CN105435213A

CN105435213A - 利用乳铁蛋白治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的方法

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Publication number: CN105435213A
Application number: CN201410393245.5A
Authority: CN
Inventors: 成国祥; 马岚青; 刘思国; 邹成钢; 陈建泉; 缪应雷; 张爱民; 罗娟; 袁渝萍; 刘雪芳
Original assignee: SHANGHAI RESEARCH CENTER OF GENETICALLY MODIFIED; JIELONG BIOENGINEERING CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: SHANGHAI RESEARCH CENTER OF GENETICALLY MODIFIED; JIELONG BIOENGINEERING CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明提供了利用乳铁蛋白治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的方法。具体地，本发明提供了乳铁蛋白在制备抑制幽门螺旋杆菌的组合物、预防或治疗与幽门螺旋杆菌相关的疾病的组合物。试验表明，重组乳铁蛋白可有效抑制幽门螺旋杆菌，并对Hp毒力因子cagA、vacA和ure基因表达有显著的抑制作用。此外，当患者配伍使用人乳铁蛋白制剂时，可强化常规三联或四联疗法的疗效，因而具有广阔的商业前景。

Description

利用乳铁蛋白治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种利用乳铁蛋白治疗或预防幽门螺旋杆菌感染以及相关消化道疾病的方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(H.pylori，Hp)是一种革兰阴性微量需氧、弯曲性杆状细菌。它能够产生大量的尿素酶，在胃中分解尿素后生成氨，从而改变了胃的生理条件，引发胃黏膜局部炎症反应，破坏正常的胃黏膜屏障，从而诱发胃十二指肠溃疡。现已表明，幽门螺旋杆菌的感染是引发消化性溃疡的重要原因之一。80％以上的胃溃疡患者和95％～100％的十二指肠溃疡患者都能够检出Hp阳性。当Hp被成功根除后，消化性溃疡的复发率可降到1％～3％。

临床治疗幽门螺旋杆菌感染的方法主要是抗生素疗法。所用抗生素包括克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、氯霉素、链霉素、青霉素、四环素等。其中，克拉霉素是作用最强的药物之一，单一用药Hp根除率为42％～54％。在治疗中还需联合应用其他胃粘膜保护性药物，如抑酸剂、质子泵抑制剂(PPI)、H2受体拮抗和胃黏膜保护剂等。由于幽门螺旋杆菌的顽固性，目前尚无单一药物和二联疗法(铋剂或PPI与一种抗菌药物联合应用)都难以有效根除Hp，临床用药多采用三联疗法。目前公认的根除Hp三联疗法的最佳方案有两种：奥美拉唑20mg、阿莫西林1g、克拉霉素500mg，疗程为1周，根除率为96.4％；奥美拉唑20mg、甲硝唑400mg、克拉霉素250mg(每日2次)，疗程为1周，根除率为94.6％。对于一线治疗失败的患者，可进行补救疗法，以质子泵抑制剂、铋剂联合两种抗生素的四联疗法，如PPI、铋剂、甲硝唑和四环素，Hp根除率>95％；奥美拉唑、枸橼酸铋钾、克拉霉素、替硝唑的四联疗法Hp根除率95.7％。

此外，还有使用中药和中西结合的治疗方法，但因中药汤剂成分复杂、疗程长、服用不便，成本较西药高等原因，还需在精简处方、提取有效成分等方面做进一步研究。

综上所述，本领域尚缺乏令人满意、安全度高的防治幽门螺旋杆菌的方法，因此，本领域迫切需要开发新的、能够有效抑制幽门螺旋杆菌感染的药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效抑制幽门螺旋杆菌感染的组合物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种乳铁蛋白的用途，用于制备：(a)抑制幽门螺旋杆菌的组合物；和/或(b)治疗或预防与幽门螺旋杆菌相关的疾病的组合物；和/或(c)抑制幽门螺旋杆菌毒力因子cagA、vacA和/或ure的组合物；

其中，所述的组合物包括：药物和膳食补充剂。

在另一优选例中，所述疾病包括与幽门螺旋杆菌相关的消化道疾病。

在另一优选例中，所述疾病包括幽门螺旋杆菌感染引发的胃部、十二指肠和/或其它消化道疾病。

在另一优选例中，与幽门螺旋杆菌相关的疾病包括：胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、食道炎、食道癌、胃癌。

