CN106749650B - 抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法及其应用 - Google Patents
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法，它是使用感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌作为抗原混合后制备成福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原，经皮下和肌肉免疫产蛋母鸡，从免疫的母鸡鸡蛋黄中应用水稀释法提取IgY抗体，应用两步硫酸胺盐析法纯化IgY抗体，获得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体。使用本发明特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体配制的制品，可以用于防治由感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌，以及与其有共同抗原的病毒和细菌引起的上呼吸道感染性炎症，如感冒、鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽喉炎、支气管炎等。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法及其应用。
背景技术
上呼吸道病毒感染，以及继发性细菌感染的发病无时间、季节特点，常年发生，且发病人群无选择性，人人均可发病，并可反复发生。感冒为上呼吸道感染，感冒通常可由季节发病的流感病毒，以及常年非季节性发病的鼻病毒，冠状病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等引起，然而病毒感染导致机体抵抗力下降，继而引发存在于上呼吸道或外来的肺链菌、葡萄球菌继发感染导致上呼吸道炎症。病毒感染目前无有效药物可用，过早采用抗菌素预防则不允许，甚至导致耐药菌株的产生以及菌群失调。因此迫切需要解决这个既能控制病毒反复感染细胞，又可预防继发性细菌感染且不破坏机体微生态环境的防治手段和方法。
流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等是目前引发流行性感冒和普通感冒的病毒，且每种病毒均有多种抗原有一些不同的亚型，因此采用病毒疫苗接种预防效果无法达到理想效果，甚至几乎无效。感冒的局部症状是鼻塞、流涕、打喷嚏，全身症状是发烧、肌肉和骨头酸痛、倦怠。
病毒感冒后2-3天由于炎症局部组织水肿，细胞抵抗力下降，继而引发存在于上呼吸道或外来的肺链菌、葡萄球菌继发感染，从而导致上呼吸道炎症进一步发展加重，不仅上呼吸道，而且炎症蔓延至下午呼吸道，出现咽喉肿痛、咳嗽、咳痰，毒血症反应，白细胞升高，发热加剧。因此控制病毒感染是其炎症控制的关键。
根据这一客观存在，加之目前无针对病毒的特异性药物，以及疫苗主动免疫机体存在产生特异性抗体的能力和种类的差异，因此被动免疫防治感冒和继发性细菌感染则显得尤为重要和疗效突出。病毒疫苗是人类感染病毒的重组亚单位疫苗或减毒病毒疫苗，由于长期感染人体，故人对其抗原常常产生耐受不予识别，或者识别的抗原决定簇有限，所以免疫效果不佳，预防效果不理想，甚至几乎无效。鉴于此，我们发明了采用种属关系相距甚远的禽类动物，即母鸡，作为产生抗体的母体，使用人源性感染的流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等作为免疫原免疫母鸡，使其产生抗更多种类的抗原决定簇抗体和更高效价的稳定抗体(IgY)，同时也能产生抗不同亚型病毒和细菌的共同抗原决定簇抗体，这一策略可以解决疫苗不理想的难题。
事实上，无论是病毒，如流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等，还是细菌，如链球菌和葡萄球菌等都具有许多致病性亚型，而且这些亚型之间均有共同的抗原决定簇和抗原性(交叉抗原)，原因是它们除了具有各自特异性的抗原或称识别抗原外，还存在着大量的不同种和型的家族遗传的共同抗原。因此，抗共同抗原决定簇抗体就可以和所有亚型病毒或细菌结合，产生抗原—抗体反应，达到消除不同亚型的病毒和细菌之目的。
鸡与哺乳动物由于种系进化差异的关系，其对同一种抗原诱导产生抗体的能力和产生抗不同抗原决定簇的抗体的能力与哺乳动物差异很大。鸡较哺乳动物(兔)对哺乳动物类的抗原有更好的免疫应答反应，对同一种抗原产生的不同抗原决定簇的抗体种类和数量都不同。鸡比哺乳动物能产生抗更多抗原决定簇的抗体，尤其是对哺乳动物的保守的抗原更是如此，哺乳动物不能产生抗体而鸡则能产生很高效价的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体(Chicken IgY: utilizing the evolutionary difference. Comp ImmunolMicrobiol Infect Dis. 1990;13(4):199-201. Chicken antibodies: a clinicalchemistry perspective. Larsson A.Ups J Med Sci. 1999;104(3):179-89.Comparative studies on the purity and specificity of yolk immunoglobulin Yisolated from eggs laid by hens immunized with Toxoplasma gondii antigen.Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A]. 1987，267(2):247-53.)。因此使用人源性的病毒和细菌免疫母鸡可以产生比人更多数量和抗更多不同抗原决定簇的抗体。
根据上述事实，采用一株病毒或细菌免疫的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体就可以治疗这类病毒或细菌引起的疾病，例如：特异性抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体能有效地治疗所有由轮状病毒引起的秋季腹泻(Randomized, placebo-controlled,clinical trial of hyperimmunized chicken egg yolk immunoglobulin in childrenwith rotavirus diarrhea. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001; 32(1):19-25)；一株变型链球菌免疫母鸡产生的特异性抗变型链球菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体能有效地治疗所有由变型链球菌引起的龋齿，甚至是缘远链球菌引起的龋齿；一株绿脓杆菌免疫母鸡产生的特异性抗绿脓杆菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体能有效地预防胆囊纤维化患者绿脓杆菌感染(Oral administration of specific yolk antibodies (IgY) may preventPseudomonas aeruginosa infections in patients with cystic fibrosis: A phase Ifeasibility study. Pediatr Pulmonol. 2003; 35(6):433-40)；一株幽门螺杆菌免疫母鸡产生的特异性抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体能有效地治疗所有由幽门螺杆菌引起的胃炎，减轻幽门螺杆菌炎症反应(Effect of dietary anti-Helicobacterpylori-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection. AlimentPharmacol Ther. 2004; 20 Suppl 1:185-92)。
