PT2158921E

PT2158921E - Vacina intranasal contra a gripe à base de virossomas

Info

Publication number: PT2158921E
Application number: PT09178084T
Authority: PT
Inventors: Alexander J Kersten; Lisya Gerez; Pieter J Schoen; Jozef J P Nauta; Dorine Van Rheineck Leyssius
Original assignee: Abbott Biologicals Bv
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2012-03-27
Also published as: HRP20120013T1; JP5285595B2; PT1996229E; WO2007107585A1; PL2158921T3; BRPI0709864A2; EP2158921A1; EP2158921B1; ES2375436T3; SI1996229T1; EA014532B1; CA2646895A1; DE602007003815D1; EP1996229A1; DK2158921T3; EP1996229B1; ATE539766T1; AU2007228736A1; MY142996A; HRP20100144T1

Description

DESCRIÇÃO VACINA INTRANASAL CONTRA A GRIPE À BASE DE VIROSSOMAS Campo da Invenção A presente invenção refere-se, por exemplo, a composições para vacinas do virus da gripe inactivado e a vias de administração em que uma única administração intranasal ou por inalação fornece uma resposta sistémica do sistema imunitário que está correlacionada positivamente com a protecção clinica.

Antecedentes da Invenção: Vários conceitos para a imunização contra a gripe através das vias nasal e orofaringea e utilizando o antigénio da gripe inactivado foram explorados como alternativas sem utilização de agulha para a imunização subcutânea ou intramuscular. Dados experimentais, que apoiam as abordagens sem utilização de agulha foram gerados em modelos animais. Os conceitos que utilizam o antigénio da gripe inactivado (tais como partículas de vírus inteiras quimicamente inactivadas ou componentes virais adicionalmente processados, tais como subunidades do vírus, ou os antigénios de superfície hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase (NA) purificados) para a imunização através da via intranasal que são sustentados por dados em animais incluem ou o uso de um adjuvante ou de um estimulador imunitário em combinação com o antigénio da gripe inactivado, ou requerem a vacinação múltipla. Um adjuvante é qualquer substância que aumente a imunogenicidade de antigénios misturados com o mesmo. Em seres humanos, a vacinação bem sucedida contra a gripe através da via 1 intranasal apenas foi relatada para (a) vacinas contra a gripe vivas (estirpes adaptadas ao frio) (FluMist™, Medimmune Vaccines Inc.) (Refs. 1, 2, 3), (b) vacina contra a gripe virossómica tendo como adjuvante a toxina termolábil de E. coli (NasalFlu, Berna Biotec Ltd.) (Ref. 4) ou (c) usando elevadas quantidades de antigénio e vacinação repetida (Refs. 5, 10, 11) . Embora as vacinas vivas sejam capazes de induzir uma resposta imunitária satisfatória, a sua natureza especifica de serem um virus vivo causa preocupações de segurança adicionais, e é provável que induza efeitos secundários devido ao ciclo de replicação virai necessário no tracto respiratório superior. Além disso, as condições de armazenamento requeridas limitam a comercialização destes produtos. Uma forte associação entre o uso da vacina de influenza intranasal com E. coli HLT como adjuvante, e a paralisia facial (Paralisia de Bell), conduziram à retirada do mercado da vacina virossómica com o adjuvante HLT (Ref. 6) . A eficácia de vacinas contra a gripe numa determinada população pode ser estimada através da avaliação dos parâmetros de imunogenicidade referentes à quantidade de anticorpos anti-vírus da gripe que são gerados após a vacinação. Estes parâmetros de imunogenicidade, geralmente referidos como critérios do CHMP, são usados para a renovação do licenciamento anual de vacinas de virus da gripe inactivados (Ref. 7). Até à data, a imunização bem sucedida de seres humanos contra a gripe, que satisfaz estes requisitos imunológicos ou critérios do CHMP (Ref. 7), com uma única administração intranasal de uma vacina inactivada, e sem a adição de um adjuvante, o qual é um ingrediente adicional da vacina que não é derivado do agente infeccioso que a vacina pretende prevenir e que é adicionado à 2 formulação da vacina com o propósito de aumentar a resposta imunitária ao antigénio, não foi ainda descrita. É reconhecido, portanto, que existe ainda uma necessidade na técnica relativamente a uma composição de vacina contra a gripe inactivada que seja capaz de induzir uma resposta sistémica imunitária satisfatória após uma única administração intranasal, que não contenha um adjuvante, e satisfaça os critérios do CHMP (Ref. 7) com a referida administração única.

Os referidos "critérios do "CHMP" são definidos como se segue. No CHMP (Comittee for Medicinal Products for Human Use) Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines, são definidos os seguintes parâmetros serológicos, de modo a avaliar a imunogenicidade de vacinas contra a gripe inactivadas: - taxa de seroprotecção, a seroprotecção sendo definida como o titulo de Inibição de Hemaglutinação (Hl) > 40, - a taxa de seroconversão, sendo a seroconversão definida como o título de Hl de pré- -vacinaçao < 10 e um titulo de Hl de pós-vacinação > 40 ou um título de Hl de pré- vacinação > 10 e pelo menos um aumento de 4 vezes no titulo de Hl, - o aumento de vezes médio, que é a média geométrica dos aumentos intra-individuais (isto é, titulo de Hl de pós-vacinação/titulo de Hl de pré-vacinação). 0 requisito do CHMP para a imunogenicidade da vacina contra a gripe é que para cada uma das três estirpes de vírus na vacina pelo menos um dos critérios que se seguem é satisfeito: 3

Critério

Adultos

Idosos

Taxa de seroprotecçao > 70% Taxa de seroconversão > 40% > 60% > 30% > 2,0

Aumento de vezes médio >2,5 A invenção também se aplica a crianças, para as quais se mostrou que respondem imunologicamente de um modo comparável aos adultos (Ref 8). A invenção também se aplica a indivíduos idosos. Idosos têm mais de sessenta anos de idade.