在另一优选例中，所述的胃炎包括慢性胃炎、糜烂性胃炎。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白选自下组：人乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白包括重组的乳铁蛋白。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白包括重组的人乳铁蛋白。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白或来自人乳中的人乳铁蛋白。

在另一优选例中，所述的重组人乳铁蛋白来自转基因山羊乳汁。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白以0.01-100mg/kg体重的剂量施用于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的乳铁蛋白以0.01-100mg/kg体重(较佳地0.05-50mg/kg体重，更佳地0.1-10mg/kg体重)的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、舌下含化、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔喷雾、或口腔喷雾。

在另一优选例中，所述的膳食补充剂通过口服施用。

在另一优选例中，所述的药物通过口服施用。

在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：散剂、颗粒剂、糖衣片、胶囊剂、片剂、粉末、液剂、丸剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物含有药学上可接受的载体、人乳铁蛋白和任选的抗生素和任选的胃酸抑制剂。

在另一优选例中，所述的抗生素选自下组：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、氯霉素、链霉素、青霉素、四环素、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗生素包括阿莫西林、克拉霉素、或其组合。

在另一优选例中，所述抗生素与乳铁蛋白的的重量比为0.1-10mg：20-50mg，较佳地为0.2-5mg：20-40mg。

在另一优选例中，所述的胃酸分泌抑制剂选自下组：H2阻断剂和/或质子泵抑制剂。

在另一优选例中，所述的质子泵抑制剂选自拉唑类药物，优选奥美拉唑和兰索拉唑。

在另一优选例中，所述的H2阻断剂选自下组：法莫替丁、尼扎替丁、罗沙替丁、雷尼替丁、西咪替丁、或其组合。

在另一优选例中，所述胃酸分泌抑制剂与乳铁蛋白的的重量比为0.002-1mg：20-50mg，较佳地为0.005-0.5mg：20-40mg。

在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的一种或多种物质：

胃酸分泌抑制剂、抗酸剂(如碳酸氢钠、碳酸镁、碳酸钙沉淀或水滑石)、胃粘膜保护剂(如合成硅酸铝、叶绿酸铜钠、铋剂)、消化酶(如生物淀粉酶、脂肪酶)、除菌剂。

在另一优选例中，所述的除菌剂为活性炭。

在另一优选例中，所述的铋剂是胶态次枸橼酸铋。可选的铋剂包括但不限于：枸橼酸铋钾胶囊、枸橼酸铋钾、胶体次枸橼酸铋及其组合。

在另一优选例中，所述的药物或膳食添加剂的给予对象为哺乳动物，优选人、猴、猫、猪、狗。

在另一优选例中，“抑制幽门螺旋杆菌毒力因子cagA、vacA和/或ure”指抑制幽门螺旋杆菌毒力因子cagA、vacA和/或ure基因的表达。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及以下活性成分：

(a)乳铁蛋白；

(b)抗生素；和

(c)胃酸抑制剂。

在另一优选例中，所述的活性成分包括：(a)乳铁蛋白；(b)作为抗生素的克拉霉素和阿莫西林；和(c)作为胃酸抑制剂的奥美拉唑。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性抑制幽门螺旋杆菌的方法，包括步骤：将幽门螺旋杆菌在乳铁蛋白存在下进行培养，或者与乳铁蛋白接触，从而抑制幽门螺旋杆菌。

在另一优选例中，所述的抑制包括抑制幽门螺旋杆菌的生长。

在另一优选例中，在所述方法中，所述的乳铁蛋白的浓度为0.01-100mg/mL，较佳地为0.05-50mg/mL，更佳地为0.1-10mg/mL。

在本发明的第四方面，提供了一种预防、抑制或治疗幽门螺旋杆菌感染的方法，包括以下步骤：将乳铁蛋白或含有乳铁蛋白的组合物施用于需要的哺乳动物对象。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物和膳食补充剂。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人。

在另一优选例中，所述乳铁蛋白的施用剂量或有效量为每天1mg～100g/70kg体重，较佳地为10mg～50g/70kg体重。

在另一优选例中，所述的用药方式包括口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、鼻腔喷雾、口腔喷雾。

