CN106075436B

CN106075436B - 一种不含抗生素的抗幽门螺杆菌口服制剂

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Publication number: CN106075436B
Application number: CN201610548167.0A
Authority: CN
Inventors: 闫小君
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-07-12
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2036-07-12
Also published as: CN106075436A

Abstract

本发明涉及一种抗幽门螺杆菌口服制剂，其包含抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白、乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素。所述抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白的含量为6‑12重量份、所述乳铁蛋白的含量2‑5重量份，并且所述麦绿素中的叶绿素的含量为2‑5重量份。通过本发明的制剂，能够在不使用抗生素的情况下治愈幽门螺杆菌感染，既提高了治愈率，又消除了使病原体产生耐药性和愈后复发的潜在性，同时大大降低了不良反应率。

Description

一种不含抗生素的抗幽门螺杆菌口服制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，更特别地，涉及一种抗幽门螺杆菌口服制剂。

背景技术

幽门螺杆菌(HP)于1983年由Marshll等成功分离。许多研究证实幽门螺杆菌是引起慢性胃炎，十二指肠溃疡的主要致病菌，是导致胃癌发生的潜在因素。目前，幽门螺杆菌的感染人群分布于全世界各地，在人群中的检出率在20％-80％之间，且发展中国家比发达国家高。

目前普遍采用国际标准三联疗法(STT)对幽门螺杆菌进行治疗，即将铋、甲硝唑与四环素或羟氨苄青霉素联合使用，最初该疗法的幽门螺杆菌根除率为90％。该疗法副作用大，抗生素的滥用导致幽门螺杆菌耐药性提高，使抗生素的用量越来越大，而同时治疗效果缺逐年下降，现在该疗法的幽门螺杆菌根除率已经降低到80％左右了。幽门螺杆菌在抗生素和体内不利因素的诱导下可能形成细胞壁缺陷的L型。这也是临床上幽门螺杆菌感染治愈后易复发的主要因素。此外，三联疗法的不良反应率居高不下也是令人困扰的问题之一。

近年来，人们在降低不良反应率和寻找上述三联疗法的替代疗法方面做了大量工作。

有研究表明，当使用乳铁蛋白与抗生素联用时，能够大大降低单独使用抗生素时的不良反应率。乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白，具有强的铁离子结合能力。通过乳铁蛋白螯合细菌生存环境中的铁离子，可由此达到抑菌的效果。因此乳铁蛋白与抗生素配合治疗幽门螺杆菌感染降低了不良反应率，同时提高了治愈率。但是，乳铁蛋白本身的抑菌效果不足以完全消除幽门螺杆菌，因而必须与抗生素联用，所以，仍然无法摆脱抗生素的许多固有缺陷。

抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)是另一种有前途的幽门螺杆菌抑制剂。抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白通过用灭活或减毒的幽门螺杆菌，或者幽门螺杆菌的表面抗原来免疫生蛋的母鸡，使该母鸡所生的蛋的卵黄中含有抗幽门螺杆菌的免疫球蛋白。已有许多研究者和医药公司制作出在体外能够高效特异性地杀伤幽门螺杆菌的鸡卵黄免疫球蛋白。

鸡的IgY分子量约为180Kd，等电点接近5.2。其性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4℃存储6-7年活性下降仅5％以下。IgY耐碱耐酸，在ph 4.0-11.0时稳定，在ph 3.0时活性迅速下降。此外，IgY可抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。抗体经口服途径进入机体后仍保持有效，能耐受酶的分解作用，并且能在自身功能和结构不变的情况下到达其发挥作用的部位。IgY对酸及胃蛋白酶的稳定性差，是其广泛应用的一个限制性因素。因此，有必要采取措施提高其稳定性。Nomura等认为IgY在胃酸环境下活性容易丧失，加入组氨H2拮抗剂—法莫替丁后能保持活性。在动物实验中，给感染HP小鼠饲喂IgY的同时加入法莫替丁，发现该制剂能有效防止HP定植。

大麦初生嫩芽中的麦绿素富含多种人体需要的营养素，包括：矿物质、氨基酸、多种酶、各种维生素、植物黄酮、可溶性膳食纤维、天然叶绿素、二十六烷醇等，可以全面均衡细胞营养，调节机体酸碱度。让细胞充满活力，加速自我修复速度，增强免疫力，固本正源，康复疾病。