Aqui divulga-se: 1. Composição compreendendo virossomas do virus da gripe compreendendo envelopes reconstituídos do referido vírus, em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas do vírus de influenza, em que não se adiciona lípido de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados, em que não se adiciona de forma separada à composição qualquer adjuvante e/ou estimulador imune, e em que a composição é desenhada na forma de uma formulação de administração por via intranasal ou por inalação, sendo a composição caracterizada pelo facto de uma única administração intranasal ou por inalação da referida formulação a um ser humano ser capaz de induzir uma resposta imunitária sistémica e/ou local contra os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou os seus derivados. 4 2. Composição de acordo com o item 1, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por uma administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 pg. 3. Composição de acordo com qualquer um dos itens 1 ou 2, em que a administração única intranasal ou por inalação da formulação é também capaz de induzir uma resposta dos linfócitos citotóxicos. 4. Composição de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, em que a resposta imunitária está de acordo com o critério CHMP para vacina contra o virus da gripe. 5. Composição de acordo com o item 4, em que a resposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, uma taxa de seroprotecção de > 40% para adultos e/ou > 30% para idosos, e um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou 2,0 vezes para idosos. 6 . Composição de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 25 pg. 7. Composição de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 20 pg. 8. Composição de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por 5 administraçao intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 15 pg. 9. Composição de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 10 pg. 10. Composição de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 5 pg. 11. Composição de acordo com qualquer uma dos itens 1 a 10, em que a composição é uma formulação de vacina compreendendo um veículo farmacêutico para administração intranasal ou por inalação. 12. Utilização de virossomas do vírus da gripe compreendendo envelopes reconstituídos do referido vírus para o fabrico de uma composição para administração intranasal ou por inalação, em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas do vírus de influenza, em que não se adiciona lípido de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados, em que não se adiciona de forma separada à composição qualquer adjuvante e/ou estimulador imune, e em que a composição é desenhada na forma de uma formulação de administração por via intranasal ou por inalação, sendo a composição caracterizada pelo facto de uma única 6 administração intranasal ou por inalação da referida formulação a um ser humano ser capaz de induzir uma resposta imunitária sistémica e/ou local contra os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou os seus derivados. 13. Utilização de acordo com o item 12, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por uma administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 pg. 14. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 12 ou 13, em que a administração única intranasal ou por inalação da formulação é também capaz de induzir uma resposta dos linfócitos citotóxicos. 15. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 12 a 14, em que a resposta imunitária está de acordo com o critério CHMP para vacina contra o virus da gripe. 16. Utilização de acordo com o item 15, em que a resposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, uma taxa de seroprotecção de > 40% para adultos e/ou > 30% para idosos, e um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou 2,0 vezes para idosos. 17. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 13 a 16, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 25 pg. 7 18. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 13 a 16, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 20 pg. 19. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 13 a 16, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 15 pg. 20. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 13 a 16, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 10 pg. 21. Utilização de acordo com qualquer um dos itens 13 a 16, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 5 pg. 22. Utilização de acordo com qualquer uma dos itens 12 a 21, em que a composição fabricada é uma formulação de vacina. 23. Formulação de vacina compreendendo uma composição de virossomas do virus da gripe compreendendo envelopes reconstituídos do referido virus, em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas do vírus de influenza, em que não se adiciona lípido de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados, em 8 que não se adiciona de forma separada à composição qualquer adjuvante e/ou estimulador imune, vacina essa que se caracteriza pela vacina ser desenhada para administração por via intranasal ou por inalação a um ser humano e em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por uma única administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 pg. 24. Formulação de vacina de acordo com qualquer o item 23, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 25 pg. 25. Formulação de vacina de acordo com qualquer o item 23, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 20 pg. 26. Formulação de vacina de acordo com qualquer o item 23, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 15 pg. 27. Formulação de vacina de acordo com qualquer o item 23, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 10 pg. 28. Formulação de vacina de acordo com qualquer o item 23, em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 5 pg. 9 29. Formulação de vacina de acordo com qualquer um dos itens 23 a 28, em que uma única administração intranasal ou por inalação da formulação é capaz de induzir no referido ser humano uma resposta imunitária compreendendo uma ou mais de uma resposta sistémica contra os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados, uma resposta imunitária local contra os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados, e uma resposta imunitária citotóxica mediada por linfócitos. 30. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 29, em que a resposta imunitária está de acordo com os critérios CHMP para a vacina da gripe. 31. Utilização de acordo com o item 30, em que a resposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, uma taxa de seroprotecção de > 40% para adultos e/ou > 30% para idosos, e um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou 2,0 vezes para idosos. 32. Um dispositivo para administração intranasal ou por inalação compreendendo uma formulação de vacina de acordo com qualquer um dos itens 23 a 31 e um mecanismo para a aerossolização da vacina. 33. Dispositivo de acordo com o item 32, em que o dispositivo contem uma quantidade de formulação de vacina para uma única administração intranasal ou por inalação. 10 34. Dispositivo de acordo com qualquer um dos itens 32 ou 33, em que o dispositivo é descartável.

Em particular, a presente invenção refere-se aos conceitos terapêuticos tais como apresentados nas reivindicações e sub-reivindicações.

Descrição da Invenção A presente invenção proporciona uma composição compreendendo virossomas de gripe para utilização na indução de uma resposta imunitária sistémica e/ou local de acordo com a reivindicação 1 e a utilização de uma composição compreendendo virossomas de gripe no fabrico de uma formulação de vacina de acordo com a reivindicação 6. Realizações preferidas para tal composição ou utilização são apresentadas nas reivindicações dependentes.

De um modo surpreendente, e em contradição com dados pré-clínicos em roedores e da literatura referente à experiência clínica humana, verificámos que a resposta imunitária em seres humanos após uma única vacinação intranasal com uma vacina contra a gripe inactivada que compreende envelopes do vírus da gripe reconstituídos estava de acordo com todos os três critérios do CHMP para a eficácia da vacina contra a gripe para o grupo etário dos 18-60 anos de idade. Uma única administração nasal é uma inoculação da formulação da vacina através de uma ou ambas as narinas sem a necessidade de uma repetição da administração da formulação da vacina de modo a satisfazer os critérios do CHMP acima mencionados quanto à imunogenicidade de uma vacina contra a gripe inactivada. Uma única administração de uma vacina (através de via nasal, por 11 inalação, por via oral, subcutânea ou intramuscular) de modo geral é um calendário de vacinação que não inclui administrações múltiplas da vacina que são separadas no tempo por dias ou semanas, conhecidas na técnica como inoculação e reforço. Uma formulação preparada como uma formulação intranasal ou por inalação compreende uma mistura de um ou mais componentes activos e excipientes preparados de tal modo a permitir a administração intranasal ou por inalação. A presente invenção proporciona um meio para a indução de uma resposta imunitária sistémica (imunoglobulinas circulantes ou células B produtoras de anticorpos) que está de acordo com os critérios do CHMP, de um modo vantajoso com uma única administração intranasal ou por inalação da vacina virossómica contra a gripe. A presente invenção também proporciona um meio para a indução de uma resposta imunitária local ou da mucosa, compreendendo um aumento nas imunoglobulinas secretoras conhecidas como IgA na superfície de membranas da mucosa, de um modo vantajoso com uma administração única intranasal ou por inalação da vacina virossómica contra a gripe. A indução de respostas de IgG e de IgA específicas após a administração intranasal envolve a actividade do tecido linfóide na cavidade nasal (Ref. 12). Um tal tecido é conhecido como tecido linfóide associado ao nariz (NALT) , e foi demonstrado também como sendo um local indutivo da mucosa para respostas imunitárias celulares (Ref. 13). Dado que se sabe que os virossomas apresentam o potencial para induzir respostas imunitárias celulares (Ref. 14, 15) , a presente invenção também proporciona um meio para induzir linfócitos citotóxicos específicos (CTL).