在另一个优选例中，用药方式包括口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化。

在另一个优选例中，用药方式是口服。

在另一优选例中，含有乳铁蛋白的药物是单方制剂或复方制剂，其中复方制剂还可包含胃酸抑制剂，如H2阻断剂和/或质子泵抑制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了Hp触酶试验的情况。其中，图1A为加入正常培养基的对照组，1B为加入细菌培养物的测试组。

图2显示了实施例1中的尿素酶检测结果。

图3显示了rhLF对Hp在液体培养基中的增值影响情况。

图4显示了对实施例5中各组总RNA提取情况检测。其中，

泳道M为DL2000分子量；泳道1为1.5mg/mlrhLF培养菌；泳道2为0.75mg/mlrhLF培养菌；泳道3为0.1875mg/mlrhLF培养菌；泳道4为阴性对照。

图5显示了检测Hp菌毒力基因引物的特异性检测。其中:

泳道M为DL2000分子量标准；泳道1和2为cagA基因检测引物；泳道3和4为vacA基因检测引物；泳道5和6为ure基因检测引物；泳道7和8为16srRNA检测引物；泳道9和10为阴性对照。

图6显示了不同浓度rhLF培养对Hp毒力因子表达的影响(qRT-PCR法)。

图7显示了实施例6中1号模型小鼠的胃粘膜快速尿激酶试验，结果显示为试验阳性。

图8显示了小鼠胃粘膜组织切片的H.E染色的情况。图中示意1号模型小鼠胃组织中存在等量炎性细胞浸润的现象。

图9显示了胃粘膜组织切片的特殊银染结果。图中显示1号模型小鼠的胃粘膜表面见幽门螺旋杆菌，聚集成簇。

图10显示了胃粘膜组织切片的特殊银染(无Hp定植)。图中可见对照组5号小鼠胃粘膜表面未见幽门螺旋杆菌。

图11显示了rhLF治疗效果的部分胃样本切片的H.E染色结果。其中：

图11A为正常小鼠组的10号标本，无炎性细胞浸润；

图11B为rhlf+标准三联组的33号标本，有少量炎性细胞浸润；

图11C为rhlf组的1号标本，中等量炎性细胞浸润。

图12显示了rhLF治疗效果的部分胃样本切片的银染。其中：

图12A为rhLF+标准三联组8号标本，阴性(未见幽门螺旋杆菌)；

图12B为标准三联组6号标本，轻度感染(胃粘膜表面见幽门螺旋杆菌)；

图12C为rhlf+标准三联疗法组1号标本，中度感染(胃粘膜表面见散在的幽门螺旋杆菌，未聚集成簇)；

图12D为未治疗组15号标本，重度(胃粘膜表面见大量幽门螺旋杆菌，聚集成簇)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，乳铁蛋白居然可非常有效地抑制幽门螺旋杆菌，因此可用于制备预防或抑制幽门螺旋杆菌感染及相关疾病的药物。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人以转人乳铁蛋白基因山羊乳汁为原料，经离心、脱脂、去除乳清中的颗粒状杂质、SP-Sepharose阳离子交层析纯化等处理步骤，获得高纯度的乳铁蛋白。

体外试验表明，来自转基因山羊乳汁中的重组人乳铁蛋白可以体外抑制幽门螺旋杆菌的生长(体外MIC范围为0.75～1.5mg/ml)。此外，通过荧光定量PCR技术分析发现，不同浓度的rhLF在体外对Hp毒力因子cagA、vacA和ure基因表达有不同程度的抑制作用，在1.5mg/ml的浓度条件下，三个毒力基因的表达受抑制程度最强。

此外，在动物试验中，发明人还利用小鼠感染幽门螺旋杆菌模型评价了rhLF的体内治疗效果，结果发现rhLF单独用药和联合用药治疗后，对Hp诱导的炎症改善程度均优于标准三联治疗组及非治疗组。放射免疫检测试验小鼠模型血清中的胃泌素含量，发现rhLF+三联组血清胃泌素含量较标准三联治疗组、非治疗组降低，且差异有统计学意义。

