovalbúmina (0,3-20,0 ng/ml) incluidos en el ensayo.
Las concentraciones de las muestras desconocidas se obtienen por
interpolación de la curva patrón.
^{f} De acuerdo con las monografías 0869 y
2053: La pureza de la vacuna monovalente combinada se examina
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Electroforesis: de
acuerdo con Ph.Eur 2.2.31.
Se utilizaron siete grupos de diez ratones
Balb/c hembras (BALB/cAnNCrl) cada uno. Al comienzo del tratamiento
los ratones tenían una edad de 8-9 semanas y pesaron
17-19 g. Los animales se vacunaron intranasalmente
el día 0, y el día 14 se vacunaron con vacuna antigripal virosómica
LPP monovalente (A/Wyoming) y se efectuó la necropsia 21 días
después de la segunda vacunación.
Intranasal: las sustancias de ensayo se
inocularon intranasalmente (10 \mul divididos entre ambas fosas
nasales) bajo suave anestesia con isoflurano/O_{2}/N_{2}O con el
animal en posición dorsal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la primera vacunación y 14 días después
de la misma se recolectaron muestras de sangre orbital bajo
anestesia de isofluorano/O_{2}/N_{2}O. El día 35, los animales
se sacrificaron y se recolectaron muestras de sangre (extracciones
de sangre bajo anestesia O_{2}/CO_{2} vía la aorta abdominal o
punción cardíaca). El suero de todas las muestras se recolectó, se
congeló profundamente y se almacenó en tubos de polipropileno a
<-10ºC hasta el procesamiento.
El virus de influenza aglutina hematíes (RBCs,
por sus siglas en inglés), siendo el virus bloqueado en presencia
de suficientes anticuerpos específicos. Este fenómeno proporciona la
base para el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI, por sus
siglas en inglés), que es utilizado para detectar y cuantificar los
anticuerpos antivirales específicos en el suero. A los virus de
influenza y RBCs de pavo se añade suero. Se ensayaron varias
diluciones (titulación). El título de inhibición de la
hemaglutinación (título HI) se define como la inversa de la máxima
dilución que todavía inhibe la hemaglutinación. La media geométrica
de los títulos (GMT, por sus siglas en inglés) se calculó como
sigue:
1) calculando el logaritmo individual de los
títulos como la media aritmética de dos duplicados:
[log(título 1)+ log(título 2)]/2
2) calculado la media aritmética de los
logaritmos individuales de los títulos,
3) (GMT)_{(del \ grupo)} = 10
EXP(media de los logaritmos de los títulos para el grupo)
Los títulos HI se compilaron por grupo de
vacunación y día, utilizando la media geométrica de los títulos.
Los logaritmos de los títulos HI en el día 35 para los grupos se
analizaron mediante regresión lineal, para investigar la relación
dosis-respuesta entre la cantidad de LPP en la
vacuna y las GMTs.
En la tabla 5 se muestran muestra las GMTs.
El día 0 no se pudieron detectar anticuerpos
HA-específicos en los ratones (es decir, todos los
títulos HI <10). El día 14 no se pudieron detectar anticuerpos
HA-específicos en la mayoría de los ratones
vacunados por vía intranasal (i.n.). Todos los títulos HI eran
\leq10, excepto para un ratón del grupo A (título HI: 80, un
ratón del grupo C (título HI: 35) y un ratón del grupo D (título HI:
160).
El día 35 se observó una relación
dosis-respuesta en la generación de anticuerpos
HA-específicos, es decir, la adición de más LPP a
la vacuna condujo a mayores títulos de anticuerpos.
Los logaritmos de los títulos en el día 35 se
compararon entre los grupos mediante regresión lineal. La pendiente
de regresión ajustada era altamente significativa (P < de
0,0001). Por lo tanto, la relación dosis-respuesta
entre la cantidad de LPP en la vacuna y los GMTs era
estadísticamente significativa.
