CN1557492A - 抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球蛋白制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗胃部疾病的产品制备方法及其应用,特别涉及一种从免疫乳牛的牛奶中提取和分离抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球蛋白制剂的制备方法和应用,其特征是,选择健康妊娠的母牛免疫接种幽门螺旋杆菌乳状混悬液或用其他方法制备的幽门螺旋杆菌疫苗,从被免疫的母牛的初乳或牛奶中分离、提纯对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球蛋白,采用浓缩提纯的制剂,给患者口服,杀灭粘附在消化道粘膜上的幽门螺旋杆菌,从而治疗由于幽门螺旋杆菌所致的胃肠道溃疡或其他慢性胃肠道炎症。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种治疗胃部疾病的产品制备方法及其应用,特别涉及一种从免疫乳牛的牛奶中提取和分离抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球旦白制剂的制备方法和应用。
发明技术背景
现代研究证明幽门螺旋杆菌是引起胃肠道溃疡及炎症的主要原因,临床应用抗菌素或铋复合物杀灭幽门螺旋杆菌,能够明显缓解胃肠道溃疡及慢性炎症。
幽门螺旋杆菌直径约0.85μm,长度约2.9μm,其生长需厌氧环境,并能耐受局部很大范围的PH值变化,能够在强酸环境下生存,并能附于胃和十二指肠粘膜表面,引发胃肠道溃疡和慢性炎症。
幽门螺旋杆菌的特殊生存环境及能附于胃肠道的特性,使灭除或治疗很困难,因为其抗菌药物不仅需要在低PH值的酸性环境中稳定,还要能穿透胃肠粘膜,并且能够在局部发挥有效的抗菌作用。至今为止,仍未发现理想的抗幽门螺旋杆菌的抗菌药物。
目前,临床上应用于治疗慢性活动性胃和肠道溃疡的药物是组织胺H2受体拮抗剂、铋复合物和抗菌素,这些制剂的治疗效果并不十分理想,而且其中某些制剂还有付作用,例如,用抗菌素治疗幽门螺旋杆菌并获得足够的效果,通常需要4~6周时间,这期间会导致患者腹泻和胃肠道不适,而铋复合制剂还会引起其他付反应。较为理想的治疗胃肠道溃疡的药物是组织胺H2受体拮抗剂,通过抑制胃酸和胃旦白酶释放而发挥作用,能有效地促进溃疡恢复,但不能清除诱发溃疡的病因,因此,如果能够同时有效的清除螺旋杆菌,则能获得更理想效果。
众所周知,牛初乳中含有高活性的免疫球旦白,能够有效对抗多种微生物。通过免疫接种母牛的方式,可以从牛初乳中获得对某些病原菌的特异性抗体,并能够有效发挥作用。
美国专利3,992,521和3,984,539公布的技术中介绍了从牛和马的血清中获得免疫球旦白的方法,但是未提及对抗幽门螺旋杆菌的抗体。
美国专利3,128,230公布的技术中介绍一种预先对母牛注射灭活的微生物混合疫苗,然后从血清和牛奶中分离免疫球旦白的方法,但是也未提及对抗幽门螺旋杆菌的抗体及制备方法。
本发明所要解决的技术问题是,采用简单而易行的方法,制备能在低PH值的胃酸环境中有效杀灭幽门螺旋杆菌的药物制剂或营养制剂,并有效地应用于临床治疗胃肠道疾病。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是,选择健康妊娠的母牛免疫接种幽门螺旋杆菌乳状混悬液或用其他方法制备的幽门螺旋杆菌疫苗,从被免疫的母牛的初乳或牛奶中分离、提纯对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白,采用浓缩提纯的制剂,给患者口服,杀灭粘附在消化道粘膜上的幽门螺旋杆菌,从而治疗由于幽门螺旋杆菌所致的胃肠道溃疡或其他慢性胃肠道炎症。
本发明的技术特征是,本发明用来对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白是从被幽门螺旋杆菌免疫的母牛分泌的初乳或牛奶中提取制备的,这种抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白可以单独应用或联合其他治疗胃溃疡和慢性胃肠道炎症的药物或营养品共同使用,其施用方式可以是粉末状、液体状、片剂或胶囊剂等各种剂型。
