KR20110101930A - 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법 - Google Patents
브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2200/00—Function of food ingredients
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum MG207; Lactobacillus paracasei MG310; Lactobacillus casei MG311; Lactobacillus acidophilusMG501; Streptococcus thermophilus MG510; 및 Bifidobacterium longumMG723로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 관한 것이다.
또한 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리를 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법에 관한 것이다.
한편 브로콜리를 유산균으로 발효하여 헬리코박터 파이로리균의 증식억제는 물론 헬리코박터균에 의해 일어 날 수 있는 염증을 억제시키는 싸이토카인 물질은 증가시키고 염증을 활성화 시키는 싸이토카인은 감소시키는 효과가 있는 기능성 발효물질의 생산 방법에 관한 것이다.
나아가 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명인 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법을 통해 항생제의 남용으로 초래되는 다양한 부작용을 방지함과 동시에, 식품과 같이 자연스럽게 섭취할 수 있다는 점은 물론 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
또한 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리를 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법에 관한 것이다.
한편 브로콜리를 유산균으로 발효하여 헬리코박터 파이로리균의 증식억제는 물론 헬리코박터균에 의해 일어 날 수 있는 염증을 억제시키는 싸이토카인 물질은 증가시키고 염증을 활성화 시키는 싸이토카인은 감소시키는 효과가 있는 기능성 발효물질의 생산 방법에 관한 것이다.
나아가 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명인 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법을 통해 항생제의 남용으로 초래되는 다양한 부작용을 방지함과 동시에, 식품과 같이 자연스럽게 섭취할 수 있다는 점은 물론 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
Description
본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum MG207; Lactobacillus paracasei MG310; Lactobacillus casei MG311; Lactobacillus acidophilusMG501; Streptococcus thermophilus MG510; 및 Bifidobacterium longumMG723로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 관한 것이다.
또한 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리를 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효하여 헬리코박터 파이로리균의 증식억제는 물론 헬리코박터균에 의해 일어 날 수 있는 염증을 억제시키는 싸이토카인 물질은 증가시키고 염증을 활성화 시키는 싸이토카인은 감소시키는 효과가 있는 기능성 발효물질의 생산 방법을 제공하고 또한 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 함유되어 있는 유산균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균은 1982년 호주의 marshall과 warren에 의하여 인체의 위점막에서 처음 분리된 이래 만성위염 및 소화성 궤양의 주요 원인균임이 밝혀졌으며, 1994년에는 세계보건기구 산하 국제 암연구기관에서 발암인자의 하나로 규명되었다. 이 균은 몇 개의 편모를 가진 그람음성 간균으로 위 점막층의 표층이나 점액내에 증식하며 가장 특징적인 미생물학적 성상은 강력한 운동성과 유레아제(urease)효소 활성을 가진 것이다. 강력한 운동성은 위의 점액내에서도 자유롭게 이동하면서 살아가기 위한 것으로 주된 역할을 하는 것은 편모이다. 또한 유레아제 활성은 위 점막 내에 낮은 농도로 존재하는 요소를 효과적으로 분해할 수 있으며 이에 따라 생산되는 암모니아가 세균의 주위환경을 중화시킴으로써 위산에 의한 공격에 대처하기 위한 것으로 추측되고 있다. 이러한 특징을 가진 헬리코박터 파이로리균은 만성위염, 위, 십이지장 궤양, 위암의 원인균으로 우리 나라 성인 인구 중 약 60~70%가 감염되어 있는 것으로 조사되고 있으며 만성 위염 환자의 경우 90% 이상의 감염률을 나타내고 있다.
헬리코박터 파이로리균은 특성에 대해 보다 구체적으로 검토하면 운동성이 있는 나선형 그람음성 간균으로 위점막의 점액질층에서 서식하며, 유레아제라는 효소를 가지고 있어 요소(urea)를 분해함으로써 생성되는 암모니아로 위의 강산성인 환경을 중화시켜 생존하고 있다. 헬리코박터 파이로리균은 만성위염과 위궤양과 관련이 있으며, 특히 위궤양의 70%, 위염의 90%, 십이지궤양의 90%가 직접적인 발병 원인이며 게스트릭 에더노머(gastric adenoma) 및 게스릭 무코사 어소시에이티드 림포머(gasric mucosa associated lymphoma)와 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀져 항헬리코박터 파이로리균에 대한 관심이 꾸준히 대두되고 있다.
현재 항헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 항생제가 사용되고 있다. 그러나 항생제 남용으로 인한 주요 부작용은 쇼크, 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 대한 영향, 혈액장애, 간 장애, 위장관 출혈, 청각장애 등이 있다. 새로운 항생제 주사 중에는 술과 함께 복용했을 때 심각한 장애를 일으키는 것도 있다. 항생제의 위험성 중에서 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 미치는 영향 등은 항생제에만 있는 심각한 부작용이다. 또한 항생제는 신장병 발생의 주요 원인이 될 수 있다. 이태리의 베로나 대학 소아과학부 Fanos교수의 연구보고에 의하면 항생제의 투여 또는 항생제와 다른 약의 혼합 투여 시 신장에 주는 의 에 대해 경고한 바 있다. 특히 저체중 신생아에게 흔히 투여되는 항생제가 신장의 을 악화시킬 수 있다고 보고했다(Fanos & Cataldi, 1999). 즉 완전한 제균이 힘들고 10~20%의 환자는 제대로 제균이 되지 않아 재감염이 일어나며 또다시 항생제를 처리하므로서 이의 남용에 따른 심각한 부작용과 항생제내성 균주의 증가로 국민건강에 악영향을 끼치는 악순환이 계속되는 실정이다.
따라서 부작용이 없으면서 식품과 같이 자연스럽게 섭취하여 헬리코박터파이로리균을 예방하고, 나아가 치료효과를 발휘 할 수 있는 제품이 개발이 필요한 실정이다.
헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 사용되고 있는 항생제는 남용이 될 경우 부작용으로 쇼크, 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 대한 영향, 혈액장애, 간 장애, 위장관 출혈, 청각장애 등이 초래될 수 있다. 나아가 항생제의 위험성 중에서 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 미치는 영향 등은 항생제에만 있는 심각한 부작용이고, 신장병 발생의 주요 원인이 될 수 있다. 또한 헬리코박터 파이로리균에 대항하기 위해 항생제를 사용하더라도 완전한 제균이 힘들고 10~20%의 환자는 제대로 제균이 되지 않아 재감염이 일어나기 쉽다. 따라서 부작용이 없으면서 식품과 같이 자연스럽게 섭취하여 헬리코박터 파이로리균을 예방하고, 나아가 치료효과를 발휘 할 수 있는 제품이 개발이 필요하다고 할 것이다.
이에 브로컬리는 로마시대부터 양배추류의 녹색 꽃줄기(green shoot)가 이용되었고, 주요 성분으로는 글루코라파닌(glucoraphanin)과 설포라판(sulforaphane)이 있는데 위암, 위궤양의 원인인 헬리코박터 파이로리균에 대한 항균 활성을 나타내며 조직의 항산화 방어체제를 강화하고 염증 반응을 감소시켜 심혈관 건강을 개선하는 효과와 암 발생의 위험성을 감소시키는 효과가 보고되고 있다. 또한 브로컬리는 레몬의 2배 정도의 비타민C를 함유하고 있으며 비타민B1, 비타민B2, 비타민E, 칼륨 및 칼슘도 풍부하게 함유하고 있어 오늘날 바쁜 현대인들을 위한 웰빙식품으로서 자리 잡고 있다.
