CN1482141A - 抗牙周病特异性复合IgY制备方法及其组合制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗牙周病特异性IgY及其制备方法和制剂。本发明制备方法包括下列步骤:筛选出引致牙周病的主要病原体,在筛选和分类组合各种病原体的基础上,分别制备单一或复合的病原体抗原,制备免疫蛋,制备抗牙周病各种病原体特异性IgY粗提物,抗牙周病各种病原体特异性IgY粗提物的纯化,本发明抗牙周病特异性IgY多种制剂用于牙周病的预防和治疗具有长效、安全、使用方便的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗牙周病特异性复合IgY及其制备方法,特别是涉及用于预防和治疗牙周病(牙龈炎、牙周炎等)特异性复合IgY及其制备方法和组合制剂。
背景技术
牙周病是人类最普遍的口腔常见多发病之一,由于牙周病初期不会引起痛楚和大的功能障碍,患者往往容易忽视,直至牙龈出血、酸软疼痛、肿胀发炎、化脓松动、槽骨病变,才就医治疗。因此牙周病发病率极高,据WHO调查统计,牙龈炎在儿童和青少年中患病率在70-90%,且随年龄增高,老年人牙周病发病率达80-90%,香港一项资料称成年人发病率高达95%。在病因学方面除少数因内分泌药物遗传、精神因素外,近50年来学者们公认各类牙周病均由牙菌斑引起的感染而致病,它比龋齿患病率更高。至今世界各国都尚无特效的药物预防和治疗,对人类健康危害极大。
目前世界各国对牙周病多用化学药物治疗或抑制菌斑细菌。100年来基本没有大的变化,有大量的研究报告试验了各种药物,目前临床最常应用的药物有硝基味唑类,如甲硝唑、替硝唑和二胍己烷类如盐酸洗必泰、醋酸洗必泰、葡萄糖酸洗必泰等,这些都是广谱抗菌药。存在最大的问题是长期使用广谱抑菌药会产生耐药菌株和二重感染及其它副作用;近年上市了一些酶类制剂,如溶菌酶、葡萄糖氧化酶、葡聚糖酶、SOD.H2O2酶、RNA酶等虽能减少菌斑形成,但稳定性很差,极易降解和失活,是口腔用药稳定性的难题。
目前使用的氟化物治疗药(含氟漱口水等)因人体“摄氟多源性”和“高氟区域性”及氟化水源等因素;再用氟化物治疗会造成摄氟过多的危害,氟牙症、氟骨症甚至致癌;用硝咪唑类、甲硝唑、替硝唑治疗牙周病,不仅味道极苦难耐,口中金属味,久用易致肝功不全者积蓄中毒、钠潴留,诱发白色念珠菌性口腔炎,周围神经炎,白细胞减少,妊娠危险、双硫仑反应、过敏等一系列副作用;洗必泰类是目前推荐的口腔用药,对龋齿和牙周病有较好的疗效,但仍逃不过广谱化学药物的弊端,重复使用引起粘膜牙龈过敏、干燥、红肿、皲裂,在其合成中对氯苯胺的残留,是潜在的致癌因素,对此美FDA和英国BP限制极严。在用该品冲洗、漱口治疗中,手脚固定性药疹、粘膜损伤经常出现。
因此,研制一种既可杀灭牙周病细菌,又没有毒副作用的天然安全,且有长效作用的新药,非常必要。抗人类牙周病多种病原微生物特异性复合卵黄抗体(Immunoglobulinof Yolk,IgY)属IgG类免疫球蛋白,它是用致牙周病多种病原体来免疫健康产蛋禽类,使之产生大量相应免疫球蛋白,经提取分离纯化,而制得特异性复合卵黄抗体。这些复合IgY对导致牙周病的多种病原体,有特异性结合抑制作用,即使在浓度极低的情况下,也能起到有效作用,并且只抑制致病菌,对口腔共生菌无作用。绝不会产生耐药菌株和二重感染,更没有化学药品的毒副作用。
技术内容
本发明的目的是提供一种直接抑制牙周病多种病原微生物的特异性复合IgY的制备方法及其制剂;本发明的目的还在于提供一种由可抑制牙周病病原微生物的特异性复合IgY制成的天然安全又具特效的预防和治疗牙周病的制剂。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
(1)筛选引致牙周病的病原微生物:
按照感染微生态学文献和临床口腔科流行病学资料,经分离筛查牙周病菌斑中31种病原菌,按照它们存在数量和出现机率,并根据这些最常见病原体的“抗原交叉性”进行分类组合,最后确定为如下8种主要致病菌:
牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingiValis)
具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum)
放线共生放线菌 (Actinobacillus actinomycetem comitans)
粘性放线菌 (Actinomgces Viscosus)
福赛类杆菌 (Bacteroides forsythus)
齿垢密螺旋体 (Treponemas denticola)
中间类杆菌 (Bacteroides intermedius)
牙龈类杆菌 (Bacteroides gingivalis)
(2)在筛选和分类组合这些病原体的基础上分别制备单一或复合的牙周病病原体抗原:按照这些病原微生物的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;
