KR20000033752A - Poncirus trifoliata로부터 분리한 인체장기 보호용 화합물 - Google Patents

Poncirus trifoliata로부터 분리한 인체장기 보호용 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 위장병을 위암으로 발전시키는 Helicobacter pyolri(HP)의 생성과 위궤양 및 십이지장궤양의 원인물질인 우레아제의 활성을 저해하는 Poncirus trifoliata로부터 분리한 인체 장기 보호용 화합물에 관한 것으로 Poncirus Fructus로부터 폰시린을 추출분리한 후 인간 장내 세균 마이크로플로라(human intestinal microflora)와 함께 혐기적으로 배양하여 폰시린 대사산물을 얻고 폰시린(poncirin)과 이의 대사산물들의 HP 성장 저해와 HP가 생산하는 우레아제 활성 저해 정도를 분석한 결과, 폰시린 대사산물중 폰시레틴은 위장병을 위암으로 발전시키는 HP의 성장을 강력하게 저해하고 플로로글루시놀(phloroglucinol)은 위궤양과 십이지장 궤양의 원인 물질인 HP 유래의 우레아제 활성을 강력하게 저해하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ로부터 분리한 인체 장기 보호용 화합물
본 발명은 Poncirus trifoliata로부터 분리한 신규한 위장 및 십이지장 보호용 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 위장병을 위암으로 발전시키는 Helicobacter pyolri(HP)의 생성과 위궤양 및 십이지장궤양의 원인물질인 우레아제의 활성을 저해하는 신규한 Poncirus trifoliata 유래의 인체 장기 보호용 화합물에 관한 것이다.
1983년 Warren과 Marshall에 의해 만성 위장병 환자로부터 HP를 분리하였다(Warren J.R., Marshall B. J., 1983). HP는 위장병을 위암으로 발전시키고 병원성 HP는 우레아를 CO2와 암모니아로 가수분해하는 우레아제의 생산을 촉진한다. HP 우레아제는 소화성 궤양과 위장병의 병인으로 결정적인 역할을 담당한다.
따라서 본 발명자들은 민간에서 위궤양과 십이지장궤양 치료에 사용하는 Poncirus trifoliata(Rutaceae)의 프럭투스로부터 주요성분인 폰시린을 분리한 후 시험관내에서 인간 장내 세균 마이크로플로라에 의해 전환된 폰시린과 그들 대사산물들의 HP 성장저해 활성과 우레아제 활성 저해효과를 조사하므로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 위장병을 위암으로 발전시키는 Helicobacter pyolri(HP)의 생성과 위궤양 및 십이지장궤양의 원인물질인 우레아제의 활성을 저해하는 신규한 인체 장기 보호용 화합물을 Poncirus trifoliata로부터 분리하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 인체 장기 보존용 화합물의 위장병 및 십이지장병 치료제로서의 용도를 제공함에 있다
본 발명의 상기 목적은 Poncirus trifoliata로부터 폰시린을 추출분리한 후 인간 장내 마이크로플로라와 함께 혐기적으로 배양하여 폰시린 대사산물을 얻고 폰시린과 그의 대사산물들의 HP 성장 저해와 HP가 생산하는 우레아제 활성 저해 정도를 분석하므로써 달성하였다.
본 발명은 Ponciri Fructus를 증류수로 추출한 후 에틸아세테이트와 부탄올로 분별증류하고 실리카겔 칼럼 크로마토그라피에 적용하여 폰시린 화합물을 얻는 단계; 인간 장내 세균 마이크로플로라와 함께 폰시린을 혐기적으로 배양하여 대사산물을 얻고 이중 주요 대사산물인 폰시레틴과 최소대사산물인 폰시레닌을 분리하여 이화학적 특성을 조사하는 단계; 상기 단계에서 얻은 폰시린과 폰시린 대사산물을 최소저해농도 측정법에 의해 HP 성장저해 정도를 조사하는 단계 및; 아가플레이트에 HP를 접종하고 배양하여 HP 우레아제를 얻은 후 폰시린과 폰시린 대사산물에 의한 상기 HP 우레아제의 활성 저해 정도를 Gutmann과 Bergmyer의 방법에 따라 분석하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 브루셀라 아가와 브루셀라 브로스는 Difco, Co(U.S.A)로부터 구입하였고 말혈청은 시그마사(U.S.A)로부터 구입하였으며 혐기성팩 캄필로는 미쯔비시 가스사(JAPAN)로부터 구입하였다. 또 사용한 미생물균주 HP ATCC43504, NCTC11637과 NCTC11638은 각각 ATCC와 NCTC로부터 얻었다. 한국인 위경(胃鏡) 샘플로부터 선택된 임상분리물로 다른 HPs(HP82516, 82548, 4)를 한국화학기술연구소의 박박사로부터 얻었다. 이것들을 7% 말혈청이 첨가된 브루셀라 아가 플레이트내에 접종하고 비혐기성팩 캄필로(Campylo)에 의한 비혐기성 조건하에서 37℃의 온도를 유지하면서 3일동안 배양하였다.
