KR100537492B1 - 항균활성을 갖는 신규한 천연 조성물 - Google Patents

항균활성을 갖는 신규한 천연 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균활성을 가지는 탱자유래의 천연화합물에 관한 것으로, 탱자즙은 병원성 세균에 대해 비교적 높은 항균활성을 나타냈다. 또한, 본 발명의 탱자즙은 열처리하여도 비브리오 콜레라에 대한 항균성은 변하지 않아 열에 대하여 매우 안정하므로 본 발명 탱자유래의 천연화합물을 유효성분으로 하는 천연항균제를 포함한 기능성 제품에 사용될 수 있다.

Description

항균활성을 갖는 신규한 천연 조성물{Novel natural compound having antibacterial activity}
본 발명은 항균활성이 있는 탱자로부터 추출한 천연화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 병원성 세균에 대해 항균활성이 있으며 열에 안정한 탱자즙으로부터 얻은 천연화합물에 관한 것이다.
식품으로 인한 위해 중 위생상 가장 문제가 되는 것은 식중독이라 할 수 있으며, 경제성장과 소득수준의 향상으로 식생활 방식이 다양화되고, 집단급식 및 외식이 증가함에 따라 식중독의 발생도 매년 증가추세에 있다. WHO의 보고에 따르면, 전 세계적으로 전염병과 기생충질환이 전체사망의 35%를 차지하고 개발 도상국에서 주로 일어난다고 하였으며, 주요 질병은 설사, 말라리아, 결핵, 홍역 등이었고, 이들 중 설사의 70% 이상은 식중독에 의한 것이라고 보고되고 있다(Yang, J. S. 1997. Food irradiation for safety of microbiological aspect(in Korean). Food Science and Industry 30: 131-136.7).
최근 식품관련 산업에서는 자연계에 존재하는 다양한 동·식물 유래의 각종 유용성분을 이용하여 식품소재로 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 식품산업의 새로운 연구목표가 되고 있다. 따라서 국내의 천연자원 및 부산물로부터 기능성을 갖는 물질을 탐색하여 식품이나 식품부원료로 개발하는 것은 효율적인 자원이용의 측면이나 국민의 보건증진에 기여할 수 있는 측면에서 의미있는 일이라 할 수 있다.
최근 기능성 식품개발이나 특정 목적을 위하여 한약재나 천연식물재료를 이용한 생리활성물질 규명에 관한 연구가 활발히 수행되고 있다. 그러나 대부분의 연구재료는 무기 및 유기용매를 이용하여 추출한 추출액의 이용방법이나 유효 성분규명에 관한 것이기 때문에 실제 유효한 성분이 다량 함유되어 있는 재료를 발견할 지라도 개발비용 측면에서 많은 문제점에 부딪히게 된다.
한편, 탱자는 우리나라 중부 경기도 이남지방의 촌락부근에 흔히 울타리용으로 심고 있는 귀화식물로서 5월경에 꽃이피고 9월경에 열매가 성숙되며, 식용, 관상용, 밀원용, 약용 등으로 이용된다. 약용으로 이용되는 탱자는 6∼7월경의 미성숙과를 햇볕에 말려 이용하는 지각과 5∼6월경의 미성숙과를 이용하는 지실로 구분된다. 지실이나 지각은 자궁에 대하여 수축력과 긴장력을 증가시키는 효능, 위장의 운동을 규칙적이고 강하게 하는 효능 및 안전범위가 넓고, 독성이 없는 혈압상승효능이 있는 것으로 알려져 있다(정보섭, 신민교. 1988. 도해향약(생약) 대사전(식물편). pp.791-793, 영림사). 또한 위통, 위하수, 자궁하수, 유방결핵, 수종, 식체, 변비 등의 치료에 사용되는 것으로도 알려져 있으며, 시험관내에서 결핵균에 대하여 1:10000의 농도로 정균작용을 나타낸다고 밝혀져 있다(김창민, 신민교, 이경순, 안덕균. 1998. 중약대사전. pp.5210-5127, 도서출판정담). 지각과 지실은 주로 정유성분인 α-피넨(α-pinene), β-피넨(β-pinene), 미르센(myrcene), 리모넨(limonene), 카프릭 알데히드(capric aldehyde), 메틸 안트라닐레이트(methyl anthrannilate), 리나룰(linalool), γ-테르피넨(γ-terpinene) 등과 네오헤스페리딘(neohesperidin), 나링진(naringin), 로이폴린(rhoifolin), 로니세린(lonicerin) 등의 플라보노이드 배당체 및 비타민 C와 쓴맛 성분인 아우란티아마린(aurantiamarin), 아우라우티아마르산(aurautiamaric acid) 등을 함유하고 있으며, 탱자의 성숙과는 청결한 향기가 진하여 식품소재개발의 원료로써 이용가치가 높은 재료이다. 