CN1557494A - 抗微生物生物活性物质的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对抗微生物生物活性物质的制备及应用，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆及其相关原料中制备多种对抗微生物的生物活性物质并应用于不同领域的方法，其特征是，以牛初乳、牛奶或者相关产品为原料制备乳铁蛋白、乳过氧化物酶和免疫球蛋白，程序为：离心方式脱脂，用50,000～70,000D的超微滤膜滤除乳糖、矿物质、小分子蛋白质，用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过氧化物酶后，分别用不同浓度缓冲盐溶液洗脱，冷冻干燥成粉，分别得到乳铁蛋白和乳过氧化物酶，通过层析柱的液体用分子量为100,000D的超微滤膜分离、过滤、浓缩后干燥成粉，得到免疫球蛋白。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种对抗微生物生物活性物质的制备及应用，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆及其相关原料中制备多种对抗微生物的生物活性物质并应用于不同领域的方法。
发明技术背景
牛奶中，尤其是牛初乳中含有多种有效对抗各类微生物的生物活性物质，目前已经证实的生物活性物质包括：乳铁旦白、乳过氧化物酶、溶菌酶、免疫球旦白G(IgG)、免疫球旦白A(IgA)和免疫球旦白M(IgM)，上述生物活性物质都能有效地抑制人类的多种致病微生物，包括各种致命细菌、致命病毒、真菌等。
乳铁旦白和乳过氧化物酶是哺乳动物乳汁中重要的生物活性成份，乳铁旦白是人乳中的重要活性成份，其含量高达7～8克/升，它不但可以将机体正常活动所需的铁离子运输到血细胞，以供应造血时所必需的铁离子，还能通过粘附铁离子，使致病的细菌和病毒无法得到其生长所需的铁离子而抑制细菌或病毒繁殖。动物实验和临床试验表明，乳铁旦白能有效抑制包括大肠杆菌、厌氧杆菌、链球菌在内的数十种致病菌，以及包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒在内的数十种病毒的繁殖，是新生儿早期重要的过继性免疫组成部份。此外还能通过刺激CD4+、CD8+等淋巴细胞繁殖，激活自然杀伤细胞(NK细胞)，刺激白介素和细胞因子释放而调节免疫系统反应，提高人体免疫功能，抑制多种肿瘤细胞生长。
乳过氧化物酶是一种具有生物活性的酶，通过非特异性氧化作用，破坏致病原的外膜旦白、运送系统、糖降解酶及核酸等，已被证实对大肠杆菌和沙门氏菌有良好的杀灭效果。
在牛初乳或牛奶中的免疫球旦白是过继性免疫功能的重要组成部份，能有效对抗多种微生物的感染，研究证实，牛初乳或牛奶中的免疫球旦白同样能有效对抗各种人体致病性微生物，从而防止人体的各种胃肠道感染性疾病，包括志贺氏杆菌、大肠杆菌、核状芽孢杆菌、变异链球菌、隐孢子菌等致病菌引发的胃肠道病变。
牛奶中含有乳铁旦白和乳过氧化物酶，其生物活性与人乳中成份相似，每升牛奶中含有约200mg乳铁旦白和约30mg乳过氧化物酶，牛初乳中含量更高，每升牛初乳中含有约1克乳铁旦白和约150mg乳过氧化物酶，在制备奶酪的付产品乳浆中，乳铁旦白约残存25％，没有经过高温灭菌的乳浆中乳过氧化物酶仍具有活性。
乳铁旦白是一种含铁的糖旦白，分子量约7,700D，目前已经广泛应用于调节免疫功能、抗感染、补充铁剂、抗肿瘤等作用的营养制剂中，但目前从人乳中提取的乳铁旦白价格昂贵，每克价格约3800美元，严重限制了其应用。
牛初乳中含有丰富的免疫球旦白，约占旦白总量的70～80％，其中IgG是最主要成份，而在牛奶中免疫球旦白含量明显下降，占旦白总量的1％～2％，免疫球旦白分子量约15万D，可以用于预防和治疗感染性疾病。
下表显示牛初乳及牛奶中各种微生物的生物活性成份
(Korhonen，1977；Korhonen et al，1995和Butler 1994)
成份 牛初乳 牛奶
(mg/ml) (mg/ml)
●免疫球旦白
IgG1 46.4 0.6
IgG2 2.9 0.06
IgM 6.8 0.09
IgA 5.4 0.08
●乳铁旦白 1.5 0.10
●乳过氧化物酶 0.02 0.03
●溶菌酶 0.0004 0.0004
如上表所显示，从牛初乳或牛奶中制备乳铁旦白、乳过氧化物酶、免疫球旦白显然是可行性途径。
欧洲专利(EP-AO 253395)公布的方法中，介绍了从牛奶中提取乳铁旦白的方法，但此方法显然不适合工业化规模制备。
欧洲专利(EP-A 418704)介绍了采用层析的方法制备乳铁旦白和乳过氧化物酶，但是过柱速率太低，无法进行规模化制备，也未提及同时制备免疫球旦白。