本发明的技术特征是,制备抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球旦白的方法是,采用乳化剂佐剂制备的乳状幽门螺旋杆菌细胞悬浮液或其他形式的幽门螺旋杆菌疫苗,免疫注射至妊娠的母牛,收集被上述方法免疫接种的母牛分泌的初乳和/或牛奶,采用能有效保存免疫球旦白生物活性并能高纯度提取免疫球旦白的方法,分离、提取、浓缩特异性免疫球旦白。
本发明的技术特征是,用于接种妊娠母牛的幽门螺旋杆菌(Attcc Strain 26695,美国菌种保存中心,品种编号26695)进行细菌培养后,可以采用甲醛杀灭细菌的方法,采用沸洛德佐剂(Frend’s adjuvant)制备乳化剂;也可以采用高温杀灭细菌的方法制备制剂,并浓缩至4times.10.sup.9 colony forming units(CFU)/ml。每次接种应用10-14ml,最好12ml的上述浓缩液。用于接种妊娠母牛的幽门螺旋杆菌也可以采用其他保留其抗原特性的方法,以其他制备疫苗可以接受的方法制备,例如通过超声波或其他方法粉碎细菌后制备匀浆,并采用已知的方法制备注射剂等。
本发明的技术特征是,在对妊娠母牛免疫接种时可以采用下列时间表和方法:第一次在分娩前14天,皮下注射;第二次在分娩后7天,乳房内注射,;第三次在分娩后30天,乳房内注射。上述免疫接种的时间和方法仅代表可能获得较高的特异性免疫球旦白的收获率,并不限制其他的免疫接种方式和时间。
本发明的技术特征是,用来制备对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白的原材料是来自被采用上述方法免疫接种的妊娠母牛所分泌的初乳和牛奶,其中母牛分娩后10小时内初乳中特异性免疫球旦白含量最高,以后含量逐渐减少。用上述方法免疫接种母牛分娩后两个月内的牛奶均可用来作为制备本发明制剂的原材料。
本发明的技术特征是,从被免疫接种乳牛分泌的初乳或牛奶中制备免疫球旦白的方法是,收集新鲜的初乳或牛奶,或采用深冷冻(-20℃)的初乳或牛奶用已知的方式化冻后,采用离心方式脱脂,用酸制剂调整PH值至4.6~4.9,最好是4.7~4.8,同时加温至30℃~50℃持续20~60分钟,最好是加热40℃持续30分钟,然后冷却,保持在4℃状态下静置过夜,用过滤器滤除凝固沉淀的酪旦白颗粒,用0.9%生理盐水扩充至原体积1~3倍,最好是2倍,收集扩充稀释后的上清液,用孔径为0.4.mμ.m超微滤膜在交错流体切面过滤装置上进行第一次粗滤,收集上清液,用10000分子量的超微滤膜在同样装置内第二次过滤,最后用碱剂调节PH至中性,无菌过滤后装瓶,或直接喷雾干燥制备干粉制剂。
本发明的技术特征是,从被免疫接种乳牛分泌的初乳或牛奶中制备免疫球旦白的方法还可以是,收集的冰冻牛奶或冰冻初乳(-10℃~-20℃)于5℃~10℃化冻,用蒸镏水以2~4倍量稀释,最好是3倍量,用离心方式脱脂,用酸剂调整PH值至4.7~4.8,同时加热30℃~40℃约20~30分钟,用滤布过滤凝固的酪旦白后,用分子量8000~10000的超微滤膜浓缩后无菌过滤或喷雾干燥。
本发明的技术特征是,采用本发明方法制备的对抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体,可以是液体制剂形式,也可以是粉状制剂形式,或者与药用载体或辅料制备散剂、胶囊、片剂、丸剂、滴剂、脂质体、微胶囊等多种药物形式,或多种食品或营养品形式,例如奶粉、茶、咖啡、饼干、面包等形式以口服等胃肠道吸收形式施用。
本发明的技术特征是,采用本发明制备的对抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体,既可以单独应用,也可以与其他药物或营养制剂联合应用来治疗胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性胃炎等胃肠道疾病,这些药物和营养成分包括但不限于组织胺H2受体拮抗剂、铋复合剂、各类抗菌素、保护胃肠粘膜制剂,降低胃酸或胃旦白酶制剂等。
本发明的有益效果是,与现有技术相比,本发明能够采用简单方式大量制备具有对抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体,产量高、成本低、无毒付作用,能有效杀灭诱发胃肠道疾病的幽门螺旋杆菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明:
实施例1
制备幽门螺旋杆菌疫苗