한편 우리의 장내에 존재하는 장내 세균은 유익균과 유해균으로 나눌 수 있으며 이들의 종류는 약 2000여 종으로 균수는 100조 정도에 이른다. 이들은 증식을 계속하면서도 서로 다른 균의 증식을 항상 견제하고 있기 때문에 장내 환경의 급격한 변화가 없는 한 대체로 일정한 비율을 유지하며 장내에 동시에 살고 있다. 유해균과 유익균은 서로 경쟁적인 관계이다. 따라서 어느 쪽이 우월 하느냐에 따라 장이 건강한지 아니면 자주 문제가 발생하는 지가 결정되게 된다. 장내 세균의 균형이 파괴되어 유해균이 많아지거나 또는 유익균이 너무 적어지면 장의 기능이 떨어지고, 만성적 설사, 복부 통증, 팽만감, 냄새, 영양결핍, 패혈증, 쇼크 등 여러 증상들이 나타난다. 유해균은 주로 단백질을 분해시켜 인체에 해로운 암모니아나 유화수소, 아민, 페놀, 인돌 등의 악취가 나거나 독성이 강한 물질을 생성한다. 이들 유해물질은 장점막을 지나 혈액 속으로 스며들어 전신에 퍼질 수 있으며, 이로 인해 면역계에도 심각한 문제를 유발할 수 있다. 또한 염증 질환 설재으켜 지고, 해를 사,게 된다. 장내 유익균으로 알려진 유산균은 장내 유해균과 부패균의 증식을 억제하여 각종 장질환의 원인물질인 암모니아, 인돌, 황화수소 등 장내 부패산물의 생성을 막고 장내에 작용하는 항생물질을 생성하여 장내 세균총을 정상적으로 만들어 준다. 또한 생체의 면역기전(대식세포, 임파구) 활성화와 혈액 내 항체의 생성을 촉진하여 면역성을 좋게 할 뿐만 아니라 장내 활성 산소와 발암물질을 생성하는 유해균의 생육을 억제하거나 사멸을 유도하여 항염작용을 하는 것으로 보고되고 있으며 비타민 K, 수용성 비타민 B군(B1, B2, B6, B12) 등을 합성하여 장의 영양 상태를 좋게 만든다. 그 외에 헬리코박터 파이로리균에 대한 항균 활성을 나타내며 스트레스성 변비나 설사를 개선시키고 콜레스테롤 합성을 억제시키며 알레르기 개선이나 피부미용에도 효과적이다.
따라서 본 발명 내용은 분말화한 유기농 브로커리를 장 내에서 잘 정착하고 활동할 수 있는 유산균으로 발효 시킨 제품을 개발하여, 상시 섭취함으로써 항생제와 같이 부작용을 염려할 필요가 없고, 저비용으로 헬리코박터 파이로리균을 억제하여 이 균에 의해서 발생되는 제반 질환을 사전에 예방 및 치료하는데 그 목적이 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 과제를 해결하기 위해 본 발명에서는 본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum MG207; Lactobacillus paracasei MG310; Lactobacillus casei MG311; Lactobacillus acidophilusMG501; Streptococcus thermophilus MG510; 및 Bifidobacterium longumMG723로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 상기 제조방법은 발효원료인 브로컬리분말로부터 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리 분말을 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함할 수 있다.
한편 브로콜리를 유산균으로 발효하여 헬리코박터 파이로리균의 증식억제는 물론 헬리코박터균에 의해 일어 날 수 있는 염증을 억제시키는 싸이토카인 물질은 증가시키고 염증을 활성화 시키는 싸이토카인은 감소시키는 효과가 있는 기능성 발효물질의 생산 방법을 제공한다.
또한 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 함유되어 있는 유산균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법을 제공한다.
나아가 상기 기초 동결보호제는 skim milk, whole milk, whey, casein일 수 있다.
바람직하게는 상기 스킴밀크(skim milk)는 브로콜리발효물에 대해 10~15wt%가 첨가 되고, 수크로오스(Sucrose) 4~6wt%, 말토오스(Maltose) 4~6wt%, 트레할로스(Trehalose) 4~6wt%를 더 첨가할 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 스킴밀크(skim milk)는 브로콜리발효물에 대해 10~15wt%가 첨가 되고, 수크로오스(Sucrose) 5wt%, 말토오스(Maltose) 5wt%, 트레할로스(Trehalose) 5wt%를 더 첨가할 수 있다.
본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법을 통해, 헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 사용되고 있는 항생제는 남용으로 초래되는 쇼크, 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 대한 영향, 혈액장애, 간 장애, 위장관 출혈, 청각장애 등을 방지함과 동시에, 식품과 같이 자연스럽게 섭취할 수 있다는 유리한 효과가 있다.
도 1은 Effect of pre-heating on sulforaphane을 나타내는 그래프이다. A는 control이고, B는 60의 pre-heating을, C는 80의 pre-heating을, D는 100의 pre-heating을, E는 121의 pre-heating을 나타낸다.
도 2는 Comparison of control and microwave treatment in sulforaphane from Broccoli seed meal을 나타내는 그래프이다. 왼쪽 그래프는 control이고, 오른쪽 그래프는 60의 경우를 나타낸다.
도 3은 Effect of broccoli culture broth fermented by lactic acid bacteria on IL-10 production in the LPS(lipopolysaccharide) stimulated RAW 264.7 cells을 나타낸 그래프이다. 왼쪽 흰색 막대는 상등액 처리, 가운데 회색 막대는 lactic acid bacteria cell 처리, 오른쪽 검은색 막대는 상등액과 lactic acid bacteria cell을 혼합 처리한 것을 나타낸다. 또한 '0'은 브로컬리 미발효액, '1'은 Lactobacillus plantarum MG207 발효액, '2'는 Lactobacillus paracasei MG310 발효액, '3'은 Lactobacillus casei MG311 발효액, '4'는 Lactobacillus acidophilus MG501 발효액, '5'는 Bifidobacterium longum MG723 발효액, '6'은 Streptococcus thermophilus MG510 발효액을 나타낸다.
도 4는 Effect of broccoli culture broth fermented by lactic acid bacteria on TNF-a production in the LPS(lipopolysaccharide) stimulated RAW 264.7 cells을 나타낸다. 왼쪽 흰색 막대는 상등액 처리, 가운데 회색 막대는 lactic acid bacteria cell 처리, 오른쪽 검은색 막대는 상등액과 lactic acid bacteria cell을 혼합 처리한 것을 나타낸다. 또한 '0'은 브로컬리 미발효액, '1'은 Lactobacillus plantarum MG207 발효액, '2'는 Lactobacillus paracasei MG310 발효액, '3'은 Lactobacillus casei MG311 발효액, '4'는 Lactobacillus acidophilus MG501 발효액, '5'는 Bifidobacterium longum MG723 발효액, '6'은 Streptococcus thermophilus MG510 발효액을 나타낸다.
도 2는 Comparison of control and microwave treatment in sulforaphane from Broccoli seed meal을 나타내는 그래프이다. 왼쪽 그래프는 control이고, 오른쪽 그래프는 60의 경우를 나타낸다.
도 3은 Effect of broccoli culture broth fermented by lactic acid bacteria on IL-10 production in the LPS(lipopolysaccharide) stimulated RAW 264.7 cells을 나타낸 그래프이다. 왼쪽 흰색 막대는 상등액 처리, 가운데 회색 막대는 lactic acid bacteria cell 처리, 오른쪽 검은색 막대는 상등액과 lactic acid bacteria cell을 혼합 처리한 것을 나타낸다. 또한 '0'은 브로컬리 미발효액, '1'은 Lactobacillus plantarum MG207 발효액, '2'는 Lactobacillus paracasei MG310 발효액, '3'은 Lactobacillus casei MG311 발효액, '4'는 Lactobacillus acidophilus MG501 발효액, '5'는 Bifidobacterium longum MG723 발효액, '6'은 Streptococcus thermophilus MG510 발효액을 나타낸다.