실시예 1: 폰시린과 그 대사산물 생성
제 1단계: Ponciri Fructus로부터 폰시린 분리
Ponciri Fructus는 현진 약업사(SEOUL KOREA)로부터 구입하여 동정하였다. 이를 6시간동안 80℃에서 증류수로 두 번 추출하고 에틸아세테이트와 부탄올로 분별증류하였다. Poncirin Fructus의 물추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 주요 구성성분인 폰시린의 분리를 위해 추출물(15g)을 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(5 × 80cm)에 적용하였고 클로로포름/메탄올(10:1 ~ 2:1)로 용출하였다. 주요 구성성분은 MeOH로 분리하였고 재결정하였다. 기기분석으로 폰시린(1.2g) 화합물을 얻었다. 폰시린(5,7-디하이드록시-4'-메톡시플라바논-7-람노글루코시드)의 이화학적 특성은 다음과 같다.
물질의 성상:메탄올에서 무색 첨상.
녹는점: 211 ~ 213℃.
[α]20 D:-76.5(c=1.2 in DMSO).
FAB-MS m/z:595(M+1).
1H-NMR(500MHz, CD3OD): δ2.50(1H, d, J=2.2Hz, cis) 2.80(1H, d, J=9.1Hz, trans), 3.77(3H, s), 4.55(1H, s), 5.10(1H, d, J=8.0Hz), 5.57(1H, dd, J=2.2, 9.1Hz), 6.09(1H, d, J=2.1Hz), 6.3(1H, d, J=2.2Hz), 6.97(2H, d, J=8.7Hz), 7.45(2H, d, J=8.7Hz), 12.7(1H, s, OH).
13C-NMR(125MHz, CD3CD): δ78.31(C2), 42.05(C3), 197.12(C4), 162.88(C5), 96.33(C6), 164.85(C7), 95.13(C8), 162.65(C9), 103.29(C10), 130.35(C1'), 128.42(C2'), 113.90(C3'), 159.50(C4'), 113.90(C5'), 128.42(C6'), 100.35(C1˝), 77.10(C2˝), 76.08(C3˝), 69.58(C4˝), 76.87(C5˝), 60.41(C6˝), 97.43(C1'''), 70.44(C2'''), 70.34(C3'''), 71.79(C4'''), 68.23(C5'''), 17.97(C6'''), 56.44(-OCH3)
제 2단계; 인체 장내 미생물에 의한 폰시린의 대사에 의해 대사산물 생성
인체 장내 미생물에 의한 폰시린의 대사는 공지 방법에 의해 실시하였다. 즉, 인간 장내 세균 마이크로플로라와 함께 폰시린을 혐기적으로 배양하여 6개 대사물질인 폰시레닌, 폰시레틴, 2.4-디하이드록시아세토페논, 4-하이드록시벤조산, 플로로글루시놀 및 피로갈롤을 동정하였다. 주요 대사물질 하나와 최소 대사물질 하나인 두 개의 대사물질은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피에 의해 분리하였다. 주요 대사물의 FAB-MS는 m/z(M+1)에서 분자이온 피크가 287이였다. TLC 크로마토그램과 대사물의1H- 과13C-NMR 스펙트럼은 폰시린의 플라바논 스켈레톤(flavanone skeleton)이 변하지 않은 상태임을 나타냈지만 라암노글라이코실(rhamnoglycosyl) 일부분은 빠졌음을 확인하였다. 천연상태의 폰시레틴과 비교하여 이것이 폰시레틴임을 확인하였다. 또 최소 대사물의 FAB-MS는 m/z(M+1)에서 분자 이온피크가 449이였다. TLC 크로마토그램과 대사물의1H- 과13C-NMR 스펙트럼은 폰시린의 플라바논 스켈톤이 변하지 않은 상태임을 나타냈지만 라암노실 일부분이 빠져있었다. 천연상태의 폰시레닌과 비교하여 이것이 폰시레닌(5,7-디하이드록시-4'-메톡시 플라바논-7-글루코피라노사이드)임을 확인하였다. 폰시린 대사산물의 주요 구성성분인 폰시레틴의 이화학적 특성과 구조식(I)은 하기와 같다.
물질의 성상: 메탄올에서 무색첨상
녹는점: 193 ~ 194℃
[α]20 D: -3(c=0.7 in DMSO)
FAB-MS m/z: 287(M+1)
1H-NMR(500MHz, CD3OD):δ2.69(1H, d, J=2.2Hz, cis) 2.80(1H, d, J=9.1Hz, trans), 3.80(3H, s), 5.34(1H, dd, J=2.2, 9.1Hz), 5.89(1H, d, J=2.1Hz), 5.90(1H, d, J=2.2Hz), 6.94(2H, d, J=8.7Hz), 7.39(2H, d, J=8.7Hz), 12.10(1H, s, OH).