乳铁蛋白

在本发明的组合物中，核心的活性成分是乳铁蛋白。

乳铁蛋白是一种分子量为77kD的铁结合性糖蛋白。人乳铁蛋白(humanlactoferrin，hLF)主要存在于人乳中，含量为1～2g/L。hLF具有增强体内铁传递与铁吸收、调节机体免疫等多种重要的生理功能。有报道表明，吃母乳的婴儿比吃配方奶粉的婴儿有更强的抵御肠道微生物感染的能力。LF可通过下述机制行使其抗菌和杀菌功能。第一是通过是离子结合区捕获铁离子，由此剥夺了细菌生长所必须的铁，引起细菌生长延迟；第二是LF同革兰氏阴性菌上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中的脂质A相互作用，引起LPS从细胞壁内释放，导致细菌死亡；第三是通过位于hLFN-端的前47个氨基酸内的一个阳离子富含区(被命名为lactoferricin，LFcin)，这个区域中的疏水残基成簇分布在一侧，而大部分正电荷侧链则位于外侧。疏水残基同细菌的脂质双分子层内的脂肪酰基团相互作用，起到了杀菌作用。

可用于本发明的乳铁蛋白宜为哺乳动物的乳铁蛋白，包括天然的乳铁蛋白或重组的乳铁蛋白。代表性的例子包括(但并不限于)：人、牛、羊的乳铁蛋白。

在另一优选例中，所述人乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白(rhLF)及来自人乳中的人乳铁蛋白。

在另一优选例中，所述人乳铁蛋白纯化自转基因哺乳动物的乳汁。

在另一优选例中，所述人乳铁蛋白纯化自转基因山羊的乳汁。

药物组合物和给药方式

本发明提供了含有活性成分(a)乳铁蛋白；以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物。

在本发明的药物组合物中，乳铁蛋白的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt％,较佳地为0.1-90wt％。

本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。

在复方制剂中，除了含有乳铁蛋白之外，还可包含其他活性成分，如抗生素和胃酸抑制剂。

在本发明中，代表性的抗生素包括(但并不限于)：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、氯霉素、链霉素、青霉素、四环素、或其组合。

在另一优选例中，所述抗生素(按抗生素的总重量计)与乳铁蛋白的的重量比为0.1-10mg：20-50mg，较佳地为0.2-5mg：20-40mg。

在另一优选例中，所述胃酸分泌抑制剂(按胃酸分泌抑制剂的总重量计算)与乳铁蛋白的的重量比为0.002-1mg：20-50mg，较佳地为0.005-0.5mg：20-40mg。

此外，本发明组合物还包括选自下组的一种或多种物质：抗酸剂(如碳酸氢钠、碳酸镁、碳酸钙沉淀或水滑石)、胃粘膜保护剂(如合成硅酸铝、叶绿酸铜钠、铋剂)、消化酶(如生物淀粉酶、脂肪酶)、除菌剂。

本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。

在本发明中，乳铁蛋白或含乳铁蛋白的的药物制剂可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌相关的疾病。

在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内等途径给药，优选口服。

本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。

服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人1mg～200g，较佳地为10mg～100g。

膳食补充剂

本发明还提供了一种乳铁蛋白的用途，它被用于制备抑制幽门螺旋杆菌的保健品或食品补充剂(即膳食补充剂，dietarysupplementcomposition)。所述膳食补充剂可作为膳食添加剂。

本发明的膳食补充剂含有食品上可接受的载体以及乳铁蛋白。

在本发明的保健品或食品补充剂中，乳铁蛋白(优选的外源的重组乳铁蛋白)的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt％,较佳地为0.1-90wt％。

在另一优选例中，所述的膳食补充剂可添加或混入到食品或饮料中，与通常的饮食品一起摄取。

代表性的食品或饮料包括但不限于：口香糖、糖、果冻、软饮料、植物蛋白粉。

可选地，所述的药物或膳食添加剂还包括选自下组的一种或多种可口服摄取蛋白：

来源于小麦、大麦、稻米、玉米、大豆、红豆等植物蛋白；和

来源于奶、蛋、鱼、肉等动物蛋白，及其组合。

在另一优选例中，小麦来源的所述植物蛋白包含但不限于，麦谷蛋白、白蛋白及其组合。

在另一优选例中，玉米来源的所述植物蛋白包括但不限于，玉米蛋白。

在另一优选例中，蛋来源的所述动物蛋白包括但不限于，卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白或溶酶菌。

