KR100526992B1

KR100526992B1 - 탱자 추출발효물 및 헬리코박터 파일로리 감염 질환의치료용 조성물

Info

Publication number: KR100526992B1
Application number: KR10-2002-0049368A
Authority: KR
Inventors: 권석형; 김동현; 황보식
Original assignee: 주식회사 렉스진바이오텍
Priority date: 2002-08-21
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2005-11-09
Also published as: KR20040019116A

Abstract

본 발명은 탱자나무(학명: Poncirus trifoliata Raf.)의 과실, 즉 탱자로부터의 물추출물을 유산균 및/또는 헤리페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여 발효함으로써 얻어지는 탱자 추출발효물, 및 상기 추출발효물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파일로리균의 감염에 의해 유발되는 질환의 치료용 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 상기 조성물의 활성성분인 탱자 추출발효물은 헬리코박터 파일로리균의 감염 및 성장을 억제하며, 상기 헬리코박터 파일로리균으로부터 생산되는 내독소에 의해 유발되는 위장 및/또는 십이지장 조직의 공포화(vacuolation)를 억제함을 특징으로 한다.

Description

탱자 추출발효물 및 헬리코박터 파일로리 감염 질환의 치료용 조성물{FERMENTED EXTRACT OF A FRUIT OF THE TRIFOLIATE ORANGE, AND A COMPOSITION FOR TREATING THE DISEASE CAUSED BY INFECTION OF HELICOBACTER PYLORI}

본 발명은 탱자나무(학명: Poncirus trifoliata Raf.)의 과실, 즉 탱자로부터의 물추출물을 유산균 발효하여 얻어지는 탱자 추출발효물, 및 상기 추출발효물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파일로리균의 감염에 의해 유발되는 질환의 치료용 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 상기 조성물의 활성성분인 탱자 추출발효물은 헬리코박터 파일로리균의 감염 및 성장을 억제하며, 상기 헬리코박터 파일로리균으로부터 생산되는 내독소에 의해 유발되는 위장 및/또는 십이지장 조직의 공포화(vacuolation)를 억제함을 특징으로 한다.

지실은 탱자나무의 익지 않은 열매를 그대로 또는 반으로 자른 것을 지칭하며, 그의 형태는 거의 구형이고 지름은 1-4 cm이다. 탱자는 지실이 완전히 성숙한 것을 지칭하며, 폰시린(poncrin), 나린긴(naringin), 헤스페리딘(hesperidin) 등의 활성 성분들이 함유되어 있다. 한편, 탱자 또는 지실의 물추출물은 예로부터 민간과 한방에서 화농성 염증질환이나 알레르기 등의 치료에 사용되었다.

최근에, 윤 등(1992)은 탱자가 흰쥐의 족부종 모델에서 항염증 효과가 있음을 보고하였고(윤황금 등, 악학회지, 36, 548-555, 1992), 김은 탱자로부터 폰시린을 분리하고, 이를 장내세균으로 생물전환시켜, 헬리코박터 파일로리 성장을 억제하는 폰시레틴을 분리하였다(특허 공개번호 특2000-33752, 공개일자 2000년 6월 15일; Kim et al., Biol. Pharm. Bull., 22, 422-424, 1999). 그러나, 상기 장내새균은 사람의 장내세균총을 대신하여 장내분변현탁액을 사용하며, 여기에는 적어도 10개 이상의 균주가 포함되어 있다. 따라서, 장내세균총과 배양시 장내세균총의 종류를 정확히 알 수 없다. 뿐만 아니라, 생물전환에 이용되는 장내세균은 대부분 그람음성균으로, 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 내독소(endotoxin)를 생산하기 때문에, 최종적으로 수득되는 폰시레틴은 LPS을 함유하고 있을 가능성이 매우 높다. 따라서, 상기 특허에서 분리해낸 폰시레틴을 식품 개발에 이용하기에는 안정성의 측면에서 문제점이 많다. 게다가, 상기 특허에 기재된 방법에 따라 제조되는 폰시레틴의 수율은 상당히 낮다.

한편, 헬리코박터 파일로리균은 1983년에 위염환자로부터 최초로 분리되어 동정되었다. 헬리코박터 파일로리균은 나선형의 그람음성 간균으로써, 4-6개의 외장성 편모(sheathed flagella)를 가지며, 크기는 약 0.5 ×3.0㎛ 정도이다. 헬로코박터 파일로리균은 당 발효능력을 갖고 있지 않으며, 미호기적조건(5% O₂, 15% CO₂, 80% N₂)에서 증식하고, 실험관내 실험에서는 간균의 형태를 띄고 있지만, 사람의 위에 일단 감염되면 위점막에서 운동성이 좋은 나선형으로 바뀌어, 위점막 및 위 세포 조직에 콜로니를 형성한다.

이러한 특성을 갖는 헬리코박터 파일로리균은, 여러 가지 역학적 연구를 통하여, 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 원인균임이 밝혀졌다. 또한, H. 파일로리균에 의한 감염은 위암의 위험율을 상대적으로 2-10배까지 증가시킨다는 것도 밝혀져, 헬리코박터 파일로리 균의 감염이 위암의 원인 중 하나라고 여겨지고 있다.