复合细菌抗原的制备:将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
将各单一或复合的牙周病致病菌一定数量加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得单一或复合的牙周病病原体抗原。
(3)制备免疫蛋
选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康母禽,每只在胸部肌肉或皮下分别多点注射所制备的单一或复合牙周病病原体抗原,在第一次注射后,间隔7天,再以同样剂量、方法注射第二次;第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次,第一次注射20天后,根据测得血清和卵黄中复合IgY的效价情况拣取高效价免疫蛋。并对应不同抗原对免疫蛋编号标记。
母禽可以是产蛋母鸡或产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟或产蛋野鸡。
(4)抗牙周病致病菌特异性复合IgY粗品制备
将不同抗原分别免疫的母禽所产禽蛋用消毒液浸泡或擦拭,用无菌纯水冲洗晾干,再分别置打蛋机中,打碎蛋壳,用卵黄筛滤除蛋清,留取蛋黄,加入5-8倍蒸馏水稀释混匀,用1mol NaOH或HCL液调节pH至5.5-6.0,4-6℃下静置过夜,此稀释液以1000-3000r/min离心20分钟,取上清用截留分子量5-10万Da超滤膜浓缩15-20倍,浓缩液用冻干法干燥,将单一抗原IgY冻干粉按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合即得抗牙周病特异性复合IgY粗品。
(5)抗牙周病致病菌特异性复合IgY纯品制备
采用本公司已公开的技术(专利申请号00101270.3,专利公开号1307061)分别过离子交换树脂柱和凝胶交换柱,对按以上工艺制取的抗牙周病复合IgY粗品进行纯化,即得纯复合IgY。
应用SDS-PAGE电泳测定法对上述IgY粗品检测,测得其中复合IgY含量为50%以上。
(6)采用酶联免疫法(ELISA)测得复合IgY生物活性效价达128-512。
将0.02-80%这种特异性IgY配以99.98-20%的药用辅料,可制成临床口腔科可接受的口喷剂、漱口水、含片、棒状治疗剂或牙膏。
本发明上述剂型直接施于口腔牙周局部预防和治疗牙周病疗效好、见效快,解决了使用各种化学治疗药对口腔难耐、刺激性、耐药性和副作用的弊端,且对口腔共生菌无影响。
实验例1:将致病菌20-35亿其中牙龈卟啉单胞菌20%,具核梭杆菌20%,放线共生放线菌20%,粘性放线菌15%,福赛类杆菌10%,齿垢密螺旋体5%,中间类杆菌5%,牙龈类杆菌5%,制成0.5ml菌液,加入0.5ml福氏佐剂充分混匀即制成复合抗原,再用它免疫产蛋母禽,拣蛋制备它们的特异性复合IgY,然后分别用牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌为检测抗原用“ELISA”方法检测所制得的抗牙周病特异性复合IgY抗体结合效价,结果如下:
IgY | 检测用抗原 | 抗体结合效价 |
抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌特异性复合IgY | 牙龈卟啉单胞菌 | 1:512 |
具核梭杆菌 | 1:512 | |
放线共生放线菌 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:512 | |
福赛类杆菌 | 1:256 | |
齿垢密螺旋体 | 1:128 | |
中间类杆菌 | 1:128 | |
牙龈类杆菌 | 1:128 |
从上述检测结果显示,采用本发明制备的复合抗原强化免疫母禽所制备的特异性复合IgY具有理想的广谱性,对所免疫的细菌有很强的抑制作用(抗体效价1:128-512)。
实验例2:方法同实验例1。注射用抗原比例改变为牙龈类杆菌20%,中间类杆菌20%,福赛类杆菌20%,齿垢密螺旋体15%,粘性放线菌10%,放线共生放线菌5%,具核梭杆菌5%,牙龈卟啉单胞菌5%时,检测抗体结合效价结果如下:
IgY | 检测用抗原 | 抗体结合效价 |
抗牙龈类杆菌、中间类杆菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、粘性放线菌、放线共生放线菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌特异性复合IgY | 牙龈类杆菌 | 1:512 |
中间类杆菌 | 1:512 | |
福赛类杆菌 | 1:512 | |
齿垢密螺旋体 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:256 | |