도 4는 Effect of broccoli culture broth fermented by lactic acid bacteria on TNF-a production in the LPS(lipopolysaccharide) stimulated RAW 264.7 cells을 나타낸다. 왼쪽 흰색 막대는 상등액 처리, 가운데 회색 막대는 lactic acid bacteria cell 처리, 오른쪽 검은색 막대는 상등액과 lactic acid bacteria cell을 혼합 처리한 것을 나타낸다. 또한 '0'은 브로컬리 미발효액, '1'은 Lactobacillus plantarum MG207 발효액, '2'는 Lactobacillus paracasei MG310 발효액, '3'은 Lactobacillus casei MG311 발효액, '4'는 Lactobacillus acidophilus MG501 발효액, '5'는 Bifidobacterium longum MG723 발효액, '6'은 Streptococcus thermophilus MG510 발효액을 나타낸다.
본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 유산균은 Lactobacillus plantarum MG207; Lactobacillus paracasei MG310; Lactobacillus casei MG311; Lactobacillus acidophilusMG501; Streptococcus thermophilus MG510; 및 Bifidobacterium longumMG723로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 제조방법은 발효원료인 브로컬리분말로부터 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리 분말을 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효하여 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질을 생성하는 방법을 제공한다.
나아가 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 함유되어 있는 유산균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법에 관한 것이다.
스킴밀크(skim milk)는 브로콜리발효물에 대해 10~15wt%가 첨가 되고, 수크로오스(Sucrose) 4~6wt%, 말토오스(Maltose) 4~6wt%, 트레할로스(Trehalose) 4~6wt%를 더 첨가할 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 스킴밀크(skim milk)는 브로콜리발효물에 대해 10~15wt%가 첨가 되고, 수크로오스(Sucrose) 5wt%, 말토오스(Maltose) 5wt%, 트레할로스(Trehalose) 5wt%를 더 첨가할 수 있다.
이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.
<실시예 1> 브로컬리 시료 열처리 및 일반 세균수 측정
브로콜리 분말 8g을 100ml 증류수에 첨가(8%, w/v)한 후 각각 60에서 30분간 열처리, 80에서 30분간 열처리, 100에서 30분간 열처리, 121에서 20분간 고압멸균하였다. 다만 상기 60와 80의 경우 1차 열처리 후 2시간 37에서 방치 후 2차로 60와 80로 30분간 열처리하여 완료된 시료를 0.9% 멸균 생리 식염수로 10배 연속 희석법으로 희석한 후 뉴트리언트 아가(nutrient agar)에 접종하여 37에서 48시간배양 후 생성된 집락수를 계측하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 배양액 ml당 생균수를 산출했다.
<실시예 2> 브로컬리 시료의 설포라판(sulforaphane) 분석
브로콜리 시료의 추출 및 분석용매로 아세토나이트릴(acetonitrile, B&J, USA), 에틸아세테이트(ethyl acetate, B&J, USA), 에탄올(ethanol, B&J, USA)은 HPLC 등급을 사용하였고, 헥세인(hexane, Daejung, Korea)은 시약급을 사용하였다. 설포라판 표준물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 시료로부터 설포라판 추출 및 정제는 미로시나아제(myrosinase)에 의한 글루코시노레이트(glucosinolates)의 자가분해를 위해 브로콜리분말 5g을 150mL 초순수 증류수와 혼합하여 25에서 2시간 방치하였다. 유기용매 조추출을 위해 혼합액을 150mL 에틸아세테이트와 함께 분별깔대기에 넣어 퍼늘쉐이커(Funnel shaker, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 10분간 강하게 진탕하고 조추출액을 여과지(Advantec No.131, USA)로 여과한 후 분별깔대기에서 상층액을 분리하였다. 회전식 감압농축기를 이용해 조추출액의 용매를 증발시킨 후 150mL의 헥세인-에틸아세테이트(hexane-ethyl acetate, 8:2, v/v)에 용해시킨 다음 중압 액체크로마토그래피(Isco, USA)를 이용하여 고체상추출(Soid-Phase Extraction; SPE)을 실시하였다. 노멀 페이스 칼럼(Normal phase column, 230-400 mesh, silica, 40g)을 기기에 장치하여 100mL 헥세인으로 진공하에 분당 3mL이 흐르게 조정한 후 조추출액을 로딩(loading)하고 유속을 분당 10mL로 조정하여 500mL 에틸아세테이트로 세척하였다. 이후 다시 유속을 분당 3mL로 조정하여 50mL의 에탄올로 용출한 추출액을 회전식 감압농축기로 건조시킨 후 10mL의 아세토나이트릴에 용해시켰다.
<실시예 3> 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 배양
헬리코박터 파이로리(KCTC 5335, ATCC 700392)는 멸균된 브루셀라 브로쓰(Brucella broth, BBL)에 레이크드 홀스 블러드(Laked Horse Blood, Oxoid) 3%를 첨가하여 평판배지로 제조하여 도말하고 37, 5% CO2 조건으로 4일간 배양한 콜로니(Colony)를 수거하여 0.85% 멸균식염수에 희석하여 사용하였다.
<실시예 4> 항 헬리코박터 파이로리 용 브로콜리 발효물의 조제
발효 균주는 Bacillus coagulans MG520; Bifidobacterium bifidum MG731; Bifidobacterium breve MG729; Bifidobacterium longum MG723; Bifidobacterium thermophilum MG748; Enterococcus faecium MG89; Lactobacillus acidophilusMG501; L. brevis MG18; Lactobacillus casei sub. casei MG311; Lactobacillus casei sub. casei MG727; Lactobacillus casei sub. rhamnosus MG316; Lactobacillus casei sub. rhamnosus MG515; L. delbrueckii sub. bulgaricus MG515; L. fermentum MG590; Lactobacillus paracasei MG310; Lactobacillus plantarum MG207; L. reuteri MG505Y; L. salivarius MG595; Lactococcus lactis MG530; Leuconostoc mesenteroides MG865; treptococcus faecalis MG511; Streptococcus thermophilus MG510; 과 같은 유산균주 22종을 선정하여 사용하였다. 상기 균주는 본 발명의 출원인인 (주)메디오젠의 연구소에서 김치, 유제품, 분변으로부터 직접 분리한 균주로서, 상기 회사로부터 구매가 가능하다. 이들 각각의 균종을 MRS배지에서 증균시킨 후 최소배지(펩톤 1.5%, 포도당 1.5%, 효모추출물 0.1%)에서 중간 배양을 시킨 다음 유기농 브로콜리 분말을 증류수에 8% 첨가하고 0.5M의 NaOH로 pH7.0로 보정하여 80에서 30분간 2회 멸균하여 브로콜리액을 준비하였다. 준비된 8% 브로컬리액에 22종의 유산균 배양액을 별도로 1%씩 접종시킨 다음 37에서 24~72시간 혐기 배양 한 다음 6,000rpm에서 20분간 원심분리(Supra 22K, Hanil science Co. Ltd, Korea)하여 상등액을 취하였다. 상등액을 0.9% lactic acid를 사용하여 pH4.0 및 1N NaOH로 pH5.5, pH7.0으로 보정한 후 스터릴 0.2μm 시린지 필터(Sterile 0.2μm syringe filter, Cellulose Acetate, Advantec)로 여과한 다음 10배 농축하여 시료로 사용하였다.