미국이나 호주와 같은 선진국에서는 20세 이전에는 H. 파일로리에 의한 감염이 드물게 나타나지만, 60세 이후에는 40-60%의 감염율을 나타낸다고 보고되었으며, 개발도상국의 경우에는 20세 이전에 80%정도가 H. 파일로리에 의해 감염되어 있는 것으로 보고되었다. 또한, 우리나라의 경우는 5세 이전에는 50%, 8세에는 80%, 20세에는 약 90%의 감염율을 나타내는 것으로 보고되었다.

한편, H. 파일로리에 감염되어 발병된 위염, 위궤양이 항생제를 이용한 치료에 의해 증상이 호전될 수 있다고 보고되었다. 그러나, H. 파일로리의 성장억제를 위하여 아목시시린(amoxycillin), 테트라사이클린, 메트로니다졸, 에리트로마이신, 글리트로마이신, 시프로프록사신과 같은 많은 항생제가 개발되었다. 그러나, 이들은 실험관내 활성은 매우 우수하지만, 생체내에서는 항생제들을 단독 투여할 경우, H. 파일로리를 효과적으로 제거하지 못한다고 보고되었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 여러 종류의 약물을 선택적으로 동시에 투여하는 병용요법이 개발되었다. 예를 들어, 글리트로마이신, 아목시시린 및 양성자 펌프 억제제(proton pump inhibitor)를 이용하는 삼중치료법; 및 글리트로마이신 또는 아목시시린 및 양성자 펌프 억제제를 이용하는 이중 치료법이 널리 사용되고 있다. 또한, 비스무스(bismuth) 제제를 이용한 삼중치료법(비스무스, 메트로니다졸, 아목시시린 또는 테트라사이클린)에 대해서도 보고되어 있지만, 이를 투여한 환자의 20-30%에서 구토, 미각장애, 설사 등의 부작용이 나타났으며, 메트로니다졸에 대한 내성을 가진 H. 파일로리 균주들이 보고되어, 그 실효성이 많지 않다. 양성자 펌프 억제제를 이용한 이중 또는 삼중 치료법은 부작용의 발생이 5%이하이며, 2주간의 투여로 높은 치료율이 나타나므로 가장 널리 사용되고 있다. 그러나, 어느 정도의 치료 기간이 지나면, 내성균주가 생성되어, 치료효과가 지속적으로 낮아진다는 문제점이 있다.

한편, 헬리코박터 파일로리균은, 균체의 한쪽 또는 양쪽에 막으로 둘러싸인 편모가 하나 이상 존재하고 있어서, 끈적끈적한 환경에서도 움직일 수 있다. 이런 특성 때문에, 헬리코박터 파일로리균은 살리실레이트 또는 에탄올과 같은 화합물만이 침투할 수 있는 위점막을 뚫고 들어갈 수 있고, 점막 내에서도 이동이 자유롭다. H. 파일로리균이 보통의 세균이 도저히 생존할 수 없는 위에서 증식할 수 있는 것은, 그들이 편모와 유레아(urea)를 분해하여 산성조건을 중화시켜주는 유레아제(urease)를 갖고 있기 때문이다. 이러한 유레아제의 활성을 저해하여, H. 파일로리균의 증식을 억제함으써, H. 파일로리균에 의해 유발되는 질환을 억제하고자 하는 연구가 진행되었다. 예를 들어, 한국특허 공개번호 특2000-33752호는 캡사이신(capsaicin), 이리솔리돈(irisolidone) 및 폰시레틴과 같은 유레아제 활성 저해에 의한 H. 파일로리균 성장 억제제에 대하여 개시하고 있다.

한편, H. 파일로리균은 약 50-60%가 세포독성 활성을 갖고 있으며, 세포독소는 중요한 병원성 인자의 하나로 주목받고 있다. 이 세포독소는 실험관내 상피세포 모델에서, 1차 인간 점액 세포에 공포화 현상(vaculoation)을 일으켜 세포독성을 나타내며, 이 때문에 공포화 세포독소라고도 불리운다. 특히, 세포독소에 의한 독성은 우레아제에 의해 생산되는 암모니아에 의해 더욱 증가된다.

따라서, 헬리코박터 파일로리균의 퇴치를 위해서는, H. 파일로리에 대한 항균성과 함께, H. 파일로리에 의해 생산되는 내독소에 의한 공포화를 효과적으로 억제하는 것이 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 H. 파일로리에 대한 항균성과 함께, H. 파일로리에 의해 생산되는 내독소에 의한 공포화를 효과적으로 억제하는 물질을 개발하여, H. 파일로리에 의해 유발되는 각종 장 질환을 치료하기 위해 많은 연구를 수행한 결과, 탱자, 바람직하게는 탱자나무의 지실로부터의 물추출물을, 유산균 및/또는 헤스페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여 발효함으로써 얻어지는 탱자의 추출발효물이 H. 파일로리에 대한 감염 및 증식 활성을 억제할 뿐만 아니라, 그에 의해 생산되는 내독소에 의한 장 상피세포의 공포화에 대해 우수한 억제 효과를 가짐을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 특히, 본 발명자 들에 의해 개발된 추출발효물은 천연물로부터 유래한 물질이고, 비독성 세균인 유산균에 의해 발효시키기 때문에, 화학약품과 같이 심각한 독성 또는 부작용을 전혀 나타내지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 H. 파일로리에 대한 항균성과 함께, H. 파일로리에 의해 생산되는 내독소에 의한 공포화를 효과적으로 억제하는 물질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 물질을 함유하는, H. 파일로리에 의해 유발되는 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 H. 파일로리에 대한 항균성과 함께, H. 파일로리에 의해 생산되는 내독소에 의한 공포화를 효과적으로 억제하는 물질로서, 유산균 및/또는 헤스페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여, 탱자로부터의 물추출물을 유산균 발효함으로써 얻어지는 탱자 유래의 추출발효물을 제공한다.

