KR101050307B1 - 암 세포 증식 억제 효과 및 면역 증강 효과를 가진비피도박테리움 아돌레센티스 ｓｐｍ0212의 부탄올 추출물,이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 대장암 세포주에 대한 증식 억제 활성 및 면역 활성을 보유한 유산균, 상기 유산균의 부탄올 추출물, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포함하는 보조약제, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 유산균 부탄올 추출물의 대장암 억제 효과에 관한 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 대장암 세포주에 대한 증식 억제 효과와 면역 증강 효과를 가진 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 부탄올 추출물, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 부탄올 추출물을 포함하는 보조약제, 약학적 조성물 및 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 부탄올 추출물의 대장암 억제 효과 및 면역 증강 활성 효과에 관한 용도에 관한 것이다.

Description

암 세포 증식 억제 효과 및 면역 증강 효과를 가진 비피도박테리움 아돌레센티스 ＳＰＭ0212의 부탄올 추출물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도{Butanol extract of Bifidobacterium adolescentis SPM0212 inhibiting the growth of cancer cell and potentiating immune functions, pharmaceutical composition containing the same, and its use}

본 발명은 암 세포주에 대한 증식 억제 활성 및 면역 증강 활성을 보유한 유산균, 상기 유산균의 부탄올 추출물, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포함하는 보조약제, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 유산균 부탄올 추출물의 대장암 억제 효과에 관한 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 대장암 세포주에 대한 증식 억제 효과와 면역 증강 효과를 가진 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 부탄올 추출물, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 부탄올 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 부탄올 추출물의 대장암 억제제로서의 사용에 관한 것이다.

오늘날 가장 일반적으로 이용되고 있는 생균제는 유산균으로, 정장용 균주로 사용되는 유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다.

이러한 유산균은 소화기장관내 정상 상재균으로 많은 in vivo와 in vitro 연구에서 병원성 또는 기회성 미생물의 감염에 대한 아주 효과적인 방어막으로 작용한다고 보고되고 있다(Trejo et al., 2006; Yun et al., 2006; Fuller, 1991; von Wright와 Salminen, 1999; de Ross와 Katan, 2000; Kim et al ., 2003).

이러한 유산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria),그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다. 그 중 락토바실러스(Lactobacillus)와 비피도박테리움(Bifidobacterium ) 속의 유익한 효과는 오래 전부터 인정되어 왔다. 이 두 속의 유산균은 사람이나 동물의 장내 방어 장벽 즉, 위산과 담즙산염, 췌장 효소에 내성이 있고 장점막에 부착하여 쉽게 군락을 형성할 수 있는 특징을 가지고 있는 무해한 균으로서 위장관의 균총에서 중요한 균주로 여겨지고 있다(Rolfe, 2000; Rolfe, 2001).

우리나라에서 암 발병률은 2001년 위암, 폐암, 간암, 대장암 순이었으나, 현재 대장암의 발병률은 2위까지 올랐다. OECD 헬스데이터 2006에 따르면 인구 10만 명 당 대장암 사망자는 미국, 영국, 일본 등에서는 줄고 있으나, 한국 등 일부 국 가에선 빠르게 증가하고 있다(OECD, 2006).

대장암 발생의 원인 중 80% 이상이 식사습관과 환경오염에 있는 것으로 인정되고 있다. 음식물, 담배, 술, 대기오염, 스트레스, 자외선이 그 대표적인 원인물질로 꼽을 수 있으며 그 중에서도 매일 섭취하는 음식물이 가장 중요한 발암요인으로 지적 되고 있다(Wynder, 1975; Armstrong과 Doll, 1975). 그러나 우리가 늘 섭취하는 음식물 자체가 암을 유발하지는 않는다. 섭취된 음식물이 암을 일으키려면 장내 부패 미생물의 분해 작용에 의하여 발암물질로 변환되는 과정이 필요하며 그 발암물질들이 장관으로 흡수, 자극함으로써 암을 유발할 수 있다(Mitsuoka, 1984). 따라서 숙주의 면역 기능을 증강시킴으로써 장내 부패 미생물을 억제하거나 유용한 장내 미생물을 이용하여 장내 발암물질들을 무독화 시킴으로써 암 발생을 억제할 수도 있다.

대장암은 발견시 이미 병이 진행되어서 수술로 완치가 불가능한 경우가 많으며, 이러한 경우 항암제 치료나 방사선 치료 등을 시도하지만 그 효과가 좋지 않고 부작용 또한 적지 않아 만족할 만한 치료법이 되지 못하고 있다. 따라서 항암제와 함께 사용되어 항암제의 부작용을 줄이거나 항암효과를 증가시켜 치료효과를 높이고 생물학적 반응을 조절할 수 있는 보조약제(Biological Response Modifier, BRM)에 대한 연구가 필요하다(중앙암등록사업본부, 1999; Yamada T, 1999).