La vacunación intranasal repetida de ratones con
virosomas de influenza reconstituidos sin adyuvante no indujo una
respuesta inmune sistémica medible. La vacunación intranasal
repetida utilizando virosomas de influenza reconstituidos, con LPP
como adyuvante, al mismo nivel de dosificación de HA (2 \mug de HA
para dosis) y con una dosis creciente de LPP mostró una respuesta
inmune sistémica que era dependiente de la dosis de LPP. En claro
contraste con la presente invención (véase el Ejemplo 2 abajo),
estos datos se consideraron previamente como respaldo de la opinión
generalizada en el arte que el uso de un potenciador de inmunidad
(en este caso LPP) es esencial para la vacunación intranasal con
vacuna antigripal inactivada, aún si el antígeno de influenza (HA)
está presente en un virosoma reconstituido.
Voluntarios humanos sanos se vacunaron
intranasalmente con virosomas de influenza reconstituidos adyuvados
con LPP (lipopéptido) a una dosis volumétrica de 0,2 ml (0,1 ml por
fosa nasal) que contenía 150 mcg de HA/ml por cepa y 315 mcg de
LPP/ml. Un grupo similar se vacunó intranasalmente con virosomas de
influenza reconstituidos, sin LPP, a una dosis de 0,2 ml (0,1 ml
por fosa nasal) que contenía 150 mcg de HA/ml por cepa. El objetivo
del estudio era confirmar en humanos la comprobación del concepto
demostrado en ratones, que para obtener una respuesta inmune
sistémica satisfactoria después de una vacunación intranasal con una
vacuna antigripal inactivada es necesario el uso de un adyuvante
(por ejemplo, LPP).
Este era un estudio doble ciego, aleatorizado,
en grupos paralelos de sujetos jóvenes sanos de \geq 18 y < 40
años de edad. El estudio se realizó en un centro de estudios: Swiss
Pharma Contract Ltd., Basilea, Suiza. El investigador principal era
Dr. M. Seiberling. El estudio tenía dos partes. En la primera parte
se evaluó la seguridad de la vacuna antigripal de subunidades
virosómicas adyuvada con LPP en 12 sujetos. Nueve sujetos se
vacunaron con LPP-RVM (LPP - membranas virales
reconstituidas; antígeno de superficie de vacuna antigripal,
inactivado, virosoma, con LPP como adyuvante) y tres sujetos se
vacunaron con RVM (antígeno de superficie de vacuna antigripal,
inactivado, virosoma). En la segunda parte del estudio se evaluó la
eficacia y la seguridad de LPP-RVM en cien sujetos
(50 por grupo).
El estudio se realizó en sujetos sanos. Además,
los sujetos que participaron en la segunda parte del estudio no
habían sido vacunados contra influenza durante los tres años previos
al inicio del estudio. Esto aumentó la homogeneidad de la población
de estudio en la parte II, minimizando el número de sujetos con
anticuerpos contra influenza preexistentes.
Parte
I
Durante los 14 días previos a la vacunación
(Visita 1), después de informar al sujeto y obtener el
consentimiento del mismo, el o ella fue examinado(a) según
los criterios de inclusión o exclusión y sometido(a) a un
examen físico. Durante esta visita se recolectó una muestra de
células epiteliales nasales para un análisis citológico y se midió
el valor basal de la actividad ciliar con el ensayo de sacarina.
Durante la Visita 2 (día 1) se tomó una muestra
de 4-6 ml de sangre para un análisis hematológico
rutinario, una muestra de sangre de 6-10 ml para un
análisis bioquimico rutinario y se evaluaron los signos vitales.
Después de la aleatorización, el sujeto se vacunó con una de las dos
formulaciones de vacuna y permaneció en el sitio durante las
primeras veinticuatro horas después de la vacunación para vigilar
las reacciones locales y sistémicas inmediatas y los efectos
adversos. Veinticuatro horas después de la vacunación se evaluaron
los signos vitales. Además, después de veinticuatro horas, se
tomaron dos muestras de sangre para un análisis hematológico
(4-6 ml) y un análisis bioquimico
(6-10 ml) rutinarios; se recolectó una muestra de
las células epiteliales nasales para un análisis citológico y se
midió la actividad ciliar después de la vacunación con el ensayo de
sacarina. Se proporcionó a los sujetos un cuestionario (Cuestionario
1) para llevar a casa para evaluar las reacciones locales y
sistémicas del día siguiente (día 3).