본 발명의 추출발효물을 얻기 위해 사용되는 상기 발효물의 예로는, 락토바실러스 액시도필러스 (예컨대, KCTC 3150), 락토바실러스 불가리쿠스 (예컨대, KCTC 3635), 스트렙토코쿠스 써모필러스 (KCTC 3658), 엔테로코쿠스(스트렙토코쿠스) 패에시움 (예컨대, KCTC 3077), 비피도박테리움 브레브 (예컨대, JCM 1192), 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 (KCCM-10412), 비피도박테리움 롱굼(예컨대, KCTC 3215), 비피도박테리움 인팬티스 (예컨대, JCM 7007), 비피도박테리움 애니멀리스 (예컨대, JCM 1190), 비피도박테리움 비피둠 K-105 및 비피도박테리움 KK-3 (경희대 약학대학 미생물학 교실, 김동현 교수 실험실), 및 이의 조합균주 등이 바람직하게 이용될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 유산균의 조합균주로는, 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 또는 비피도박테리움 KK-3와 스트렙토코쿠스 써모필러스의 조합균주를 이용할 경우, 특히 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, H. 파일로리에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 병상에 대한 효과를 나타내기 위하여, 유효성분으로서 상기 탱자 추출발효물을 함유함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 탱자 추출발효물은 하기의 단계를 통해 제조됨을 특징으로 한다.

1) 탱자를 물로 추출하여 탱자의 물추출물을 얻는 단계;

2) 상기 단계에서 얻어진 물추출물을, 유산균 및/또는 헤스페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여, 발효하는 단계.

본 발명에 따르면, 상기 단계 1)에서 이용되는 탱자는 탱자나무로부터 얻어지는 성숙한 탱자일 수도 있으며, 미성숙 탱자인 지실일 수도 있다. 탱자와 지실 사이에는 특별한 유효성분의 차이는 없으며, 따라서 그로부터 얻어지는 추출발효물에서도, 유효성분으로서 활성 성분의 차이는 없다. 하기에서, 특별한 언급이 없다면, 탱자는 성숙한 탱자뿐만이 아니라, 미성숙된 탱자나무의 지실도 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.

또한, 상기 단계에서 탱자의 물추출물은 단지 탱자를 물로만 추출하여 얻어질 수도 있지만, 에탄올로 추출함으로써 더 큰 활성이 얻어질 수도 있다. 또한, 상기 얻어진 물추출물로부터 불순물 성분을 제거하거나 활성성분의 순도를 더욱 증가시키기 위하여, 예를 들어 알콜, 부탄올, 메탄올 및/또는 주정을 이용하여 추출을 더 수행할 수 있으며, 이러한 것도 본 발명의 범위 내에 속한다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 물추출물은, 끊는물에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법과 같이 예로부터 전통적으로 전해 내려오거나, 한의서 또는 교과서에 기재되어 있는 통상적인 추출법을 사용하여 얻어질 수 있으며, 추출방법에 의해서 본 발명이 한정되지는 않는다.

한편, 본 발명에 따른 탱자 추출발효물은 상기 물추출물을 유산균으로 발효시켜 수득될 수 있다. 본 발명의 탱자 추출발효물을 얻기 위해서 사용되는 유산균은, 특별히 한정되지는 않지만, 헬리코박터 파일로리균의 성장 억제 및 감염 억제, 및 그에 의한 공포화 억제에 대한 효과를 제공하는 탱자 추출발효물을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이든 선택할 수 있다. 상기 유산균의 예로는, 바람직하게는 락토바실러스 액시도필러스 (예컨대, KCTC 3150), 락토바실러스 불가리쿠스 (예컨대, KCTC 3635), 스트렙토코쿠스 써모필러스 (KCTC 3658), 엔테로코쿠스(스트렙토코쿠스) 패에시움 (예컨대, KCTC 3077), 비피도박테리움 브레브 (예컨대, JCM 1192), 비피도박테리움 카테누라툼 K-309, 비피도박테리움 롱굼 (예컨대, KCTC 3215), 비피도박테리움 인팬티스 (예컨대, JCM 7007), 비피도박테리움 애니멀리스 (예컨대, JCM 1190), 비피도박테리움 비피둠 K-105, 비피도박테리움 KK-3 및 이의 조합균주, 특히 바람직하게는 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 또는 비피도박테리움 KK-3 균주를 사용할 수 있다.