대장 속의 분변중에는 암을 일으키는 세균성발암 효소들이 끊임없이 생산되고 있다. 그 효소들 중에서 지금까지 많이 알려진 발암효소들은 azoreductase, β- glucuronidase, β-glucosidase, tryptophanase, nitroreductase로서 주로 장내 부패균들에 의해 생산되고 있다. 이들 효소들의 활성은 결장암 발생에 관련이 있는 음식물을 탐색하는 데 매우 중요한 지표로 이용되고 있으며, 장내의 높은 pH에 의해 활성이 유도되므로 장내의 pH를 낮춤으로 효소활성을 저하시킬 수 있다.

유산균 중 비피도박테리움 에스피피(Bifidobacterium spp.)는 장내에서 젖산(lactic acid)과 아세트산(acetic acid)을 생산하여 장내의 pH를 낮추고 그에 따라 유해균의 증식과 유해효소의 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있다.

Goldin은 분변내 이들 효소들의 활성이 육식 위주의 서구식 식사에 의해 증가하였으나 매일 400억마리의 락토바실러스 엑시도필러스(L. acidophilus) 생균을 급여한 후 1주일부터 현저히 감소하였다고 보고하였고, 또한 Ayebo 등은 락토바실러스 엑시도필러스 우유(L. acidophilus milk)를 마셨던 사람들의 배설물에는 β-glucuronidase의 활성이 크게 감소하였으며 유산균 수는 증가한 반면 대장균 수는 현저하게 감소한 것이 확인되었다 (Goldin, 1976; Ayebo, 1981).

이밖에, 유산균은 장내 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선시킬 뿐 아니라, 비타민 합성, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다(Perdigon et al., 1986).

특히, 유산균이 생체내의 반응을 조절하는 BRM으로서의 역할은 장내에서 서식하며 자연살해세포(Natural Killer cell, NK)나 대식세포(Macrophage) 등을 활성화 시켜 대식세포의 장내 유해세균에 대한 인지능력, 살균능력 능을 강화시키고, 면역관련 물질의 분비를 촉진하여 면역증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있 다(Song et al ., 2003).

유산균의 항암효과에 관한 연구는 1900년대 매치니코프가 유산균에 의한 수명 연장 효과를 발표하면서부터 본격화되어 활발히 이루어지고 있으며, 구체적으로 Bogdanov 등이 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)가 실험동물의 복수로 이식된 복수암 세포주인 Sarcoma 180의 성장을 현저하게 억제한다고 발표하였으며, Matsuzaki 등은 사람의 암 전이와 유사한 암모델인 3LL과 Line-10 hapatoma에서 락토바실러스 카세이(L. casei)를 투여하였을 때 폐전이와 임파절 전이가 현저하게 억제 되었다고 발표하였다. 또한 그는 전이가 잘 되는 B16-F10 Melanoma에서도 락토바실러스 카세이(L. casei)를 마우스의 정맥에 연속적(100 ㎎/㎏×4)으로 투여하면 우수한 암 치료 효과를 거둘 수 있다고 하였다.

유산균 중 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.)은 젖산과 아세트산의 생성으로 pH를 낮추는 기능을 할 뿐만 아니라, 면역기능의 활성화에 특히 좋은 기능을 나타내고 항암효과까지 있는 것으로 보고되고 있다(Sekine et al., 1994; You et al ., 2004; Commane et al ., 2005; Han et al ., 2005).

한편, 이러한 항암제와 함께 사용되어 생물학적 반응을 조절 할 수 있는 보조약제(BRM)의 일종으로 생체내 면역기능을 활성화시키는 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

앞서 살펴본 락토바실러스 카세이(L. casei)의 항종양 효과는 화학요법제들인 cyclophosphamide, 5-fluorouracil, mitomycin C, bleomycin과 복합 투여하면 현저하게 증폭되는 것으로 밝혀졌다(Bogdanov, 1975; Matsuzaki, 1985).

현재 BRM으로 사용하고 있는 생균제제로는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 스트렙토코커스 파이오젠스(Streptococcus pyogenes), 코리네박테리움 파븀(Corynebacterium parvum) 등이 이용되고 있으나, 이들은 낮은 빈도로 감염증이나 다른 합병증을 유발하는 것으로 보고되어 있어 임상사용이 극히 제한적으로 이루어지고 있다(Milas et al ., 1975; Sato et al ., 1978; Proft et al., 2001).