Os virossomas são bicamadas lipídicas contendo glicoproteínas virais. Os virossomas são, de um modo geral, produzidos 12 através da extracção de proteínas de membrana e de lípidos a partir de vírus com envelope com um detergente, seguida pela reconstituição de bicamadas específicas através da remoção do referido detergente. A presente invenção também proporciona uma composição de virossomas da gripe compreendendo envelopes virais da gripe reconstituídos (em particular reconstituídos sem a adição suplementar de lípidos e sem a adição de um imunomodulador de imunoestimulante (geralmente referido como um adjuvante)) para o uso da vacinação através de um aerossol que é administrado à mucosa da nasofaringe ou da orofaringe através de uma ou de ambas as narinas de modo a alcançar imunidade local e sistémica contra a gripe. Uma única administração através de inalação é também possível. Uma única administração através da mucosa oral é também possível. Os virossomas da gripe reconstituídos podem ser preparados a partir de um vírus inactivado, que pode ser solubilizado através de um detergente não dialisável, que é removido através de adsorção em esferas hidrofóbicas. A preparação pode compreender uma suspensão purificada de um ou mais antigénios da gripe, seleccionados a partir de hemaglutinina (HA) , neuraminidase (NA), um derivado de hemaglutinina, e um derivado de neuraminidase. As proteínas da membrana virai hemaglutinina e neuraminidase podem ser reconstituídas numa membrana composta de lípidos virais, contendo baixos níveis de endotoxina e de ovalbumina (vide Ref. 9). Os derivados de hemaglutinina e/ou neuraminidase são moléculas de hemaglutinina e/ou neuraminidase com sequências e/ou estruturas de aminoácidos modificadas. Os aminoácidos podem, por exemplo, ser deletados, alterados ou adicionados às sequências. Além disso, os padrões de glicosilação podem ser alterados. Os derivados mantêm a capacidade para induzir uma resposta imunitária quando introduzidos num hospedeiro. 13 0 vírus da gripe usado para preparar os virossomas reconstituídos pode ser desenvolvido, por exemplo, em ovos de galinha embrionados ou em cultura celular em células aderentes ou em células em suspensão. 0 vírus pode, por exemplo, ser um vírus nativo ou um vírus de estirpe reagrupada ou geneticamente modificada. 0 tipo de vírus pode ser, por exemplo, gualquer subtipo de gripe A ou B, incluindo as estirpes pandémicas. A presente invenção também proporciona vacinas. 0 termo vacina é entendido como sendo dirigido a uma preparação farmacêutica imunorreactiva. Em certas realizações, as vacinas podem compreender variantes inócuas ou derivados de microrganismos patogénicos que, por exemplo, estimulam o sistema imunitário, de modo a formar defesas contra o patogénio real. Em certas realizações, a vacina, por exemplo, induz a imunidade adaptativa quando administrada a um hospedeiro. Uma vacina pode conter uma forma morta ou atenuada de um patogénio ou um componente do patogénio, tal como um componente antigénico do patogénio. A preparação da vacina pode ainda conter um veículo farmacêutico, que pode ser desenhado para o modo particular através do qual se pretende administrar a vacina, tal como um veículo farmacêutico desenhado para a administração intranasal ou por inalação. Uma vacina contra a gripe pode compreender um ou mais antigénios de gripe não desnaturados, sendo um ou mais dos quais capaz de induzir uma resposta imunitária específica para a gripe.

A presente invenção proporciona uma composição que compreende virossomas de gripe que compreendem envelopes reconstituídos do referido vírus, em que a composição é desenhada como uma formulação para a administração intranasal ou por inalação. A 14 invenção também proporciona a referida composição na qual os virossomas compreendem os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos. A invenção também proporciona a referida composição em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas virais. A invenção também proporciona a referida composição em que nenhum lípido é adicionado a partir de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos. A invenção também proporciona a referida composição em que nenhum adjuvante separado e/ou estimulador imunitário é adicionado à composição. A invenção também proporciona a referida composição em que uma única administração intranasal ou por inalação da formulação a um paciente é capaz de induzir uma resposta imunitária sistémica. A invenção também proporciona a referida composição, em que a referida administração única intranasal ou por inalação da formulação a um paciente é capaz de induzir uma resposta imunitária local. A invenção também proporciona a referida composição em que a referida administração única intranasal ou por inalação da formulação a um paciente é também capaz de induzir uma resposta de linfócitos citotóxicos. A invenção também proporciona a referida composição em que a capacidade de induzir uma resposta imunitária sistémica e/ou uma resposta imunitária local e/ou uma resposta de linfócitos citotóxicos é apresentada num ser humano. A invenção também proporciona a referida composição em que a resposta imunitária compreende uma resposta imunitária dirigida contra os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos. Numa realização preferida, a invenção também proporciona a referida composição em que a resposta imunitária está de acordo com os critérios do CHMP para a vacina contra a gripe. A invenção também proporciona a 15 referida composição em que a resposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou de > 60% para idosos, uma taxa de seroconversão de > 40% para adultos e/ou de > 30% para idosos, e um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou > 2,0 vezes para idosos. Numa realização particularmente preferida, a invenção também proporciona a referida composição em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é igual a, ou mais baixa do que 30 pg. Finalmente, a invenção também proporciona a referida composição em que a composição é uma formulação de vacina que compreende um veiculo farmacêutico para a administração intranasal ou por inalação. A presente invenção proporciona ainda o uso de virossomas de gripe que compreendem envelopes reconstituídos do referido vírus para o fabrico de uma composição para a administração intranasal ou por inalação. A invenção também proporciona o referido uso no qual os virossomas de gripe compreendem os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos. A invenção também proporciona o referido uso em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas virais da gripe. A invenção também proporciona o referido uso, em que nenhum lípido é adicionado a partir de uma fonte externa aos virossomas de gripe na composição. A invenção também proporciona o referido uso em que nenhum adjuvante e/ou estimulador imunitário separado é adicionado à composição. A invenção também proporciona o referido uso em que uma administração intranasal ou por inalação da composição a um paciente é suficiente para a indução de uma resposta imunitária sistémica. A invenção também proporciona o referido uso em que a administração 16 única intranasal ou por inalação da composição também induz uma resposta imunitária local. A invenção também proporciona o referido uso em que a administração intranasal ou por inalação da composição também induz uma resposta de linfócitos citotóxicos. A invenção também proporciona o referido uso em que o paciente que recebe a administração é um ser humano. A invenção também proporciona o referido uso em que a composição induz uma resposta imunitária que compreende uma resposta imunitária dirigida contra os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos. Numa modalidade preferida, a invenção também proporciona o referido uso em que a composição induz uma resposta imunitária que está de acordo com os critérios do CHMP para a vacina contra a gripe. A invenção também proporciona o referido uso em que a reposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, uma taxa de seroconversão de > 40% para adultos e/ou > 30% para idosos e um aumento de médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou > 2,0 vezes para idosos. Numa modalidade particularmente preferida, a invenção também proporciona o referido uso em que a dose administrada de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é igual a ou inferior a 30 pg. Finalmente, a invenção também proporciona o referido uso em que a composição preparada é uma formulação de vacina.

Assim, numa realização, a presente invenção proporciona uma composição de virossomas de gripe, que compreende envelopes reconstituídos do referido vírus, em que os referidos envelopes virais são inteiramente derivados de partículas virais de gripe, em que nenhum lípido é adicionado a partir 17 de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos, em que nenhum adjuvante e/ou estimulador imunitário separado é adicionado à composição e em que a composição é desenhada como uma formulação para a administração intranasal ou por inalação, cuja composição é caracterizada por uma única administração intranasal ou por inalação da referida formulação a um ser humano ser capaz de induzir uma resposta imunitária local e/ou sistémica contra os referidos antigénios de gripe, cuja resposta sistémica está de acordo com os critérios do CHMP para a vacina contra a gripe, e em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 pg.

De acordo com outra realização, a presente invenção proporciona o uso de virossomas de gripe compreendendo envelopes reconstituídos do referido vírus, para o fabrico de uma composição para a administração intranasal ou por inalação, em que os envelopes virais são inteiramente derivados de partículas virais de gripe, em que nenhum lípido é adicionado a partir de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos, e em que nenhum adjuvante e/ou estimulador imunitário separado é adicionado à composição, cujo uso dos referidos virossomas de gripe para o fabrico de uma composição para a administração intranasal ou por inalação é caracterizado por uma única administração intranasal ou por inalação única da composição a um ser humano ser suficiente para a indução de uma resposta imunitária local e/ou sistémica contra os referidos antigénios de gripe, cuja resposta está de acordo com os 18 critérios do CHMP para vacinas contra a gripe, e em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 gg.