상기 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 는 본 발명자들에 의해 개발된 균주로서, 동일 종에 속하는 균주와 비교하여 일반적인 분류학적 특성은 동일하지만, 보다 높은 활성의 본 발명에 따른 발효추출물을 제공할 수 있다. 이러한 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 균주는 2002년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였으며, 그로부터 수탁번호 KCCM-10412을 부여받았다. 본 발명에서는, 본 발명에 따른 추출발효물을 얻기 위해서 사용되는 균주로서, 보다 효과가 우수한 신규 균주로서, 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 균주를 제공한다.

본 발명의 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 균주는 그람양성균이고, 간균이며, 혐기성 균주이고, 프룩토오스 6-포스페이트 포스포케토라아제(fructose 6-phosphate phosphoketolase) 양성을 나타내며, 하기와 같은 당 이용성을 갖는다.

종류	당이용성	종류	당이용성
아미그달린(amygdalin)아라비노오스(arabinose)셀로비오스(cellobiose)덱스티린에스쿠린(esculin)프룩토오스갈락토오스글루코네이트글루코오스글리코겐이노시톨이눌린(inulin)락토오스	+/-+-+-++-++-+/-+	말토오스만니톨(mannitol)만노오스(mannose)멜레지토오스(melezitose)멜리비오스(melibiose)라피노오스(raffinose)리보오스살리신소르비톨스타취(starch)수크로오스트레할로오스(trehalose)크실로오스(xylose)	++--++++-++-+

본 발명에 따르면, 유산균의 상기 조합균주로는 바람직하게는 비피도박테리움 K-309 균주와 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주의 조합균주 또는 비피도박테리움 KK-3와 스트렙토코쿠스 써모필러스의 조합균주를 사용할 수 있으며, 이에 의해 얻어지는 추출발효물은 헬리코박터 파일로리균의 성장 억제, 감염 억제, 및 그에 의한 공포화 억제에 대한 매우 우수한 효과를 얻을 수 있다.

한편, 유산균에 의한 상기 탱자 물추출물의 발효조건은 특별히 한정되지는 않으며, 당업자에게 통상적으로 숙지된 유산균의 생장조건을 만족시키는 액체배지 또는 고체배지를 사용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 추출발효물은, 유산균을 이용하는 발효 이외에도, 헤스페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여 탱자의 물추출물을 효소발효하는 것에 의해서도 얻어질 수 있으며, 효소발효하여 얻어지는 추출발효물도 또한 헬리코박터 파일로리균의 성장 억제, 감염 억제, 및 그에 의한 공포화 억제에 대한 매우 우수한 효과를 나타낸다. 한편, 당업자는, 상기 효소 발효에 이용되는 헤스페린다아제 및 나린기나아제가 그의 기원에 상관없이 본 발명에 따른 탱자 발효추출물을 얻는데 사용할 수 있으며, 시판되는 것을 사용할 수도 있고, 상기 효소들을 생산하는 것으로 당업계에 공지된 효소로부터 분리하여 사용하여도 된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상기 효소의 사용양 및 사용 조건에 대해서는, 당업계에 알려져 있으며, 당업계에 통상적으로 공지된 기술 및 반복실험을 통하여 최적을 조건을 어려움 없이 찾아낼 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 언급한 유산균 균주와 상기 효소들을 조합하여, 탱자 물추출물을 발효시킬 경우, 헬리코박터 파일로리균의 성장 억제, 감염 억제, 및 그에 의한 공포화 억제에 대해 상승적으로 더욱 우수한 효과를 얻을 수 있다.

최종적으로, 본 발명의 탱자 추출발효물은, 보관 또는 사용에 적합하도록 하기 위하여, 동결건조된 형태 또는 농축물의 형태로 얻어질 수 있다.

한편, 본 발명에 따라 제조하여 얻어지는 탱자 추출발효물은, H. 파일로리에 대한 감염 및 증식 활성을 억제하며, 그에 의해 생산되는 내독소에 의한 장 상피세포의 공포화에 대해 우수한 억제 효과를 나타내어, H. 파일로리에 대한 항균성과 함께 H. 파일로리에 의해 생산되는 내독소에 의한 공포화를 효과적으로 억제하는 물질로서 이용될 수 있고, 따라서 본 발명의 탱자 추출발효물은 H. 파일로리에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 병상에 대한 효과를 얻는데에 유용하게 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 탱자 추출발효물은 천연물로부터 유래한 물질이고, 비독성 세균인 유산균에 의해 발효시키기 때문에, 화학약품과 같이 심각한 독성 또는 부작용을 전혀 나타내지 않는다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 탱자 추출발효물을 유효성분으로 함유하는, H. 파일로리에 의해 유발되는 질환의 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 H. 파일로리에 의해 유발되는 질환의 치료용 조성물에 있어서, 유효성분인 상기 탱자 추출발효물의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 탱자 추출발효물을 하루 0.5-5.0g 이 경구투여되도록 제형화될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

탱자 추출발효물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는, 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들어 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해 H. 파일로리에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물을 적용하여 효과를 얻을 수 있는 H. 파일로리에 의해 유발되는 질환은, 당업자에게 통상적으로 알려져 있으며, 예를 들어 만성 활동성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위선암, 위림프종, 만성 위염 등이 있지만, 여기에만 국한된 것은 아니다. 최근의 연구에 따르면, 헬리코박터 파일로리균은 그들의 철분사용으로 인해 철분결핍증이 유발되고, 따라서 빈혈도 유발한다고 보고되었다. 또한, H. 파일로리의 감염은 심한 경우에, 뇌졸중에도 관련되어 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 발효 추출물은, 헬리코박터 파일로리균의 감염에 의해 유발되는 질환으로서 철분결핍증, 빈혈 및 뇌졸중 등의 치료에도 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이는 본 발명을 예시한 것일 뿐, 본 발명이 이에 의해서 한정되지는 않으며, 당업계에서 통상적으로 수행되어지는 변형 등도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