따라서 새로운 면역요법제의 필요성이 증가함에 따라 항암과 면역활성을 가지고 식품으로서의 사용에 안전성이 확보되어 있는 유산균에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.

현재까지는 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 발효유나 분유들에 생균 형태로 이용하였으나 최근에는 대사산물 중 유용한 기능성을 가진 물질을 분리, 정제하려는 연구가 시도되고 있다. 특히, 비피도박테리움(Bifidobacterium )이 생산하는 다당류는 항암 활성이 보고되면서 고기능성 식품, 의약품 소재로 각광 받을 가능성이 매우 높은 물질이다. (Huh, 1994; Ohyama, 1982; Wang et al., 1963).

본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 대장암 세포주에 대한 증식 억제 활성 및 면역증강 활성을 보유한 유산균, 상기 유산균의 부탄올 추출물, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포함하는 보조약제, 상기 유산균 부탄올 추출물을 포 함하는 약학적 조성물 및 상기 유산균 부탄올 추출물의 대장암 억제 효과에 관한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암세포주 증식 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 의 부탄올 추출물 또는 이를 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항암용 약학적 조성물에 있어서, 상기 암 세포주는 대장암 세포주인것이 바람직하며, 보다 구체적으로는 상기 대장암 세포주는 Caco-2, HT-29, SW480 일 수 있다.

본 발명의 항암용 약학적 조성물은 보조약제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 면역 증강 활성을 가지는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 의 부탄올 추출물 또는 이를 유효성분으로 하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 면역증강용 조성물에 있어서, 상기 면역 증강 활성은 NO와 TNF-α 생산 유도 및 대식세포 활성화일 수 있다.

본 발명은 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 부탄올 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물, 생균제 조성물 및 항균용 조성물, 정장용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 암 세포주 특히, 대장암 세포주의 증식 억제 활성 및 면역 증강 활성을 갖는 특정 균주의 부탄올 추출물을 유효성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제 및 보조 약제를 제공한다.

본 발명에서는 대장암 세포주의 증식 억제 활성을 갖는 균주를 정상적인 섭식 습관을 갖는 20 - 30 세의 건강한 성인으로부터 분리하였으며, 이들 중 XTT 실험을 통해 대장암 세포주에 대한 증식 억제 효과가 있는 미생물을 선발하였고, 선발된 미생물을 16S rRNA의 염기서열 분석, PCR-RAPD 분석, 형태학적, 배양학적 및 생화학적 특성 분석을 통해 동정하였다. 그 결과 본 발명에서 분리된 유산균이 “비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)”임을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 유사균을 ‘비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212’라 명명하여 2006년 8월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁번호 : KCTC 18120P)

상기 유산균의 부탄올 추출물에 의해 생장이 억제되는 암 세포주로는 대장암 세포주, 위암 세포주, 백혈병 세포주, 폐암 세포주, 신장암 세포주, 방광암 세포주, 자궁 경부암 세포주, 유방암 세포주, 간암 세포주 또는 전립선암 세포주 등이 해당할 수 있으며, 바람직하게는 대장암 세포주인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명에서는 한국 세포주 은행(KCLB : Korea Cell Line Bank)에서 분양받은 대장암 세포주 Caco-2, HT-29와 SW480를 사용하였다.

유산균의 부탄올 추출물은 먼저 셀 배양액을 원심분리하여 침전된 세포 1g당 부탄올을 가하여 혼합하고, 다시 원심분리한 상등액으로 하였다. 이러한 과정으로 얻어진 상등액을 부탄올 추출물이라고 한다.

상기 대장암 세포주 Caco-2, HT-29와 SW480에 본 발명의 유산균의 상등액과 부탄올 추출물을 농도별로 처리하여, NO 의 생산량과 TNF-α의 생산량을 측정하였으며, 본 발명 유산균의 상등액에서보다 부탄올 추출물에 의해 대장암 세포주의 생장이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.

본 발명에서는 또한 대식 세포로서 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 배양 상등액과 부탄올 추출물의 면역증강 활성 효과를 실험하였다.

대식세포는 면역반응에 관계하는 주 세포로서 면역세포의 작용을 조절하는 사이토카인을 분비하여 면역반응 조절, 자연면역에서 미생물, 항원, 죽은 조직 등을 식균 작용으로 파괴, 체액성 면역 반응에서 작용세포(effecor cell)로서의 활동, 지연성 과민 반응(delayed type hypersensivity)에서 항원 제거, TNF-α 분비를 통한 종양세포의 파괴, 획득면역반응에서 항원의 조작과 제시(antigen processing and presentation), 염증반응에 관여하는 물질이나 사이토카인을 분비하여 염증반응을 조절, 섬유아세포와 혈관내피세포의 성장인자를 생산하여 손상된 조직의 치유 등 다양한 기능을 한다.