De acordo com outra realização, a presente invenção proporciona uma formulação de vacina que compreende uma composição de virossomas de gripe que compreende envelopes reconstituídos do referido vírus, em que os envelopes virais são inteiramente derivados a partir de partículas virais de gripe, em que nenhum lípido é adicionado a partir de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, em que os virossomas compreendem os antigénios de gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou derivados dos mesmos, em que nenhum adjuvante separado e/ou estimulador imunitário é adicionado à composição, cuja vacina é caracterizada pela vacina ser desenhada para uma única administração intranasal ou por inalação a um ser humano e em que a dose de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação é inferior ou igual a 30 gg. De um modo vantajoso, a referida administração única intranasal ou por inalação da formulação é capaz de induzir uma resposta imunitária sistémica e/ou local no referido ser humano. De acordo com a presente invenção, também se proporciona um dispositivo que compreende uma quantidade da referida formulação de vacina para uma administração intranasal ou por inalação. A dose aplicada de acordo com a presente invenção de hemaglutinina por estirpe virai por administração intranasal ou por inalação pode também ser inferior ou igual a 25 gg, 20 gg, 10 gg ou 5 gg.

Literatura citada (1) Maassab HF. Adaptation and growth characteristics of infleunza virus at 25°C, Nature 213, 612 - 14 (1967). 19 (2) Maassab HF, Bryant ML. The development of live Attenuated cold-adapted influenza vírus vaccine for humans. Ver. Med. Virol. 1999, Out-Dez; 9 (4): 237-44 (3) Keitel W., Piedra PA, Live cold- adapted, reassortant in influenza vaccines (USA). Em: Textbook of Influenza.

Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ (Ed.), Blackwel Science Oxford, Reino Unido, 373- 390 (1998). (4) Gluck U, Gebbers JO, Gluck R, Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccina with and without Escherichia coli heat- labile toxin in adult volunteers. J. Virol., 1999, Set. ; 73 (9): 7780 - 6. (5) Samdal HH, Bakke H., Oftung F., Holst J. , Haugen IL, Korsvold GE, Kristoffersen AC, Krogh G., Nord K., Rappuoli R., Berstad AKH, Haneberg B., A non-Living Nasal Influenza Vaccine Can Induce Major Humoral and Cellular Immune Responses in Humans without the Need for Adjuvants. Human Vaccines 1: 2, 85-90; Março/Abril, 2005. (6) Mutsch M., Zhou W., Rhodes P., Bopp M. Chen RT, Liner T.,

Spyr C., Steffen R. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Βθΐΐ'ε palsy in

Switzerland. N. Engl. J. Med. 2004, Fev. 26; 350 (9) : 896 - 903 . (7) Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines. EMEA/CpMP/BWP/21496. (8) Daubeney, P. Taylor, C. J., MacGraw, J. Brown, E. M. Ghosal, S., Keeton, B. R., Palache, B. Kerstens, R. Immunogenicity and tolerability of a trivalent influenza subunit vaccine (Influvac®) in high-risk children aged 6 months to 4 years. BVCP , 1997, Março, 51 (2): 87-90. (9) Stegmann, T. Morselt, H. W. M., Booy, F. P. Van Breemen, J. F. L., Scherphof, G., Wilschut, J. Functional reconstitution of influenza viris envelopes. EMBO Journal 20 1987, 6 (9) : 2651 -2659. (10) Treanor J. Nolan C., O' Brien D., Burt D., Lowell G. , Linden J., Fries L. Intranasal administration of a proteosome-influenza vaccine is well-tolerated and induces serum and nasal secretion influenza antibodies in healthy human subjetcs. Vaccine 2006; 24 (3): 254- 62. (11) Read R. C., Naylor S. C., Potter C. W., Bond J., Jabbal-

Gill I., Fischer A., Illum L., Jennnings R., Effective nasal infleunza vaccine delivery using chitosan. Vaccine 2005; 23 (35): 4367 - 74. (12) Kuper CF., Koornstra PJ, Hameleers DM., Biewenga J., Spit BJ., Duijvestein AM., van Breda Vriesman PJ., Sminia T. The role of nasopharyngeal Lymphoid tissue Immmunol. Today, 1991, 13: 219 - 24 . (13) Zuercher AW, Coffin SE, Thurnheer MC, Fundova P., Cebra JJ. Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses. J. Immunol. 2002, 168 : 1796-803. (14) Huckriede A., Bungener L., Stegmann T., Daeman T., Medema J., Palache AM., Wilschut J. The virosome concept for influenza vaccines. Vaccine 2005, 23 (Supl. 1): S 26- 38. (15) Gluck R., Burri KG., Metcalfe I. Adjuvant and antigen delivery properties of virosomes. Curr. Drug Deliv. 2005- 2: 395 - 400. EXEMPLOS EXEMPLO 1 VACINA DE LPP-VIROSSÓMICA EM RATINHOS BALB/C DE 8 SEMANAS DE IDADE; COMPARAÇÃO INTRANASAL DE VÁRIAS RAZÕES DE HA/LPP EM NÍVEIS DE DOSE DE HA SUB-ÓPTIMOS.

Grupos de 10 ratinhos Balb/c seronegativos para a gripe 21 receberam a vacina LPP (lipopéptido) - virossómica através de administração intranasal, em razões de HA/LPP de 1:1,5, 1:0,7, 1:0,4, 1:0 (isto é, sem LPP) e com 2 pg de HA por dose. Além disso, um grupo de controlo de 10 ratinhos fêmea recebeu 0 pg de HA/dose (administração intranasal de veiculo).

Foram preparadas quatro preparações de virossomas contendo LPP. Em resumo, o vírus da gripe inactivado numa solução de 30-40% de sacarose foi sedimentado através de centrifugação. O vírus foi ressuspendido e solubilizado num tampão contendo o detergente éter monododecílico de octaetileno glicol (OEG). Subsequentemente, a nucleocápside virai foi removida através de ultracentrifugação. 0 sobrenadante contendo OEG foi dividido em 4 volumes iguais e foram adicionadas quantidades diferentes do lipopéptido P3CSK4 em tampão contendo OEG (P3CSK4: N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]- [R]-cisteninil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina). O volume foi ajustado com um tampão contendo OEG. O OEG foi removido através de adsorção numa resina hidrofóbica. Isto resultou na formação de virossomas contendo LPP, vesículas virais reconstituídas contendo HA e NA nas suas membranas e (opcionalmente) LPP nas suas membranas. Após a remoção de OEG, os virossomas foram filtrados através de uma membrana de PVDF com um tamanho de poro de 0,22 pm. O material de partida foi 20 mg de HA de gripe A/Wyoming/3/2003 X-147 (A/Fujian/411/200, estirpe do tipo (H3N2)), contendo 252 U.I. de endotoxina/100 pg de HA. Após solubilização, foram preparados 4 lotes como descrito na Tabela 1. 22

Tabela 1: Preparação de virossomas

Lote Quantidade de HA como o material de partida (mg) Quantidade de P3CSK4 adicionada (mg) Razão de HA/LPP VIR-2 0 0 4-11 5 7,5 1:1,5 VIR-2004-12 5 3,5 0 1 1 VIR-2 0 0 4-13 5 2,0 1:0,4 VIR-2 0 0 4-14 5 0 1: 0 0 veículo foi composto por Hepes a 5 mM, NaCl a 145 mM, EDTA a 1 mM (pH 7,4). Para o grupo E (vide Tabela 2) o veículo foi filtrado através de uma membrana de PVDF com um tamanho de poro de 0,22 pm. Os 4 lotes de virossomas preparados foram diluídos a uma concentração de 200 pg/ml para imunização intranasal e de 67 pg/ml para imunização intramuscular, e fraccionados em alíquotas em frascos de 1 ml (2 por grupo), conforme indicado na Tabela 2. Estes grupos de vacinas foram usados conforme descrito na Tabela 4.

Tabela 2: Preparação de vacinas

Grupo Na Preparação A VIR-2 0 04-11 B VIR-2004-12 C VIR-2 0 0 4-13 D VIR-2 0 0 4-14 E Veículo* * Veículo: Hepes 5 mM, NaCl 145 mM, EDTA 1 mM (pH 7,4), filtrado através de uma membrana de PVDF com um tamanho de poro de 0,22 pm. 23

Análise da formulação

As formulações para este estudo foram analisadas relativamente a várias variáveis, tal como indicado na Tabela 3.