放线共生放线菌 | 1:128 | |
具核梭杆菌 | 1:128 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:128 |
由上表可见抗原比例改变,强化免疫后所提取的特异性复合IgY抗体结合效价也发生相应变化,免疫应答性十分良好。
实验例3:采用实验例1制作的复合抗原,分别免疫产蛋母鸡、产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋火鸡以及产蛋鸵鸟。再分别采用本发明的方法制备得到:(1)抗牙周病致病菌特异性鸡IgY、(2)抗牙周病致病菌特异性鸭IgY、(3)抗牙周病致病菌特异性鹅IgY、(4)抗牙周病致病菌特异性火鸡IgY、(5)抗牙周病致病菌特异性鸵鸟IgY。然后,采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别以牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌为检测用抗原,检测这五种抗牙周病致病菌特异性IgY的抗体效价。结果如下表
IgY | 检测用抗原 | 抗体效价 |
抗牙周病致病菌特异性鸡IgY | 牙龈卟啉单胞菌 | 1:512 |
具核梭杆菌 | 1:512 | |
放线共生放线菌 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:512 | |
福赛类杆菌 | 1:256 | |
齿垢密螺旋体 | 1:128 | |
中间类杆菌 | 1:128 | |
牙龈类杆菌 | 1:128 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:512 |
抗牙周病致病菌特异性鸭IgY | 牙龈卟啉单胞菌 | 1:512 |
放线核梭放线菌 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:512 | |
福赛类杆菌 | 1:256 | |
齿垢密螺旋体 | 1:128 | |
中间类杆菌 | 1:128 | |
牙龈类杆菌 | 1:128 | |
抗牙周病致病菌特异性鹅IgY | 牙龈卟啉单胞菌 | 1:256 |
具核梭杆菌 | 1:256 | |
放线共生放线菌 | 1:256 | |
粘性放线菌 | 1:256 | |
福赛类杆菌 | 1:128 | |
齿垢密螺旋体 | 1:64 | |
中间类杆菌 | 1:64 | |
牙龈类杆菌 | 1:64 | |
抗牙周病致病菌特异性火鸡IgY | 牙龈卟啉单胞菌 | 1:128 |
具核梭杆菌 | 1:128 | |
放线共生放线菌 | 1:128 | |
粘性放线菌 | 1:128 | |
福赛类杆菌 | 1:64 | |
齿垢密螺旋体 | 1:32 | |
中间类杆菌 | 1:32 | |
牙龈类杆菌 | 1:32 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:128 | |
具核梭杆菌 | 1:128 | |
放线共生放线菌 | 1:128 | |
粘性放线菌 | 1:128 | |
福赛类杆菌 | 1:64 | |
齿垢密螺旋体 | 1:32 | |
中间类杆菌 | 1:32 |
牙龈类杆菌 | 1:32 |
从以上试验结果可以看出,采用本发明的方法制作抗原,用免疫激活方法免疫母鸡、母鸭、母鹅、产蛋火鸡或产蛋鸵鸟,再采用本发明的方法分别制得抗牙周病致病菌特异性鸡IgY、抗牙周病致病菌特异性鸭IgY、抗牙周病致病菌特异性鹅IgY、抗牙周病致病菌特异性火鸡IgY、抗牙周病致病菌特异性鸵鸟IgY五种不同的IgY,虽然免疫的禽类不同,但是所制得的特异性IgY对引致牙周病的几种致病菌都有较强的抑制效果。虽然免疫产蛋鸵鸟和产蛋火鸡所制得的IgY抗体效价从检测数据看稍微低了一些,但是,由于鸵鸟和火鸡蛋个体特别大,每个免疫蛋所能提取得到的IgY比鸡免疫蛋和鸭免疫蛋以及鹅免疫蛋都多得多,这点对于工业化大规模生产,也是十分可取的。
实验例4:采用实验例2制作的复合抗原,分别免疫产蛋母鸡、产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋火鸡以及产蛋鸵鸟。再分别采用本发明的方法制备得到:(1)抗牙周病致病菌特异性鸡IgY、(2)抗牙周病致病菌特异性鸭IgY、(3)抗牙周病致病菌特异性鹅IgY、(4)抗牙周病致病菌特异性火鸡IgY、(5)抗牙周病致病菌特异性鸵鸟IgY。然后,采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别以牙龈类杆菌、中间类杆菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、粘性放线菌、放线共生放线菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌为检测用抗原,检测这五种抗牙周病致病菌特异性IgY的抗体效价。结果如下表