麦绿素中包含了大量的叶绿素。现代医学发现，叶绿素有强效的消炎作用，消炎功能是黄胺类药物的30倍。它可促进溃疡伤口肉芽新生加速伤口愈合。特别是久治难愈的胃溃疡，其作用比传统的抗溃疡胃药还要好。除此之外，它还有保护胃壁和抗胃蛋白酶的作用，对慢性胃炎有良好的效果。

因此，目前仍然需要一种有效的治疗剂来替代使用了大量抗生素的三联疗法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种抗幽门螺杆菌口服制剂，其特征在于，包含抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白、乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素。

优选地，所述抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白的含量为6-12重量份、所述乳铁蛋白的含量2-5重量份，并且所述麦绿素中的叶绿素的含量为2-5重量份。

优选地，所述抗幽门螺杆菌口服制剂为粉剂、片剂、丸剂、胶囊或口服液。

优选地，所述抗幽门螺杆菌口服制剂还包含赋形剂、缓冲剂、调味剂、着色剂和保存剂中的一种或多种组合。

优选地，所述抗幽门螺杆菌口服制剂由单元剂型组成，每个所述单元剂型中含有60-120mg的所述抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白，20-50mg的所述乳铁蛋白和20-50mg的所述麦绿素中的叶绿素。

通过本发明的制剂，能够在不使用抗生素的情况下治愈幽门螺杆菌感染，既提高了治愈率，又消除了使病原体产生耐药性和愈后复发的潜在性，同时大大降低了不良反应率。

具体实施方式

发明人在研究用麦绿素中的叶绿素治疗幽门螺杆菌感染的过程中出乎意料地发现，当将乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素与抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白配合使用时，可大大提高其杀伤幽门螺杆菌的效力。不受现有理论的约束，发明人认为，有可能是因为乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素的存在改善了抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白的工作环境，使得抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白能够在胃中发挥杀伤幽门螺杆菌的作用。

在该发现的基础上，发明人制备出了能够有效治疗幽门螺杆菌感染的口服制剂。

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.麦绿素中的叶绿素的制备

1.1工艺流程

大麦苗鲜样→挑选、清洗、沥干→真空冷冻干燥(预冻温度：-45℃；冷阱温度：-37℃；升华温度：25℃；真空度：170Pa)→粉碎(100目)→浸提→过滤→减压浓缩成膏状(水浴温度：30℃；真空度：110Pa)。

1.2指标测定

将干燥后的大麦苗用高速粉碎机粉碎，过100目筛。称取样品约2.00g置于250mL锥形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液提取溶剂，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中以一定转速恒温摇晃浸提，提取完成后将提取液10℃、10,000r/min离心15min，取2mL上清液用相应体积分数的乙醇溶液定容至50mL容量瓶中，采用紫外分光光度法测定叶绿素含量；叶绿素提取量采用下式进行计算。

式中：Y为大麦苗叶绿素提取量/(mg/g)；m为提取液中叶绿素含量/(mg/mL)；M为提取样品质量/g。

本发明叶绿素提取工艺参数为液料比31∶1、乙醇体积分数92％、提取时间112min，在此工艺条件下，叶绿素提取量为13.622mg/g。

2.从牛乳中分离纯化乳铁蛋白

通过以方法从牛乳中分离纯化乳铁蛋白：

1)原料乳预处理：将原料乳用消毒纱布过滤，除去大部分杂质，用离心式净乳机进行净化，放于水池冷却，于-18℃下储存待用；

2)缓化：冷冻的初乳化冻时放置室温缓化；

3)脱脂：用奶油分离机进行脱脂；

4)酪蛋白沉淀：脱脂乳放置于38℃、pH 4.6下进行沉淀；

5)乳清分离：由于乳清超滤时,膜面必将产生蛋白质凝乳层,因而板式和管式组件较适合乳铁蛋白分离。滤膜选用醋酸纤维素和聚砜超滤膜,由于乳铁蛋白分子量为82000～86000，故选用截留分子量为60000和100000两种膜；

6)超滤分离：先用截留分子量为60000的膜处理,当透过液达0.5L时,在浓缩液中加入同体积的生理盐水,再处理得0.25L分子量大于8×105的过滤液,所得浓缩液用截留分子量为100000的膜处理得滤液0.25ml分子量小于9×10⁵,经过两种膜处理后的蛋白质分子量介于8×10⁵和9×10⁵之间；