Tabela 3: Dados analíticos sobre os virossomas usados para a preparação das vacinas

Analito VIR-2004-11 VIR-2004-12 VIR-2004-13 VIR-2004-14 Proteína (mg/ml)a 1,7 1,6 1,5 1,4 HA (pg/ml)b 776 759 697 757 Fosfolípido (mmol/ l)c 0,658 0,692 0, 658 0,682 Endotoxina (U.I. por 100 pg HA)d 3,1 1,5 1,9 0 1 1 Ovalbumina (pg por 100 pg HA)e 0,047 0,050 0,055 0, 050 Pureza1 Principalmente HA Principalmente HA Principalmente HA Principalmente HA a Método de Lowry, princípio: as proteínas formam uma cor azul após o tratamento com sulfato de cobre alcalino e reagente fenol de Folin-Ciocalteu. 0 conteúdo de proteína é determinado a partir da absorvância a 750 nm, usando o padrão albumina BSA como referência. Lowry, OH, NJ, Rosebrough, AI Farr, e RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951. Oostra, GM, NS Mathewson, e GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology, 182: 50-69 (1990). Hartree, EF. Anal. Biochem 48 : 422- 427 (1972) . b PhEur: monografia 2053 e secção 2.7.1. c Princípio: Cada fosfolípido contém um único átomo de fósforo que pode ser usado para a quantificação dos fosfolípidos. Os fosfolípidos são destruídos pelo ácido perclórico e o fosfato gerado é complexado pelo molibdato que é reduzido pelo ácido ascórbico, de modo a resultar num produto colorido azul. A cor é determinada usando um espectrofotómetro a 812 nm. A quantidade de fosfolípido numa amostra é quantificada pela inclusão de um calibrador de fosfato. Armes BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases. Meth. Enzymol. 1966; 8: 115 - 118. Bõttcher CJF, van Gent CM & Pries C., A rapid and sensitive sub-micro phosphorus determination. Anal. Chim. Acta. 1961; 24: 203-204. d Ph.Eur. 2.6.14 e O teste ELISA de Ovalbumina é um imunoensaio enzimático directo em sanduíche usando anticorpos policlonais anti-ovalbumina imobilizados para a captura e o conjugado anti-ovalbumina-HRP como sistema de detecção. O conjugado e as amostras são incubados em simultâneo. Os componentes não ligados são removidos através de um passo de lavagem. O substrato (TMB e H202) é adicionado aos poços. A presença de um conjugado especificamente ligado nos poços é indicada pelo desenvolvimento de uma cor azul. Adiciona-se ácido sulfúrico ao substrato de modo a interromper a reacção e que resulta numa alteração de cor no produto para amarelo. As absorvâncias (DO) são lidas a 450 nm. Para resultados óptimos é usado um filtro de referência a 620 nm. Uma curva de calibração é criada a partir da resposta dos padrões de ovalbumina (0,3 -20,0 ng/ml) incluídos no ensaio. As concentrações das amostras desconhecidas podem ser interpoladas a partir da curva de calibração. f De acordo com as monografias 0869 e 2053: A pureza da recolha monovalente é examinada através de electroforese em gel de poliacrilamida. Electroforese: de acordo com a Ph. Eur.2.2.31. 25

Sistema de Teste

Animais de Teste:

Foram usados sete grupos de dez ratinhos fêmea Balb/c (BALB/cAnNCrl) cada.

No início do tratamento, os ratinhos tinham 8-9 semanas de idade e pesavam 17-19 g.

Os animais foram vacinados por via intranasal nos dias 0 e 14 com vacina contra a gripe virossómica de LPP monovalente (A/Wyoming) e autopsiados 21 dias após a segunda vacinação.

Intranasal: as substâncias de teste foram inoculadas por via intranasal (10 μΐ divididos por ambas as narinas) sob ligeira anestesia de isoflurano/02/N20 com o animal em posição dorsal.

Tabela 4: Programa de Tratamento

Grupo N° Via de administração Formulação da vacina N° de fêmeas Animal N 0 A Intranasal 2 pg HA, relação de HA/LPP 1:1,5 10 01-10 B Intranasal 2 pg HA, relação de HA/LPP 1:0,7 10 11-20 C Intranasal 2 pg HA, relação de HA/LPP 1:0,4 10 21-30 D Intranasal 2 pg HA, relação de HA/LPP 1:0 10 31-40 E Intranasal 2 pg HA, relação de HA/LPP 0:0 10 41-50 26

Antes da primeira vacinação e 14 dias após a primeira vacinação, recolheram-se amostras de sangue orbitário sob anestesia de isoflurano/02/N20. No dia 35, os animais foram sacrificados e recolheram-se amostras de sangue (exsanguinação sob anestesia com 02/C02 através da aorta abdominal ou de punção cardíaca). Recolheu-se soro de todas as amostras, congelou-se, e armazenou-se em tubos de polipropileno a < -10°C até processamento. 0 vírus da gripe aglutina os glóbulos vermelhos (RBCs), que é bloqueado na presença quantidade suficiente de anticorpo especifico para o virus. Este fenómeno proporciona a base para o ensaio de inibição de hemaglutinação (Hl) que é usado para detectar e quantificar anticorpos antivirais específicas no soro. Os soros foram adicionados ao vírus de influenza e a RBCs de peru. Várias diluições foram testadas (titulação). 0 título de Hl é definido como o recíproco da diluição mais elevada que ainda inibe a hemaglutinação. As Médias Geométricas dos Títulos (GMT) foram calculadas como se segue: 1) calcular os log(título)s individuais como a média aritmética dos dois duplicados: [log(títuloi)+[log (título2) ] /2 2) calcular a média aritmética dos log(título)s individuais 3) GMT(grUp0) = 10 EXP (média do grupo dos log (título) s)

Estatística

Os títulos de Hl foram resumidos por grupo de vacinação e dia, usando médias geométricas dos títulos. As transformações logarítmicas dos títulos de Hl do dia 35 dos grupos foram analisadas por meio de regressão linear, de modo a investigar 27 a relaçao de dose-resposta entre a quantidade de LPP na vacina e as GMTs.

Resultados

Análise dos títulos de Hl

As GMTs são apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5 Médias Geométricas dos Títulos

Grupo Via de administração Razão de HA/LPP Dia 0 Dia 14 Dia 35 A Intranasal 1:1,5 5 8 415 B Intranasal 1:0,7 5 6 161 C Intranasal 1:0,4 5 7 97 D Intranasal 1: 0 5 7 12 E Intranasal O O 5 5 5

No dia 0, não puderam ser detectados anticorpos específicos para HA nos ratinhos (isto é, todos os títulos de Hl < 10) . No dia 14, não puderam ser detectados anticorpos específicos para HA na maioria dos ratinhos vacinados por via intranasal (i.n.). Todas as titulações de Hl foram < 10, excepto para um ratinho no grupo A (título de Hl: 80), um ratinho no grupo C (titulo de Hl: 35) e um ratinho no grupo D (título de Hl: 160) .

No dia 35, foi observada uma dose-resposta na geração de anticorpos específicos para HA, isto é, a adição de mais LPP à vacina conduziu a títulos de anticorpo mais elevados. 28

As transformações logarítmicas dos títulos de Hl no dia 35 foram comparadas entre os grupos por meio de regressão linear. 0 declive da regressão ajustada teve uma significância elevada (P<0,0001). Deste modo, a relação observada de dose-resposta entre a quantidade de LPP na vacina e as GMTs foi estatisticamente significativa.