在另一优选例中，鱼或肉来源的所述动物蛋白包括但不限于，肌球蛋白、肌动蛋白及其组合。

本发明的保健品或食品补充剂还可含有其他营养成分，例如硒、铁、以及维生素等。

本发明的主要优点在于：

(a)人乳铁蛋白是人体的正常组分，对人无毒无害。

(b)实验表明，rhLF可在病人感染Hp后单独或联合治疗手段使用。当患者配伍使用人乳铁蛋白制剂时，可强化常规三联或四联疗法的疗效，增强疗效和/或缓解副作用。此外，乳铁蛋白可长时间服用起到良好的预防或治疗效果，因而具有广阔的商业前景。

(c)乳铁蛋白对Hp毒力因子cagA、vacA和ure基因表达有显著的抑制作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料与方法

1.1试剂和原料

bufferA(400mMNaCl,20mMPB,pH7.5)，bufferB(1000mMNaCl,20mMPB,pH7.5)；生理盐水。

重组人乳铁蛋白(rhLF)的转基因山羊乳汁(购自上海转基因研究中心)，经测定，每升羊乳汁含有约40-66g的人乳铁蛋白和约0.05-0.12g的少量羊乳铁蛋白。

1.2方法

1.2.1脱脂：

取高效表达重组人乳铁蛋白的转基因山羊乳汁20mL，如下进行羊乳脱脂：10000rpm离心30min后，用4层纱布过滤得滤液。

1.2.2脱酪：

滤液与20mL800mMNaCl(40mMPB,pH7.5)混匀，用浓盐酸调pH4.6；40℃温浴30min后，10000rpm离心30min，取上清；上清用NaOH调pH7.0后，10000rpm离心30min，取上清。

1.2.3去除杂质

脱脂脱酪后的上清过0.22μm滤膜除菌、除杂质，得无菌羊乳清。

1.2.4SP-Sepharose阳离子交换层析

脱脂、脱酪、除菌后的羊乳清，在400mMNaCl(20mMPB,pH7.5)条件下上样，与SP-Sepharose介质结合后，用1MNaCl(20mMPB,pH7.5)进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰即得到乳铁蛋白。

1.2.5SephadexG-25分子筛脱盐

阳离子交换层析纯化获得的乳铁蛋白，经SephadexG-25分子筛脱盐，流动相为生理盐水。脱盐后，乳铁蛋白所处溶液体系为生理盐水。

1.2.6冻干

目的蛋白分装于西林瓶中，冻干。

1.2.7鉴定及质量检查

纯化获得的乳铁蛋白生理盐水溶液经Western印迹进行蛋白鉴定；经Lorry法蛋白定量测得蛋白含量；非还原性SDS-PAGE凝胶电泳和高效液相法测定乳铁蛋白纯化产物纯度；紫外分管光度法测定乳铁蛋白纯化产物的铁饱和度；还原性SDS-PAGE凝胶电泳和质谱法测定乳铁蛋白纯化产物的分子量。

2.结果

纯化获得的乳铁蛋白生理盐水溶液经Western印迹鉴定，结果为阳性，羊乳铁蛋白的Western印迹鉴定结果为阴性，说明该乳铁蛋白确为人乳铁蛋白；经Lorry法蛋白定量测得蛋白含量为30mg/mL；非还原性SDS-PAGE凝胶电泳和高效液相法测定乳铁蛋白纯化产物纯度均大于98％；紫外分管光度法测定乳铁蛋白纯化产物的铁饱和度约为5％，铁不饱和乳铁蛋白占蛋白总量的95％；还原性SDS-PAGE凝胶电泳和质谱法测定乳铁蛋白纯化产物的分子量约为80KD。