El sujeto tenía que volver al sitio del estudio
dos días después de haber salido: Visita 3 (día 4). Durante esta
visita se evaluaron las reacciones locales y sistémicas y se
registró cualquier evento adverso espontáneo que se produjo entre
esta visita y la anterior. Además, se tomaron dos muestras de sangre
para un análisis hematológico (4-6 ml) y un
análisis bioquimico (6-10 ml) rutinarios y se
evaluaron los signos vitales.
Los sujetos volvieron al sitio de estudio el día
15, dos semanas después de la primera vacunación (Visita 4).
Durante esta visita se recolectó una muestra de células epiteliales
nasales para un análisis citológico, se midió la actividad ciliar
con el ensayo de sacarina y se registraron los eventos adversos que
ocurrieron entre la Visita 3 y Visita 4.
Parte
II
Durante los catorce días previos a la primera
toma de muestra de sangre y lavado nasal (Visita 1), después de
haber informado al sujeto y haber obtenido su consentimiento, el o
ella fue examinado(a) según los criterios de inclusión y
exclusión y se chequeó su salud mediante un examen físico.
Durante la Visita 2 (día 1; esta visita puede
combinarse con la Visita 1) se tomó una muestra de 6 a 10 ml de
sangre para determinar el valor basal del título de inhibición de
hemaglutinación (HI) y se tomaron muestras de sangre para los
análisis hematológico (4-6 ml) y bioquimico
rutinarios (6-10 ml). Se recolectó una muestra de
lavado nasal para determinar el valor basal del título de
anticuerpos IgA nasales.
El día siguiente, durante la Visita 3 (día 1),
después de evaluar los signos vitales, el sujeto fue aleatorizado
para ser vacunado con una dosis única de una de las dos
formulaciones de la vacuna antigripal nasal. Las posibles
reacciones locales, reacciones sistémicas y eventos adversos
cualesquiera se vigilaron en el sitio durante la primer hora
después de la vacunación. Luego, se reevaluaron los signos vitales y
el sujeto recibió un cuestionario para llevar a casa para registrar
las reacciones locales y sistémicas diarias durante los primeros
siete días después de la vacunación.
Dos semanas más tarde (Visita 4; día 15), se
tomó una muestra de 6-10 ml de sangre para la
determinación del título HI, se tomaron dos muestras de sangre
adicionales para efectuar análisis hematológicos
(4-6 ml) y bioquimicos (6-10 ml)
rutinarios, y se tomó una muestra de lavado nasal para determinar el
título de anticuerpos IgA nasales.
Para evaluar la eficacia, se recolectaron
muestras de sangre y muestras de lavado nasal los días -1 (valor
basal) y 15.
Se recolectaron seis a diez ml de sangre para
determinar los títulos (Palmer DF, Dowdle WR, Coleman MT, Schild
GC. Hemagglutination Inhibition Test. Advanced laboratory techniques
for inflluenza diagnosis. U.S. Dept. Hlth. Ed. Welfare, P.H.S.
Atlanta; 1975:25-62) de anticuerpos de inhibición de
hemaglutinación (HI). Después de la recolección y coagulación (al
menos 30 minutos a temperatura ambiente) de la sangre se separaron
los sueros y se mantuvieron congelados (-20ºC) hasta la titulación.
Las titulaciones de los anticuerpos se efectuaron por duplicado. El
título asignado a una muestra fue la media geométrica de las dos
determinaciones. Los sueros pre- y post-vacunación
se titularon simultáneamente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Para la recolección de muestras de lavado nasal,
se aplicaron en una fosa nasal 6 ml de solución fisiológica
precalentada (37ºC) bajo control rinoscópico. Se pidió al sujeto
inclinar su cabeza a un ángulo de 60º para permitir el flujo del
fluido del lavado. El lavado recolectado se aplicó a la segunda fosa
nasal que se lavó bajo las mismas condiciones. A las muestras se
agregó una solución conservante (1/100 del volumen de la muestra).
La solución conservante contenía 10 mg/ml de albúmina de suero
bovino disueltos en tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8.