<실시예 5> 발효물의 산도 측정
pH 측정은 피에이치 미터(pH meter, Istec720P, Korea)를 이용하여 측정을 하였고, 산도는 식품공전 방법에 따라 측정하였다. 즉 생약 발효액 10ml에 동량의 증류수를 가하여 1% 페노프탈레인 알콜(phenophthalein alcohol) 0.5ml를 가한 후 0.1N 수산화나트륨(NaOH)용액으로 적정하여 엷은 홍색이 30초간 유지되는 시점에서의 소비량을 측정하여 다음 식에 의해 총산을 적정하여, 그 적정값을 젖산(lactic acid) 함량(%)으로 환산하여 표시하였다. 하기 f는 0.1N 수산화나트륨의 factor를 나타낸다.
<실시예 6> 발효물의 유산균수 측정
생균수 측정은 배양 완료된 시료를 0.9% 멸균 생리 식염수로 10배 연속 희석법으로 희석한 후 Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus속은 BCP plate count agar에 접종하였고 Bifidobacterium속은 BL agar에 접종하여 37, 48시간 혐기 jar에서 배양 후 생성된 집락수를 계측하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 배양액 ml당 생균수를 산출했다.
<실시예 7> 헬리코박터 파이로리 저해도 측정
각각 pH4.0, pH5.5, pH7.0으로 보정한 Brucella broth(Lakee horse blood 3% 포함)에 Brucella broth와 동일한 pH로 보정한 브로컬리 발효 여과 농축액을 각각 2.5%, 1.0%, 0.5%, 0.1%씩 첨가한 다음 여기에 0.85% 멸균식염수에 희석된 H. pylori를 100μm씩 접종하여 mixed broth를 만들었다. 이 mixed broth를 37, 5% CO2에서 24시간 반응시킨 후 Brucella agar plate(Laked Horse Blood 3% 포함)에 100μl씩 도말하고 37, 5% CO2 조건으로 4일간 배양하여 H. pylori의 colony를 계측하여 확인하였다.
<실시예 8> 유레아제(Urease) 저해도 측정
유산균으로 발효한 브로콜리 상등액의 헬리코박터 파이로리 유레아제 억제활성을 측정 위하여 Brucella agar(Lake horse blood 3% 포함) 평판배지에서 72시간 배양된 H. pylori colonies를 수거하여 0.85% 멸균식염수로 세척한 후, 1/20로 희석하여 600nm의 흡광도에서 0.89값이 나오도록 현탁하였다. 미리 준비된 pH4.0, pH5.5, pH7.0의 브로콜리 발효 상등농축액을 배양하지 않은 신선한 Brucella broth(Lake horse blood 3% 포함)에 1%, 5%씩 첨가하고 0.85% 멸균식염수에 현탁된 H. pylori를 10%(v/v) 접종하여 37, 5% CO2에서 1시간동안 미호기적으로 배양하였다. Urease의 활성을 측정하기 위해 Urea brtoh(Merck, Germany)에 상기 시료를 30%(v/v) 혼합하여 30에서 1시간 반응시킨 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다.
<실시예 9> RAW 264.7 세포배양 및 시료처리
한국세포주은행으로부터 마우스 매크로파지 셀라인(mouse macrophage cell line) RAW 264.7를 분양받아 질소탱크(nitrogen tank)에 보관하였고, 실험에 사용할 세포는 10% fetal bovine serum과 streptomycin (100㎍/ml), penicillin (100U/ml)이 포함된 Dulbecco`s modified Eagle`s medium (DMEM, GIBCO, USA)에서 37, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 실험에 사용할 Raw cell (p=30)을 24-well culture plate에 2x105 cells/ml씩 첨가하여 18시간 배양한 후 샘플을 처리하였다. 실험에 사용할 브로컬리 배양액 샘플을, 하나는 배양액 전체 (whole)를, 다른 하나는 배양액을 원심분리한 후 membrane filter로 여과한 상등액 (medium)으로 나누었다.
그리고 유산균 배양배지에서 키운 순수한 유산균체는 균주별로 5 x 107 CFU/ml로 희석하여 사용하였다. 샘플 50μl를 DMEM배지 550μl에 희석 (1:12)하여 전체 600μl를 RAW 264.7 cell이 배양된 well에 각각 처리하여 두 가지 방법으로 실험하였다. 시료를 첨가하여 16시간 배양한 후 시료를 제거하고 100 ng/ml의 LPS가 포함된 DMEM배지를 500μl를 첨가하여 8시간 배양한 후 배양액을 회수, 원심분리한 상등액을 cytokine측정에 사용하였다. Negative control 샘플로는 박테리아를 배양하지 않은 10% 브로콜리 미발효여과액을 같은 비율로 희석하여 사용하였다. Positive control로는 Pseudomonas aerogunosa의 lipopolysaccharide (Sigma, USA)를 100 ng/ml의 농도로 DMEM배지에 첨가하였다.
<실시예 10> 싸이토카인(Cytokine) 측정
샘플을 처리한 세포상등액에 존재하는 IL-10과 TNF-a의 정량은 ELISA kit(KOMA, Korea)를 사용하여 실시하였다. 세포상등액 50μl를 assay diluent 100 μl와 함께 anti-mouse IL-10, anti-mouse TNF-a가 부착된 well에 첨가하여 반응이 일어나게 한 다음, biotinylated detection antibody를 첨가하였다. PBS buffer로 네 번의 세척과정을 거친 다음, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 동안 실온에서 반응하였다. 다시 PBS로 네 번의 세척과정을 거친 다음, 100μl의 tetramethylbenzidine과 hydrogen peroxide를 첨가하여 부착된 peroxidase conjugate를 검출한 후, 1M H2SO4 용액 100μl를 첨가하여 반응을 종료시키고 microplate reader에서 450 nm의 흡광도를 측정하였다. Cytokine의 농도는 linear dose-response standard curve를 작성하여 정량하였다.
<실시예 11> 브로컬리 발효물의 동결건조 및 원료제조
발효배양액에 5~30% 농도로 동결건조 보호제제를 첨가 한 후 균일화한 다음 -70에서 2시간 예비동결 시키고 48시간 동안 동결건조 시켰다. 건조기 내부 챔버(chamber)의 온도는 -10에서 시작하여 2시간에 10씩 상승하고 30에서 고정하도록 조절하였다. 동결건조가 종료된 후 분말을 분쇄하고 생균수 측정을 하고 최초 생균수와 비교하여 그 생존률을 계산하였다. 측정은 배양 완료된 시료를 0.9% 멸균 생리 식염수로 10배 연속 희석법으로 희석한 후 Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus속은 BCP plate count agar에 접종하였고 Bifidobacterium속은 BL agar에 접종하여 37, 48시간 혐기 jar에서 배양 후 생성된 집락수를 계측하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 배양액 g당 생균수를 산출했다.