7)添加抗变性剂：向浓缩液中添加蔗糖、柠檬酸盐、磷酸盐等以增加乳铁蛋白的稳定性；

8)杀菌：将65℃～70℃、30min低温杀菌；

9)干燥：采用冷冻干燥法,此法对乳铁蛋白的生物活性损失小；也可应用超滤技术制备乳铁蛋白的回收率可达70％左右,浓缩倍数达2.7,超滤操作简便,费用相对较低,易于形成工业化规模。

3.抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的提取与纯化

按以下方法制备抗幽门螺杆菌IgY：

3.1免疫：向鸡肌肉注射免疫原1ml，隔两周注射一次，共3次。1月后收集鸡蛋，共提取IgY抗体之用。

3.2两步硫酸铵提取方法：

取消毒完毕的鸡蛋1个，用剪刀打开一个小洞，让蛋清缓缓流出至不能再流出后，再以无菌生理盐水洗净卵清，将整个卵黄小心移至滤纸上，来回滚动，除尽蛋清。再用针头刺破蛋黄，使之移到量筒。量取约8ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释卵黄，混匀后调ph值为5.1，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000r/min离心30min,再将上清液用滤纸过滤除脂，获得较轻上清液。上清液加入硫酸铵晶体，使其浓度为19％，静置1h后，再次于4℃下12000r/min离心15min，取其白色沉淀。将白色沉淀溶于15ml 0.01mol/l PH 7.4的PBS中，再加入硫酸铵晶体，使其浓度为14％，再次静置1h后，再次于4℃下12000r/min离心15min，取其白色沉淀，溶于2ml 0.01mol/L、PH 7.4的PBS中。置于双蒸水中搅拌透析，1h后更换透析液一次，共4-5次，透析过夜后，析出透析后的样品，再以0.22μm滤器过滤灭菌。获得IgY后用无菌EP管盛装，置-20℃保存。

3.3透析袋处理：

在300ml透析处理液(2％NaHCO₃，1mmol/L EDTA,pH 8.0)中将透析袋煮沸10min后，以蒸馏水彻底漂洗后再在300ml pH8、1mmol/L EDTA液中煮沸10min，再以灭菌水里外彻底冲洗。

3.4SDS-PAGE电泳：

根据目标蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，进行SDS-PAGE电泳。

经软件分析所得IgY的纯度为90％以上，蛋白得率为6.25g/L蛋黄。

4.抗幽门螺杆菌口服制剂的制备

本实施例的抗幽门螺杆菌口服制剂为胶囊剂，将抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白、乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素碾成粉末，按表1所示的量装填于胶囊中。

表1抗幽门螺杆菌口服胶囊中的活性组分含量

5.使用上述实施例中的抗幽门螺杆菌口服制剂治疗幽门螺杆菌感染的患者

将150名被诊断患有幽门螺杆菌感染的患者随机分成5组，每组30名，其中4组分别口服实施例1-4中的一种口服制剂进行治疗，每天两次，每次一粒，持续四周。余下的一组使用标准三联疗法治疗，奥美拉唑胶囊0.8mg/(kg·d)、阿莫西林50mg/(kg·d)、克林霉素15mg/(kg·d)治疗两周，两周后停用抗生素，继续服用奥美拉唑2周，总疗程4周。

用药期间通过问诊来确定是否有不良反应。停药两周后，通过¹⁴C-尿素呼气试验来评估治愈情况。治疗效果和不良反应见表2。

从治疗效果和不良反应率可看出，本发明的口服制剂可用于治疗幽门螺杆菌感染，治疗效果优于传统的三联疗法，并且大大降低了不良反应率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗幽门螺杆菌口服制剂，其特征在于，包含抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白、乳铁蛋白和麦绿素中的叶绿素，所述抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白的含量为6-12重量份、所述乳铁蛋白的含量2-5重量份，并且所述麦绿素中的叶绿素的含量为2-5重量份。

2.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌口服制剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌口服制剂为粉剂、片剂、丸剂、胶囊或口服液。

3.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌口服制剂，其特征在于，还包含赋形剂、缓冲剂、调味剂、着色剂和保存剂中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗幽门螺杆菌口服制剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌口服制剂由单元剂型组成，每个所述单元剂型中含有60-120mg的所述抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白，20-50mg的所述乳铁蛋白和20-50mg的所述麦绿素中的叶绿素。