接种幽门螺旋杆菌(Attcc strain 26695)在细菌培养皿,以常规方式培养,在培养过程结束时,过滤培养液,收集培养的细菌菌落,用甲醛溶液杀灭后,用Frend’s adjuvant制备细胞悬浮的乳化剂,并浓缩至4,times,10,sup,9 colony forming units(CFU)/ml,配制12ml备用。
实施例2
免疫注射幽门螺旋杆菌疫苗。
采用实施例1制备的幽门螺旋杆菌疫苗,按照兽医免疫接种的常规方式,在干燥季节,选择健康妊娠母牛,在分娩前14天第一次皮下注射,注射剂量为12ml,母牛分娩后7天,两侧乳房内注射,注射剂量为每侧6ml,分娩后30天再次追加乳房内注射,注射剂量为每侧6ml。
实施例3
制备对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白。
收集3.75L实施例2中被免疫接种乳牛分娩后5小时内分泌的初乳,以离心方式脱脂、离心速度3000转/分,离心时间20分钟,收集脱脂初乳,测试PH为6.22,用1N HCL220ml调节脱脂初乳内PH至4.8,加热酸化脱脂初乳温度至40℃,保持30分钟,然后冷却并保持在4℃,静置过夜。
次晨,酸化和沉淀的脱脂初乳用滤布过滤器过滤凝固的酪旦白颗粒,收集上清液,用0.9%氯化钠液体稀释至6升,上清液采用交错流体切面过滤装置过滤,稀释的上清液通过两个平行的中空纤维过滤柱,每个过滤柱孔径大小为0.4.mu.m,表面积为0.5m.sup.2压力为0.25bars,时间为4小时,加入2升的0.9%氯化钠的析层液,去除酪旦白凝结颗粒。
收集的上清液采用同样方式进入交错切面流体超滤装置内,通过分子量为10000D的中空纤维过滤柱进行浓缩,过滤柱表面积为0.9m,sup.2.在1bar压力下,首次浓缩过程为3小时,浓缩至5L浓缩液,第二次浓缩过程加入20升0.9%氯化钠液体,浓缩4小时,获得旦白含量为9.7%的浓缩液,原上清液中所含低分子量的成分被滤除,浓缩液用45ml的1N NaOH调节PH7.4,无菌过滤后装瓶,部份浓缩液送入冷冻干燥装置内冷冻干燥制备粉状物。
实施例4
特异性免疫球旦白特性测试
取实施例3制备的对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白,分析其特异性对抗幽门螺旋杆菌的抗体特性,采用的测试方法为已知的染色粘附法,放射免疫法和酶联免疫试剂,结果表明,采用实施例1和2方式免疫注射妊娠母牛初乳中对抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球旦白(IgG)效价是对照组中未被免疫注射母牛初乳的100倍以上。
Claims (10)
1.本发明涉及一种治疗胃部疾病的产品制备方法及其应用,特别涉及一种从免疫乳牛的牛奶中提取和分离抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球旦白制剂的制备方法和应用,其特征是,选择健康妊娠的母牛免疫接种幽门螺旋杆菌乳状混悬液或用其他方法制备的幽门螺旋杆菌疫苗,从被免疫的母牛的初乳或牛奶中分离、提纯对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白,采用浓缩提纯的制剂,给患者口服,杀灭粘附在消化道粘膜上的幽门螺旋杆菌,从而治疗由于幽门螺旋杆菌所致的胃肠道溃疡或其他慢性胃肠道炎症。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征是,本发明用来对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白是从被幽门螺旋杆菌免疫的母牛分泌的初乳或牛奶中提取制备的,这种抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白可以单独应用或联合其他治疗胃溃疡和慢性胃肠道炎症的药物或营养品共同使用,其施用方式可以是粉末状、液体状、片剂或胶囊剂等各种剂型。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征是,制备抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球旦白的方法是,采用乳化剂佐剂制备的乳状幽门螺旋杆菌细胞悬浮液或其他形式的幽门螺旋杆菌疫苗,免疫注射至妊娠的母牛,收集被上述方法免疫接种的母牛分泌的初乳和/或牛奶,采用能有效保存免疫球旦白生物活性并能高纯度提取免疫球旦白的方法,分离、提取、浓缩特异性免疫球旦白。