<실시예 12> 통계 처리
효과의 우수성을 나타내는 객관적인 데이터 확보를 위해 연구 결과에 대한 각 군간의 유의성 검증을 시행하였다. 보다 상세하게는 Student's t-test를 사용하였고, 유의수준이 P>0.05일 경우 그 결과에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
<실험례 1> 유기농 브로컬리의 동결건조 분말의 microwave 처리
유기농 브로커리를 동결건조한 후 일반세균을 감소시키기 위한 전처리 과정으로 마이크로웨이브(microwave)처리하였으며 그 결과 미처리군에서의 일반세균수는 3.0X105cfu/ml를 나타 냈으며 처리군에서는 5.0X103 cfu/ml로 약 100배정도 감소하였으며 설포라판 함량을 HPLC 분석한 결과 [도 1]에서와 같이 마이크로웨이브처리군은 분말 g당 약 7.0ug이 함유되어 있으며 미처리군은 약 2.6ug이 함유되어 있는 것으로 나타나 처리군이 약 2.7배 정도 높게 나타났다. 이를 [표 1]에 나타내었다.
| 방법 | 일반세균수 (cfu/ml) | 브로콜리분말 1g당 Sulforaphane함량(㎍) |
| Microwave 미처리 | 3.0×105 | 2.6 |
| Microwave 처리 | 5.0×03 | 7.0 |
<실험례 2> 유기농 브로컬리의 동결건조 분말의 일반 세균수 측정
마이크로 웨이브처리한 유기농 브로컬리의 동결건조 분말을 증류수에 8% 함량이 되도록 첨가한 다음 60, 80, 100에서 30분간 열처리하고 121에서는 20분간 고압멸균을 한 결과 [표 2]에서와 같이 60 처리에서는 약 2.8X103cfu/ml의 일반 세균이 검출되었고, 80에서는 1.8X101cfu/ml이 검출되었으며 100와 121 고압멸균에서는 일반세균이 검출되지 않았다. 그러나 100와 121의 열처리에서는 브로컬리의 주요 성분인 설포라판의 손실이 우려되어 60와 80에서 약 3시간의 차이를 두고 2회 열처리한 결과 60에서는 2.7X102cfu/ml 일반 세균수를 보였으며 80에서는 검출되지 않아 향후 발효시험을 하기 위한 열처리 온도는 80에서 30분간 열처리 후 3시간 방치 후 다시 80에서 30분간 열처리하는 방법을 선택하였다.
| 열처리 온도 | 일반세균수 (cfu/ml) | ||
| 열처리전 | 1차 열처리 | 2차 열처리 | |
| 60℃ | 5.0×03 |
2.8×03 | 2.7×02 |
| 80℃ | 2.8×02 | ND* | |
| 100℃ | ND | - | |
| 121℃ | ND | - | |
*ND: not detected
<실험례 3> 브로컬리 주요성분인 설포라판의 열처리 온도에 따른 변화
[도 2]에서 보는 것과 같이 유기농 브로커리의 동결건조 분말을 발효하기 위해서는 마이크로웨이브 처리를 한 후에도 잔존하는 일반세균의 사멸이 필수이며 이를 위해 일반세균수를 최대한 감소시키고 브로컬리 주요성분인 설포라판의 분해가 최소화될 수 있는 최적의 열처리 온도를 시험한 HPLC 분석 결과 60에서 30분간 열처리한 결과 설포라판의 함량은 약 97%를 유지하였으며 80에서는 약84%, 100에서는 45%, 120에서 20분간 고압 열처리한 경우는 설포라판이 모두 파괴되었다. 따라서 설포라판이 파괴되지 않는 적절한 온도는 60와 80이나 살균을 60에서 할 경우 브로컬리 분말에 함유되어 있는 일반세균의 사멸율이 낮아 살균 온도는 80로 정하였으나 한번의 열처리로는 일반 세균이 잔존하여 80로 2회에 걸쳐 살균을 하였으며 그 결과 설포라판의 함량은 약 66%로 감소하였다([표 3] 참조).
| Heat | sulforaphane (%) | ||||
| No heat | 60℃ | 80℃ | 100℃ | 121℃ | |
| 1회 | 100 | 96.88 | 83.50 | 44.92 | 0.0 |
| 2회 | - | - | 66.18 | 13.68 | - |
<실험례 4> 브로컬리 발효 및 균주선별
브로컬리에 대한 [표 4]에서의 유산균 22종에 대한 배양시간별 생육 시험과 pH 및 산도 변화를 측정한 결과 [표 4]와 [표 5]에서와 같이 전반적으로 pH 및 산도는 24시간 배양 이후 큰 변화는 없었으며 배양액 생균수는 48시간 배양 보다 24시간 배양에서 양호하였고, Bifidobacterium속에서는 Bifidobacterium longum MG723이 5.3×108 cfu/ml로 생육이 가장 우수하였고 Lactobacillus속에서는 Lactobacillus acidophilusMG501, Lactobacillus plantarum MG207, Lactobacillus paracasei MG310, Lactobacillus casei sub. rhamnosus MG311이 각각 5.5×108 cfu/ml, 35.5×108 cfu/ml, 54.5×108 cfu/ml, 23.5×108 cfu/ml로 생육이 우수하였으며 Streptococcus속에서는 Streptococcus thermophilus MG510이 5.7×108 cfu/ml로 우수하였다. 그 외에 Enterococcus faecium MG89, Lactobacillus casei sub. rhamnosus MG515, Streptococcus faecalis MG511 등도 우수하였으나 중복성 및 소비자 선호도에 따라 브로컬리 발효용 유산균으로 Bifidobacterium longum MG723, Lactobacillus acidophilusMG501, Lactobacillus plantarum MG207, Lactobacillus paracasei MG310, Lactobacillus casei sub. rhamnosus MG311, Streptococcus thermophilus MG510 등 6종을 선별하였으며 향후 브로컬리 발효물 시료 제조에 상기 언급한 6종의 균주를 사용하여 24시간 발효하여 제조하였다.
| No | Strain | 발효후 배양액 pH |
산도 (%) |
생균수 (×108 cfu/ml) |
| 0 | control | - | 0.18 | - |
| 1 | Bacillus coagulans MG520 | 4.4 | 1.02 | 0.86 |
| 2 | Bifidobacterium bifidum MG731 | 5.5 | 0.20 | <105 |
| 3 | Bifidobacterium breve MG729 | 4.3 | 1.14 | 0.25 |
| 4 | Bifidobacterium longum MG723 | 4.1 | 1.32 | 5.3 |
| 5 | Bifidobacterium thermophilum MG748 | 4.1 | 1.32 | 0.35 |
| 6 | Enterococcus faecium MG89 | 4.3 | 1.14 | 6.7 |
| 7 | L. acidophilus MG501 | 3.8 | 1.60 | 5.5 |
| 8 | L. brevis MG18 | 5.0 | 0.35 | 1.5 |
| 9 | L. casei sub. casei MG311 | 4.1 | 1.32 | 23.5 |
| 10 | L. casei sub. casei MG727 | 4.1 | 1.32 | 4.7 |
| 11 | L. casei sub. rhamnosus MG316 | 4.0 | 1.43 | 16 |
| 12 | L. casei sub. rhamnosus MG515 | 4.2 | 1.25 | 9.5 |
| 13 | L. delbrueckii sub. bulgaricus MG515 | 4.2 | 1.25 | 0.39 |
| 14 | L. fermentum MG590 | 4.4 | 1.02 | 1.2 |
| 15 | L. paracasei MG310 | 4.1 | 1.32 | 54.5 |
| 16 | L. plantarum MG207 | 3.9 | 1.50 | 35.5 |
| 17 | L. reuteri MG505Y | 4.6 | 0.82 | 1.1 |
| 18 | L. salivarius MG595 | 4.1 | 1.32 | 1.5 |
| 19 | Lactococcus lactis MG530 | 4.5 | 0.96 | 0.20 |
| 20 | Leuconostoc mesenteroides MG865 | 4.5 | 0.96 | 0.48 |
| 21 | Streptococcus faecalis MG511 | 4.5 | 0.96 | 5.5 |