Las muestras se clarificaron directamente mediante centrifugación a
baja velocidad (10 min a 800 x g), se subdividieron en alícuotas
(para evitar el descongelamiento repetido de las muestras más tarde
y se colocaron sobre hielo seco antes de ser transferidas a
-80ºC.
Los niveles de IgA en las muestras de lavado
nasal se determinaron mediante ELISA y se analizaron
estadísticamente con el ensayo de Wilcoxon. La vacuna antigripal se
usó como antígeno de recubrimiento en placas de 96 pocillos. La
incubación con un tampón de bloqueo no bloqueó ningún sitio de
ligadura específico. Los lavados nasales se aplicaron en diluciones
al doble (doce diluciones por muestra) en tampón de bloqueo para la
absorción de los anticuerpos específicos de influenza por los
antígenos sobre la placa de 96 pocillos. Las placas de 96 pocillos
se lavaron antes de la incubación con anticuerpos
anti-humanos conjugados con enzima (peroxidasa de
rábano picante o fosfatasa alcalina conjugada). Los anticuerpos
anti-humanos no ligados se separaron por lavado y
se determinó la cantidad de anticuerpos específicos para la cepa de
influenza mediante la medición de la densidad óptica después de la
adición del sustrato para la reacción enzimática.
En este estudio se utilizaron dos formulaciones
diferentes de vacuna antigripal. Ambas formulaciones contenían los
antígenos virales recomendados por la OMS para el hemisferio sur
para el año 2005 (WHO. Recommended composition of influenza virus
vaccines for use in the 2005 influenza season. Weekly Epidem Rec.
200;79:369-376) a un nivel de dosis de 30 mcg por
cepa por dosis de 0,2 ml,
- -
- una cepa similar a A/New Caledonia/20/99 (H1N1),
- -
- una cepa similar a A/Wellington/1/2004(H3N2),
- -
- una cepa similar a B/Shanghai/361/2002.
Brevemente, virus de influenza inactivado en una
solución de sacarosa al 30-40% se sedimentó mediante
centrifugación. El virus se resuspendió y se solubilizó en un
tampón que contenía el detergente éter monododecílico de
octaetilenglicol (OEG). Subsecuentemente se eliminó la
nucleocápside viral mediante ultracentrifugación. El sobrenadante
que contenía OEG se ajustó con el lipopéptido P3CSK4 en tampón que
contenía OEG o con tampón que contenía solamente OEG en el caso de
membranas virales reconstituidas libres de LPP (P3CSK4:
N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-[R]-cisteinil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina).
Se separó el OEG mediante adsorción a una resina hidrofóbica. Esto
dio como resultado la formación de membranas virales reconstituidas
que contenían LPP o libres de LPP (vesículas virales reconstituidas
con HA y NA en sus membranas y, opcionalmente, LPP en sus
membranas). Después de la separación del OEG, los virosomas se
filtraron a través de una membrana de PVDF con un tamaño de poro de
0,22 \mum.
Para cada cepa de virus se hizo una preparación
separada, ya sea con o sin LPP (Tabla 6). Las cantidades de LPP
agregadas correspondieron a relaciones HA/LPP de 1:0,7 (p/p).
^{a} Principio del ensayo de Lowry: las
proteínas forman un color azul después del tratamiento con sulfato
de cobre alcalino y reactivo fenólico de
Folin-Ciocalteu. El contenido de proteína se
determina a partir de la absorbancia a 750 nM, utilizando un patrón
de albúmina de suero bovino (BSA) como referencia.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Lowry, OH, N.J.Rosebrough, AL Farr, y RJ
Randall. J. Biol. Chem. 193:265. 1951
Oostra, GM, NS Mathewson, y GN Catravas. Anal.
Biochem 89:31,1978.
Stoscheck, GM, Quantitation of Protein. Methods
in Enzymology 182:50-69 (1990).
Hartree, EF. Anal Biochem
48:422-427 (1972).
^{b} PhEur: monografía 2053 y sección
2.7.1.