한편, 하기 실시예에서 사용된 균주는, 락토바실러스 액시도필러스 KCTC 3150, 락토바실러스 불가리쿠스 KCTC 3635, 스트렙토코쿠스 써모필러스 KCTC 3658, 엔테로코쿠스(스트렙토코쿠스) 패에시움 KCTC 3077, 비피도박테리움 브레브 JCM 1192, 비피도박테리움 카테누라툼 K-309, 비피도박테리움 롱굼 KCTC 3215, 비피도박테리움 인팬티스 JCM 7007, 비피도박테리움 애니멀리스 JCM 1190, 비피도박테리움 비피둠 K-105, 비피도박테리움 KK-3이다. 그러나, 당업자는 상기 균주에 의해서 본 발명이 한정되지 않고, 그 외 다른 유산균에 속하는 균주를 이용할 수 있다는 것을 자명하게 인식할 수 있을 것이다.

[실시예 1] 탱자 발효조성물의 제조

용매로서 2000㎖의 물을 이용하여, 500g의 탱자 지실을 80-100℃의 수욕상(water bath)에서 3시간 동안 추출한다. 다시 1000㎖의 동일 용매를 이용하여, 잔사를 80-100℃의 수욕상에서 2시간 추출하고, 감압농축 또는 동결건조한다. 상기 탱자 추출물의 양이 약 5%가 되도록 물을 넣는다. 이때, 물로 추출한 경우에는, 감압농축함이 없이 직접 5%가 되도록 한다. 추출 농축액에 유산균으로서 비피도박테리움 KK-3 및/또는 스트렙토코쿠스 써모필러스(KCTC 3658)와, 선택적으로 효소로서 아스페르질루스 나이거 유래의 헤스페린다아제 및 나린기나아제 (시그마, MO, 미국)를 넣어, 37℃에서 12 내지 72시간 동안 배양한 다음, 추출발효물을 동결건조한다.

한편, 상기 추출발효물의 성분은 다음과 같은 방법에 의해서, 분석하였다.

탱자추출물 또는 탱자 추출발효물 0.1g을 동결건조하고, 이를 메탄올 10㎖에 녹이고, 원심분리한 다음, 얻어진 상등액을 TLC (전개용매 클로로포름:메탄올=5:1)분석을 실시하였다. 그럼 다음, TLC 스캐너 (Shimadzu model CS9301 PC)로 정량하였다. 정량에 사용한 기지성분인 헤스페리딘, 네오헤스페리딘, 나린긴, 나린게닌, 헤스페레틴은 시그마사(Sigma, MO, 미국)로부터 구입하였고, 폰시린, 폰시레틴 및 로이폴린은 이미 보고된 방법(Kim et al., Biol. Pharm. Bull., 22, 422-424, 1999 등)에 따라 분리하여, 정량분석하였다. 각 추출물 및 발효추출물에 함유된 성분들의 분석결과는 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에 기재된 함량(%) 값은, 추출발효물에 함유된 효소 및 유산균의 함량을 배제함으로써, 각 추출물과 추출발효물 사이에 정확한 함유성분들의 비교가 이루어질 수 있게 하였다.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 탱자 추출발효물에는, 탱자가 거의 함유하지 않은 폰시레틴, 헤스페레틴, 나린게닌 성분의 증가된 함량을 가짐을 확인하였다.

	함량 (%)
	탱자¹⁾	탱자추출물²⁾	탱자추출물발효³⁾
폰시린	5	10-25	<15
폰시레틴	<0.05	<0.1	>1.5
헤스페리딘	0.06	0.05-1	<1
네오헤스페리딘	0.06	0.05-1	<1
헤스페레틴	<0.05	<0.05	>0.05
로이폴린	0.3	0.05-2	<2
나린긴	2.1	2-5	<3
나린게닌	<0.05	<0.1	>0.5
1) 탱자 과육까지 포함하여 계산한 함량2) 상기 추출발효물을 얻기 전의 탱자 물추출물로부터 측정된 성분의 함량3) 상기 실시예 1에서 유산균 및 효소를 사용하여 제조된 탱자 추출발효물로부터 측정된 성분의 함량

[실시예 2] H. 파일로리 에 의해 유발되는 공포화 억제 효과

실험에 앞서, H. 파일로리로부터 세포독소를 분리하는 방법은 다음과 같다. H. 파일로리를 500 ㎖의 브루셀라 배양액에서 통상적인 방법에 따라 배양한 다음, 12,000 rpm으로 원심분리(Vison model 한국)하여 1시간동안 집균하고, 그의 여액을 포화 50% 황산암모늄으로 침전시켜 얻은 분획을 다시 60mM Tris-HCl 완충액 30㎖에 녹인 후, 페닐-아가로스 컬럼 크로마토그래피(1 x 5 cm, 60mM Tris-HCl 완충액, 1M에서 0 M의 암모늄 술페이트를 이용한 농도구배)를 걸어, 독소분획을 분리하고, 이 분획을 다시 50mM Tris-HCl 완충액으로 투석하여 세포독소액을 제조하였다.

