CN1477128A - 抗呼吸道感染特异性IgY制备方法及其组合制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗呼吸道感染特异性IgY及其制备方法和制剂。本发明制备方法包括下列步骤：筛选出引致呼吸道感染的主要致病病毒，在筛选和分类组合各种致病病原体的基础上，分别制备各种致病病原体抗原，制备免疫蛋，制备抗呼吸道感染各种致病病原体特异性IgY粗提物，抗呼吸道感染各种致病病原体特异性IgY粗提物的纯化。本发明的抗呼吸道感染特异性IgY多种制剂使用安全、无毒付作用，预防和初期治疗效果好，见效快，并解决了有关耐药性的难题，对有益菌秋毫无犯，有助于形成不易受病毒和致病菌感染的正常菌群平衡。

Description

抗呼吸道感染特异性IgY制备方法及其组合制剂

技术领域

本发明涉及一种抗呼吸道感染特异性IgY及其制备方法，特别是涉及用于预防和早期治疗呼吸道感染的特异性IgY及其制备方法和组合制剂。

背景技术

当前国内外治疗气管炎、支气管炎以及肺炎，主要用抗生素、喹喏酮类(沙星类)和其它合成抗菌药、抗病毒药。为控制病情发展，不惜用大剂量、高浓度的广谱新抗；加上某些商业利益的驱动，人们对抗菌类药物的依赖和滥用，已成为世界难题，在中国尤为严重。据世界卫生组织(WHO)一份调查报告显示，中国住院患者的抗菌素使用率高达80％，其中使用广谱抗菌素和联合使用两种以上抗菌素的占58％，远远高于30％的国际水平。结果大大加速了细菌耐药性发展，一个新抗上市仅仅使用二三年，耐药菌株即会出现，而开发一个新抗则需十年左右。新抗亚胺培南(四代头孢)的使用从1998年至今，绿脓杆菌对它的耐药率已超过40％。广谱抗菌素在治疗混合感染上发挥了一定作用，但对非致病菌也一律灭杀，致使细菌为适应环境而产生耐药性，并迅速蔓延；耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)等引起的感染，已成为临床界难题。

目前，传染病的死灰复燃，归根结底是人类免疫系统产生故障，其罪魁祸首是人类发明的抗菌(毒)药物的滥用，这是自然界对人类的无情报复。

除此之外，抗菌素药物的毒付作用，也令人震惊。青霉素和头孢类致敏，氨基糖苷类的耳毒性和肾毒性，喹喏酮类对神经系的干扰以及使儿童关节软骨畸变，其它合成药造成的剥脱性皮炎等。

综上所述，各类抗菌类药物的种种弊端，现在防治呼吸道感染临床用药方面，急需要一种只对病原微生物有杀灭作用，而又没有毒付作用的绿色药物。

抗人类呼吸道感染多种病原体的特异性复合卵黄抗体(Immunoglobulin of Yolk，IgY)属IgG类免疫球蛋白，是用致呼吸道炎症的多种病原体，免疫健康良种产蛋禽类，使之产生大量相应免疫球蛋白，经提取分离纯化，而制得特异性复合卵黄免疫抗体。这些特异性IgY，对导致呼吸道感染的多种病原微生物，有特异性结合抑制作用，即使在浓度极低的情况下，也能起到有效作用，并且只抑杀病原体，对呼吸道共生菌群无作用，更不会产生耐药菌株，对人体也没有毒付作用。

技术内容

本发明的目的是提供一种直接抑制引致呼吸道炎症的各种病原体的特异性IgY制备方法及其制剂；本发明的目的还在于提供一种由可抑制呼吸道炎症病原体的特异性复合IgY制成的天然、安全又具有特效作用的预防和治疗多种呼吸道感染的制剂。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一、筛选引致呼吸道感染的主要病原体确定有代表性的病原体

根据感染微生态学和流行病学的原理，在广泛调查研究、筛选分析的基础上，确定有代表性的致病病毒和致病菌以及致病真菌。

1、有代表性的致病病毒：

(1)鼻病毒，选常见的5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒；

(2)腺病毒，选常见的3型腺病毒、7型腺病毒；

(3)呼吸道合胞病毒，选4型呼吸道合胞病毒和A亚型呼吸道合胞病毒以及B亚型呼吸道合胞病毒。

2、有代表性的致病细菌：

(1)A簇B型溶血性链球菌；

(2)肺炎链球菌；

(3)流感嗜血杆菌；

(4)金黄色葡萄球菌；

(5)1-6型肺炎克雷伯杆菌；

3、有代表性的致病真菌：白色念珠菌

二、制备复合抗原

(一)采用常规方法，分别对以上所选的几种有代表性致病病毒进行培养繁殖，然后灭活后在4℃或-20℃保存；另外，同样采用常规方法，按照以上所优选的致病细菌和真菌的培养特性和最适宜的培养条件，选择适宜的培养基，进行培养，然后收集所培养的细菌或真菌，提纯、菌株计数、稀释分装。