实施例1幽门螺旋杆菌培养与冻存

幽门螺旋杆菌(Hp)的培养：称取哥伦比亚琼脂3.9g，溶于去离子水中，定容至90ml，高压灭菌(121℃，30min)，待冷却至50～60℃后加入10ml热灭活胎牛血清(56℃，30min)、两性霉素B200μl(5.0mg/ml)，万古霉素100μl(10.0mg/ml)，多粘菌素B10μl(3.8mg/ml)，TMP(5.0mg/ml)100μl，混匀后倒入无菌培养皿中制成Hp的固体培养平板。将冻存的标准HpSS1菌株(ATCC43504)于冰上解冻，接种于Hp固体培养平板中，培养皿置入厌氧培养盒中，于微需氧(5％O₂，10％CO₂和85％N₂)、90％湿度，37℃条件下培养3～5天。取生长良好的Hp转至新的培养基上进行传代培养，于相同条件下培养3～5天。

Hp的冻存：冻存液为3.8％的脑心浸液肉汤培养基，高压灭菌(121℃，30min)后，加入30％的灭菌甘油使用。鉴定为Hp的菌落，用冻存液反复洗涤2～3次，制成菌悬液，分装入冻存管，置于-80℃冰箱中保存。

实施例2幽门螺旋杆菌的鉴定

Hp的鉴定：通过两种方法进行鉴定

(1)触酶实验：Hp是具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和氧气，出现气泡。触媒试验表明，所培养的细菌可使3％的过氧化氢溶液产生大量气泡(具体如图1所示)。

(2)快速尿素酶实验：

幽门螺旋菌能够产生尿素酶分尿素形成氨气，使培养基变为碱性。挑取18～24h待试菌培养物接种于胃幽门螺杆菌(HP)检测试纸中(广州贝思奇诊断试剂有限公司)继续培养2～4小时，结果呈尿素酶阳性(具体如图2所示)。

实施例3.平板培养法检测rhLF抑制Hp菌的效果

取无菌试管6支，第1管中加入6ml0.22μm过滤除菌的的rhLF(15mg/ml)，其余各管加入3ml无菌水，以2倍倍比稀释法做5次稀释：15、7.5、3.75、1.875、0.9375mg/ml。最后1管不加药物，为阴性对照。

取无菌三角烧瓶6只，加入24.5ml/瓶的无菌哥伦比亚培养，待温度降至50～60℃时加入2.5ml/瓶的热灭活胎牛血清、3ml/瓶的各浓度rhLF及阴性对照，混匀后倒入无菌培养皿中。各组平板中，rhLF的浓度依次为：1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09375、0mg/ml。7号板为无细菌有药物，阳性对照。

分光光度计法检测Hp细菌的OD600值，调整细菌浓度为1×108cfu/ml，取100μlHp菌悬液于含不同药物浓度的固体培养基上，L棒涂布均匀，微需氧条件下，37℃，湿度＞90％，培养3天后取出。

结果：在rhLF浓度为1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09375mg/ml的各平板上，细菌菌落随药物浓度的增加呈明显的减少趋势，0.75mg/ml平皿上见数个菌落，1.5mg/ml平皿上无菌落生成。所有可见菌落均通过快速尿素酶实验、触酶实验和革兰氏染色镜检，结果均为Hp。可见，由此计算rhLF的抑制Hp细菌的体外MIC范围为0.75～1.5mg/ml。

实施例4.菌液培养法检测rhLF抑制Hp菌的效果

按实施例3的方法配制3mg/ml，1.5mg/ml，0.75mg/ml，0.375mg/ml，0.1875mg/ml，0mg/ml的rhLF。

配制Hp菌的完全液体培养基：准确称取脑心浸液肉汤BHI3.85g溶于去离子水定容至100ml，121℃，30min灭菌，后加入10ml灭活胎牛血清和抗生素混合液，0.22um过滤，4℃保存备用。

调整Hp浓度为1×10⁸细菌菌悬液，用T25细胞培养瓶进行Hp的液体培养。微需氧环境下，180rpm，37℃，湿度＞90％，振荡培养，每8h测定细菌OD600值，(为保证细菌的微需氧环境每打开一次培养盒更换一次产气袋)，观察rhLF对Hp菌生长增殖的影响。