Conclusão: A vacinação intranasal repetida de ratinhos com os virossomas de gripe reconstituídos sem adjuvante não induziu uma reposta imunitária sistémica mensurável. A vacinação intranasal repetida usando virossomas de gripe reconstituídos com adição do adjuvante LPP no mesmo nível de dose de HA (2 pg HA/dose) e com uma dose crescente de LPP apresentou uma resposta imunitária sistémica de um modo dependente da dose de LPP. Em franco contraste com a presente invenção (vide Exemplo 2 abaixo), estes dados foram previamente considerados como sustentando a opinião de consenso na técnica de que o uso de um imunoestimulante (neste caso LPP) é essencial para a vacinação intranasal com a vacina contra a gripe inactivada, mesmo se o antigénio da gripe (HA) estiver presente num virossoma reconstituído. EXEMPLO 2 UM ESTUDO EM GRUPOS PARALELOS, ALEATÓRIO, COM DUPLA OCULTAÇÃO PARA INVESTIGAR A SEGURANÇA DO ADJUVANTE DE LIPOPÉPTIDO E 0 SEU EFEITO SOBRE A EFICÁCIA DE UMA VACINA VIROSSÓMICA SUBUNITÁRIA CONTRA 0 VÍRUS DA GRIPE APÓS ADIMINISTRAÇÃO NASAL EM ADULTOS JOVENS SAUDÁVEIS, COM IDADE > 18 E < 40 ANOS. 29

Voluntários humanos saudáveis foram vacinados por via intranasal com virossomas de gripe reconstituídos, com a adição do adjuvante LPP (lipopéptido) com um volume de dose de 0,2 ml (0,1 ml por narina) contendo 150 mcg HA/ml por estirpe e 315 mcg LPP/ml. Um grupo similar foi vacinado por via intranasal com virossomas de gripe reconstituídos, sem LPP, com um volume de dose de 0,2 ml (0,1 ml por narina) contendo 150 mcg de HA/ml por narina. 0 objectivo do estudo foi confirmar no homem a prova de conceito tal como foi demonstrada em ratinhos, que a obtenção de uma resposta imunitária sistémica satisfatória após a vacinação intranasal com uma vacina contra a gripe inactivada requer o uso de um adjuvante (por exemplo, LPP).

Desenho do Estudo:

Este foi um estudo de grupos paralelos, aleatório, com dupla ocultação, em pacientes jovens saudáveis com idade > 18 e < 40 anos. 0 estudo foi executado num centro de estudos: Swiss Pharma Contract Ltd., Basileia, Suíça. 0 investigador principal foi o Dr. M. Seiberling. 0 estudo teve duas partes. Na Parte I, a segurança da vacina virossómica subunitária contra a gripe com adição do adjuvante LPP foi avaliada em 12 indivíduos. Nove indivíduos foram vacinados com LPP-RVM (membranas virais reconstituídas com LPP; Vacina contra a gripe - antigénio superficial, inactivada, virossómica, com o adjuvante LPP) e três indivíduos com RVM (Vacina contra a gripe - antigénio superficial, inactivada, virossómica). Na Parte II do estudo, a eficácia e a segurança de LPP-RVM foi avaliada numa centena de indivíduos (50 por grupo). O estudo foi efectuado em indivíduos saudáveis. Além disso, os indivíduos que participaram na Parte II do estudo não 30 foram vacinados contra a gripe durante os três anos anteriores ao inicio do estudo. Isto aumenta a homogeneidade da população de estudo na Parte II através da minimização do número de indivíduos com anticorpos previamente existentes contra a gripe.

Parte I:

Durante os 14 dias anteriores à vacinação (Visita 1), após o indivíduo ter dado o seu consentimento informado, ele ou ela foi seleccionado quanto a critérios de inclusão e exclusão e foi submetido a um exame físico. Nesta visita, foi colhida uma amostra de células epiteliais nasais para a citologia e a actividade basal ciliar foi medida com o teste de sacarina.

Na Visita 2 (Dia 1) uma amostra de 4-6 ml de sangue foi tomada para a análise hematológica convencional, uma amostra de sangue de 6-10 ml foi tomada para a análise bioquímica convencional e os sinais vitais foram avaliados. Após a distribuição aleatória, o indivíduo foi vacinado com uma das duas formulações de vacina e permaneceu no local durante as primeiras vinte e quatro horas após a vacinação de modo a monitorizar as reacções locais e sistémicas e os efeitos adversos. Os sinais vitais foram avaliados quatro e vinte e quatro horas após a vacinação. Além disso, após vinte e quatro horas, duas amostras de sangue foram tomadas para análise hematológica (4-6 ml) e bioquímica (6 - 10 ml) convencionais; uma amostra das células epiteliais nasais foi recolhida para citologia e a actividade ciliar após vacinação foi medida com o teste de sacarina. Foi fornecido aos pacientes um questionário (Questionário I) para levarem para casa de modo a avaliar as reacções locais e sistémicas no dia 31 seguinte (Dia 3). 0 indivíduo teve de regressar ao local de estudo dois dias após a sua liberação: Visita 3 (Dia 4). Nesta visita, as reacções locais e sistémicas foram avaliadas e quaisquer efeitos adversos espontâneos que tivessem ocorrido entre a visita precedente e a visita presente foram registados. Além disso, duas amostras de sangue foram tomadas para análise hematológica (4-6 ml) e bioquímica (6 - 10 ml) convencionais e os sinais vitais foram avaliados.

Os indivíduos regressaram ao local de estudo duas semanas após a primeira vacinação no Dia 15 (Visita 4). Nesta visita, uma amostra das células epiteliais nasais foi recolhida para citologia, a actividade ciliar foi medida com o teste de sacarina e os efeitos adversos que houvessem ocorrido entre a Visita 3 e a Visita 4 foram registados.

Parte II:

Durante os 14 dias anteriores à primeira amostragem de sangue e lavagem nasal (Visita 1), após o indivíduo ter fornecido o seu consentimento informado, ele ou ela foi seleccionado quanto aos critérios de inclusão e de exclusão e a saúde dele ou dela foi verificada através de exame físico.

Na Visita 2 (Dia -1; esta visita pode ser combinada com a Visita 1), uma amostra de sangue de 6 a 10 ml foi tomada para a determinação do título basal da Inibição de Hemaglutinação (Hl) e foram tomadas amostras de sangue para análises hematológicas (4 - 6 ml) e bioquímicas (6 - 10 ml) convencionais. Uma amostra da lavagem nasal foi recolhida 32 para a administração do titulo basal do anticorpo IgA nasal.

No dia seguinte, na Visita 3 (Dia 1) após a avaliação dos sinais vitais, o indivíduo foi distribuído de um modo aleatório, de modo a ser vacinado com uma dose única de uma das duas formulações da vacina nasal contra a gripe. Quaisquer reacções locais imediatas, reacções sistémicas e eventos adversos foram monitorizados no local durante a primeira hora após a vacinação. Depois disto, os sinais vitais foram novamente avaliados e o indivíduo recebeu um questionário para levar para casa, de modo a registar diariamente as reacções locais e sistémicas durante os primeiros sete dias após a vacinação.

Duas semanas depois (Visita 4; Dia 15), uma amostra de sangue de 6 - 10 ml foi tomada para a determinação do titulo de Hl, duas amostras de sangue adicionais foram tomadas para análises hematológica (4-6 ml) e bioquímica (6 - 10 ml) convencionais, uma amostra da lavagem nasal foi tomada para determinação do título do anticorpo IgA nasal.

Avaliação de Eficácia

De modo a avaliar a eficácia, recolheram-se amostras de sangue e amostras de lavagem nasal foram no Dia -1 (basal) e no Dia 15.