한편, 본 발명의 발효추출물의 H. 파일로리에 의해 유발되는 공포화 억제 효과는 다음과 같이 측정하였다. DMEM 배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; Sigma D5648)에 배양한 HeLa 세포(한국세포주은행; KCLB-10002)를 96웰 플레이트에 160㎕/웰(5x10³ 세포수/웰)씩 분주하고, 이를 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 상기 분리한 H. 파일로리의 세포독소 20㎕와 검액 20㎕을 넣은 후, 16시간 동안 배양을 수행한다. 이어서, 96웰 플레이트로부터 액체 성분을 제거한 후, 100㎕의 염색액(Neutral Red(0.33%)을 PBS로 희석하여, 0.05% 용액으로 만든 것)을 첨가하고, 8분간 염색한 다음, 염색액을 제거한다. 이어서, 세척액(BSA 0.2%를 함유하는 0.9% NaCl을 만든 용액)으로 2회 세척한다. 산성 알콜(36% HCl 1㎖과 70% 에탄올 99㎖을 혼합하여 조제한 용액) 100㎕를 넣고, 540㎚에서 흡광도를 측정한다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 한편, 도 2에서, IC₅₀은 H. 파일로리가 공포화를 50% 억제할 수 있는 농도를 의미하다.

탱자 그 자체는 H. 파일로리의 공포화를 억제하지 못하였다. 그러나, 비피도박테리움 K-309 균주를 이용하여, 발효한 추출발효물은 강력하게 H. 파일로리 공포화를 저해하였다. 또한, 비피도박테리움 이외에 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 더 첨가하면, 저해효과에 있어서 상승효과를 나타냄을 알 수 있었다. 유산균 중에는, 비피도박테리움 K-309 균주가 가장 우수한 효과를 나타냈다. 또한, 본 발명의 탱자 추출발효물의 성분인 폰시레틴, 나린게닌, 헤스페레틴 등도 우수한 공포화 억제효과를 나타냄을 확인하였다.

	IC₅₀ (㎎/㎖)
	H. 파일로리 ATCC49503	H. 파일로리 ATCC43504
탱자	>2	>2
비피도박테리움 카테누라툼 K-309	1.8	1.7
비피도박테리움 KK-3	1.8	1.7
스트렙토코쿠스 써모필러스	>2	>2
락토바실러스 액시도필러스	>2	>2
락토바실러스 불가리쿠스	>2	>2
엔테로코쿠스 파에시움	>2	>2
비피도박테리움 브레브	1.9	1.7
비피도박테리움 롱굼	>2	>2
비피도박테리움 인팬티스	>2	>2
비피도박테리움 애니멀스	1.8	1.9
비피도박테리움 비피둠	1.9	>2
비피도박테리움 카테누라툼 K-309로 발효시킨 탱자(지실)	0.4	0.3
비피도박테리움 KK-3로 발효시킨 탱자	0.3	0.4
스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	1.1	1.2
락토바실러스 액시도필러스로 발효시킨 탱자	0.8	0.9
락토바실러스 불가리쿠스로 발효시킨 탱자	0.8	0.8
스트렙토코쿠스 파에시움으로 발효시킨 탱자	0.8	0.8
비피도박테리움 브레브로 발효시킨 탱자	1.2	0.9
비피도박테리움 카테누라툼으로 발효시킨 탱자	0.3	0.4
비피도박테리움 롱굼로 발효시킨 탱자	0.9	0.7
비피도박테리움 인팬티스로 발효시킨 탱자	0.5	0.6
비피도박테리움 애니멀리스로 발효시킨 탱자	0.8	0.8
비피도박테리움 비피둠으로 발효시킨 탱자	1.0	1.2
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	0.1	0.2
비피도박테리움 KK-3과스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	0.1	0.2
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와헤스페리나아제로 발효시킨 탱자(지실)	0.1	0.1
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와 나린기나아제로 발효시킨 탱자(지실)	0.1	0.1
탱자 물추추물을 헤스페린다아제로 발효한 추출발효물	0.19	0.18
탱자 물추추물을 나린기나아제로 발효한 추출발효물	0.15	0.18
폰시린	>1	>1
폰시레틴	0.14	0.12
헤스페리딘	>1	>1
네오헤스페리딘	>1	>1
헤스페레틴	0.15	0.15
로이폴린	>1	>1
나린긴	>1	>1
나린게닌	0.14	0.12