자유-라디칼인 NO(nitric oxide)는 혈관확장, 신경전달, 혈소판 응집억제, 면역반응, 세포외 매트릭스 생성의 억제 등 다양한 기능을 매개한다. 특히, NO는 비특이적으로 숙주를 방어하거나 대식세포-매개 사멸, 생체 외 및 생체 내에서 미생물 및 종양세포의 증식 억제 등 전반적인 체내 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 NO는 염증 반응시 염증 부위에 면역세포들이 신속히 이동할 수 있도 록 혈관사이의 틈을 만들어주는데 관여한다.

따라서, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 유산균 SPM0212가 대식세포의 NO(nitric oxide)의 생산을 유도하는지 조사하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 유산균 SPM0212의 배양 상등액이 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 세포에서 NO의 생산을 높은 수준으로 유도함을 확인할 수 있었다.

TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 감당하는 사이토카인이다. TNF-α는 세균의 세포막에 있는 내독소(bacterail endotoxin)인 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 림프구에 의해 만들어지는데, 많은 종류의 사이토카인 분비를 조절하는 면역 반응에 있어서 가장 초기에 일차적인 매개체로 작용한다. 또한 T 세포와 B 세포의 활성화에 공동-자극제(co-stimulator)로 작용하기도 한다. 따라서, TNF-α의 생성을 조절하는 것은 면역반응을 초기에 조절하기 때문에 매우 효과적인 조절단계로 여겨지고 있다. 또한 TNF-α는 염증반응에서 백혈구들이 혈관내피세포에 부착하는 것을 촉진하며, 염증세포들의 미생물 살해능력을 증가시키며, 단핵 식균세포(mononuclear phagocytes)에 작용하여 여러 가지 염증반응에 관여하는 사이토카인을 생산하게 만들어 염증반응을 촉진한다. TNF-α는 또한 종양세포에 작용하여 아폽토시스를 유도하기도 한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 유산균 SPM0212가 TNF-α의 생산을 유도하는지 조사하였다. 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 분석한 결과, 본 발명의 유산균 SPM0212가 TNF-α의 생산 또한 유도함을 확인할 수 있었다.

이러한 대식세포는 휴지기 상태에서는 둥글고 매끄러운 형태이나, 활성화되면 세포의 크기가 커지고 세포 표면이 거칠게 변하는 형태학적 변화를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 다른 실시예에서는 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 가 본 발명의 유산균 SPM0212에 의해 활성화되는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 유산균 SPM0212에 의해 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 가 활성화되는 것을 관찰할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 사용한 유산균주의 부탄올 추출물은 암 세포주 특히, 대장암 세포주에 대해 증식 억제 효과 및 면역 활성 증강 효과가 우수하였다.

본 발명에 따른 유산균주의 부탄올 추출물을 유효성분으로 하는 암 세포주 증식 억제제를 사용하면, 대장암의 증식을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 유산균주의 부탄올 추출물만을 제제화하면 되므로, 기존의 항생제를 포함하는 여러 종류의 항암제들에 비하여 생산 원가를 낮출 수 있다.

따라서, 상기 유산균의 부탄올 추출물을 유효 성분으로 하는 항암적 약학 조성물 또는 보조 약제에 의해 암을 예방하는 효과 및 면역 활성이 증대되는 효과를 기대할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인변으로부터 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)균 분리

정상적인 섭식 습관을 갖는 20 - 30 세의 건강한 성인 15명으로부터 분변을 수집하였다.

수집된 인분의 적당량을 생리식염수 100 ㎖에 현탁한 후, 적당량을 취하여 5% 양 혈청이 함유된 BL 아가 배지(Blood-Liver, Nissue)에 도말하였다. 박트론 혐기 챔버(Bactron Anaerobic chamber; Sheldon Manufacturing Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.

생존한 균주 중에서 0.5-2.0 mm 의 적갈색 중심 부분을 갖는 밝은 갈색, 유백색 또는 황갈색 형태의 비피도박테리움 속 미생물을 선별하였다.

선별된 3종의 유산균은 fructose-6-phosphate phosphoketlase (F6PPK) 시험을 통해 비피도박테리움 속인 것을 확인하고, 이들을 (SPM0212, SPM1005, SPM1601)로 각각 명명하였다.