Amostras de Sangue

Recolheram-se seis a dez ml de sangue para determinar o titulo do anticorpo de Inibição de Hemaglutinação (Hl).1 Após a recolha e a coagulação do sangue (pelo menos 30 minutos à 33 temperatura ambiente) os soros foram separados e mantidos congelados (-20°C) até à titulação. As titulações de anticorpo foram efectuadas em duplicado. 0 titulo atribuído a uma amostra foi a média geométrica das duas determinações. Os soros de pré- e pós- vacinação foram titulados em simultâneo. Palmer DF, Dowdle WR, Coleman MT, Schild GC. Hemagglutination Inhibition Test. Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis. U.S. Dept. Hlth. Ed. Welfare, P.H.S. Atlanta; 1975 :25-62.

Amostras de lavagem nasal

Para a recolha de amostras da lavagem nasal, 6 ml de solução salina previamente aquecida (37°C) foram aplicados sob controlo rinoscópico numa narina. Foi pedido ao indivíduo que inclinasse a sua cabeça num ângulo de 60° de modo que o fluido de lavagem pudesse fluir. A lavagem recolhida foi aplicada à segunda narina que foi lavada sob as mesmas condições. Foi adicionada às amostras uma solução conservante (1/100 de volume da amostra). A solução conservante continha 10 mg/ml de albumina de soro bovino dissolvidos em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8. As amostras foram clarificadas directamente através de centrifugação a baixa velocidade (10 minutos a 800xg) e fraccionadas em alíquotas (de modo a evitar o posterior descongelamento repetido das amostras) e colocadas em gelo seco antes de sua transferência a -80°C.

Os níveis de IgA nas amostras de lavagem nasal foram determinados através de ELISA e analisados estatisticamente com o teste Wilcoxon. A vacina contra a gripe foi usada como o antigénio de revestimento em placas de 96 poços. Os sítios de ligação não-específica foram bloqueados através de 34 incubação com um tampão de bloqueio. As lavagens nasais foram aplicados em diluições de duas vezes (doze diluições por amostra) em tampão de bloqueio para a absorção dos anticorpos específicos para a gripe aos antigénios na placa de 96 poços. As placas de 96 poços foram lavadas antes da incubação com anticorpos anti-humano conjugados com enzima (peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina conjugada). Os anticorpos anti-humano não ligados foram removidos através de lavagem e a quantidade anticorpo específico para a estirpe de gripe foi determinada através da medição da densidade óptica após a adição do substrato para a reacção enzimática.

Formulação de Vacina

Duas formulações diferentes de vacina contra a gripe foram usadas neste estudo. Ambas as formulações continham os antigénios virais conforme recomendado pela OMS para o hemisfério sul para o ano de 2005 a um nível de dose de 30 mcg por estirpe por dose de 0,2 ml. - estirpe do tipo A/New Caledonia/20/99 (H1N1) - estirpe do tipo A/Wellington/1/2004 (H3N2) - estirpe do tipo B/Shangai/361/2002 2 OMS. Composição recomendada de vacinas de vírus da gripe para uso na temporada de gripe de 2005. Weekly Epidem Rec. 2004; 79:369-376

Em resumo, o vírus da gripe inactivado numa solução de sacarose a 30-40% foi sedimentado por centrifugação. O vírus foi ressuspendido e solubilizado num tampão contendo o detergente éter monododecílico de octaetileno glicol (OEG). 35

Subsequentemente, a nucleocápside virai foi removida por ultracentrifugação. 0 sobrenadante contendo OEG foi ajustado com o lipopéptido P3CSK4 em tampão contendo OEG ou tampão contendo OEG apenas no caso de membranas virais reconstituídas isentas de LPP (P3CSK4: N- palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-[R]-cisteinil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina) . 0 OEG foi removido através de adsorção numa resina hidrofóbica. Isto resultou na formação de membranas virais reconstituídas, contendo LPP ou isentas de LPP (vesículas virais reconstituídas com HA e NA nas suas membranas, e opcionalmente, LPP nas suas membranas). Após a remoção de OEG, os virossomas foram filtrados através de uma membrana PVDF com um tamanho de poro de 0,22 μτη.

Para cada estirpe de vírus foi produzida uma preparação separada com ou sem LPP (Tabela 6). As quantidades de LPP adicionadas corresponderam à razão de HA/LPP de 1:0,7 (p/ p).

Tabela 6 : Preparação de virossomas

Lote LPP Estirpe do Virus VIR-2005-09 Presente Vírus de Gripe B/Jiangsu/10/2003 VIR-2005-11 Presente Virus de Gripe A/New Caledonia/20/1999 IVR -116 reagrupada VIR-2005-13 Presente Vírus de Gripe A/Wellington/1/ 2004 IVR -139 reagrupada VIR-2005-10 Ausente Virus de Gripe B/Jiangsu/10/2003 VIR-2005-12 Ausente Vírus de Gripe A/New Caledónia/20/1999 IVR - 116 reagrupada VIR-2005-14 Ausente Vírus de Gripe A/Wellington 1/2004 IVR -139 Reagrupada 36

Tabela 7: Análise da formulação

Analito VIR- 2005-9 VIR- 2005-10 VIR- 2005-11 VIR- 2005-12 VIR-2005-13 VIR- 2005-14 Proteína (mg/ml)a 1,51 1,54 1,86 1,83 1,37 1,18 HA (μς/ ml)b 805 854 711 784 704 644 Fosfolípido (mmo1/1)c 0, 494 0,563 0,820 1,03 0, 717 0,695 Endotoxina (U.I. por 100 pg HA)d <0,4 <0,4 <0,4 <0,4 <0, 4 <0,5 Ovalbumina (pg por 100 pg de HA)e 0,068 0,088 0,037 0,036 0,132 0,126 Pureza1 Princi- Princi- Princi- Princi- Princi- Princi- palmente palmente palmente palmente palmente palmente HA HA HA HA HA HA a Método de Lowry, princípio: As proteínas formam uma cor azul após o tratamento com sulfato de cobre alcalino e reagente fenol de Folin-Ciocalteu. 0 conteúdo em proteína é determinado a partir da absorvância a 750 nm, usando o padrão de BSA de albumina como referência. Lowry, OH, NJ Rosebrough, AL Farr, e RJ Randall. J. Biol. Chem., 193: 265. 1951. Oostra, GM, NS Mathewson, e GN Catravas. Anal. Biochem., 89: 31. 1978. Stoschek, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology , 182: 50-69 (1990). Hartree, EF. Anal. Biochem, 48 : 422 - 427 (1972). bPhEur: monografia 2053 e secção 2.7.1. c Princípio: cada fosfolípido contém um único átomo de fósforo, que pode ser usado para a quantificação dos fosfolípidos. Os fosfolípidos são destruídos pelo ácido perclórico e o fosfato gerado é complexado pelo molibdato que é reduzido pelo ácido ascórbico de modo a resultar num produto colorido azul. A cor é determinada com um espectrofotómetro a 812 nm. A quantidade de fosfolípido numa amostra é quantificada pela inclusão de um calibrador de fosfato. Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases. Meth. Enzymol. 1966; 8: 115-118. Bõttcher CJF, van Gent CM & Pries C. A rapid and sensitive sub-micro phosphorous determination. Anal. Chim. Acta, 1961; 24: 203-204. 37 d Ph. Eur. 2.6.14 e O ELISA de Ovalbumina é um imunoensaio de enzima em sanduíche directo usando anticorpos policlonais anti-ovalbumina imobilizados para a captura e conjugado anti-ovalbumina-HRP como sistema de detecção. 0 conjugado e as amostras são incubados em simultâneo. Os componentes não ligados são removidos através de um passo de lavagem. 0 substrato (TMB e H202) é adicionado aos poços. A presença de um conjugado especificamente ligado nos poços é indicada pelo desenvolvimento de uma cor azul. Adiciona-se ácido sulfúrico ao substrato de modo a interromper a reacção, o que resulta em uma alteração de cor no produto para amarelo. As absorvâncias (DO) são lidas a 450 nm. Para resultados óptimos, um filtro de referência a 620 nm é usado. Uma curva calibração é criada a partir da resposta dos padrões de ovalbumina (0,3 - 20,0 ng/ml) incluídos no ensaio. As concentrações de amostras desconhecidas podem ser interpoladas a partir da curva de calibração. f De acordo com as monografias 0869 e 2053: A pureza da recolha monovalente é examinada através de electroforese em gel de poliacrilamida. Electroforese: de acordo com a Ph. Eur. 2.2.31.