IgY | 检测用抗原 | 抗体效价 |
抗牙周病致病菌特异性鸡IgY | 牙龈类杆菌 | 1:512 |
中间类杆菌 | 1:512 | |
福赛类杆菌 | 1:512 | |
齿垢密螺旋体 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:256 | |
放线共生放线菌 | 1:128 | |
具核梭杆菌 | 1:128 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:128 | |
牙龈类杆菌 | 1:512 | |
中间类杆菌 | 1:512 |
抗牙周病致病菌特异性鸭IgY | 福赛类杆菌 | 1:512 |
齿垢密螺旋体 | 1:512 | |
粘性放线菌 | 1:256 | |
放线共生放线菌 | 1:128 | |
具核梭杆菌 | 1:128 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:128 | |
抗牙周病致病菌特异性鹅IgY | 牙龈类杆菌 | 1:256 |
中间类杆菌 | 1:256 | |
福赛类杆菌 | 1:256 | |
齿垢密螺旋体 | 1:256 | |
粘性放线菌 | 1:128 | |
放线共生放线菌 | 1:64 | |
具核梭杆菌 | 1:64 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:64 | |
抗牙周病致病菌特异性火鸡IgY | 牙龈类杆菌 | 1:128 |
中间类杆菌 | 1:128 | |
福赛类杆菌 | 1:128 | |
齿垢密螺旋体 | 1:128 | |
粘性放线菌 | 1:64 | |
放线共生放线菌 | 1:32 | |
具核梭杆菌 | 1:32 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:32 | |
抗牙周病致病菌特异性鸵鸟IgY | 牙龈类杆菌 | 1:128 |
中间类杆菌 | 1:128 | |
福赛类杆菌 | 1:128 | |
齿垢密螺旋体 | 1:128 | |
粘性放线菌 | 1:64 | |
放线共生放线菌 | 1:32 | |
具核梭杆菌 | 1:32 | |
牙龈卟啉单胞菌 | 1:32 |
由上表可见抗原比例改变,强化免疫后所提取的各种不同产蛋禽类的特异性复合IgY抗体结合效价也发生相应变化,免疫应答性十分良好。
实验例5:牙周病患者以本发明的抗牙周病特异性复合IgY为原料制备组合口腔喷剂和短棒剂,进行治疗观察。
(1)在牙周病患者中随机选择牙龈炎患者20名和牙周炎患者20名。
(2)牙龈炎患者用口腔喷剂每日于刷牙后饭后漱口后及中间时间、睡前,施喷剂于牙龈牙齿部位每次4-6喷,每日4-6次,对牙周炎患者(牙周袋0-2mm)先用施用口腔喷剂,再在牙周袋中嵌入短棒剂或IgY颗粒剂,每次饭后清洁口腔后嵌一颗,睡前嵌一粒,共4次。
(3)观察牙龈、牙周袋、牙菌斑变化情况。
(4)用药7-15天,20名牙龈炎患者症状基本消失齿龈由暗红色转为正常红色,肿痛出血消失,灼烧感消失。
牙周炎患者15人用药后1-5天内压挤无脓液,疼痛消失,叩诊转阴,牙周袋闭合,另5人症状明显减轻,牙菌斑明显变淡,无新斑发展。
(5)连续用药15天,牙龈炎20人症状消失,牙周炎(牙周袋形成0-2mm)20人,18人牙周袋闭合,龈肿出血消失,动度改善,菌斑消失或明显变淡,1人只龈乳头轻度肿胀,1人有轻度牙菌斑。
实施例1:制备100g抗牙周病特异性IgY
(1)选具高免疫应答能力的良种鸭:
用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只母鸭,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次。于第一次注射后第7个月,将这些鸭所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的鸭200只,再用这批鸭所产的蛋孵出优良鸭种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭;
(2)牙周病病原体复合抗原的制备
按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;
将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原。
(3)分别对优选的特种母鸭进行强化免疫:
用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种母鸭进行免疫,每只母鸭每次注射量达到1ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化。第一次免疫20天后,开始拣取免疫鸭蛋至第10个月终止并淘汰母鸭。
(4)抗牙周病特异性IgY的制备:
首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0N HCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩至1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
实施例2:制备一种抗牙周病口腔喷剂
按以下配方调配100升抗牙周病特异性IgY组合溶液
抗牙周病特异性IgY 150g
甘 油 1500g
甘露醇 1500g
薄荷醇 200g
薄荷油 300g
桉叶油 100g
酒 精 2000ml
蒸馏水 适量
制 成 100升
制备工艺:
1、取总量80%的蒸馏水加入甘露醇搅拌溶解,再加入IgY溶解搅拌均匀,用1mol/LNaOH调节pH至6.5-7.5。
2、薄荷脑加薄荷油、桉叶油、乙醇搅拌溶解加入甘油充分混合均匀。
3、再搅拌将2项缓缓加于1项中,并充分搅拌均匀。
4、过滤,从滤器上补加蒸馏水至全量,检验澄明度,pH效价合格后供灌装于常压喷中,每支20ml,全检合格后包装即得。
实施例3:一种牙周袋用颗粒剂的制备
配方:
抗牙周病特异性复合IgY 100g
羟丙基甲基纤维素(HPMC) 400g
羟丙基甲基纤维素磷苯二甲酸酯(HPMCP) 400g
胶性微粉硅胶 20g
聚乙二醇4000(PEG 4000) 80g
丙 酮 适量
全 量 1000g
制备工艺:
1、将特异性复合IgY,HPMC、HPMCP胶性SiO2和PHG4000混合均匀一同过30目筛预混两次;
2、加入丙酮适量制成适宜软性材料;
3、装入九号针筒,挤出成型,室温下挥去溶剂,再真空除去溶剂;
4、将上述成型物切成细条状使重量在1.5-2mg之间,密封包装即得抗牙周病复合IgY条粒剂,用于嵌入牙周袋除牙菌斑消炎治疗。
实施例4:制备一种抗牙周病特异性复合IgY含片
配方:
抗牙周病特异性复合IgY 3.8g
山 梨 醇 505.5g
麦芽糊精 225g
阿斯巴甜 0.9g
薄 荷 醇 1.5g
薄 荷 油 0.98ml
桉 叶 油 0.33ml
2%羟丙甲基纤维素50%乙醇液 适量
乙 醇 适量
制 成 1000片
制备工艺:
1、山梨醇、麦芽糊精、阿巴斯甜分别过80目筛,按配方比例混合均匀,过60目筛一次;
2、以2%羟丙甲基纤维素50%乙醇液作粘合剂,加入上述混合粉中制成适宜软材,16目尼龙筛制粒,60#通风干燥,颗粒水分3-5%收粒,过14目筛整粒,筛出适量细粉加入IgY粉混匀,并混入颗粒中拌匀;
3、薄荷醇加薄荷油、桉叶油并加乙醇适量(约5ml)溶解,喷于上述颗粒中密闭4小时,加入硬脂酸镁(按总量1%)混均压片,每片重约0.75g。
Claims (16)
1、一种抗牙周病特异性IgY,其特征在于该抗牙周病特异性IgY的制备方法包括下列步骤:
分离和培养引致牙周病的主要病原体,制备单一或复合的牙周病病原体抗原;制备免疫蛋;制备抗牙周病特异性IgY粗提物;抗牙周病特异性IgY粗提物的纯化;制备多种抗牙周病特异性IgY制剂。
2、如权利要求1所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于该抗牙周病特异性IgY的制备方法包括下列步骤:
在筛选和分类组合这些病原体的基础上分别制备单一或复合的牙周病病原体抗原:按照这些病原微生物的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将培养好的病原体单独或按适当比例混合,再按1∶1比例或其他适当比例分别加入福氏佐剂,置入高速匀浆机中高速匀化,形成油包水溶液,即制成单一或复合的牙周病病原体抗原;
制备免疫蛋:选择具有高免疫应答能力的产蛋SPF健康母禽,每只在胸部肌肉或皮下分别多点注射所制备的单一或复合牙周病病原体抗原,在第一次注射后,间隔7天,再以同样剂量、方法注射第二次;第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次,第一次注射20天后,根据测得血清和卵黄中复合IgY的效价情况拣取高效价免疫蛋,并对应不同抗原对免疫蛋编号标记;
制备抗牙周病致病菌特异性复合IgY粗品:将不同抗原分别免疫的母禽所产禽蛋用消毒液浸泡或擦拭,用无菌纯水冲洗晾干,再分别置打蛋机中,打碎蛋壳,用卵黄筛滤除蛋清,留取蛋黄,加入5-8倍蒸馏水稀释混匀,用1mol NaOH或HCL液调节pH至5.5-6.0,4-6℃下静置过夜,此稀释液以1000-3000r/min离心20分钟,取上清用截留分子量5-10万Da超滤膜浓缩15-20倍,浓缩液用冻干法干燥,将各单一抗原的IgY冻干粉按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合,即得抗牙周病特异性复合IgY粗品;