特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗体与病毒和细菌表面抗原发生特异性抗原—抗体结合，其改变病毒和细菌表面结构、抑制病毒和细菌与靶细胞结合、抑制病毒和细菌的活性、阻止病毒进入细胞、抑制细菌生长、排斥了病毒和细菌在炎症部位的存在，抗原—抗体结合改变了病毒和细菌表面结构和电场，促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬病毒和细菌，并清除之。因此，抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体与目前的抗病毒和抗菌素作用原理完全不同，而且完全不会诱发耐药毒株和菌株的产生。同时避免了抗菌素滥用和广泛的耐药菌株发生。
发明内容
本发明目的是提供一种抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体及其制备方法，并用这种抗体制剂防治由感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌，以及与之具有共同抗原决定簇的病毒和细菌引起的上呼吸道感染性炎症，如：感冒，急、慢性鼻炎，鼻窦炎，扁桃体炎，咽炎、喉炎、支气管炎等。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体，其制备方法是：
（1）免疫原制备：
取流感病毒甲1型病毒10~20份、流感病毒甲3型病毒20~30份、流感病毒乙型病毒5~10份、鼻病毒10~20份、冠状病毒10~20份、呼吸道合胞病毒5~10份、腺病毒5~10份、肺炎链球菌10~20份、金黄色葡萄球菌20~30份混合成病毒+细菌液；
将等量体积的病毒+细菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原；
将等量体积的病毒+细菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原；
每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中均含有病毒20～200μg+细菌10亿～50亿；
（2）免疫：
将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉10～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1ml～1.5ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉20～60点注射给产蛋母鸡共计五次，此后每隔一个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉10～40点注射给产蛋母鸡加强免疫五次；
第一次免疫后第20天收集免疫母鸡的鸡蛋，第一次免疫后第28天至第360天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体；
（3）抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的制备：
收集免疫20天后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用水洗净、70%酒精浸泡，去蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:3～11的比例加蒸馏水搅拌，并用1N HCl调节酸碱度至pH4.8～5.5，在温度4℃下静置过夜；
将蛋黄稀释液在4℃高速离心15分钟取上清，然后经截留分子量为10~50kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10～20倍，再加入0.02%～5.0%的氯已定，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，且在4℃静置过夜；之后高速离心10-15分钟取上清，将上清经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物。
所述的免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的莱杭鸡、海兰褐鸡、罗曼鸡、明星鸡、以及家养的土鸡。
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的纯品制备方法，包括如下步骤：
将氯已定处理后的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物加硫酸胺至45%~60%的饱和度搅拌，室温静置2～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀物，将沉淀物使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至28%~35%的饱和度充分搅拌，室温静置2～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀物，用蒸馏水溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品。
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的纯品，加入药学上可接受的附加剂制成含有抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的滴鼻液、喷雾剂、气雾剂、含片和口香糖。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的纯度，经SDS-PAGE电泳测定IgY抗体的纯度达到33%以上；本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品的纯度，经SDS-PAGE电泳测定IgY抗体的纯度达到85%以上。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的生物学效价经ELISA（酶联免疫吸附实验）方法测定，特异性抗流感病毒甲1型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒甲1型病毒抗原结合效价为1:256~512/mg蛋白；特异性抗流感病毒甲3型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒甲3型病毒抗原结合效价为1:512~1024/mg蛋白；特异性抗流感病毒乙型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒乙型病毒抗原结合效价为1:256~512/mg蛋白；特异性抗鼻病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗鼻病毒抗原结合效价为1:256~512/mg蛋白；特异性抗冠状病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗冠状病毒抗原结合效价为1:256~512/mg蛋白；特异性抗呼吸道合胞病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗呼吸道合胞病毒抗原结合效价为1:128~256/mg蛋白；特异性抗腺病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗腺病毒抗原结合效价为1:128~256/mg蛋白；特异性抗肺炎链球菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗肺炎链球菌抗原结合效价为1:128~256/mg蛋白；特异性抗金黄色葡萄球菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗金黄色葡萄球菌抗原结合效价为1:256~512/mg蛋白。