结果如图3，可见重组人乳铁蛋白对Hp生长的影响与固体培养基所得结果一致，最低抑菌浓度为0.75-1.5mg/ml之间，且在细菌潜伏期就有抑制细菌增殖的作用。

实施例5.定量PCR检测rhLF对Hp菌毒力因子cagA、vacA、ure基因表达的影响

根据GenBank中已报道的Hp菌株ATCC43504(NCTC11637)vacA、cagA和ure三个基因的全序列，结合Primier5.0和DNAMAN软件设计用于对上述三个基因的qRT-PCR引物，序列见表1。(引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。)

表1.Hp菌毒力因子基因的qRT-PCR检测引物

收集培养至稳定期的实施例4中含有不同rhLF浓度培养的Hp菌，利用Trizol法提取细菌总RNA，利用琼脂糖电泳检测总RNA提取效果良好(具体如图4所示)。

采用primeScript^TMRTreagentkitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)两步法进行反转录。通过普通PCR检测引物特异性，扩增体系为25μl，反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，33个循环。1.2％琼脂糖凝胶电泳结果表明引物扩增特异(具体如图5所示)。

RealTimePCR反应如下：

按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)，同一样本同一基因设计3个实验重复。同时设3个空白孔(加入等体积的dH₂O)。

表2.RealTimePCR反应混合液

(2)应用AppliedBiosystems7000FastReal-timePCRsystem两步法PCR反应程序：预变性，95℃30秒；PCR反应：95℃5秒，60℃31秒，40个循环。

根据扩增曲线取溶解曲线单峰所得ct值，并利用其△ct值进行定量，即用每个样本目的基因的ct值减去内参基因的ct值得到△ct，再用观察组的减去对照组的△ct值(△△ct)，代入公式2-△△ct计算即得到处理组相对对照组PCR产物的浓度比值。

qRT-PCR的定量结果如图6所示，从中可见，不同浓度的rhLF对Hp毒力因子cagA、vacA和ure的基因表达有不同程度的抑制作用。而在1.5mg/ml的高浓度条件下，三个毒力基因的表达受抑制程度最强。

实施例6.小鼠感染幽门螺旋杆菌模型的建立

1.实验动物及用药

150只雄性BABL/C(6周龄，体重18±2g，购自昆明医科大学动物实验室)小鼠适应性喂养7天。抗生素混合液及用量：20mg/ml氨苄青霉素溶液，灌胃0.25ml/只。4mg/ml庆大霉素溶液，0.15ml/只。50mg/ml阿奇霉素溶液，0.10ml/只。

2.试验程序：

第1-5天，清除胃内微生物。每天予抗生素混合液0.5ml/只灌胃，1次/d。

第6天，接种Hp菌。小鼠正常饮食，停药第5天禁食24h，禁水4小时，后灌胃0.2ml的2％NaHCO₃，1h后给予Hp新鲜悬菌液1ml。禁食禁水2h后给予新鲜配Hp菌置营养液0.5ml灌胃，之后恢复正常饮食。

第8天，重复接菌1次。禁食12小时，禁水4小时，后灌胃0.2ml的2％NaHCO₃，1h后给予Hp新鲜悬菌液1ml。禁食禁水2h后给予新鲜配Hp菌置营养液0.5ml灌胃，之后恢复正常饮食。

如上述，重复接菌4次。

3.建模效果评价

最后一次接菌后5周，随机处死6只小鼠，取胃组织(包括十二指肠、胃窦、胃体等)；一半胃黏膜组织组织行快速尿素酶试验(详见图7)；另一半胃黏膜组织用10％的甲醛溶液固定后进行H-E染色(详见图8)和银染(详见图9和图10)。

实验结果

根据快速尿素酶试验、改良银染色、H-E染色检查小鼠胃黏膜病理组织情况表明，建模成功。

实施例7.rhLF对感染Hp小鼠模型的疗效评价

7.1小鼠分组及用药

按照表3所列，将实施例6中的建模小鼠随机分为6组，并进行每天1次灌胃用药。

表3.口服rhLF对感染Hp小鼠模型的疗效评价分组和用药情况

组别	使用药物	rhLF用药量(mg/只·天)
			1.试验组(48只)	rhLF+三联	33
2.试验组(48只)	rhLF	33
			3.阳性对照(48只)	三联	/
4.阴性对照(48只)	生理盐水	/