本发明所要解决的技术问题是，以规模化生产的方式，从牛初乳和牛奶中制备对抗微生物的生物活性物质，并应用于相关领域。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，以牛初乳、牛奶或者相关产品为原料制备乳铁旦白、乳过氧化物酶和免疫球旦白。程序为：离心方式脱脂，用50,000～70,000D的超微滤膜滤除乳糖、矿物质、小分子旦白质，用阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶后，分别用不同浓度缓冲盐溶液洗脱，冷冻干燥成粉，分别得到乳铁旦白和乳过氧化物酶，通过层析柱的液体用分子量为100,000D的超微滤膜分离、过滤、浓缩后干燥成粉，得到免疫球旦白。
制备上述对抗微生物的生物活性成份所用原材料可以是牛初乳、牛奶，也可以是制备干酪的付产品乳浆，或者以乳浆为原料制备的乳浆干粉、乳浆浓缩旦白粉(WPC)、乳浆旦白分离粉(WPI)，为了保持其生物活性，最好选用的原料是未被高温处理过的，巴氏消毒的温度最好不要超过72℃持续15分钟，或者63℃持续30分钟，否则大部份生物活性物质的生物活性将会丧失，最理想的原料是牛初乳。
本发明的技术特征是，如果是以牛初乳或牛奶为原料，需采用离心方式脱脂，如果是采用乳浆或相关产品为原料，则脱脂程序可以省略，但在经层析柱过滤前，均需用分子量50,000～70,000的超微滤膜进行超滤，滤除矿物质、乳糖和小分子旦白，增加阳离子交换树脂的吸附率，超滤可以采用通常的超滤设备，为了增强过滤效率，减少网孔阻塞，最好采用交错切面流体过滤设备。
本发明的技术特征是，多种阳离子交换树脂可以被选择采用，包括多糖类、纤维素类和丙烯酸类，但考虑到大规模生产时要求较高的灌注压和较快的过柱速率，最好采用机械物理性能稳定的琼脂糖凝胶离子交换树脂(S-Sepharose，FF.Pharmacia Biosystem Corp)，缓冲液PH范围在5～8，最好PH范围在6～7，工作温度＞4℃和＜60℃，在大规模处理牛初乳或牛奶时温度最好低于15℃，温度过高会刺激微生物繁殖。
本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025molNa.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白和乳过氧化物酶被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质。
本发明的技术特征是，洗脱吸附在层析柱上的乳铁旦白和乳过氧化物酶可以是用一种缓冲液一次性洗脱，洗脱液内含有上述两种生物活性成份：也可以分次采用不同浓度缓冲液，分别洗脱乳过氧化物酶和乳铁旦白，低浓度的缓冲液(大约0.2～0.5mol NaCL)仅能洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(大约2.5mol NaCL)可以单独洗脱乳铁旦白，而中等浓度的缓冲液(大约＞0.7mol NaCL)能同时洗脱乳铁旦白和乳过氧化物酶，过高浓度的缓冲液不应作为最佳选择，洗脱液需进行除盐程序，除盐的方法可以是离子交换、电透析或超滤，其中超滤是最好的方法，在除盐前或除盐后用超滤方法浓缩洗脱液至原体积20％～30％后冷冻干燥，可分别制备乳铁旦白和乳过氧化物酶干粉。
本发明的技术特征是，收集经过层析柱分离的牛初乳或牛奶等原材料，用分子量90,000～120,000D的超微滤膜进行分离过滤，可以采用普通超滤设备，最好采用交错切面流体超滤设备以提高分离效率，浓缩至原体积20％～40％，最好20％～30％后，冷冻干燥或喷雾干燥(温度不能高于65℃)成干粉状免疫球旦白。
本发明解决上述技术问题的另一个技术方案，其特征是，在对牛初乳或牛奶等原材料采用离心方式脱脂后，用酸剂调PH至4.7～4.8，并加热至30℃～40℃维持20～30分钟，高速离心或滤布过滤方式去除凝结的酪旦白，用碱液调PH至6.5～7.5，采用分子量为60,000～70,000D的超微滤膜在交错切面流体超滤设备上进行分离过滤，浓缩至起始容积的10％～30％，冷冻干燥成干粉，内含丰富的乳铁旦白、乳过氧化物酶和免疫球旦白G(IgG)、免疫球旦白A(IgA)、免疫球旦白M(IgM)。