^{c} Principio: Cada fosfolípido contiene un
solo átomo de fósforo que puede utilizarse para la cuantificación
de fosfolípidos. Los fosfolípidos se destruyen mediante ácido
perclórico y con el fosfato generado se forma un complejo con
molibdeno que se reduce mediante ácido ascórbico para proporcionar
un producto de color azul. El color se determina mediante un
espectrofotómetro a 812 nm. La cantidad de fosfolípido en una
muestra se cuantifica mediante la inclusión de un calibrador de
fosfato.
Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total
phosphate and phosphatases. Meth. Enzymol. 1966;
8:115-118.
Böttcher CJF, van Gent CM & Pries C. A rapid
and sensitive sub-micro phosphorus determination.
Anal. Chim. Acta 1961;
24-203-204.
^{d} Ph.Eur. 2.6.14
^{e} El ensayo ELISA para ovalbúmina es un
ensayo inmunoenzimático directo tipo sandwich que utiliza
anticuerpos anti-ovalbúmina policlonales
inmovilizados para la captación y un conjugado
anti-ovalbúmina-HRP como sistema de
detección. El conjugado y las muestras se incuban simultáneamente.
Por lavado no se separan componentes ligados. A los pocillos se
añade substrato (TMB y H_{2}O_{2}). La presencia de un conjugado
específicamente ligado en los pocillos es indicada mediante el
desarrollo de un color azul. Se añade ácido sulfúrico al substrato
para detener la reacción, lo que resulta en un cambio de color del
producto a amarillo. Las absorbancias (OD) se leen a 450 nm. Para
resultados óptimos se utiliza un filtro de referencia a 620 nm. Se
establece una curva patrón a partir de la respuesta de patrones de
ovalbúmina (0,3-20,0 ng/ml) incluidos en el ensayo.
Las concentraciones de las muestras desconocidas se obtienen por
interpolación de la curva patrón.
^{f} De acuerdo con las monografías 0869 y
2053. La pureza de la vacuna monovalente combinada se examina
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Electroforesis: de
acuerdo con Ph.Eur 2.2.31.
Por cepa viral, se compararon entre sí los
logaritmos de los títulos de anticuerpos HI del día 15 y los títulos
de anticuerpos IgA nasales del día 15 de los dos grupos de
vacunación mediante el ensayo de suma de rangos de Wilcoxon, al
nivel de significancia de dos colas de 0,05.
También se analizaron los títulos de anticuerpos
HI del día 15 mediante el cálculo de los siguientes tres parámetros
por cepa viral y por grupo de vacunación:
- la tasa de seroprotección, definiéndose la
seroprotección como un título de HI \geq 40,
- la tasa de seroconversión, definiéndose la
seroconversión como el título de HI pre-vacunación
< 10 y un título de HI post-vacunación \geq
40, o un título de HI pre-vacunación \geq 10 y un
aumento post-vacunación del título de HI al menos
cuádruple,
- el factor de seroconversión, es decir la media
geométrica del coeficiente de aumento del título HI.
Los datos de eficiencia se analizaron tanto por
análisis por protocolo o análisis de casos válidos como por
análisis por intención de tratar. Sin embargo, como este estudio fue
un así llamado estudio de comprobación de un principio, el análisis
por protocolo se consideró como el análisis principal. La muestra
del análisis por intención de tratar estaba constituida por los
sujetos vacunados, con algunos datos de eficacia
post-vacunación. La muestra por protocolo estaba
constituida por los sujetos vacunados según el protocolo completo
sin que se produjeran mayores violaciones del protocolo. Las
mayores violaciones incluyeron (entre otros): la violación de los
criterios de inclusión o exclusión y el uso de medicación prohibida.
Además, también se excluyeron de la muestra por protocolo los
sujetos con una infección de influenza intercurrente confirmada por
el laboratorio y los sujetos sin datos de eficacia primarios. La
decisión de excluir o no un sujeto de la muestra por protocolo se
tomó antes de eliminar el carácter de ciego de la base de datos del
estudio.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Inesperadamente y en contradicción con los datos
preclínicos obtenidos con el mismo lote de vacuna (Ejemplo 1) y
como se describe en WO 04/110486 y los datos clínicos (Gluck U.