[실시예 3] H. 파일로리 감염억제 효과

부르셀라 배양액(Burcellar broth; Difco사, 미국)에서, H. 파일로리 ATCC 43504 (미국 ATCC에서 분양) 또는 임상균주 4 (한국인의 위궤양환자로부터 분리한 균주)를 배양한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 다음, 이를 PBS 용액(인산완충 생리식염수)을 이용하여 세척한 다음, 3,000rpm에서 10분간 다시 원심분리한다. PBS 3㎖에 균체를 현탁한다. 400㎕의 검체에 400㎕의 균체를 넣고, 37℃ 수욕상에서 30분간 반응시킨 후, KATO III 세포(한국세포주은행; KCLB-30103)를 회수한 후, 200㎕의 KATO III 세포(5×10⁶세포수/㎖)를 37℃ 수욕상(water bath)에서 1시간동안 반응시킨다. 시험관에 15% 수크로오스 용액을 넣고, 반응액을 상기 수크로오스 용액과 섞이지 않게 기벽에 대고 넣은 후, 1,000rpm에서 10분간 원심분리하여, KATO III 세포를 모은다. 그럼 다음, 모은 KATO III 세포에 PBS를 이용하여 세척하고, PBS 300㎕를 첨가하여 현탁한 후, 유레아제 활성을 측정하여, 감염정도를 평가한다. 유레아제 효소활성은 상기 H. 파일로리 감염된 KATO III 세포 현탁액 100㎕, 5M 유레아 50㎕를 37℃ 수욕상에서 20분간 반응시킨 후, 100㎕의 황산을 첨가하여, 반응을 정지시킨다. 용액 I (500㎖의 증류수에 5g의 페놀 및 25㎎의 나트륨 니트로프루시드(Sodium nitroprusside)를 넣어 만든 용액) 및 용액 II (490㎖의 증류수에 2.5g의 NaOH, 26.8g의 2 염기성 인산 나트륨(Sodium phosphate dibasic) 및 10㎖의 NaOCl를 넣어 만든 용액)을 각각 1㎖씩 첨가한 다음, 60℃ 수욕상에서 20분간 반응시킨 후, 원심 분리하여, 660㎚에서 흡광도를 측정한다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 여기에서, IC₅₀은 H. 파일로리가 KATO III로 감염되는 것을 50% 저해하는 농도를 의미한다.

표 3에서 보는 바와 같이, 탱자 자체는 H. 파일로리 감염억제 효과를 나타내지 않았지만, 본 발명의 추출발효물은 우수한 H. 파일로리 감염억제 효과를 나타내었다. 특히, 비피도박테리움 KK-3 균주를 이용하였을 때, 가장 우수한 효과가 나타났으며, 비피도박테리움 KK-3 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스를 동시에 사용한 경우도 매우 우수하였다. 그러나, 스트렙토코쿠스 써모필러스 만을 이용하여, 발효시킨 경우에는 그 효과가 미약하였다.

	IC₅₀ (㎎/㎖)
	H. 파일로리 ATCC43504	H. 파일로리 임상균주 4
탱자(지실)	>5	>5
비피도박테리움 카테누라툼 K-309	>5	>5
비피도박테리움 KK-3	>5	>5
스트렙토코쿠스 써모필러스	>5	>5
락토바실러스 액시도필러스	>5	>5
락토바실러스 불가리쿠스	>5	>5
엔테로코쿠스 파에시움	>5	>5
비피도박테리움 브레브	>5	>5
비피도박테리움 롱굼	>5	>5
비피도박테리움 인팬티스	>5	>5
비피도박테리움 애니멀리스	>5	>5
비피도박테리움 비피둠	>5	>5
비피도박테리움 카테누라툼 K-309로 발효시킨 탱자(지실)	0.2	0.2
비피도박테리움 KK-3로 발효시킨 탱자	0.2	0.2
스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	1.9	2.0
락토바실러스 액시도필러스로 발효시킨 탱자	1.5	1.9
락토바실러스 불가리쿠스로 발효시킨 탱자	1.8	1.8
스테렙토코쿠스 파에시움으로 발효시킨 탱자	2.0	2.0
비피도박테리움 브레브로 발효시킨 탱자	0.4	0.5
비피도박테리움 케테누라툼으로 발효시킨 탱자	0.2	0.2
비피도박테리움 롱굼로 발효시킨 탱자	0.5	0.6
비피도박테리움 인팬티스로 발효시킨 탱자	0.5	0.5
비피도박테리움 애니멀리스로 발효시킨 탱자	0.5	0.5
비피도박테리움 비피둠으로 발효시킨 탱자	0.4	0.5
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	0.3	0.2
비피도박테리움 KK-3과스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	0.3	0.3
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와 헤스페린다아제로 발효시킨 탱자(지실)	0.2	0.2
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와 나린기나아제로 발효시킨 탱자(지실)	0.2	0.2
탱자 물추추물을 헤스페린다아제로 발효한 추출발효물	>5	>5
탱자 물추추물을 나린기나아제로 발효한 추출발효물	>5	>5
폰시린	>1	>1
폰시레틴	>1	>1
헤스페리딘	>1	>1
네오헤스페리딘	>1	>1
헤스페레틴	>1	>1
로이폴린	>1	>1
나린긴	>1	>1
나린게닌	>1	>1
헤파린 (대조물질)	2.0	2.3

[실시예 4] H. 파일로리 성장억제 효과

H. 파일로리 ATCC 43504, NCTC 11638, 임상균주 4, 임상균주 82516, 임상균주 82548을, 7% 가열 불활성화된 혈청(시그마사, 미국)을 첨가한 브루셀라 아가(agar) 배지에 이식하고, 37℃에서 미호기적 조건 (5% O₂, 15% CO₂, 80% N₂)으로 3일간 배양한 후, 각각의 균주가 자라나온 플레이트에 2㎖의 생리식염수를 첨가하여, 균주를 집균한다. 이중에서 0.5㎖을 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 20㎖의 브루셀라 배양액에 이식하여, 37℃에서 미호기적 조건 (5% O₂, 15% CO₂, 80% N₂)으로 3일간 배양한 후, 디메틸 술폭시드(DMSO)를 10%가 되도록 첨가하고, -70℃에 보관하여 실험균주로 사용한다.