<실시예 2> 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis )균의 분리 및 동정

a. 16S rRNA 분석

상기 과정을 통하여 분리되고 명명된 SPM0212, SPM1005, SPM1601를 동정하기 위하여, 당업계에 공지된 통상의 방법(Matsuki, T., et al., FEMS Microbiology Lett., 167: 113-121, 1998; Mullie, C., et al., FEMS Microbiology Lett., 222: 129-136, 2003; Venema, K., et al., FEMS Microbiology Lett., 224: 143-149, 2003)에 따라 16S rRNA 분석을 수행하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 유산균 SPM0212의 5' 영역과 3' 영역 모두 비피도박테리움 아돌레센티스 L2-32(1518bp)와 99.2%의 상동성을 나타내었다(결과 미도시)

b. PCR-RAPD 분석

상기 과정을 통하여 분리되고 명명된 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212, SPM1005, SPM1601과 KCTC에서 구입한 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) KCTC3325와의 유전적인 관계를 조사하기 위하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 분석을 수행하였다.

유산균의 genomic DNA는 wizardgenomic DNA purification kit (Promega, Co. Ltd., Madison, U.S.A.)를 사용하여 분리하였다.

PCR 반응은 2.5 units 택 폴리머라제(Taq polymerase), 1.5 mM MgCl₂, 0.25 mM dNTPs, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, template genomic DNA와 각각의 프라이머를 포함하는 30 ㎕ 부피에서 수행하였다. PCR 증폭반응은 PTC-200 thermal cycler (MJ Research, U.S.A.)에서 수행하였으며, PCR-RAPD 분석을 수행하 기 위한 primer들은 (주) 서린바이오사이언스에서 구입하였다. 증폭된 PCR 산물들은 2% 아가로스 젤에서 5시간 동안 100 V에서 전기영동법으로 분리하였고, 에디티움 브로마이드(ethidium bromide (EtBr)) 염색법으로 결과를 판독하였다.

도 1에서 보는 바와 같이 i)lane 1의 SPM 0212, ii)lane 2의 SPM 1005, iii)lane 3의 SPM 1601 은 KCTC에서 구입한 iv)lane 4의 비피도박테리움 아돌레센 티스(Bifidobacterium adolescentis) KCTC 3325와는 다른 유전적 구성을 나타냄을 알 수 있다.

c. 당 이용성 분석

비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212, SPM1005, SPM1601의 당이용성은 다음과 같았다.

Sugar	Bifidobacterium adolescentis
	SPM0212	SPM1005	SPM1601
L-Srabinose	-	+	-
D-Ribose	-	-	-
Xylose	+	+	+
Galactose	+	+	+
Fructose	+	+	+
Mannose	-	-	+
Mannitol	-	+	-
Sorbitol	-	-	-
Salicine	-	+	-
Cellobiose	-	-	+
Maltose	+	-	-
Lactose	+	+	-
Melibiose	+	+	+
Saccharose	+	+	+
Trehalose	+	+	-
Inuline	-	+	-
Melezitose	+	+	-
Raffinose	+	-	+
Starch	+	+	+
Gluconate	+	-	-

<실시예 3> 대장암 세포주 증식 억제 효과를 가진 균주의 선발

상기 실시예에서 건강한 한국인 청년의 분변으로부터 분리, 동정된 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM 3가지 균주 중에서 대장암 세포 증식 억제효과를 가진 유산균을 선발하기 위하여 XTT 시험을 통하여 인간 대장암 세포주에 대한 세포 증식 효과를 측정하였다.

인간 대장암 세포주인 Caco-2, HT-29와 SW480은 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받았으며, 각각 세포주의 특징은 다음과 같다.

Cell lines	Cell type	Origin	Growth property	KCLB (ATCC) No.
Caco-2	Epithelioid	Colonic adenocarcinoma	Adherent	KCLB 30037
HT-29	Epithelioid	Colonic adenocarcinoma	Adherent	KCLB 3003
SW480	Epithelioid	Colonic adenocarcinoma	Adherent	KCLB 10228

상기 3가지 균주는 10%의 FBS와 1% penicillin-streptomycin을 넣은 RPMI-1640 (RPMI-10) 배지에서 T-75 플라스크를 이용하여 37℃, 5.5% CO₂가 유지되는 CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다.

대장암 세포의 증식 억제는 XTT 시험 (sodium 3-[1-(phenylaminocarbonyl)-3, 4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate)을 이용하였다. Caco-2, HT-29와 SW480 각각의 대장암 세포를 96-well plate에 각 well당 3 × 10³ cells로 group당 4개의 well에 분주하였으며, 분리되고 동결건조시킨 SPM 3가지 균주의 상등액으로 처리한 후, 72시간 동안 37℃, 5.5% CO₂에서 배양하고, 50 ㎕의 XTT solution (1 ㎎/㎖)을 넣고 6 시간 후에 ELISA reader를 이 용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 대장암 세포주 Caco-2, HT-29와 SW480 각각에 대해 도 2 내지 도 4로 나타내었다.