在脱脂、去除酪旦白后，乳清内主要旦白质是β-乳球旦白、α-白旦白、乳糖、脂溶性物质、微量金属离子，以及上述对抗微生物的生物活性物质，除后者外，前者分子量都小于60,000D，采用60,000D～70,000D分子量的超微滤膜能滤除大部份这些小分子物质，而残留浓缩物内所含乳铁旦白、乳过氧化物酶、各类免疫球旦白的分子量都大于70,000D，不会流失，残留浓缩物经过浓缩后，冷冻干燥粉未中是有效对抗多种微生物的复合生物活性物质。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的乳铁旦白和乳过氧化物酶、免疫球旦白或对抗微生物的复合生物活性物质可以广泛应用于多种对抗微生物的营养制剂中，其应用范围包括但不限于，预防和治疗婴幼儿腹泻、免疫功能低下人群胃肠道微生物感染、旅行者腹泻、口腔及咽喉微生物感染，预防感冒、呼吸道感染、中耳炎，治疗龋齿、牙龈炎，其中乳铁旦白还可以预防和治疗乙型和丙型病毒性肝炎，治疗艾滋病患者顽固性腹泻和预防艾滋病。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的对抗微生物的生物活性物质均属于天然食品成分，无毒无害无付作用，食用安全，可以用作食品防腐及对抗微生物的添加剂，如喷洒在未加工或加工后的肉、鱼、鸡、鸭等动物食品表面以对抗微生物的繁殖，或添加在已加工的微波食品或灌装食品内以对抗微生物的繁殖。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的对抗微生物的生物活性物质，在应用时可以加工成任何形式，包括但不限于下列方式：添加在牛奶或奶粉内，加工成片剂或胶囊剂口服，添加在各种食品成份内直接食用，制备成漱口水或添加在牙膏、牙粉内防止口腔感染，溶解在气溶剂内制备气雾剂喷洒在口腔、咽喉防治感冒和呼吸道感染性疾病等。
本发明的有益效果是，采用经济可行的方式从牛初乳、牛奶或相关产品中同时制备多种有效对抗微生物的生物活性物质，并广泛应用于多种对抗微生物的营养制剂中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实例1
从牛初乳中分别制备乳铁旦白、乳过氧化物酶、免疫球旦白
收集母牛分娩后三天内的牛初乳15升，采用离心方式脱脂，离心速度5000转/分，离心时间20分钟，脱脂牛初乳通过交错切面流体分离过滤装置(Pall公司生产TFF装置)，选择超微滤膜分子量为6万D，收集超滤浓缩物准备过层析柱。
采用10cm自动控制生产的层析仪(Bioprocess system pharmacia)，灌装琼脂糖凝胶阳离子交换树脂(SP Sepharose Big Beadsion exchanger)，层析柱直径为10cm，床高度为11cm，床容量为0.864升。
在室温下，用3.2升0.025M，PH6.5磷酸缓冲液对层析柱进行平衡，超滤浓缩物用泵抽方式，以180升/小时的流速通过层析柱，表面速度约2300cm/小时，过柱速率约208床容量/小时。
用0.3M NaCL缓冲液冲洗，冲洗液量为2.8升，获得乳过氧化物酶洗脱液，然后用1.0MNaCL缓冲液冲洗，冲洗液量为2.2升，获得乳铁旦白洗脱液，两种洗脱液分别用10,000D的超微滤膜超滤除盐浓缩后冷冻干燥，得到乳过氧化物酶干粉和乳铁旦白干粉。
收集通过层析柱的牛初乳，用真空泵抽入交错切面流体超滤装置，应用分子量为100,000D的超微滤膜，流速为1500ml/分，浓缩至起始容积的20％，送入冷冻干燥装置制备免疫球旦白干粉。
实施例2
从牛奶中制备对抗微生物的复合生物活性物质
收集新鲜牛奶200升，离心机以5000转/分速度离心20分钟，去除表面脂肪，加1N HCL调PH至4.7，加热至40℃维持30分钟，用尼布龙滤布过滤器滤除凝结的酪旦白，收集上清液，用真空泵抽入交错切面流体超滤装置((美国Pall公司生产)，采用超微滤膜分离量为60,000D，流速为1500ml/分，用100升0.9NaCL超滤浓缩至起始容积的20％，送入冷冻干燥装置制备干粉，内含丰富的乳铁旦白、乳过氧化物和各类免疫球旦白等多种对抗微生物的生物活性物质。
实施例3
临床测试对抗微生物的效果
取实施例1制备的乳铁旦白，给一位有顽固性腹泻症状的艾滋病患者服用，每天口服400mg，服用后第二天腹泻次数由原来9次/天，减少为3次，第三天更减少为2次，并且其他胃肠道症状明显改善。
Claims (10)
1.本发明涉及一种对抗微生物生物活性物质的制备及应用，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆及其相关原料中制备多种对抗微生物的生物活性物质并应用于不同领域的方法，其特征是，以牛初乳、牛奶或者相关产品为原料制备乳铁旦白、乳过氧化物酶和免疫球旦白，程序为：离心方式脱脂，用50,000～70,000D的超微滤膜滤除乳糖、矿物质、小分子旦白质，用阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶后，分别用不同浓度缓冲盐溶液洗脱，冷冻干燥成粉，分别得到乳铁旦白和乳过氧化物酶，通过层析柱的液体用分子量为100,000D的超微滤膜分离、过滤、浓缩后干燥成粉，得到免疫球旦白。