탱자, 유산균 및 탱자발효물의 헬리코박터 파일로리에 대한 증식억제효과 측정은 다음과 같이 수행한다. 7% 가열 불활성화된 말 혈청을 첨가한 6.3㎖의 브루셀라 아가 배지에, 10㎎/㎖의 농도가 되도록 시료 0.7㎖을 첨가한 다음, 잘 혼합하여 시료의 최종농도가 1㎎/㎖이 되게 한다. 그런 다음, H. 파일로리를 이식하여, 37℃에서 미호기적 조건 (5% O₂, 15% CO₂, 80% N₂)으로 3일간 배양한 후, H. 파일로리의 증식정도를 관찰한다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

탱자 그 자체는 H. 파일로리의 증식억제효과가 없었으나, 유산균으로서 비피도박테리움 KK-1 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 동시에 이용하여 발효시킨 경우에는, 증식억제 효과가 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한, 유산균으로서 비피도박테리움 KK-3 균주만을 이용하여 얻어지는 탱자 추출발효물도 효과가 우수한 것으로 나타났다.

	최소발육저지농도¹⁾ (㎍/㎖)
	H. 파일로리 ATCC43504	H. 파일로리 임상균주 4
탱자(지실)	>100	>100
비피도박테리움 카테누라툼 K-309	100	100
비피도박테리움 KK-3	100	100
스트렙토코쿠스 써모필러스	>100	>100
락토바실러스 액시도필러스	>100	>100
락토바실러스 불가리쿠스	>100	>100
엔테로코쿠스 패에시움	>100	>100
비피도박테리움 브레브	100	100
비피도박테리움 롱굼	>100	>100
비피도박테리움 인팬티스	100	100
비피도박테리움 애니멀리스	100	100
비피도박테리움 비피둠	>100	>100
비피도박테리움 카테누라툼 K-309로 발효시킨 탱자(지실)	25	25
비피도박테리움 KK-3로 발효시킨 탱자	25	50
스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	50	50
락토바실러스 액시도필러스로 발효시킨 탱자	50	50
락토바실러스 불가리쿠스로 발효시킨 탱자	50	50
스트렙토코쿠스 파에시움로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 브레브로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 카테누라툼로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 롱굼로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 인팬티스로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 애니멀리스로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 비피둠로 발효시킨 탱자	50	50
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과 스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	50	50
비피도박테리움 KK-3과 스트렙토코쿠스 써모필러스로 발효시킨 탱자(지실)	50	50
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와 헤스페린다아제로 발효시킨 탱자(지실)	25	25
비피도박테리움 카테누라툼 K-309과스트렙토코쿠스 써모필러스와 나린기나아제로 발효시킨 탱자(지실)	25	25
탱자 물추추물을 헤스페린다아제로 발효한 추출발효물	100	100
탱자 물추추물을 나린기나아제로 발효한 추출발효물	100	100
암피실린	1	2
1) 최소발육저지농도-H. 파일로리의 성장을 억제시킬 수 있는 최소농도를 의미함

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 탱자 추출발효물은 H. 파일로리에 대한 세포의 공포화 반응의 저해 효과, H. 파일로리의 성장저해 효과 및 감염 억제 효과를 나타낸다. 따라서, 탱자 추출발효물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 H. 파일로리에 의해 유발되는 질환, 특히 위궤양 또는 십이지장 궤양을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

탱자로부터의 물추출물을 유산균, 및/또는 헤스페린다아제 및 나린기나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 이용하여 발효함으로써 얻어지는 것임을 특징으로 하는 탱자 추출발효물.
제 1 항에 있어서, 상기 유산균이 락토바실러스 액시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 스트렙토코쿠스 써모필러스, 엔테로코쿠스(스트렙토코쿠스) 패에시움, 비피도박테리움 브레브, 비피도박테리움 카테누라툼 K-309, 비피도박테리움 롱굼, 비피도박테리움 인팬티스, 비피도박테리움 애니멀리스, 비피도박테리움 비피둠 K-105, 비피도박테리움 KK-3 및 이의 조합균주로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 탱자 추출발효물.
제 2 항에 있어서, 상기 조합균주가 비피도박테리움 카테누라툼 K-309 KCCM-10412와 스트렙토코쿠스 써모필러스의 조합균주 또는 비피도박테리움 KK-3와 스트렙토코쿠스 써모필러스의 조합균주를 이용함을 특징으로 하는 탱자 추출발효물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 탱자 추출발효물을 유효성분으로서 함유함을 특징으로 하는, 헬리코박터 파일로리균에 의해 유발되는 만성 활동성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위선암, 위림프종, 만성 위염 치료용 조성물.
삭제
비피도박테리움 카테누라툼 K-309 KCCM-10412.