도 2 내지 도 4에서 보는 바와 같이 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 균주가 가장 좋은 활성을 나타냄을 알 수 있다.

본 발명자들은 상기 균주 중 SPM0212를 “비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212”로 명명하여 , 2006년 8월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁번호 : KCTC 18120P)

이하에서는 위의 선택된 SPM0212 외에 SPM1005 및 SPM1601를 SPM0212의 효과를 대비하기 위한 비교 균주로서 사용한다.

<실시예4> SPM0212 추출 용매의 결정 및 항암 효과 실험

<추출 용매의 결정>

앞선 실시예를 통해 분리되고 명명된 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 균주를 동결건조 시킨 후 이를 추출하기 위해 n-헥산(n-Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), n-부탄올(n-Butanol) 3가지 용매를 사용하여 추출 효과를 실험하였으며, 부탄올을 사용할 경우 침전물을 얻을 수 있었으므로, 추출 용매를 부탄올로 결정하였다.

부탄올 추출물은 아래와 같은 과정으로 준비하였다.

먼저 셀 배양액을 6000rpm으로 30분간 원심분리하였으며, 원심분리가 완료된 후 상등액을 분리시켰다. 원심분리되어 침전된 세포의 무게를 측정하였다. 상기 얻어진 세포 1g당 부탄올 30 ml를 가하여 충분히 현탁될 때까지 혼합하고, 이를 호모게나이저(homogenizer)로 10분간 균질화한다. 이 용액을 12000 rpm으로 다시 20분간 원심분리 시킨 후 상등액을 얻었다. 이하 상기 상등액을 부탄올 추출물이라고 한다.

<SPM0212의 부탄올 추출물 농도에 따른 대장암 세포주 증식 억제 효과의 측정>

상기 과정을 통해 얻어진 부탄올 추출물에 의한 대장암 세포주 증식 억제 효과를 측정하기 위해 Caco-2, HT-29와 SW480 각각의 대장암 세포를 96-well plate에 각 well당 3 × 10³ cells로 group당 4개의 well에 분주하였으며, 여기에 동결건조 시킨 SPM0212 유산균 부탄올 추출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 후, 72시간 동안 37℃, 5.5% CO₂에서 배양하고, 50 ㎕의 XTT solution (1 ㎎/㎖)을 넣고 6시간 후에 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 대장암 세포주 Caco-2, HT-29와 SW480 각각에 대해 도 5 내지 도 7로 나타내었다. 동결건조시킨 SPM0212 배양 상등액을 같은 방법으로 비교 실험하였다.

도 5 내지 도 7에서 보는 바와 같이 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 부탄올 추출물은 세 가지 대장암 세포주에 대해 25 ㎍/㎖에서 200 ㎍/㎖까지 농도 의존적으로 증식 억제 효과가 나타났다.

전반적으로 본원 발명의 SPM0212와 비교 균주 1, 2(SPM1005, SPM1601) 모두에서 배양 상등액 보다는 부탄올 추출물이 증식 억제 활성이 우수한 것으로 나타났다.

도 5의 Caco-2 세포의 경우 부탄올 추출물은 200 ㎍/㎖의 농도에서 약 70%로 억제 효과가 나타난 반면, 배양 상등액은 200 ㎍/㎖의 농도에서만 약 10%의 억제 효과가 나타나기 시작했다. 또한 HT-29, SW480 세포의 경우는 200 ㎍/㎖의 농도에서 부탄올 추출물이 각각 30%와 40%로 증식 억제 효과를 보였다.

<실시예 5> 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212가 대식세포의 활성화에 미치는 영향 시험

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서의 Nitrite oxide (NO) 생성에 미치는 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 배양 상등액과 부탄올 추출물의 효과를 조사하였다.

<5-1> 대식세포의 배양

본원 발명에서 대식 세포로는 뮤린 마크로파아지 셀 라인(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 사용하였으며, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포는 10%의 FBS와 1% penicillin-streptomycin을 넣은 DMEM-1640 (DMEM-10) 배지에서 세포 배양 디쉬(cell culture dish)를 이용하여 37℃, 5.5% CO₂가 유지되는 CO₂ 인큐베이터(인큐베이터(incubator))에서 배양하였다.