| 22 | Streptococcus thermophilus MG510 | 4.4 | 1.02 | 5.7 |
| No | Strain | 발효후 배양액 pH |
산도 (%) |
생균수 (×108 cfu/ml) |
| 0 | control | - | 0.18 | - |
| 1 | Bacillus coagulans MG520 | 4.4 | 1.02 | 0.09 |
| 2 | Bifidobacterium bifidum MG731 | 5.5 | 0.20 | <105 |
| 3 | Bifidobacterium breve MG729 | 4.3 | 1.14 | 0.15 |
| 4 | Bifidobacterium longum MG723 | 4.1 | 1.32 | 3.3 |
| 5 | Bifidobacterium thermophilum MG748 | 4.1 | 1.32 | 0.15 |
| 6 | Enterococcus faecium MG89 | 4.3 | 1.14 | 3.7 |
| 7 | L. acidophilus MG501 | 3.8 | 1.60 | 2.5 |
| 8 | L. brevis MG18 | 5.0 | 0.35 | 0.8 |
| 9 | L. casei sub. casei MG311 | 4.1 | 1.32 | 0.26 |
| 10 | L. casei sub. casei MG727 | 4.1 | 1.32 | 2.7 |
| 11 | L. casei sub. rhamnosus MG316 | 4.0 | 1.43 | 8.0 |
| 12 | L. casei sub. rhamnosus MG515 | 4.2 | 1.25 | 4.8 |
| 13 | L. delbrueckii sub. bulgaricus MG515 | 4.2 | 1.25 | 0.2 |
| 14 | L. fermentum MG590 | 4.4 | 1.02 | 0.7 |
| 15 | L. paracasei MG310 | 4.1 | 1.32 | 6.2 |
| 16 | L. plantarum MG207 | 3.9 | 1.50 | 3.3 |
| 17 | L. reuteri MG505Y | 4.6 | 0.82 | 0.3 |
| 18 | L. salivarius MG595 | 4.1 | 1.32 | 0.8 |
| 19 | Lactococcus lactis MG530 | 4.5 | 0.96 | 0.1 |
| 20 | Leuconostoc mesenteroides MG865 | 4.5 | 0.96 | 0.2 |
| 21 | Streptococcus faecalis MG511 | 4.5 | 0.96 | 2.3 |
| 22 | Streptococcus thermophilus MG510 | 4.4 | 1.02 | 2.1 |
<실험례 5> 브로컬리 발효물의 헬리코박터 파이로리 저해
헬리코박터 파이로리에 대한 저해능은 전체적으로 pH가 낮을수록 효과가 있는 것으로 확인되었고 control(-)에서 보면 lactic acid로 pH 4.0과 5.5로 보정된 Brucella 배지에서 pH가 낮을수록 저해효과가 나타나는 것을 보면 lactic acid 자체가 H. pylori 증식 억제 효과 있는 것으로 보이며 pH 5.5로 보정된 시료의 경우 1.0~2.5% 첨가농도에서 H. pylori의 증식이 억제되는 것을 보임으로서 control(+)와 비교할 때 발효물의 첨가가 H. pylori 증식억제에 상승 작용을 하는 것을 알 수 있다. Lactic acid의 효과를 배제하기 위해 pH 7.0으로 중화시킨 시료에서는 control(-)군인 순수 Brucella 배지에서 1.2X106cfu/ml의 생균수를 보였으나 control(+)군인 브로컬리 미발효액이 첨가된 배지에서는 control(-)군과 비교 할때 1/10~1/100로 생균수가 감소되어 브로커리 추출물의 효과가 나타났으며 6종의 유산균으로 발효된 브로컬리 여액이 농도별로 첨가된 경우 L. acidophilus와 S. thermophilus로 발효된 여액 2.5% 첨가 농도에서는 H. pylori의 증식이 완전히 억제되었으며 0.1~0.5% 첨가 농도에서도 1/10~1/100로 생균수가 감소하는 현상을 보여 효과가 우수한 것으로 나타났으며 나머지 균종의 발효물 여액 1.0~2.5% 첨가 농도에서도 control(+)에 비해 1/10~1/100로 생균수가 감소하여 lactic acid나 브로컬리 추출물외에 발효에 의한 항H. pylori 억제 물질이 생성되었음을 알 수 있다. 그러나 0.1~0.5% 첨가 농도에서는 L. acidophilus와 S. thermophilus 균주로 발효시킨 시료 외에는 억제효과를 나타내지 않았아 적어도 0.5% 이상을 처리하여야 효과를 발휘 할 수 있는 것으로 사료되었다.
| 상등액 pH 시료 |
H. pylori 생균수(cfu/ml) | |||
| pH 4.0 | pH 5.5 | pH 7.0 | ||
| Control(-)* | ND*** | 1.1×104 | 1.2×106 | |
| Control(+)** | 2.5% | ND | ND | 3.1×104 |
| 1.0% | ND | 2.1×102 | 1.4×105 | |
| 0.5% | ND | 1.1×103 | 1.6×105 | |
| 0.1% | ND | 1.7×103 | 1.7×105 | |
| L. plantarum MG207 발효물 |
2.5% | ND | ND | 2.0×103 |
| 1.0% | ND | ND | 2.1×104 | |
| 0.5% | ND | 5.0×101 | 3.7×105 | |
| 0.1% | ND | 3.0×102 | 5.8×105 | |
| L. paracasei MG310 발효물 |
2.5% | ND | ND | 5.0×103 |
| 1.0% | ND | ND | 2.6×104 | |
| 0.5% | ND | 2.4×102 | 2.9×105 | |
| 0.1% | ND | 2.7×102 | 3.1×105 | |
| L.c asei MG311 발효물 |
2.5% | ND | ND | 4.0×103 |
| 1.0% | ND | ND | 1.3×104 | |
| 0.5% | ND | 3.3×102 | 2.4×105 | |
| 0.1% | ND | 5.4×102 | 3.9×105 | |
| L. acidophilus MG501 발효물 |
2.5% | ND | ND | ND |
| 1.0% | ND | ND | 2.3×103 | |
| 0.5% | ND | 2.0×101 | 3.4×104 | |
| 0.1% | ND | 4.3×102 | 5.7×105 | |
| S. thermophilus MG510 발효물 |
2.5% | ND | ND | ND |
| 1.0% | ND | ND | 2.7×102 | |
| 0.5% | ND | ND | 1.3×103 | |
| 0.1% | ND | 5.5×102 | 3.3×104 | |
| Bi. longum MG723 발효물 |
2.5% | ND | ND | 2.0×104 |
| 1.0% | ND | 4.0×101 | 2.2×105 | |
| 0.5% | ND | 2.7×102 | 3.6×105 | |
| 0.1% | ND | 7.0×102 | 4.4×105 | |
* Control(-) : Brucella broth + H.pylori
** Control(+) : Brucella broth + H.pylori + 브로콜리 미발효 상등액
*** ND : Not detected
<실험례 6> 유레아제(Urease) 저해도 측정
브로컬리 발효물를 사용하여 헬리코박터파이로리의 유레아제 활성에 대한 억제 효과를 시험 결과 시료 pH에 따른 urease의 활성 저해는 시료별로 큰 차이를 보이지 않았으며 농도에 따라서는 Streptococcus thermophilus와 Bifidobacterium longum발효 상등액에서 차이가 있었으며 나머지 균주에서는 유의있는 차이는 보이지 않았다. 미발효액의 5% 첨가에서 약 29%정도의 저해율을 보였고 Lactobacillus paracasei의 경우 56% 정도의 저해율을 나타냈다. L. acidophilus의 경우 농도에 따라 55~67% 정도의 유의 있는 저해 효과를 나타냈으며 특히 Streptococcus thermophilus 와 Bifidobacterium longum발효 상등액은 농도에 따라 60~80정도의 높은 저해율을 보임으로서 H. pylori의 증식을 억제 하는데 간접적으로 효과를 나타낼 것으로 사료된다([표 7] 참조).