(二)制作病原体混合物

1、呼吸道感染致病病毒复合抗原的制备：

(1)将培养好并灭活的5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒按1∶1∶1的比例混合，得到鼻病毒混合物；

(2)将培养好并灭活的3型腺病毒、7型腺病毒按1∶1的比例混合，得到腺病毒混合物；

(3)将培养好并灭活的4型呼吸道合胞病毒、A亚型呼吸道合胞病毒、B亚型呼吸道合胞病毒按1∶1∶1的比例混合，得到呼吸道合胞病毒混合物；

(4)将鼻病毒混合物、腺病毒混合物、呼吸道合胞病毒混合物，按1∶1∶1的比例混合均匀，然后按1∶1的比例加入福氏佐剂，在放入高速匀浆机中以10000-30000rpm转速高速匀化，使成均一乳状浆液，即制得呼吸道感染致病病毒复合抗原。

2、呼吸道感染致病细菌和真菌复合抗原的制备：

(1)将所优选的有代表性的致病细菌和真菌培养好后按以下比例混合：

A簇B型溶血性链球菌                         30-10％

肺炎链球菌                                 25-10％

流感嗜血杆菌                               20-15％

金黄色葡萄球菌                             10-20％

1-6型肺炎克雷伯杆菌等量混合体              10-30％

白色念珠菌                                 5-15％

(以上各成分和比例可适当变更和增减)

(2)把以上所制备的致病细菌和真菌混合物加入福氏佐剂充分混合均匀，然后置入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速高速搅拌匀化，使成均一乳状浆液，即制得呼吸道感染致病细菌及真菌复合抗原。

三、制备免疫蛋：选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康产蛋禽类(产蛋母鸡、母鸭、火鸡、鸵鸟、野鸡)，每只在胸肌或皮下分别注射上述方法所制备的呼吸道感染致病病毒复合抗原、致病细菌及真菌复合抗原，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同抗原对免疫蛋编号标记；

四、抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品的制备：将用致病病毒复合抗原和致病细菌及真菌复合抗原分别免疫的产蛋禽类所产免疫蛋分别用一定浓度的消毒液浸泡30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，分别置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入6倍蒸馏水稀释混匀，调节pH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液以1000-3000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量17-20万超滤膜超滤浓缩10-20倍，浓缩液用冷冻喷干法干燥，即分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY；然后将这两种特异性IgY按1-10∶1-10混合即得抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品；

五、抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY纯品的制备：将以上工艺所制取的抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品分别过离子交换树脂柱和凝胶交换柱进行纯化，即得纯复合IgY。

六、应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制备的抗呼吸道感染复合IgY粗品进行检测，测得其中复合IgY含量为50％以上。采用酶联免疫法(ELISA)测得复合IgY生物活性效价达256-1024。

将0.02-40％这种特异性IgY配以99.98-60％的药用辅料，可制成临床可接受的剂型，如鼻喷剂、口喷剂、气雾剂、口含片等。用于防治常见呼吸道感染性疾病。

本发明的抗呼吸道感染病原体特异性IgY，是从免疫后的产蛋禽类(母鸡、母鸭或火鸡、鸵鸟、野鸡等)所产蛋的蛋黄中提取的生物制剂，使用十分安全，无任何毒付作用。本发明的以上剂型，直接施于呼吸道各段：咽喉、气管、支气管、肺，预防和初期治疗效果好，见效快；消除了使用抗菌素和各种化学治疗药带来的各种弊端，又解决了有关耐药性的难题。且对有益菌秋毫无犯，有助于形成不易受病毒和致病菌感染的正常菌群平衡。

实验例1：将致病菌20-35亿，其中A簇B型溶血链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物、金葡菌、白色念珠菌，分别按占30％、25％、20％、10％、10％、5％制成0.5ml菌液，加入0.5ml福氏佐剂充分混匀制成复合抗原，再用它免疫母鸡，拣蛋制备它们的特异性IgY，然后，以A簇B型溶血链球菌、流感嗜血杆菌、1型克雷帕氏杆菌、金葡菌、白色念珠菌为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得抗呼吸道感染特异性IgY抗体结合效价，结果如下：