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体提纯品的生物学效价经ELISA（酶联免疫吸附实验）方法测定，特异性抗流感病毒甲1型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒甲1型病毒抗原结合效价为1:1024~2048/mg蛋白；特异性抗流感病毒甲3型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒甲3型病毒抗原结合效价为1:2048~4096/mg蛋白；特异性抗流感病毒乙型病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗流感病毒乙型病毒抗原结合效价为1:1024~2048/mg蛋白；特异性抗鼻病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗鼻病毒抗原结合效价为1:1024~2048/mg蛋白；特异性抗冠状病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗冠状病毒抗原结合效价为1:1024~2048/mg蛋白；特异性抗呼吸道合胞病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗呼吸道合胞病毒抗原结合效价为1:512~1024/mg蛋白；特异性抗腺病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗腺病毒抗原结合效价为1:512~1024/mg蛋白；特异性抗肺炎链球菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗肺炎链球菌抗原结合效价为1:512~1024/mg蛋白；特异性抗金黄色葡萄球菌抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗金黄色葡萄球菌抗原结合效价为1:1024~2048/mg蛋白。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体局部施于鼻腔、口腔、咽喉及支气管黏膜，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不破坏鼻腔、口腔、咽喉、支气管内正常微生态环境的优点。抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的制品。
具体实施方式
实施例1：
制备2000克抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物生产工艺流程：
（1）免疫原的制备：
流感病毒甲1型病毒10份、流感病毒甲3型病毒20份、流感病毒乙型病毒5份，鼻病毒10份，冠状病毒10份，呼吸道合胞病毒5份，腺病毒5份，肺炎链球菌15份，金黄色葡萄球菌20份混合后经石炭酸灭活处理；
将500ml的病毒液+菌液与500ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原，福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将500ml的病毒液+菌液与500ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原；
（2）免疫产蛋母鸡：使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉50~100点注射给18周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1.5ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉60点注射给产蛋母鸡，共五次，此后每隔一个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉40点注射给产蛋母鸡加强免疫共五次，免疫母鸡总数为500只；
（3）抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的制备：收集第一次免疫后35～70天的免疫母鸡的鸡蛋，使用清水洗净、70%的酒精进行鸡蛋表面消毒，去蛋壳、取蛋黄、去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH4.8~5.2，放置4℃冰柜过夜；
（4）将蛋黄稀释液高速离心10000g，15分钟，取上清，将上清置于截留分子量10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入2.0%的氯已定，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.2，并放置4℃过夜，此后高速离心10000g，15分钟，取上清，将上清经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物；抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物经ELISA（酶联免疫吸附实验）方法测定，每毫克蛋白的特异性抗病毒+细菌IgY抗体的效价为1:1024/mg蛋白。IgY抗体水提取物的纯度经SDS-PAGE电泳测定为33.2%。
将上述制得的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物，加硫酸胺至55%的饱和度充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000g 15分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000g 15分钟，取沉淀用蒸馏水稀释溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品。抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品 经ELISA方法测定，抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品中每毫克蛋白的特异性抗病毒+细菌IgY抗体的效价为1:4096/mg蛋白。IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经SDS-PAGE电泳测定为86.3%。
实施例2：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体滴鼻剂：抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物 0.20%、水蜜桃香精 0.60%、阿斯巴甜 0.12%、蒸馏水补充至100ml；
将80ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的滴鼻剂的瓶中。
实施例3：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体口腔喷雾剂、气雾剂：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物 0.20%、薄荷油 0.06%、香橙香精 0.60%、水蜜桃香精 0.40%、阿斯巴甜 0.12%、蒸馏水补充至100ml；