抗牙周病致病菌特异性IgY粗品的纯化:将以上工艺所制取的抗牙周病致病菌特异性IgY粗品分别先后过离子交换柱和凝胶层析柱,即得纯IgY。
3、如权利要求1或2所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于该抗牙周病特异性IgY的制备方法中引致牙周病的病原体包括:牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌。
4、如权利要求1或2所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于该抗牙周病特异性IgY的制备方法中制备免疫蛋所采用的产蛋禽类包括母鸡、母鸭、母鹅、火鸡、鸵鸟。
5、如权利要求2所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于该抗牙周病特异性IgY的制备方法中所述复合的牙周病病原体抗原的制备是这样的:将培养好并稀释分装的各病原体按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此类推的比例均匀混合,加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得复合的牙周病病原体抗原。
6、如权利要求5所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于所述复合的牙周病病原体抗原中各组分按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
7、如权利要求1或2所述的抗牙周病特异性IgY,其特征在于将0.02-80%的特异性IgY配以99.98-20%的药用辅料,可制成临床口腔科可接受的口喷剂、漱口水、含片、棒状治疗剂或牙膏。
8、一种抗牙周病特异性鸡IgY,其特征在于这种抗牙周病特异性鸡IgY的制备方法包括下列步骤:
选具高免疫应答能力的良种母鸡:用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只母鸡,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次,于第一次注射后第7个月,将这些母鸡所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的母鸡200只,再用这批母鸡所产的蛋孵出优良鸡种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种母鸡;
牙周病病原体复合抗原的制备:按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原;
制备免疫蛋:用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种母鸡进行免疫,每只母鸡每次注射量达到1ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化,第一次免疫20天后,开始拣取免疫鸡蛋至第10个月终止并淘汰母鸡;
抗牙周病特异性IgY的制备:首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0N HCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
9、一种抗牙周病特异性鸭IgY,其特征在于这种抗牙周病特异性鸭IgY的制备方法包括下列步骤:
选具高免疫应答能力的良种鸭:用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只母鸭,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次,于第一次注射后第7个月,将这些鸭所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的鸭200只,再用这批鸭所产的蛋孵出优良鸭种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭;
牙周病病原体复合抗原的制备:按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原;
制备免疫蛋:用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种母鸭进行免疫,每只母鸭每次注射量达到1-2ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化,第一次免疫20天后,开始拣取免疫鸭蛋至第10个月终止并淘汰母鸭;