4.按照权利要求1所述的方法,其特征是,用于接种妊娠母牛的幽门螺旋杆菌(AttccStrain 26695,美国菌种保存中心,品种编号26695)进行细菌培养后,可以采用甲醛杀灭细菌的方法,采用沸洛德佐剂(Frend’s adjuvant)制备乳化剂;也可以采用高温杀灭细菌的方法制备制剂,并浓缩至4times.10.sup.9 colony forming units(CFU)/ml。每次接种应用10-14ml,最好12ml的上述浓缩液。用于接种妊娠母牛的幽门螺旋杆菌也可以采用其他保留其抗原特性的方法,以其他制备疫苗可以接受的方法制备,例如通过超声波或其他方法粉碎细菌后制备匀浆,并采用已知的方法制备注射剂等。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征是,在对妊娠母牛免疫接种时可以采用下列时间表和方法:第一次在分娩前14天,皮下注射;第二次在分娩后7天,乳房内注射;第三次在分娩后30天,乳房内注射。上述免疫接种的时间和方法仅代表可能获得较高的特异性免疫球旦白的收获率,并不限制其他的免疫接种方式和时间。
6.按照权利要求1所述的方法,其特征是,用来制备对抗幽门螺旋杆菌的特异性免疫球旦白的原材料是来自被采用上述方法免疫接种的妊娠母牛所分泌的初乳和牛奶,其中母牛分娩后10小时内初乳中特异性免疫球旦白含量最高,以后含量逐渐减少。用上述方法免疫接种母牛分娩后两个月内的牛奶均可用来作为制备本发明制剂的原材料。
7.按照权利要求1所述的方法,其特征是,从被免疫接种乳牛分泌的初乳或牛奶中制备免疫球旦白的方法是,收集新鲜的初乳或牛奶,或采用深冷冻(-20℃)的初乳或牛奶用已知的方式化冻后,采用离心方式脱脂,用酸制剂调整PH值至4.6~4.9,最好是4.7~4.8,同时加温至30℃~50℃持续20~60分钟,最好是加热40℃持续30分钟,然后冷却,保持在4℃状态下静置过夜,用过滤器滤除凝固沉淀的酪旦白颗粒,用0.9%生理盐水扩充至原体积1~3倍,最好是2倍,收集扩充稀释后的上清液,用孔径为0.4.mμ.m超微滤膜在交错流体切面过滤装置上进行第一次粗滤,收集上清液,用10000分子量的超微滤膜在同样装置内第二次过滤,最后用碱剂调节PH至中性,无菌过滤后装瓶,或直接喷雾干燥制备干粉制剂。
8.按照权利要求1所述的方法,其特征是,从被免疫接种乳牛分泌的初乳或牛奶中制备免疫球旦白的方法还可以是,收集的冰冻牛奶或冰冻初乳(-10℃~-20℃)于5℃~10℃化冻,用蒸镏水以2~4倍量稀释,最好是3倍量,用离心方式脱脂,用酸剂调整PH值至4.7~4.8,同时加热30℃~40℃约20~30分钟,用滤布过滤凝固的酪旦白后,用分子量8000~10000的超微滤膜浓缩后无菌过滤或喷雾干燥。
9.按照权利要求1所述的方法,其特征是,采用本发明方法制备的对抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体,可以是液体制剂形式,也可以是粉状制剂形式,或者与药用载体或辅料制备散剂、胶囊、片剂、丸剂、滴剂、脂质体、微胶囊等多种药物形式,或多种食品或营养品形式,例如奶粉、茶、咖啡、饼干、面包等形式以口服等胃肠道吸收形式施用。
10.按照权利要求1所述的方法中,其特征是,采用本发明制备的对抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体,既可以单独应用,也可以与其他药物或营养制剂联合应用来治疗胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性胃炎等胃肠道疾病,这些药物和营养成分包括但不限于组织胺H2受体拮抗剂、铋复合剂、各类抗菌素、保护胃肠粘膜制剂,降低胃酸或胃旦白酶制剂等。
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GB2507642A (en) * | 2012-09-11 | 2014-05-07 | Al Urdonia Lemudaddat Al Ajsam Co | Immunized camelid milk for the treatment of gastrointestinal infections |
CN108660089A (zh) * | 2018-02-22 | 2018-10-16 | 河北医科大学第四医院 | 一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳 |
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