将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后加抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物，然后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和气雾剂的罐中。
实施例4：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体含片：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的水提取物 1.0%、薄荷油 0.08% 、香橙香精 0.70%、水蜜桃香精 0.50%、羧甲基纤维素 0.15%、硬脂酸镁 0.10%、山梨醇 补充至100g；
将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。
实施例5：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品滴鼻剂：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品 0.05%、水蜜桃香精 0.60%、阿斯巴甜 0.12%、蒸馏水补充至100ml；
将80ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的滴鼻剂的瓶中。
实施例6：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品口腔喷雾剂、气雾剂：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品 0.05%、薄荷油 0.06%、香橙香精 0.60%、水蜜桃香精0.40%、阿斯巴甜 0.12%、蒸馏水补充至100ml；
将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后加抗流感病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品，然后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和气雾剂的罐中。
实施例7：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品含片：
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品 2.0%、
薄荷油 0.08% 、香橙香精 0.70%、水蜜桃香精 0.50%、羧甲基纤维素 0.15%、硬脂酸镁 0.10%、山梨醇 补充至100g；
将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的水提取物，应用ELISA方法测定抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价见下表：
根据上述实验结果可以清楚地看到：⑴.发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物具有特异性抗流感病毒甲1型病毒、甲3型病毒、乙型病毒，鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等抗原的IgY抗体；⑵. 由上述实验可见，本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体可以治疗由上述病毒及细菌引起的上呼吸道炎症，急、慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽喉炎、支气管炎等。
本发明的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的纯品，应用ELISA方法测定抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价见下表：
根据上述实验结果可以清楚地看到：⑴. 本发明的抗感冒病毒和肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水纯品 具有特异性抗流感病毒甲1型病毒、甲3型病毒、乙型病毒，鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等抗原的特异性IgY抗体，且较抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物效价高。
比较不同鸡种的免疫应答和产生抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的能力：应用ELISA方法测定抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体结合抗原的生物学效价见下表：
根据上述实验结果可以清楚地看到：在相同的免疫条件下，采用不同鸡种制得的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物，其特异性抗流感病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价一致。
按本发明实验进行十一次免疫注射的方法（第一次福氏完全佐剂免疫原免疫，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫五次，以后每隔一个月再用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫五次）与传统的三次免疫注射的方法的效果比较，抗流感病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物效价结果见下表：
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的十一次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡与传统的三次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡比较其特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体产生能力的持久。并按本发明的方法制备出第一次免疫后60天的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物和330天的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物生物学效价相同。本发明的十一次免疫方法要比传统的三次免疫方法好很多，其特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的生物学效价与之相比有差异十分显著。本发明的十一次免疫方法所免疫的母鸡产生高效价的特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体的时间更长。
流感病毒甲1型病毒、甲3型病毒、乙型病毒，鼻病毒，冠状病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌等不同组成比例对特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体产生的影响，第一次免疫后60天抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY水提取物结果见下表：