抗牙周病特异性IgY的制备:首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0N HCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩至1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
10、一种抗牙周病特异性鹅IgY,其特征在于这种抗牙周病特异性鹅IgY的制备方法包括下列步骤:
选具高免疫应答能力的良种母鹅:用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只母鹅,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次,于第一次注射后第7个月,将这些母鹅所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的母鹅200只,再用这批母鹅所产的蛋孵出优良鹅种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅;
牙周病病原体复合抗原的制备:按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原;
分别对优选的特种母鹅进行免疫:用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种母鹅进行免疫,每只母鹅每次注射量达到2-10ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化,第一次免疫20天后,开始拣取免疫鹅蛋至第10个月终止并淘汰母鹅;
抗牙周病特异性IgY的制备:首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0NHCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩至1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
11、一种抗牙周病特异性火鸡IgY,其特征在于这种抗牙周病特异性火鸡IgY的制备方法包括下列步骤:
选具高免疫应答能力的良种产蛋火鸡:用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只产蛋火鸡,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次,于第一次注射后第7个月,将这些产蛋火鸡所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的产蛋火鸡200只,再用这批产蛋火鸡所产的蛋孵出优良火鸡种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋火鸡;
牙周病病原体复合抗原的制备:按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原;
分别对优选的特种产蛋火鸡进行免疫:用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种产蛋火鸡进行免疫,每只产蛋火鸡每次注射量达到3-15ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化,第一次免疫20天后,开始拣取免疫火鸡蛋至第10个月终止并淘汰产蛋火鸡;
抗牙周病特异性IgY的制备:首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0N HCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩至1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
12、一种抗牙周病特异性鸵鸟IgY,其特征在于这种抗牙周病特异性鸵鸟IgY的制备方法包括下列步骤:
选具高免疫应答能力的良种产蛋鸵鸟:用牙龈卟啉单胞菌制作抗原,分别免疫1000只产蛋鸵鸟,每次注射1ml抗原,在第一次注射后,每隔二周再注射一次,共三次,于第一次注射后第7个月,将这些产蛋鸵鸟所产的蛋标记后,按常规方法分别提取其IgY;以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价;选出其中IgY效价≥256的产蛋鸵鸟200只,再用这批产蛋鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种,待其长大至2-3个月,作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟;