13C-NMR(125MHz, CD3OD): δ80.24(C2), 44.00(C3), 197.59(C4), 165.46(C5), 97.12(C6), 168.36(C7), 96.21(C8), 164.78(C9), 103.38(C10) 57.50(-OCH3), 132.32(C1'), 128.91(C2'), 115.02(C3'), 161.43(C4'), 115.02(C5'), 128.91(C6')
실험예 1: HP 성장저해 분석
상기 실시예 1에서 얻은 폰시린과 그 대사물질 1mL을 7% 말혈청이 추가된 응고되지 않은 7mL의 브루셀라 아가가 함유된 페트리 디쉬에 첨가하였다. 각 추출물의 마지막 농도는 1mg/mL이고 분리된 화합물의 마지막 농도는 100, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1. 0.5, 0.25 그리고 0.1㎍/mL이다. 그리고 대략 5 × 105CFU의 HP는 아가 플레이트에 접종하였고 비혐기적 조건하(85% N2, 10% CO2, 6% O2)에서 3일동안 37℃조건하에서 배양하였다. MIC(minimal inhibitory concentration)는 72시간 동안 배양한 후 측정하였다. 암피실린은 양성대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 3번 반복하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 폰시린은 HP 성장을 저해하지 않았지만 주요 대사물 폰시레틴은 HP 성장을 강력하게 저해하였다. 그러나 다른 대사물인 폰시레닌과 페놀 화합물은 HP 성장을 저해하지 않았다. 즉, HP에 대항하여 인간 장내 세균 마이크로플로라에 의해 폰시린으로부터 전환된 폰시레틴의 MICs는 10 ~ 20㎍/mL이였고 암피실린의 MIC는 0.5 ~ 2㎍/mL 이였다. 이들 항생제와 비교하면 분리된 화합물은 한단계 낮은 농도에서 HP의 성장을 저해하는 효과를 나타냈다.
Helicobacter pylori의 성장에 있어서 폰시린과 그들의 대사물로부터 분리된 화합물의 MICs.
화합물 MICs(㎍/mL)
HPATCC43504 HPNCTC11637 HPNCTC11638 HP82516 HP82548 HP4
Ponciri Fructus수추출물 ＞1000 -a) - - - -
폰시린 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
폰시레닌 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
폰시레틴 10 10 10 10 10 20
4-하이드록시벤조산 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
2,4-디하이드록시아세토페논 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
플로로글루시놀 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
피로칼롤 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100
암피실린 1 1 0.5 1 2 3
[주] a) 측정안됨
실험예 2: HP 우레아제 활성저해 분석
아가 플레이트로부터 HP를 100mL의 플라스크내 10% 우혈청 알부민이 첨가된 30mL의 브루셀라 브로스내로 접종하였다. 수확된 세포는 10mL의 20mM 포스페이트 buffer pH 7.0으로 세척하고 분쇄한 후 30분 동안 5000g로 원심분리하였다. 얻어진 상청액을 조제효소로 사용하였고 실시예 1에서 얻은 분별증류 용매에 따른 Ponciri Fructus 추출물을 비롯한 폰시린과 그 대사산물의 우레아제 활성 저해정도를 Gutmann과 Bergmyer의 방법에 따라 측정하였다. 실험결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 대부분이 0.3mg/mL에서 약하게 저해하였다. 잔여 분획과 부탄올 분획 같은 극성 분획 추출물은 약한 저해 활성을 나타냈다. HP의 우레아제 활성에 대한 폰시린과 이들의 대사산물의 저해효과는 약했으나 그들 중에서 플로로글루시놀은 강력하게 우레아제 활성을 저해하였다.
Helicobacter pylori의 우레아제에 대한 저해효과
화합물a) 저해(%)
Ponciri Fructus 에테르 분획에틸아세테이트 분획부탄올 분획잔여 분획 8103333
폰시린폰시레닌폰시레틴4-하이드록시벤조산2,4-디하이드록시아세토페논플로로글루시놀피로갈롤 2418210157623
[주] a) 식물추출물의 최종농도는 0.3mg/mL
본 발명은 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 Ponciri Fructus로부터 추출분리한 폰시린을 인간 장내 세균 마이크로플로라와 함께 혐기적으로 배양하여 얻은 대사산물중 폰시레틴은 위장병을 위암으로 발전시키는 HP의 성장을 강력하게 저해하고 플로로글루시놀은 위궤양과 십이지장궤양의 원인 물질인 HP 유래의 우레아제 활성을 강력하게 저해하므로 in vitro에서 인간 장내 세균에 의하여 대사되므로 그 대사산물을 얻어 약제로 사용하거나 또는 인간 장내에 직접 투여하여 장내 세균이 이를 대사하게 하므로써 위장병 또는 십이지장병을 치유하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

  1. Ponciri Fructus를 증류수로 추출한 후 에틸아세테이트와 부탄올로 분별증류하여 얻은 폰시린을 인간 장내 세균 마이크로플로라와 함께 혐기적으로 배양하여 얻음을 특징으로 하는 HP 성장과 HP 우레아제 활성을 저해하는 인체 장기 보호용 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인체 장기 보호용 화합물은 폰시린 대사산물임을 특징으로 하는 화합물.
  3. 폰시린 대사산물의 위장병 또는 십이지장병 치료제로서의 용도.
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