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备的相同的免疫原但病毒和细菌组成比例不同，免疫产蛋海兰褐母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后60天免疫母鸡鸡蛋的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物，其抗不同组成比的病毒和细菌IgY抗体的生物学效价不同。这说明这些病毒和细菌不仅能够产生IgY抗体，而且产生的特异性IgY抗体的量根据各种抗原不同而相应变化的。
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体对白细胞吞噬肺炎链球菌的影响：按本发明的方法制备出第一次免疫后100天免疫母鸡鸡蛋中抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物与活肺炎链球菌及静脉血混合，在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中共同孵育60分钟，结果促进了人静脉血白细胞吞噬活肺炎链球菌。白细胞的吞噬率随着IgY浓度的升高而增加，见下表：
注：细胞吞噬率(%)：1组: 3组 p<0.01；1组:2组p<0.05；2组:3组p<0.01；
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备出第一次免疫后100天免疫母鸡鸡蛋的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物能够促进人外周血白细胞增强吞噬活的肺炎链球菌。这种调理吞噬促进作用可能与改变了细菌表面结构和电场效应相关。这说明了按本发明的方法制备出的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物其治疗由感冒病毒和肺链菌、葡萄球菌引起的炎症。
抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体能有效地保护致死性流感甲1型病毒(H1N1，A/fm/1/47株)感染的小鼠：按本发明的方法制备出第一次免疫后100天免疫母鸡鸡蛋中抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物滴鼻于100倍致死性流感甲1型病毒(H1N1，A/fm/1/47株)感染的小鼠，其有效地保护了100倍致死剂量流感甲1型病毒(H1N1，A/fm/1/47株)感染的小鼠，见下表：
注：三组间差异显著；其中第一组与第二组和第三组p<0.01；
根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备出第一次免疫后100天免疫母鸡鸡蛋的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物能够有效地保护致死剂量流感病毒感染的小鼠。这说明了按本发明的方法制备出的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物其防治感冒疗效明确。
Claims (4)
1.一种抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1）免疫原制备：
取流感病毒甲1型病毒10~20份、流感病毒甲3型病毒20~30份和流感病毒乙型病毒5~10份，鼻病毒10~20份，冠状病毒10~20份，呼吸道合胞病毒5~10份，腺病毒5~10份，肺炎链球菌10~20份，金黄色葡萄球菌20~30份混合成病毒+细菌液；
将等量体积的病毒+细菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂流感病毒及肺链菌、葡萄球菌免疫原；
将等量体积的病毒+细菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂流感病毒及肺链菌、葡萄球菌免疫原；
每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有病毒50～200μg+细菌10亿～50亿；
（2）免疫：
将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉10～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1ml～1.5ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉20～60点注射给产蛋母鸡共计五次，此后每隔一个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉10～40点注射给产蛋母鸡加强免疫五次；
（3）抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物的制备：
收集免疫20天后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用水洗净、70%酒精浸泡，去蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:3～11的比例加蒸馏水搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.8～5.5，在温度4℃下静置过夜；
将蛋黄稀释液在4℃高速离心15分钟取上清，然后经截留分子量为10~50kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10～20倍，再加入0.02%～5.0%的氯已定，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，且在4℃静置过夜；之后高速离心10分钟取上清，将上清经0.22μm的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物。
2.根据权利要求1所述的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体制备方法，其特征在于：所述免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的莱杭鸡、海兰褐鸡、罗曼鸡、明星鸡、以及家养的土鸡。
3.如权利要求1所述的制备方法制取的特异性抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体在制备治疗感冒、鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽喉炎、支气管炎的药物中的应用。
4.一种抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：将如权利要求1所述方法制备的抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体水提取物加硫酸胺至45%~60%的饱和度充分搅拌，室温静置2～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀物，将沉淀物使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至28%~35%的饱和度充分搅拌，室温静置2～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀物，用蒸馏水溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗感冒病毒及肺链菌、葡萄球菌复合IgY抗体纯品。
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