| 시료 및 농도 | urease 활성 저해율(%) | |||
| pH 4.0 | pH 5.5 | pH 7.0 | ||
| Control | 1 | 21.7 | 23.3 | 23.3 |
| 5 | 27.1 | 29.5 | 29.5 | |
| L. plantarum MG207 | 1 | 32.6 | 34.1 | 34.2 |
| 5 | 37.2 | 38.6 | 38.8 | |
| L. paracasei MG310 | 1 | 56.3 | 55.3 | 55.2 |
| 5 | 59.7 | 56.2 | 56.2 | |
| L. casei MG311 | 1 | 20.0 | 21.1 | 21.0 |
| 5 | 21.2 | 22.4 | 22.4 | |
| L. acidophilus MG501 | 1 | 53.3 | 55.2 | 55.5 |
| 5 | 67.4 | 65.2 | 60.5 | |
| Str. thermophilus MG510 | 1 | 59.7 | 67.7 | 40.3 |
| 5 | 79.8 | 73.9 | 42.4 | |
| Bi. longum MG723 | 1 | 59.7 | 65.1 | 64.3 |
| 5 | 83.7 | 68.8 | 66.4 | |
<실험례 7> 브로컬리 발효물에 의한 사이토카인(cytokine) 생성
브로컬리 발효액을 Raw 264.7 macrophage에 첨가하였을 때 항염 cytokine으로 알려진 IL-10의 양을 측정하였다. 각 균주의 발효액을 1:12 희석한 시료를 처리하여 Raw 264.7 세포 배양액에 존재하는 IL-10의 생성량을 측정한 결과 발효상등액과 발효에 사용된 순수 유산균체 및 발효상등액에 유산균체를 혼합한 시료에 대해 실시하였다. 실험결과 대조군인 LPS의 경우 640 pg/ml을 브로컬리 미발효 상등액은 880pg/ml을 보였으며 Lactobacillus acidophilus MG501 상등액의 경우 약 1800pg/ml로 가장 높은 생성을 나타냈고 Bifidobacterium longum MG723과 Lactobacillus plantarum MG207 상등액이 약 1700 pg/ml, Lactobacillus aracasei MG310과 Lactobacillus casei MG311이 1200~1300 pg/ml의 생성량을 보여 브로컬리 미발효액 보다 약 1.5~2배정도 많은 IL-10을 생성하였다.
발효균체의 경우 Lactobacillus acidophilus MG501 균체가 2600 pg/ml로 가장 높은 생성량을 나타냈으며 Lactobacillus plantarum MG207과 Bifidobacterium longum MG723이 2200~2300 pg/ml, Streptococcus thermophilus MG510이 1800 pg/ml 그리고 Lactobacillus paracasei MG310과 Lactobacillus casei MG311이 약 1300 pg/ml 정도의 생성량을 보임으로서 상등액 보다는 전반적으로 높은 생성량을 나타냈으며 브로컬리 발효 상등액과 유산균체가 동시에 함유된 시료를 분석한 결과 Lactobacillus acidophilus MG501과 Bifidobacterium longum MG723 시료의 경우 약 3000 pg/ml의 IL-10을 생성하였고 Lactobacillus plantarum MG207과 Streptococcus thermophilus MG510 시료의 경우 2500~2900 pg/ml의 IL-10 를 생성하여 상등액 단독 보다는 1.4~2.4배 정도, 균체 단독 보다는 1.3~1.4배 증가된 현상을 보임으로서 염증 억제 효과가 기대되며 한편 염증을 활성화시키는 기능을 나타내는 TNF-a의 경우 대조군인 LPS의 경우 1074 pg/ml를 생성하였고 브로컬리 미발효 상등액의 경우976 pg/ml을 보였으며 Streptococcus thermophilus MG510 상등액의 경우 약 829 pg/ml로 가장 낮은 생성을 나타냈으며 전반적으로 대조군과 유사하거나 그 이하의 수치를 나타냈다. 유산균체만을 처리하였을 경우 Lactobacillus acidophilus MG501 균체가 995 pg/ml로 가장 낮은 수치를 보였으며 나머지 균종의 균체시료는 약 1000~1160 pg/m로 대조군에 비해 TNF-a의 수치가 유사하거나 약간 상승 하였으며 발효 상등액과 균체혼합물 시료를 처리한 결과 Bifidobacterium longum MG723이 768 pg/ml으로 가장 적게 생성 되었으며 나머지 시료는 약 850~990pg/ml으로 대조군 보다 낮은 수치를 보임으로서 브로컬리 발효물이 항염에 효과가 있는 것으로 사료된다([도 3] 및 [도 4] 참조).
<실험례 8> 브로컬리 발효물의 동결건조 및 원료제조
브로컬리 발효 후 동결건조를 하여 균의 생존율을 높이기 위한 기초 보호제 성분들에 대해서 세포의 생존율을 실험한 결과 균주별로 차이는 있으나 전반적으로 skim milk를 24시간 배양한 브로컬리 발효물에 대해 10 ~15%첨가했을 때 가장 좋은 생존율을 보였으며 다음으로는 whole milk와 whey, casein 순으로 생존율을 보였으며 그 결과는 [표 8]과 같다.
따라서 향후 시험은 대량 생산시 비용을 감안 하여 skim milk 10%를 기본으로 첨가하고 다른 기타 성분들을 농도별로 첨가하여 생존율을 조사하였다. Skim milk 10%를 기본으로 하고 여기에 glucose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, solbitol, xylitol, mannitol, 변성전분 등 9종의 보호제를 24시간 배양한 브로컬리 발효물에 대해 5%와 10%의 농도로 첨가한 결과 L. plantrum MG207 발효물은 trehalose와 sucrose, maltose 첨가한 시료가 53~58%의 생존율을 보여 다른 보호제 보다 양호하였으며 L.paracasei MG310 발효물은 trehalose와 sucrose, maltose 첨가한 시료에서 약48% 정도의 생존율을 나타냈으며 L.casei MG311 발효물은 약50%의 생존율을 보였다.
L. acidophilus MG501 발효물의 경우 sucrose와 trehalose 첨가 시료에서 약 45%정도의 생존율을 보였고 St. thermophilus MG510 발효물은 glucose , sucrose, maltose, trehalose 첨가 시료에서 60~68%의 높은 생존율을 나타냈으며 Bifidobacterium longumMG723 발효물의 경우 sucrose와 trehalose 10% 첨가 시료에서 약 42%정도의 생존율을 나타냈다([표 9] 참조).
따라서 최종 보호제 조성은 skim milk 10%, sucrose 5%, maltose 5%, trehalose 5%로 구성하였으며 이러한 보호제 구성성분을 이용하여 각 균종의 배양 시간별 발효물에 대한 동결건조 후 생존율을 조사한 결과 Table 10에서와 같이 L. plantrum MG207로 발효한 경우 12시간 배양 후 동결 건조한 시료의 생존율이 92%로 가장 높았으며 Lactobacillus paracasei MG310, L.casei MG311, L. acidophilus MG501, Bifidobacterium longumMG723의 경우 24시간 배양 후 동결 건조한 시료의 생존율이 각각 86.5%, 87.8%, 80.6%, 66.4%로 다른 배양 시간의 시료 보다 생존율이 높았으며 St. thermophilus MG510의 경우 36시간 배양 후 동결 건조한 시료의 생존율이 97%로 가장 우수하였다. 따라서 추후 브로컬리 발효물의 동결건조 시료 제조는 L. plantrum MG207은 12시간 배양 후, Lactobacillus paracasei MG310, L.casei MG311, Lactobacillus acidophilusMG501, Bi.longum MG723은 24시간 배양 후, St. thermophilus MG510은 36시간 배양한 발효물을 취하여 수행하였다.