Eficácia

Por estirpe virai, compararam-se transformações logarítmicas dos títulos de anticorpo Hl ao Dia 15 e dos títulos nasais de anticorpo IgA no Dia 15 entre os dois grupos de vacinação através do teste de soma das ordens de Wilcoxon, no nível de significância bilateral de 0,05.

Os títulos do anticorpo Hl no dia 15 foram também analisados através do cálculo dos três parâmetros que se seguem por estirpe virai e por grupo de vacinação: - a taxa de seroprotecção, com seroprotecção definida como um título de Hl > 40 - a taxa de seroconversão, com seroconversão definida como 38 um título de Hl de pré-vacinação < 10 e um título de Hl de pós-vacinação > 40 ou um título de Hl de pré-vacinação > 10 e um título de Hl de pós-vacinação de pelo menos 4 vezes — o aumento de vezes médio, isto é, a média geométrica do aumento de vezes no título de Hl.

Os dados de eficácia são analisados tanto de acordo com o princípio por protocolo como o de intenção de tratamento. No entanto, dado que este é um estudo denominado como de prova-de-conceito, a análise por protocolo foi considerada como sendo a principal. A amostra relativamente à intenção de tratamento foi constituída pelos indivíduos vacinados com alguns dados de eficácia de pós-vacinação. A amostra relativamente ao protocolo foi constituída pelos indivíduos vacinados que completaram o protocolo e para os quais não ocorreram violações de protocolo importantes. As violações importantes incluíram (dentre outras): a violação dos critérios de inclusão ou de exclusão e o uso de medicação proibida. Além disso, os indivíduos com infecção recorrente de gripe confirmada por laboratório e os indivíduos que careciam de dados de eficácia primários foram também excluídos da amostra por protocolo. A decisão de se um indivíduo deveria ser excluído ou não da amostra por protocolo foi tomada antes que a base de dados de estudo fosse revelada.

Resultados 39

Tabela 8

Avaliação de CHMP da resposta imunitária humoral após a vacinação nasal com a Vacina de Contra Gripe Virossómica (RVM)

Taxas de Seroprotecção

Tipo A (H3N2) Tipo A (H1N1) Tipo B Dados LPP-RVM RVM LPP-RVM RVM LPP-RVM RVM Estatísticos (N= 48) (N= 43) (N= 48) (N= 43) (N= 48) (N= 43) Pós-Vacinação (Dia 15) ο

Seroprotecção

Sim n(%) 48 (100 %) 42 (97, 7 1)41 (85,4 38 (88, 4 1)35 (72,9 %) 35 (81,4¾) Não n(%) 0 1 (2,3 I) 7 14,6 I) 5 (11,6 I) 13 (27,1 I) 8 (18,6 I)

Total n 48 43 48 43 48 43 Seroconversão Sim n(%) 37 (77,1¾) 25 (58,11) 25 (52,1¾) 33 (76,71) 24 (50,0¾) 22 (51,2¾) Não n(%) 11 (22,9¾) 18 (41,9¾) 23 (47,9¾) 10 (23,3¾) 24 (50,0¾) 21 (48,8¾) Total n 48 43 48 43 48 43 Aumento Médio de Vezes n 48 43 48 43 48 43 Média*12, 8,5 4,7 10 3,6 4,5

Nota: * Média Geométrica. RVM: Vacina contra a Gripe Virossómica LPP-RVM: Vacina contra a Gripe Virossómica Adjuvada com o Liopéptido

Tabela 9 Títulos de IgA em lavagens nasais (GMT) H3N2 H1N1 B LPP— RVM N=48 RVM N=43 LPP-RVM N=48 RVM N=43 LPP—RVM N=48 RVM N=43 Dia 1 93,88 96,45 80, 93 85, 97 65,84 55,21 Dia 15 104,51 126,96 89,16 96, 94 87,93 102,10

Conclusão

De um modo inesperado e em contradição com os dados pré-clínicos obtidos com o mesmo lote de vacina (Exemplo I) e conforme descrito em WO 04/110486 e dados clínicos (Gluck U, Gebbers JO, Gluck R, Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult volunteers. J. Virol. 1999, Sep; 73(9):7780-6), uma reposta imunitária sistémica satisfatória de acordo com os critérios do CHMP para vacinas contra a gripe foi observada no grupo humano vacinado apenas uma vez com a vacina contra a gripe virossómica reconstituída sem adjuvante. 14-03-2012 41

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo virossomas do vírus da gripe compreendendo envelopes reconstituídos do vírus da gripe para utilização na indução de uma resposta imunitária sistémica e/ou local contra os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados num ser humano, por intermédio de uma única administração por via intranasal ou por inalação, em que: • os envelopes virais são inteiramente derivados das partículas virais da gripe, • não se adicionam lípidos de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, • os virossomas compreendem a hemaglutinina e/ou neuraminidase da gripe ou seus derivados, e • não se adiciona à composição nenhum adjuvante e/ou estimulante imunitário separado.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, para indução igualmente de uma resposta dos linfócitos citotóxicos.
3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que a resposta imunitária está de acordo com o critério CHMP para vacina contra o vírus da gripe.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a resposta imunitária proporciona uma ou mais de uma taxa de seroprotecção de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, uma taxa de seroprotecção de > 40% para adultos e/ou > 30% para idosos, e um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos e/ou 2,0 vezes para idosos. 1
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a composição é para utilização como uma formulação de vacina compreendendo um veiculo farmacêutico para utilização em administração intranasal ou por inalação.
6. Utilização de uma composição compreendendo virossomas do virus da gripe compreendendo envelopes reconstituídos do vírus da gripe, para o fabrico de uma formulação de vacina para uma única administração por via intranasal ou por inalação para a indução de uma resposta imunitária sistémica e/ou local contra os antigénios da gripe hemaglutinina e/ou neuraminidase ou seus derivados num ser humano, em que: • os envelopes virais são inteiramente derivados das partículas virais da gripe, • não se adicionam lípidos de uma fonte externa aos virossomas reconstituídos, • os virossomas compreendem a hemaglutinina e/ou neuraminidase da gripe ou seus derivados, e • não se adiciona à composição nenhum adjuvante e/ou estimulante imunitário separado.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a administração intranasal ou por inalação única da composição também induz uma resposta dos linfócitos citotóxicos.
8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, em que a resposta imunitária está de acordo com o critério CHMP para vacina contra o vírus da gripe.
9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a 2 resposta imuni seroprotecção uma taxa de s< para idosos, e e/ou 2,0 vezes 14-03-2012 .tária proporciona uma ou mais de uma taxa de de > 70% para adultos e/ou > 60% para idosos, eroprotecção de > 40% para adultos e/ou > 30% ; um aumento médio de > 2,5 vezes para adultos para idosos. 3