<5-2> Nitrite 생성 측정

본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212슈도카테눌라툼 SPM1204의 면역활성 증강 여부를 알아보기 위해 비피도박테 리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212슈도카테눌라툼 SPM1204가 전반적인 면역반응과 염증반응에 관계하는 NO의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. NO는 세포 배양액에서 NO^{2 -}와 NO^{3 -}의 형태로 축적되므로, NO 생산 정도를 측정하여 축적된 NO^{2 -}의 양으로 결정하였다.

상기 실시예 5-1에서 배양된 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포(ATCC TIB-71)를 well당 2 × 10⁵ cells로 group당 4개의 well에 분주하고, 여기에 LPS (50 ng/㎖), 동결건조시킨 SPM0212 유산균 상등액 또는 부탄올 추출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 후, 37℃, 5.5% CO₂가 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 22시간 동안 배양하였다.

유산균에 대한 대조군에는 앞서 분리되고 명명된 SPM1005 및 SPM1601를 각각 동일한 농도로 첨가하였다. 한편, LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포가 NF-κB 신호전달경로를 통하여 NO 생산을 증가시키는 것으로 알려졌다. 따라서, NO 생산에 대한 양성 대조군에는 LPS를 50 ng/㎖의 농도로 첨가하였다. 반면, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않았다.

이후 각 웰로부터 100 ㎕의 배양액을 취하여 새로운 96-well 플레이트에 옮기고 그리에스 시약(Griess reagent) 혼합액 (Stock-Ⅰ: 0.2% naphylendia HCl, Stock-Ⅱ: 2% sulfanilamide in 5% H₃PO₄)을 상기 상등액이 담겨 있는 플레이트에 각 well당 100 ㎕씩 분주한 후 전체 NO^2- 생성 정도를 540nm에서 ELISA 리더로 판독하였다. 이 때 NO^2- 농도에 대한 표준 곡선은 NaNO₂를 연속 희석(serialdilution)하여 작성하였다. 그 결과를 3회의 독립된 실험의 평균±표준편차로 나타내어 도 8에 도시하였다.

비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 부탄올 추출물을 처리한 군은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 배지만 처리한 음성대조군(negative control group)과 비교하였을 때 상대적으로 많은 양의 NO를 생성하였다. 또한 NO 생성이 부탄올 추출물로 처리한 경우 부탄올 추출물의 농도가 25 ㎍/㎖부터 200 ㎍/㎖까지 증가할 때까지는 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 반면에 배양 상등액에 의한 NO 생성은 크지 않았으며 농도에 상관없이 일정한 수준을 나타내었다 (도.8).

이러한 결과는 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 균주의 부탄올 추출물은 대식세포의 활성을 증가시켜 NO의 분비를 향상시킨다는 것을 알 수 있다.

<3-3> TNF -α 정량

TNF-α는 면역제어와 염증반응에 핵심적 조절자 역할을 담당하는 사이토카인이다. 따라서 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212 균주가 TNF-α의 생산에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.

상기 실시예 3-1에서 배양된 RAW 264.7 세포주에 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 동결건조된 상등액과 부탄올 추출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 후에 이를 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액에서 분비된 TNF-α를 정량하기 위해서 OPITEIA^™ Mouse TNF-α kit (Pharmingen, San diego. CA, USA)를 사용하였다.

비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM0212의 상등액과 부탄올 추출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 RAW 264.7 세포의 배양액을 수확하고 모로클로날 캡쳐 안티바디(monoclonal capture antibody) 를 미리 코팅해 놓은 96-well plate에 수확한 배양액과 recombinant standard를 각각의 well에 넣고 2시간 동안 배양 후 horseradish peroxidase conjugated streptavidin이 표지된 항체를 첨가하였다.

한편, LPS에 의해 활성화 된 RAW 264.7 세포가 NO 뿐 아니라 TNF-α의 생산도 증가시키는 것으로 알려졌다(Aradhya, S., et al., Curr. Opin. Genet.Dev., 11:300-306, 2001).

TNF-α 생산에 대한 양성 대조군에는 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 첨가하였다. 반면, 음성 대조군에는 아무것도 처리하지 않았다.

흡광도 측정을 위하여 tetramethylbezidine(TMB)(BD Biosciences, Pharmingen, USA)을 첨가하여 30분 배양 후 450 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 도.9에 나타내었다.

본 연구 결과, 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 부탄올 추출물로 처리한 경우 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(cell)보다 처리되는 부탄올 추출물의 농도에 대해 의존적으로 TNF-α 생성이 증가되었으며, 200 ㎍/㎖ 농도에서는 LPS 처리군 (100 ng/㎖)보다도 TNF-α 생성이 다소 높게 나타났다 (도 9).