IgY	检测用抗原	抗体结合效价
			抗呼吸道感染致病菌、真菌特异性复合IgY	A簇B型溶血链球菌	1∶256
肺炎链球菌	1∶256
		流感嗜血杆菌		1∶128
1型肺炎克雷帕氏杆菌	1∶64
		6型肺炎克雷伯杆菌		1∶32
金葡菌	1∶128
		白色念珠菌		1∶32

从上述检测结果看出，采用本发明制取的致病抗原强化免疫母鸡所制备的特异性IgY具有理想的广谱性，对所免疫的上表7种细菌有很强的抑制作用。

实验例2：取鼻病毒混合物、腺病毒混合物、呼吸道合胞病毒混合物20-35亿，其中鼻病毒混合物20亿、腺病毒混合物20亿、呼吸道合胞病毒(RSV)混合物10亿制成0.5ml混合液加入0.5ml福氏佐剂充分混匀制成复合抗原注射液，再用它免疫母鸡，然后，拣蛋制备它们的特异性IgY，再以鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)为检测抗原，检测抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY抗体结合效价，结果如下：

IgY	检测用抗原	抗体结合效价
			抗呼吸道感染致病病毒	5型鼻病毒	1∶1024
3型腺病毒	1∶512
		4型呼吸道合胞病毒		1∶256

从上表结果可看出以本发明的方法用多种致病病毒制备抗原，又采用本发明的强化免疫方法免疫产蛋母鸡和制备相应的IgY，所制备的抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY具有较理想的广谱性，对所免疫的上述致病病毒都有很强的抑制作用，所测抗体结合效价较高(1∶256-1024)。

实验例3：将实验例2与实验例1中的抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY按1∶1比例混合，制备抗呼吸道感染特异性复合IgY，然后用“ELISA”方法，分别以这两组抗原中的每一种病原微生物作为检测用抗原，检测所制得的抗呼吸道感染特异性复合IgY对这9种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表：

IgY	检测用抗原	抗体结合效价
			抗呼吸道感染特异性复合IgY	A簇B型溶血链球菌	1∶256
流感嗜血杆菌	1∶256
		3型肺炎克雷帕氏杆菌		1∶64
金葡菌	1∶128
		肺炎链球菌		1∶256
白色念珠菌	1∶32
		29型鼻病毒		1∶512
7型腺病毒	1∶512

A亚型呼吸道合胞病毒

1∶256

以上结果可见以本发明的方法制备的多组分抗呼吸道感染特异性复合IgY，对作为抗原直接免疫的呼吸道感染致病病毒和致病菌以及白色念珠菌都具有很高的结合效价达到理想的效果。

实验例4：将实验例1与实验例2中的两组不同复合抗原分别免疫产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋火鸡以及产蛋鸵鸟，再分别采用本发明的方法制备得到：(1)抗呼吸道感染特异性复合鸭IgY、(2)抗呼吸道感染特异性复合鹅IgY、(3)抗呼吸道感染特异性复合火鸡IgY、(5)抗呼吸道感染特异性复合鸵鸟IgY。然后用“ELISA”方法，分别以这两组抗原中的每一种病原微生物作为检测用抗原，检测所制得的抗呼吸道感染特异性IgY的抗体结合效价。

IgY	检测用抗原	抗体结合效价
			抗呼吸道感染特异性复合鸭IgY	A簇B型溶血链球菌	1∶128
流感嗜血杆菌	1∶128
		2型肺炎克雷帕氏杆菌		1∶32
金葡菌	1∶64
		肺炎链球菌		1∶128
白色念珠菌	1∶16
		14型鼻病毒		1∶256
3型腺病毒	1∶256
		B亚型呼吸道合胞病毒		1∶128
抗呼吸道感染特异性复合鹅IgY	A簇B型溶血链球菌				1∶128
		流感嗜血杆菌	1∶128
	4型肺炎克雷帕氏杆菌			1∶32
		金葡菌	1∶64
	肺炎链球菌			1∶128
		白色念珠菌	1∶16
	5型鼻病毒			1∶256
		7型腺病毒	1∶256