备注：根据以下公式计算给药量：(成人剂量×0.0026/20)×小鼠平均重量(g)，每日2次，共7天。三联：为治疗Hp感染的三联疗法，包括三种抗生素，分别为阿莫西林、克拉霉素和奥美拉唑。三种抗生素的小鼠用药剂量：阿莫西林为5.07mg/kg，克拉霉素为2.54mg/kg；PPI奥美拉唑0.1mg/kg。

7.2rhLF抗幽门螺旋杆菌体内试验

按上述分组，用药物处理7天。停药后1天每组随机抽取8只小鼠采用摘除眼球法采血，然后处死小鼠进行解剖，取完整的胃组织(包括十二指肠、胃窦、胃体等)，一半胃黏膜组织用10％的甲醛溶液固定送病理科行HE染色和银染，另一半分装于冻存管内，放置-80℃冰箱内冻存。血液静止1小时后，置于4℃离心机内用4000转，离心20分钟。吸取血清，冻存在-80℃冰箱。停药7天后按上述方法处理剩余小鼠。

实验结果

如下的表4中列出了各组胃粘膜炎症程度的比较结果，Spss11.5软件分析(Friedman)数据p<0.001，有统计学意义。

表4.各组胃粘膜炎症程度比较

图11和图12分别为各实验组的典型H.E染色和银染的切片。

以上结果可见，rhLF单独用药和联合用药对炎症改善程度优于标准三联治疗组及非治疗组，但rhLF单独用药和联合用药两组间相比无统计学差异。

7.3血清胃泌素测定

幽门螺杆菌会诱发胃泌素大量分泌，检测血清中胃泌素的含量可以评价幽门螺杆菌的感染情况。用放射免疫法检测，方法如下：

(1)将冻存的血清拿出，平衡到室温。

(2)取圆底聚苯乙烯试管若干，用记号笔编号NBS、样品对照管和测量管等，然后用微量取样器按下表加样。加样前所有试剂包括待测样品要摇匀，试剂平衡至室温。

表5.小鼠血清胃泌素含量的放射免疫检测程序(单位：μl)

(3)数据处理：使用log-logit数据处理模式进行数据处理。

放射免疫检测的结果如表6所示，Spss11.5软件分析(Kruskal-WallisH)数据p<0.05,有统计学意义。rhLF+三联组血清胃泌素含量较标准三联治疗组、非治疗组降低，差异有统计学意义；而rhLF组与标准三联治疗组、非治疗组无明显差异。

表6.各组小鼠血清胃泌素分泌情况

组别	例数(只)	中位数(ng/ml)
			rhLF+三联	48	20.92
rhLF	48	24.56
			三联	48	23.3
生理盐水	48	25.71

表6的结果表明：rhLF单独使用可以降低幽门螺旋杆菌感染；此外，rhLF与三联疗法配伍使用可显著提高三联疗法的效果，显著降低幽门螺旋杆菌的感染。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种乳铁蛋白的用途，其特征在于，用于制备：(a)抑制幽门螺旋杆菌的组合物；和/或(b)治疗或预防与幽门螺旋杆菌相关的疾病的组合物；和/或(c)抑制幽门螺旋杆菌毒力因子cagA、vacA和/或ure的组合物；

其中，所述的组合物包括：药物和膳食补充剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白选自下组：人乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、或其组合。

3.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白或来自人乳中的人乳铁蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乳铁蛋白以0.01-100mg/kg体重的剂量施用于哺乳动物。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、舌下含化、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔喷雾、或口腔喷雾。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗生素选自下组：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、氯霉素、链霉素、青霉素、四环素、或其组合。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还包括选自下组的一种或多种物质：

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及以下活性成分：

(a)乳铁蛋白；

(b)抗生素；和

(c)胃酸抑制剂。

9.一种体外非治疗性抑制幽门螺旋杆菌的方法，包括步骤：将幽门螺旋杆菌在乳铁蛋白存在下进行培养，或者与乳铁蛋白接触，从而抑制幽门螺旋杆菌。

10.一种预防、抑制或治疗幽门螺旋杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：将乳铁蛋白或含有乳铁蛋白的组合物施用于需要的哺乳动物对象。