| 보호제 시료 |
동결건조후 생존율(%). | |||||
| L. plantarum MG207 | L. paracasei MG310 | L. casei MG311 | L. acidophilus MG501 | Str. thermophilus MG510 | Bi. longum MG723 | |
| 무첨가 | 0.4 | 10.6 | 0.4 | 42.0 | ||
| Skim milk 10% | 48.1% | 35.5% | 32.5% | 30.5% | 54.8% | 22.5% |
| Skim milk 15% | 42.5% | 30.6% | 28.7% | 26.0% | 52.1% | 20.7% |
| Whole milk 10% | 31.0% | 25.5% | 22.0% | 20.5% | 40.5% | 18.0% |
| Whole milk 15% | 36.7% | 30.0% | 27.0% | 22.4% | 35.5% | 20.2% |
| Whey 10% | 36.0% | 26.9% | 23.5% | 21.5% | 40.0% | 17.5% |
| Whey 15% | 38.5% | 30.5% | 28.9% | 25.7% | 42.2% | 18.5% |
| Casein 10% | 21.5% | 23.4% | 21.2% | 18.2% | 32.5% | 18.2% |
| Casein 15% | 20.0% | 22.4% | 20.5% | 20.0% | 29.2% | 20.0% |
| 동결보호제 및 첨가농도 | 동결건조후 생존율(%). | ||||||
| L. plantarum MG207 | L. paracasei MG310 | L. casei MG311 | L. acidophilus MG501 | Str. thermophilus MG510 | Bi. longum MG723 | ||
| Control (skim milk 10%) |
48.1% | 35.5% | 32.5% | 30.5% | 54.8% | 22.5% | |
| Glucose | 5% | 42.0 | 38.9 | 36.8 | 35.6 | 60.0 | 26.4 |
| 10% | 35.1 | 37.7 | 35.4 | 36.8 | 62.1 | 25.2 | |
| Sucrose | 5% | 55.5 | 45.5 | 48.5 | 40.5 | 66.2 | 37.5 |
| 10% | 50.2 | 48.6 | 50.6 | 45.6 | 66.5 | 42.4 | |
| Maltose | 5% | 52.4 | 46.3 | 45.1 | 37.1 | 62.4 | 36.2 |
| 10% | 53.6 | 47.6 | 48.5 | 38.5 | 63.6 | 39.6 | |
| Lactose | 5% | 22.9 | 34.4 | 36.5 | 30.5 | 42.8 | 22.5 |
| 10% | 33.6 | 36.6 | 38.2 | 32.8 | 43.1 | 28.5 | |
| Trehalose | 5% | 58.1 | 44.1 | 46.8 | 40.7 | 68.6 | 37.7 |
| 10% | 55.3 | 48.2 | 50.6 | 45.5 | 65.4 | 41.6 | |
| Sorbitol | 5% | 20.6 | 24.8 | 22.5 | 20.0 | 40.0 | 24.1 |
| 10% | 30.0 | 29.1 | 26.4 | 22.8 | 42.0 | 28.1 | |
| Xylitol | 5% | 10.4 | 22.5 | 24.8 | 20.8 | 40.6 | 25.7 |
| 10% | 15.4 | 29.5 | 24.5 | 24.5 | 45.4 | 28.5 | |
| Mannitol | 5% | 12.5 | 17.0 | 16.5 | 20.5 | 42.2 | 26.0 |
| 10% | 11.2 | 11.3 | 14.4 | 24.4 | 41.3 | 24.0 | |
| 변성전분 | 5% | 10.8 | 15.8 | 12.8 | 14.2 | 30.0 | 4.8 |
| 10% | 11.1 | 10.4 | 12.4 | 14.2 | 31.2 | 2.4 | |
| 배양시간 | 동결건조후 생존율(%). | |||||
| L. plantarum MG207 | L. paracasei MG310 | L. casei MG311 | L. acidophilus MG501 | Str. thermophilus MG510 | Bi. longum MG723 | |
| 12 | 92.0 | 45.5 | 42.5 | 40.5 | 50.8 | 36.5 |
| 24 | 69.6 | 86.5 | 87.8 | 80.6 | 90.5 | 66.4 |
| 36 | 50.2 | 61.8 | 66.4 | 56.7 | 97.0 | 45.2 |
| 48 | 45.5 | 40.9 | 48.8 | 40.5 | 86.6 | 34.8 |
*동결보호제: Sucrose 5%, Maltose 5%, Trehalose 5%, Skim milk 10%
이상에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하였다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니고, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물이 존재한다. 또한 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되고, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
만성위염, 위, 십이지장 궤양, 위암의 원인균으로 우리 나라 성인 인구 중 약 60~70%가 감염되어 있는 것으로 조사되고 있는 헬리코박터 파이로리균에 대한 대책으로 통상적으로 항생제가 사용되고 있다. 그러나 항생제가 남용이 될 경우 쇼크, 내성균의 조성 등의 다양한 부작용이 초래될 수 있다. 이에 부작용이 없으면서 식품과 같이 자연스럽게 섭취하여 헬리코박터 파이로리균을 예방하고, 나아가 치료효과를 발휘 할 수 있는 제품이 개발이 절실하다고 할 것이다.
이러한 측면에서 주요 성분으로는 글루코라파닌과 설포라판을 함유하고 있는 브로컬리는 헬리코박터 파이로리균에 대한 항균 활성을 나타내며 조직의 항산화 방어체제를 강화하고 염증 반응을 감소시켜 심혈관 건강을 개선하는 효과와 암 발생의 위험성을 감소시키는 효과가 있다.
따라서 본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질 및 이의 제조방법을 제공함으로써 항생제의 남용으로 초래되는 다양한 부작용을 방지함과 동시에, 식품과 같이 자연스럽게 섭취할 수 있다는 점은 물론 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시킨다는 점에서 산업상이용가능성이 있다.
나아가 본 발명은 브로콜리를 유산균으로 발효하여 헬리코박터 파이로리균의 증식억제는 물론 헬리코박터균에 의해 일어 날 수 있는 염증을 억제시키는 싸이토카인 물질은 증가시키고 염증을 활성화 시키는 싸이토카인은 감소시키는 효과가 있는 기능성 발효물질의 생산 방법을 제공하고 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질에 함유되어 있는 유산균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법을 제공한다는 점에서 산업상이용가능성이 매우 우수하다고 할 것이다.
Claims (10)
- 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질.
- 제1항에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum; Lactobacillus paracasei; Lactobacillus casei; Lactobacillus acidophilus; Streptococcus thermophilus; 및 Bifidobacterium longum으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질.
- 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 설포라판의 파괴를 최소화시킴과 동시에 일반세균을 효과적으로 사멸시키기 위해, 증류수에 브로콜리를 5~10wt%첨가하는 단계; 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계; 2시간~3시간 상온방치하는 단계; 다시 75~85에서 25분~35분 살균처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum; Lactobacillus paracasei; Lactobacillus casei; Lactobacillus acidophilus; Streptococcus thermophilus; 및 Bifidobacterium longum으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 제조방법.
- 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 유산균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum; Lactobacillus paracasei; Lactobacillus casei; Lactobacillus acidophilus; Streptococcus thermophilus; 및 Bifidobacterium longum으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 기초 동결보호제는 skim milk, whole milk, whey, casein인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 스킴밀크는 브로콜리발효물에 대해 10~15wt%가 첨가 되고, 수크로오스 4~6wt%, 말토오스 4~6wt%, 트레할로스 4~6wt%를 더 첨가하는 하는 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 브로콜리발효물에 대해 상기 수크로오스는 5wt%, 상기 말토오스는 5wt%, 상기 트레할로스 5wt%인 것을 특징으로 하는 브로콜리를 유산균으로 발효한 항염 및 항헬리코박터의 효과가 있는 기능성 발효물질의 균의 생존률을 높이기 위해 기초 동결보호제를 처리하는 방법.
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