	4型呼吸道合胞病毒	1∶128
			抗呼吸道感染特异性复合火鸡IgY	A簇B型溶血链球菌	1∶128
流感嗜血杆菌	1∶128
		5型肺炎克雷帕氏杆菌		1∶32
金葡菌	1∶64
		肺炎链球菌		1∶128
白色念珠菌	1∶16
		29型鼻病毒		1∶256
3型腺病毒	1∶256
		A亚型呼吸道合胞病毒		1∶128
抗呼吸道感染特异性复合鸵鸟IgY	A簇B型溶血链球菌				1∶128
		流感嗜血杆菌	1∶128
	6型肺炎克雷帕氏杆菌			1∶32
		金葡菌	1∶64
	肺炎链球菌			1∶128
		白色念珠菌	1∶32
	14型鼻病毒			1∶128
		7型腺病毒	1∶128
	B亚型呼吸道合胞病毒			1∶64

从以上试验结果可以看出，采用本发明的方法制作抗原，用免疫激活方法免疫母鸭、母鹅、产蛋火鸡或产蛋鸵鸟，再采用本发明的方法分别制得抗呼吸道感染特异性复合鸭IgY、抗呼吸道感染特异性复合鹅IgY、抗呼吸道感染特异性复合火鸡IgY、抗呼吸道感染特异性复合鸵鸟IgY四种不同的IgY，虽然免疫的禽类不同，但是所制得的特异性IgY对引致呼吸道感染的多种致病病原体都有很好的抑制效果。由于鸭IgY没有Fc段，如果将鸭IgY制成注射用剂型，注射入人体内，人体不易产生排斥反应，这是鸭IgY最大的优点。虽然免疫产蛋鸵鸟和产蛋火鸡所制得的IgY抗体结合效价从检测数据看稍微低了一些，但是，由于鸵鸟和火鸡蛋个体特别大，每个免疫蛋所能提取得到的IgY比鸡免疫蛋和鸭免疫蛋以及鹅免疫蛋都多得多，这点对于工业化大规模生产，也是十分可取的。

实验例5：呼吸道炎症患者(气管炎)以本发明的抗呼吸道感染特异性复合IgY为原料制备组合气雾剂治疗临床观察。

(1)在患呼吸道感染气管炎患者中随机选择30名。

(2)抗呼吸道感染组合气雾剂喷嘴对喉部呼吸道，每次吸气按压6喷，每天4-6次。

(3)观察试验者咳嗽、痰液等各种症状变化情况。

(4)经喷用5-7天后，25名患者炎症基本消失，另5名患者炎症减轻。

(5)连续喷该气雾剂10天，其中28名患者炎症消失，另两名患者也明显减轻。

实施例1：制备抗呼吸道感染特异性复合IgY

分别按照A簇B型溶血链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物、金葡菌、白色念珠菌、5型、14型和29型鼻病毒、3型和7型腺病毒、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒的培养特性和最适培养条件、选择适宜培养基、进行菌(毒)株大量繁殖，收集培养物、处理纯化、计数、稀释分装。将5、14、29型鼻病毒等量混合物15亿、3型和7型腺病毒等量混合物15亿、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒混合物10亿三者再混合，共制成0.5ml混合液，再加入福氏佐剂0.5ml，充分混匀制成第一组复合抗原；将A簇B型溶血链球菌等5种细菌和白色念珠菌，其中A簇B型溶血链球菌占30％、肺炎链球菌占20％、流感嗜血杆菌占25％、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物占10％、金葡菌占10％，共制成0.5ml，再加福氏佐剂0.5ml充分混匀制得第2组复合抗原。用此两组复合抗原分别对选取的健康无病产蛋罗曼鸡各100只免疫，每只胸部肌肉注射1ml，注射后第7天第14天再同样各注射一次强化，第1次注射后第20天开始拣取蛋至第7个月终止。

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合IgY粗品。

特异性复合IgY的纯化：采用本公司公开的专利技术(专利申请号：00101270.3，专利公开号：1307061)分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合IgY粗品进行纯化即得特异性复合IgY纯品。

实施例2：制备抗呼吸道感染特异性复合鹅IgY

选具高免疫应答能力的良种鹅：用A簇B型溶血链球菌制作抗原，分别免疫500只母鹅，每次注射3ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鹅所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅200只，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅；

用实施例1中的两组复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达3ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋至第7个月终止；

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性鹅IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性鹅IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合鹅IgY粗品。

特异性复合鹅IgY的纯化：采用本公司公开的专利技术(专利申请号：00101270.3，专利公开号：1307061)分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合鹅IgY粗品进行纯化即得特异性复合鹅IgY纯品。