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，如果是以牛初乳或牛奶为原料，需采用离心方式脱脂，如果是采用乳浆或相关产品为原料，则脱脂程序可以省略，但在经层析柱过滤前，均需用分子量50,000～70,000的超微滤膜进行超滤，滤除矿物质、乳糖和小分子旦白，增加阳离子交换树脂的吸附率，超滤可以采用通常的超滤设备，为了增强过滤效率，减少网孔阻塞，最好采用交错切面流体过滤设备。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，多种阳离子交换树脂可以被选择采用，包括多糖类、纤维素类和丙烯酸类，但考虑到大规模生产时要求较高的灌注压和较快的过柱速率，最好采用机械物理性能稳定的琼脂糖凝胶离子交换树脂(S-Sepharose，FF.Pharmacia Biosystem Corp)，缓冲液PH范围在5～8，最好PH范围在6～7，工作温度＞4℃和＜60℃，在大规模处理牛初乳或牛奶时温度最好低于15℃，温度过高会刺激微生物繁殖。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025mol Na.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白和乳过氧化物酶被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，洗脱吸附在层析柱上的乳铁旦白和乳过氧化物酶可以是用一种缓冲液一次性洗脱，洗脱液内含有上述两种生物活性成份；也可以分次采用不同浓度缓冲液，分别洗脱乳过氧化物酶和乳铁旦白，低浓度的缓冲液(大约0.2～0.5mol NaCL)仅能洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(大约2.5mol NaCL)可以单独洗脱乳铁旦白，而中等浓度的缓冲液(大约＞0.7mol NaCL)能同时洗脱乳铁旦白和乳过氧化物酶，过高浓度的缓冲液不应作为最佳选择，洗脱液需进行除盐程序，除盐的方法可以是离子交换、电透析或超滤，其中超滤是最好的方法，在除盐前或除盐后用超滤方法浓缩洗脱液至原体积20％～30％后冷冻干燥，可分别制备乳铁旦白和乳过氧化物酶干粉。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，收集经过层析柱分离的牛初乳或牛奶等原材料，用分子量90,000～120,000D的超微滤膜进行分离过滤，可以采用普通超滤设备，最好采用交错切面流体超滤设备以提高分离效率，浓缩至原体积20％～40％，最好20％～30％后，冷冻干燥或喷雾干燥(温度不能高于65℃)成干粉状免疫球旦白。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明解决上述技术问题的另一个技术方案，其特征是，在对牛初乳或牛奶等原材料采用离心方式脱脂后，用酸剂调PH至4.7～4.8，并加热至30℃～40℃维持20～30分钟，高速离心或滤布过滤方式去除凝结的酪旦白，用碱液调PH至6.5～7.5，采用分子量为60,000～70,000D的超微滤膜在交错切面流体超滤设备上进行分离过滤，浓缩至起始容积的10％～30％，冷冻干燥成干粉，内含丰富的乳铁旦白、乳过氧化物酶和免疫球旦白G(IgG)、免疫球旦白A(IgA)、免疫球旦白M(IgM)。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的乳铁旦白和乳过氧化物酶、免疫球旦白或对抗微生物的复合生物活性物质可以广泛应用于多种对抗微生物的营养制剂中，其应用范围包括但不限于，预防和治疗婴幼儿腹泻、免疫功能低下人群胃肠道微生物感染、旅行者腹泻、口腔及咽喉微生物感染，预防感冒、呼吸道感染、中耳炎，治疗龋齿、牙龈炎，其中乳铁旦白还可以预防和治疗乙型和丙型病毒性肝炎，治疗艾滋病患者顽固性腹泻和预防艾滋病。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的对抗微生物的生物活性物质均属于天然食品成分，无毒无害无付作用，食用安全，可以用作食品防腐及对抗微生物的添加剂，如喷洒在未加工或加工后的肉、鱼、鸡、鸭等动物食品表面以对抗微生物的繁殖，或添加在已加工的微波食品或灌装食品内以对抗微生物的繁殖。
10.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的对抗微生物的生物活性物质，在应用时可以加工成任何形式，包括但不限于下列方式：添加在牛奶或奶粉内，加工成片剂或胶囊剂口服，添加在各种食品成份内直接食用，制备成漱口水或添加在牙膏、牙粉内防止口腔感染，溶解在气溶剂内制备气雾剂喷洒在口腔、咽喉防治感冒和呼吸道感染性疾病等。
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