<5-3> 본 발명의 유산균 SPM0212에 의한 대식세포의 형태 변화 관찰

일반적으로 휴면상태의 대식세포의 형태학적 특징은 둥글고 매끄러우나, 활성화되면 세포의 크기가 커지고 세포 표면이 거칠게 변하는 형태학적 변화를 나타낸다. 본 발명의 유산균 SPM0212에 의해 대식세포가 활성화되는지 알아보았다.

RAW 264.7 세포를 살균 글래스-슬라이드 체임버(sterile glass-slide chamber (NunC))에서 1×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고, 각각 LPS (50 ng/㎖), 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 동결건조된 상등액과 부탄올 추출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양한 체임버(chamber)의 배지를 제거한 후 디프-퀵 용액 (Diff-quick solution )(Sysmex corporation, Japan)으로 고정시키고 염색하여 현미경으로 세포를 관찰하였다.

양성 대조군(Positive control)으로는 LPS를 처리한 group을 사용하였다.

배지만 처리한 정상적인 마우스 대식세포 RAW 264.7 는 활성화 되지 않은 라운드 형태로 나타났으며, 50 ng/㎖의 LPS를 처리한 경우와 비피도박테리움 아돌레센 티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212의 배양 상등액과 부탄올 추출물을 처리한 경우 라운드 형태가 아닌 활성화 된 형태를 보였다.

또한 앞선 실시예의 NO 생성과 TNF-α 생성에서와 같이, 부탄올 추출물에서 대식세포 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.

이것으로 종합해볼 때 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주는 대식세포 활성을 증가시켜 면역력을 증강시킨다는 것을 알 수 있으며 배양 상등액 보다는 부탄올 추출물에서 더 좋은 면역 증강 활성이 있음을 알 수 있었다.

<비교예>

기존에 전립선암에 대해 항암활성이 있는 것으로 알려진 연교 추출물인 Arctiin과 본원 발명에 따른 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 의 대장암 세포주에 대한 대장암 억제 효과를 비교하기 위하여, Arctiin에 대해서도 상기 실시예에서 사용한 방법과 같은 방법으로 비교 실험하였다.

Caco-2 세포의 경우 200㎍/㎖의 농도에서 20%정도의 억제효과를 보였던 arctiin에 비해 본원 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 부탄올 추출물은 같은 농도에서 70%로 억제효과가 컸으며, 다른 대장암 세포주에서도 Arctiin의 억제 효과는 본원 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 부탄올 추출물보다 30~40%정도 낮은 수치를 보였다.

도 1은 증폭된 PCR 산물들을 전기영동법으로 분리하고, EtBr 염색법을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.

i)lane 1은 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) SPM 0212, ii)lane 2는 SPM 1005, iii)lane 3은 SPM 1601, iv)lane 4는 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) KCTC 3325을 각각 나타낸다.

도 2는 Caco-2 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis) SPM0212, SPM1005, SPM1601의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 3은 HT-29 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212, SPM1005, SPM1601의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 4는 SW480 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212, SPM1005, SPM1601의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 5는 Caco-2 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212의 상등액과 부탄올 추출물(25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 6은 HT-29 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212의 상등액과 부탄올 추출물(25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 7은 SW480 세포에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212의 상등액과 부탄올 추출물(25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)의 증식 억제 효과를 XTT 테스트를 통해 나타낸 도면이다.

도 8은 마우스 대식세포 RAW 264.7의 NO 생산량에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis )SPM0212의 영향을 나타낸 도면이다.

도 9는 마우스 대식세포 RAW 264.7의 TNF-α 생산량에 대한 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis )SPM0212의 영향을 나타낸 도면이다.

도 10은 마우스 대식세포의 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis)SPM0212에 의한 형태학적 변화를 나타낸 도면이다.

도 11은 대장암 세포주 Caco-2, HT-29 및 SW480 각각에 있어서 Arctiin에 의한 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.

Claims (10)

1. 기탁번호 KCTC 18120P 로 기탁된, 암세포주 증식 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 암이 대장암인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 암 세포주는 Caco-2(KCLB 30037), HT-29(KCLB 3003), 또는 SW480(KCLB 10228)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 항암용 약학적 조성물은 보조약제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물
5. 기탁번호 KCTC 18120P 로 기탁된, 면역 증강 활성을 가지는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물.
6. 제5항에 있어서, 상기 면역 증강 활성은 NO와 TNF-α 생산 유도 및 대식세포 활성화인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물.
7. 제5항의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물.
8. 제5항의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 함유하는 생균제 조성물.
9. 제5항의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 함유하는 항균용 조성물.
10. 제5항의 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 함유하는 정장용 조성물.

Images