实施例3：制备抗呼吸道感染特异性复合鸵鸟IgY

选具高免疫应答能力的良种鸵鸟：用A簇B型溶血链球菌制作抗原，分别免疫500只产蛋鸵鸟，每次注射4ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鸵鸟所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸵鸟200只，再用这批鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟；

用实施例1中的两组复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫，每只鸵鸟每次注射量达3-6ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取鸵鸟所产免疫蛋至第7个月终止；

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性鸵鸟IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性鸵鸟IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合鸵鸟IgY粗品。

特异性复合鸵鸟IgY的纯化：采用本公司公开的专利技术(专利申请号：00101270.3，专利公开号：1307061)分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合鸵鸟IgY粗品进行纯化即得特异性复合鸵鸟IgY纯品。

实施例4：用所制备的抗呼吸道感染特异性复合IgY作为主要原料制成一种抗呼吸道感染气雾剂。

配方(各成份可适量增减)：

           抗呼吸道感染特异性复合IgY             10g

           甘油                                  20g

           阿斯巴甜                              1.2g

           薄荷脑                                3.0g

           薄荷香精                              5ml

           乙醇                                  10ml

           桉叶油                                1ml

           蒸馏水                                适量

           制成                                  1000ml

制法：1、称取IgY、阿斯巴甜溶于800ml蒸馏水中，搅拌均匀，用1mol NaOH调pH至6.5-7.5。薄荷脑、桉叶油、薄荷香精加乙醇搅拌溶解再加甘油混合均匀，在搅拌下将此液呈细流混入上述药液中搅匀、过滤，自滤器上补加蒸馏水至1000ml混匀，测IgY效价合格后备用。

2、压灌封口，将上述药液灌入消毒容器中，装上阀门轧紧，上压装机压入定量99％以上纯度氮气，操作压力不低于101.3Kpa，当容器上顶时灌装针头伸入伐杆内压装机与容器阀门同时打开使氮气自动进入。制成每瓶20ml充氮气雾剂50瓶，包装即得。

实施例5：用所制备的抗呼吸道感染特异性复合IgY作为主要原料制成一种抗呼吸道感染喷雾剂。

配方(各成份可适量增减)：

              抗呼吸道感染复合IgY          150g

              甘油                         2000g

              木糖醇                       2000g

              香橙香精                     300g

              薄荷油                       300g

              薄荷脑                       100g

              酒精                         1000ml

              蒸馏                         适量

              制成                         100升

制法：

1、取蒸馏水80升加IgY木糖醇搅拌溶解用1mol NaOH调pH6.5-7.5。

2、香橙香精、薄荷油、薄荷脑加酒精溶解再加甘油混匀，在搅拌下呈细流混入上述溶液中，过滤从滤器上补加蒸馏水至100升，测IgY效价合格后供灌装。

3、灌装药液。在灌装线上灌装手动定量压力喷雾罐5000支，每支20ml，再充入抛射剂30％以上，包装即得。

实施例6：用所制备的抗呼吸道感染特异性复合IgY作为主要原料制成一种抗呼吸道感染常压喷雾剂。

              抗呼吸道感染复合IgY             100g

              甘油                            2000g

              PEG400                          1000g

              薄荷脑                          200g

              桔子油香精                      300g

              乙醇                            1500ml

              蒸馏水                          适量

              制成                            100升

制法：IgY溶于80升蒸馏水中，加入甘油混匀。薄荷脑、桔子油香精加乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，调pH至7.0，灌装。将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得。

Claims (16)

1、一种抗呼吸道感染特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染特异性IgY的制备方法包括下列步骤：

优选引致呼吸道感染的主要致病病原体，分别制备引致呼吸道感染的各种病原体抗原；制备免疫蛋；制备抗呼吸道感染各种病原体特异性IgY粗提物；抗呼吸道感染各种病原体特异性IgY粗提物的纯化；制备抗呼吸道感染特异性复合IgY。

2、如权利要求1所述的抗呼吸道感染特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染特异性IgY的制备方法包括下列步骤：

筛选引致呼吸道感染的病原体，在筛选和分类组合各种呼吸道感染病原体的基础上，按照这些病原体的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行菌(毒)株大量繁殖，收集培养物、提纯、菌株计数、稀释分装，将各种单一或复合的呼吸道病原体一定数量加入福氏佐剂，再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化，使成均一乳状浆液，即制得单一或复合的呼吸道感染病原体抗原；

制备免疫蛋：选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康产蛋禽类，每只在胸肌或皮下分别注射所制备的单一或复合呼吸道感染病原体抗原，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同抗原对免疫蛋编号标记；

抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品的制备：将不同抗原分别免疫的产蛋禽类所产免疫蛋分别用一定浓度的消毒液浸泡30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，分别置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入6倍蒸馏水稀释混匀，调节pH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液以1000-3000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量17-20万超滤膜超滤浓缩10-20倍，浓缩液用冷冻喷干法干燥，然后按1-10∶1-10混合即得抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品；

抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY纯品的制备：将以上工艺所制取的抗呼吸道感染病原体特异性复合IgY粗品分别过离子交换树脂柱和凝胶交换柱进行纯化，即得纯复合IgY。

3、如权利要求1或2所述的抗呼吸道感染特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染特异性IgY的制备方法中引致呼吸道感染的病原体包括致病病毒、致病菌及致病真菌；

致病病毒包括：

    鼻病毒，选常见的5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒；

    腺病毒，选常见的3型腺病毒、7型腺病毒；

    呼吸道合胞病毒，选4型呼吸道合胞病毒和A亚型呼吸道合胞病毒以及B亚型呼吸道合胞病毒；

致病细菌包括：

    A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、1-6型肺炎克雷伯杆菌；

致病真菌包括：

    白色念珠菌

4、如权利要求1或2所述的抗呼吸道感染特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染特异性IgY可以制成临床呼吸道可接受的剂型，包括鼻喷剂、口喷剂、气雾剂、口含片。

5、一种抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY的制备方法包括下列步骤：

优选引致呼吸道感染的主要致病病毒：分别对5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒、3型腺病毒、7型腺病毒、4型呼吸道合胞病毒、A亚型呼吸道合胞病毒以及B亚型呼吸道合胞病毒进行培养繁殖，然后灭活，在4℃或-20℃保存；

制备呼吸道感染致病病毒复合抗原：将培养好并灭活的5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，得到鼻病毒混合物；将培养好并灭活的3型腺病毒、7型腺病毒按1-10∶1-10的比例混合，得到腺病毒混合物；将培养好并灭活的4型呼吸道合胞病毒、A亚型呼吸道合胞病毒、B亚型呼吸道合胞病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，得到呼吸道合胞病毒混合物；将鼻病毒混合物、腺病毒混合物、呼吸道合胞病毒混合物，按1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，然后按1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，在放入高速匀浆机中以10000-30000rpm转速高速匀化，使成均一乳状浆液，即制得呼吸道感染致病病毒复合抗原；

制备免疫蛋：选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康产蛋禽类，每只在胸肌或皮下分别注射上述方法所制备的呼吸道感染致病病毒复合抗原，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同抗原对免疫蛋编号标记；

抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY粗品的制备：将用致病病毒复合抗原免疫的产蛋禽类所产免疫蛋用一定浓度的消毒液浸泡30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，分别置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入6倍蒸馏水稀释混匀，调节pH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液以1000-3000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量17-20万超滤膜超滤浓缩10-20倍，浓缩液用冷冻喷干法干燥，即制得抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY；

抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY纯品的制备：将以上工艺所制取的抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY粗品分别过离子交换树脂柱和凝胶交换柱进行纯化，即得纯IgY。

6、如权利要求5所述的一种抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY的制备方法中，所述病毒复合抗原5型鼻病毒、14型鼻病毒、29型鼻病毒按1∶1∶1的比例混合，得到鼻病毒混合物；3型腺病毒、7型腺病毒按1∶1的比例混合，得到腺病毒混合物；4型呼吸道合胞病毒、A亚型呼吸道合胞病毒、B亚型呼吸道合胞病毒按1∶1∶1的比例混合，得到呼吸道合胞病毒混合物；鼻病毒混合物、腺病毒混合物、呼吸道合胞病毒混合物，按1∶1∶1的比例混合均匀，然后按1∶1的比例加入福氏佐剂。

7、一种抗呼吸道感染致病致病细菌和真菌特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染致病细菌和真菌特异性IgY的制备方法包括下列步骤：

优选引致呼吸道感染的病原体：采用常规方法，分别按照A簇B型溶血性链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、1-6型肺炎克雷伯杆菌等量混合体、白色念珠菌的培养特性和最适宜的培养条件，选择适宜的培养基，进行培养，然后收集所培养的细菌或真菌，提纯、菌株计数、稀释分装；

呼吸道感染致病细菌和真菌复合抗原的制备：将上述致病细菌和真菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成致病细菌和真菌混合物，加入福氏佐剂充分混合均匀，然后置入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速高速搅拌匀化，使成均一乳状浆液，即制得呼吸道感染致病细菌及真菌复合抗原；