Gebbers JO, Gluck R. Phase 1 evaluation of intranasal virosomal
influenza vaccine with and without Escherichia coli
heat-labile toxin in adult volunteers J. Virol,
1999 Sep; 73(9):7780-6), se observó una
respuesta inmune sistémica satisfactoria de acuerdo con los
criterios CHMP para vacunas antigripales en el grupo humano vacunado
solamente una vez con la vacuna antigripal virosómica reconstituida
sin adyuvante.
Claims (15)
1. Uso de virosomas de influenza, formados a
partir de envolturas reconstituidas de dicho virus, en la
fabricación de una composición para una administración única
intranasal a un ser humano y capaz de inducir una respuesta inmune
sistémica y/o local contra los antígenos de influenza hemaglutinina
y/o neuraminidasa o derivados de los mismos, donde dicha
composición comprende virosomas de influenza formados a partir de
envolturas reconstituidas de dicho virus, en donde:
- las envolturas virales se obtienen
íntegramente a partir de partículas virales de influenza,
- no se añade ningún lípido de fuentes externas
a los virosomas reconstituidos,
- los virosomas comprenden la hemaglutinina y/o
la neuraminidasa de influenza, o derivados de las mismas,
- la dosis de hemaglutinina por cepa viral y por
una administración única intranasal o inhalatoria es menor o igual
que 30 \mug,
caracterizado por que no se añade ningún
adyuvante ni/o potenciador de inmunidad separado a la
composición.
2. Una composición para una administración única
intranasal a un ser humano y capaz de inducir una respuesta inmune
sistémica y/o local contra los antígenos de influenza hemaglutinina
y/o neuraminidasa o derivados de los mismos, donde dicha
composición comprende virosomas de influenza formados a partir de
envolturas reconstituidas de dicho virus, en donde:
- las envolturas virales se obtienen
íntegramente a partir de partículas virales de influenza,
- no se añade ningún lípido de fuentes externas
a los virosomas reconstituidos,
- los virosomas comprenden la hemaglutinina y/o
la neuraminidasa de influenza, o derivados de las mismas,
- la dosis de hemaglutinina por cepa viral y por
una administración única intranasal o inhalatoria es menor o igual
que 30 \mug,
caracterizada por que no se añade ningún
adyuvante ni/o potenciador de inmunidad separado a la
composición.
3. Uso o composición según la reivindicación 1 o
2, en donde la administración única intranasal o inhalatoria de la
formulación también es capaz de inducir una respuesta de los
linfocitos citotóxicos.
4. Uso o composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la respuesta inmune está de
acuerdo con los criterios del CHMP para las vacunas
antigripales.
5. Uso o composición según la reivindicación 4,
en donde la respuesta inmune proporciona uno o más de las
características siguientes: una tasa de seroprotección > 70% para
adultos y/o > 60% para personas más mayores, una tasa de
seroconversión > 40% para adultos y/o > 30% para personas más
mayores y un factor de seroconversión > 2,5 para adultos y/o
> 2,0 para personas más mayores.
6. Uso o composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis de hemaglutinina por cepa
viral y por administración intranasal o inhalatoria es menor o igual
que 25 \mug.
7. Uso o composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis de hemaglutinina por
cepa viral y por administración intranasal o inhalatoria es menor o
igual que 20 \mug.
8. Uso o composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis de hemaglutinina por cepa
viral y por administración intranasal o inhalatoria es menor o igual
que 15 \mug.
9. Uso o composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis de hemaglutinina por
cepa viral y por administración intranasal o inhalatoria es menor o
igual que 10 \mug.
10. Uso o composición según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis de hemaglutinina por
cepa viral y por administración intranasal o inhalatoria es menor o
igual que 5 \mug.
11. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 3-9, en donde la composición
fabricada es una formulación de vacuna.
12. Una formulación de vacuna, que comprende una
composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 o
3-9.
3-9.
13. Un dispositivo para administración
intranasal o inhalatoria, que comprende la formulación de vacuna
según la reivindicación 12 y un mecanismo para dar forma de aerosol
a la vacuna.
14. Un dispositivo según la reivindicación 13,
en donde el dispositivo contiene una cantidad de formulación de
vacuna para una administración única intranasal o inhalatoria.
15. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 o 14, en donde el dispositivo es de un solo
uso.
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