牙周病病原体复合抗原的制备:按照牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线共生放线菌、粘性放线菌、福赛类杆菌、齿垢密螺旋体、中间类杆菌、牙龈类杆菌的培养特性和最适培养条件,分别选择适宜的培养基,进行菌株大量繁殖和扩增,然后收获培养物,进行提纯、菌株计数、稀释分装;将以上培养纯化分装好的单一抗原参照牙周病菌斑中所出现机率和所占比例,按如下百分比混合:
牙龈卟啉单胞菌 20-5%
具核梭杆菌 20-5%
放线共生放线菌 20-5%
粘性放线菌 15-10%
福赛类杆菌 10-20%
齿垢密螺旋体 5-15%
中间类杆菌 5-20%
牙龈类杆菌 5-20%
然后向含20-35亿菌数/0.5ml混合菌液中,按1∶1的比例加入福氏佐剂,再放入高速匀浆机中以10000-30000r/min匀化,使成为均一W/O乳状液,制得牙周病致病菌复合抗原;
分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫:用所制得的牙周病致病菌复合抗原,采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法,分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫,每只产蛋鸵鸟每次注射量达到3-15ml抗原,注射后第7天、第14天再同样各注射一次进行强化,第一次免疫20天后,开始拣取免疫鸵鸟蛋至第10个月终止并淘汰产蛋鸵鸟;
抗牙周病特异性IgY的制备:首先将免疫蛋洗净,酒精消毒晾干;用打蛋机将免疫蛋打碎,蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;加入4-6倍蒸馏水,混合均匀;用1.0N HCL溶液调整pH至6.0-6.5,进一步充分搅拌均匀,4-6℃下静置过夜,将此稀释液2000r/min离心20分钟;取上清液用截留分子量7-10万超滤膜浓缩至1/20;浓缩液加入0.1-0.3%海藻酸钠充分混匀,4℃过夜,12000rpm离心20分钟;取上清超滤;继而用膜过滤技术除菌;冷冻干燥,即制得抗牙周病特异性IgY粗提物;过离子交换柱和凝胶交换柱,对抗牙周病特异性IgY粗提物进行纯化,即得纯IgY。
13、一种抗牙周病口腔喷剂的制备方法,其特征在于该方法为:
按以下配方调配100000体积份抗牙周病特异性IgY组合溶液
抗牙周病特异性IgY 150重量份
甘 油 1500重量份
甘露醇 1500重量份
薄荷醇 200重量份
薄荷油 300重量份
桉叶油 100重量份
乙 醇 2000体积份
蒸馏水 适量
制 成 100000体积份
制备工艺:
取总量80%的蒸馏水加入甘露醇搅拌溶解,再加入IgY溶解搅拌均匀,用1mol/L NaOH调节pH至6.5-7.5;薄荷醇加薄荷油、桉叶油、乙醇搅拌溶解加入甘油充分混合均匀;在搅拌下将后项缓缓加于前项中,并充分搅拌均匀;过滤,从滤器上补加蒸馏水至全量,检验澄明度,pH效价合格后供灌装于常压喷瓶中,每支20ml,全检合格后包装即得。
14、一种牙周袋用颗粒剂的制备方法,其特征在于该方法为:
配方:
抗牙周病特异性复合IgY 100重量份
羟丙基甲基纤维素(HPMC) 400重量份
羟丙基甲基纤维素磷苯二甲酸酯(HPMCP) 400重量份
胶性微粉硅胶 20重量份
聚乙二醇4000(PEG 4000) 80重量份
丙 酮 适量
全 量 1000重量份
制备工艺:
将特异性复合IgY,HPMC、HPMCP胶性SiO2和PHG4000混合均匀一同过30目筛预混两次;加入丙酮适量制成适宜软性材料;装入九号针筒,挤出成型,室温下挥去溶剂,再真空除去溶剂;将上述成型物切成细条状使重量在1.5-2mg之间,密封包装即得抗牙周病复合IgY颗粒剂。
15、一种抗牙周病特异性复合IgY含片的制备方法,其特征在于该方法为:
配方:
抗牙周病特异性复合IgY 3.8重量份
山 梨 醇 505.5重量份
麦芽糊精 225重量份
阿斯巴甜 0.9重量份
薄 荷 醇 1.5重量份
薄 荷 油 0.98体积份
桉 叶 油 0.33体积份
2%羟丙甲基纤维素50%乙醇液 适量
乙 醇 适量
制 成 1000片
制备工艺:
山梨醇、麦芽糊精、阿巴斯甜分别过80目筛,按配方比例混合均匀,过60目筛一次;
以2%羟丙甲基纤维素50%乙醇液作粘合剂,加入上述混合粉中制成适宜软材,16目尼龙筛制粒,60℃通风干燥,颗粒水分3-5%收粒,过14目筛整粒,筛出适量细粉加入IgY粉混匀,并混入颗粒中拌匀;
薄荷醇加薄荷油、桉叶油并加乙醇适量(约5体积份)溶解,喷于上述颗粒中密闭4小时,加入硬脂酸镁(按总量1%)混均压片,每片重约0.75重量份。
16、一种抗牙周病牙膏的制备方法,其特征在于该方法为:
将适量抗牙周病特异性复合IgY加入牙膏中,混匀即得。
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