制备免疫蛋：选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康产蛋禽类，每只在胸肌或皮下分别注射上述方法所制备的呼吸道感染致病细菌及真菌复合抗原，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同抗原对免疫蛋编号标记；

抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY粗品的制备：将呼吸道感染致病细菌及真菌复合抗原免疫的产蛋禽类所产免疫蛋分别用一定浓度的消毒液浸泡30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，分别置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入6倍蒸馏水稀释混匀，调节pH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液以1000-3000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量17-20万超滤膜超滤浓缩10-20倍，浓缩液用冷冻喷干法干燥，即得抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY粗品；

抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY纯品的制备：将以上工艺所制取的抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY粗品分别过离子交换树脂和凝胶交换柱进行纯化，即得纯IgY。

8、如权利要求7所述的一种抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY，其特征在于该抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY的制备方法中，所述呼吸道感染致病细菌及真菌复合抗原中各种病原体按如下比例混合：

   A簇B型溶血性链球菌                       30-10％

   肺炎链球菌                               25-10％

   流感嗜血杆菌                             20-15％

   金黄色葡萄球菌                           10-20％

   1-6型肺炎克雷伯杆菌等量混合体            10-30％

   白色念珠菌                               5-15％

9、如权利要求2或5或7所述的特异性IgY的制备方法，其特征在于：用于制备免疫蛋的产蛋禽类可以为母鸡或母鸭或母鹅或火鸡或鸵鸟或野鸡。

10、一种抗呼吸道感染特异性复合IgY的制备，其特征在于将所述抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY粗品或纯品干粉以1-10∶1-10的比例混合均匀而成。

11、一种抗呼吸道感染特异性复合IgY，其特征在于该抗呼吸道感染特异性复合IgY的制备方法包括下列步骤：

分别按照A簇B型溶血链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物、金葡菌、白色念珠菌、5型、14型和29型鼻病毒、3型和7型腺病毒、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒的培养特性和最适培养条件、选择适宜培养基、进行菌(毒)株大量繁殖，收集培养物、处理纯化、计数、稀释分装；

将5、14、29型鼻病毒等量混合物15亿、3型和7型腺病毒等量混合物15亿、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒混合物10亿三者再混合，共制成0.5ml混合液，再加入福氏佐剂0.5ml，充分混匀制成第一组复合抗原；将A簇B型溶血链球菌等5种细菌和白色念珠菌，其中A簇B型溶血链球菌占30％、肺炎链球菌占20％、流感嗜血杆菌占25％、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物占10％、金葡菌占10％，共制成0.5ml，再加福氏佐剂0.5ml充分混匀制得第2组复合抗原；

用此两组复合抗原分别对选取的健康无病产蛋罗曼鸡各100只免疫，每只胸部肌肉注射1ml，注射后第7天第14天再同样各注射一次强化，第1次注射后第20天开始拣取蛋至第7个月终止；

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合IgY粗品；

特异性复合IgY的纯化：分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合IgY粗品进行纯化即得特异性复合IgY纯品。

12、一种抗呼吸道感染特异性复合鹅IgY，其特征在于该特异性鹅IgY的制备方法包括下列步骤：

选具高免疫应答能力的良种鹅：用A簇B型溶血链球菌制作抗原，分别免疫500只母鹅，每次注射3ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鹅所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅200只，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅；

将5、14、29型鼻病毒等量混合物15亿、3型和7型腺病毒等量混合物15亿、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒混合物10亿三者再混合，共制成0.5ml混合液，再加入福氏佐剂0.5ml，充分混匀制成第一组复合抗原；将A簇B型溶血链球菌等5种细菌和白色念珠菌，其中A簇B型溶血链球菌占30％、肺炎链球菌占20％、流感嗜血杆菌占25％、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物占10％、金葡菌占10％，共制成0.5ml，再加福氏佐剂0.5ml充分混匀制得第2组复合抗原；

用此两组复合抗原采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达3ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋至第7个月终止；

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性鹅IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性鹅IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合鹅IgY粗品。

特异性复合鹅IgY的纯化：分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合鹅IgY粗品进行纯化即得特异性复合鹅IgY纯品。

13、一种抗呼吸道感染特异性复合鸵鸟IgY，其特征在于该特异性复合鸵鸟IgY的制备方法包括下列步骤：

选具高免疫应答能力的良种鸵鸟：用A簇B型溶血链球菌制作抗原，分别免疫500只产蛋鸵鸟，每次注射4ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次，于第一次注射后第七个月，把这些鸵鸟所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附试验)检测所制得的IgY的效价，选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸵鸟200只，再用这批鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟；

将5、14、29型鼻病毒等量混合物15亿、3型和7型腺病毒等量混合物15亿、4型和A亚型以及B亚型呼吸道合胞病毒混合物10亿三者再混合，共制成0.5ml混合液，再加入福氏佐剂0.5ml，充分混匀制成第一组复合抗原；将A簇B型溶血链球菌等5种细菌和白色念珠菌，其中A簇B型溶血链球菌占30％、肺炎链球菌占20％、流感嗜血杆菌占25％、1-6型克雷帕氏杆菌等量混合物占10％、金葡菌占10％，共制成0.5ml，再加福氏佐剂0.5ml充分混匀制得第2组复合抗原；

用此两组复合抗原采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫，每只鸵鸟每次注射量达3-6ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取鸵鸟所产免疫蛋至第7个月终止；

将不同抗原的免疫蛋分别用流动水冲净，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋壳以卵黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀用1mol NaOH液调节pH至6.0，4-6℃静置过夜，将此稀释液2000r/min离心20分钟，取上清液用截留分子量10万的超滤膜超滤浓缩至1/20，浓缩液用冷冻喷干法干燥，分别制得抗呼吸道感染致病病毒特异性鸵鸟IgY和抗呼吸道感染致病细菌及真菌特异性鸵鸟IgY，然后将二者按1-10∶1-10混合即得特异性复合鸵鸟IgY粗品；

特异性复合鸵鸟IgY的纯化：分别过离子交换树脂和凝胶交换柱对上述特异性复合鸵鸟IgY粗品进行纯化即得特异性复合鸵鸟IgY纯品。

14、一种抗呼吸道感染气雾剂的制备方法，其特征在于该方法为：

(1)配方：

              抗呼吸道感染特异性复合IgY              10g

              甘油                                   20g

              阿斯巴甜                               1.2g

              薄荷脑                                 3.0g

              薄荷香精                               5ml

              乙醇                                   10ml

              桉叶油                                 1ml

              蒸馏水                                 适量

              制成                                   1000ml

(2)制法：

称取IgY、阿斯巴甜溶于800ml蒸馏水中，搅拌均匀，用1mol NaOH调pH至6.5-7.5。薄荷脑、桉叶油、薄荷香精加乙醇搅拌溶解再加甘油混合均匀，在搅拌下将此液呈细流混入上述药液中搅匀、过滤，自滤器上补加蒸馏水至1000ml混匀，测IgY效价合格后备用；

压灌封口：将上述药液灌入消毒容器中，装上阀门轧紧，上压装机压入定量99％以上纯度氮气，操作压力不低于101.3Kpa，当容器上顶时灌装针头伸入伐杆内压装机与容器阀门同时打开使氮气自动进入。制成每瓶20ml充氮气雾剂50瓶，包装即得。

15、一种抗呼吸道感染喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为：

(1)配方：

             抗呼吸道感染复合IgY            150g

             甘油                           2000g

             木糖醇                         2000g

             香橙香精                       300g

             薄荷油                         300g

             薄荷脑                         100g

             酒精                           1000ml

             蒸馏                           适量

             制成                           100升

(2)制法 ：

a、取蒸馏水80升加IgY木糖醇搅拌溶解用1mol NaOH调pH 6.5-7.5；

b、香橙香精、薄荷油、薄荷脑加酒精溶解再加甘油混匀，在搅拌下呈细流混入上述溶液中，过滤从滤器上补加蒸馏水至100升，测IgY效价合格后供灌装；

c、灌装药液：在灌装线上灌装手动定量压力喷雾罐5000支，每支20ml，再充入抛射剂30％以上，包装即得。

16、一种抗呼吸道感染常压喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为：

(1)配方：

             抗呼吸道感染复合IgY            100g

             甘油                           2000g

             PEG400                         1000g

             薄荷脑                         200g

             桔子油香精                     300g

             乙醇                           1500ml

             蒸馏水                         适量

             制成                           100升

(2)制法：

将IgY溶于80升蒸馏水中，加入甘油混匀，薄荷脑、桔子油香精加乙醇溶解，再加PEG400混匀，在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤，补加蒸馏水至全量，调pH至7.0，将药液灌入常压喷瓶中，每支20ml，全检合格后包装即得。