그럼에도 불구하고 국내에서 기능성 식품 소재개발에 이용된 연구재료들은 대부분 각종 과실류, 다류제, 한약제 등이며 탱자에 관한 연구는 극히 미미한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 천연물로부터 식중독 원인균 등의 병원성 세균을 제거할 수 있는 기능성 식품 소재개발을 위한 일련의 연구로써 탱자즙의 항균효과를 검정하여 천연항균제 및 가공식품으로서의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 숙성한 탱자를 착즙하여 본 발명 시료를 제조하고 상기 탱자즙의 항균활성을 검정하기 위하여 병원성 세균을 배양하고 상기 세균을 멸균 생리식염수로 현탁하고 페이퍼 디스크법을 이용하여 상기 세균현탁액에 대한 본 발명 탱자즙 시료의 항균효과를 검정하며 비브리오 콜레라에를 지시균주(indicator strain)로 사용하여 탱자즙 항균성의 열 안정성을 조사함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 숙성한 탱자를 착즙하여 본 발명 시료를 제조하는 단계; 상기 탱자즙의 항균활성을 검정하기 위하여 병원성 세균을 배양하고 상기 세균을 멸균 생리식염수로 현탁하여 세균현탁액을 제조하는 단계; 상기 세균현탁액에 대한 본 발명 탱자즙 시료의 항균효과를 페이퍼 디스크법을 이용하여 검정하는 단계; 비브리오 콜레라에를 지시균주(indicator strain)로 사용하여 탱자즙 항균성의 열 안정성을 조사하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 본 발명 탱자즙의 제조
본 발명에서 이용된 탱자는 완숙한 것을 2001년 10월초에 직접 채취하여 과피부분을 제외한 부분을 손으로 착즙하고 하룻밤 동안 10℃에 정치시킨 다음, 상층의 투명한 원액을 시료로 사용하였다.
사용균주 및 배지
본 발명 탱자즙의 항균활성을 검정하기 위하여 사용한 균주는 그람음성 세균 8종 및 그람양성 세균 14종 등 22종의 병원성 세균을 사용하였으며, 각 균주들은 최적배지에서 2회 이상 계대배양하여 활성화시킨 후 사용하였다. 사용한 균주 및 배양온도는 표 1과 같으며, 비브리오 속균의 배양을 위한 배지에는 1%의 NaCl을 첨가하였다.
본 발명에 사용된 균주와 성장 조건
사용 균주 배지 온도(℃)
그람 양성균 -Bacillus cereusATCC 11778 -Bacillus subtilisATCC 17686 -Corynebacterium zerosis ATCC 9755 -Listeria monocytogenes(식품에서 분리) -Micrococcus luteusATCC 9341 -Rhodococcus equiATCC 6939 -Staphylococcus aureusATCC 65389 -Staphylococcus epidermidisATCC 12228 그람 음성균 -Citrobacter freundiiATCC6750 -Enterobacter cloacaeATCC13047 -Escherichia coliATCC9637 -Escherichia coliO157 (환자로부터 분리) -Klebsiella pneumoniaeATCC10031 -Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 -Salmonella enteritidisATCC13076 -Salmonella typhi(환자로부터 분리) -Shigella sonneiATCC9290 -Vibrio alginolyticus(해수에서 분리) -Vibrio cholerae(환자로부터 분리) -Vibrio parahaemolyticus(환자로부터 분리) -Vibrio vulnificus(환자로부터 분리) -Yersinia enterocoliticaATCC29729 MHAMHAMHABAPMHAMHAMHAMHA MHAMHAMHAMHAMHAMHAMHAMHAMHAMHANMHANMHANMHANMHA 3737373037373737 3737373737373737373737373730
MHA : 뮤엘러 힌톤 아가(Mueller Hinton agar)
BAP : 블러드 아가 플레이트(blood agar plate)
MHAN : 1% 의 NaCl이 첨가된 뮤엘러 힌톤 아가
세균현탁액의 조제
각 공시균의 최적배지에서 자란 집락 1 백금이를 10 ㎖의 뮤엘러 힌톤 브로스(Mueller Hinton broth, 디프코사 제품)에 접종하고 최적온도에서 24시간 동안 배양하여 활성화시킨 후, 멸균된 생리식염수로 2.5 x 105 CFU/㎖의 농도가 되도록 균수를 조절하여 항균효과 검증에 이용할 세균현탁액으로 사용하였다.
실시예 2: 본 발명 탱자즙의 항균효과 측정
실험예 1: 본 발명 탱자즙의 항균력 측정
본 발명 탱자즙의 항균력은 Zaika의 방법에 따라 페이퍼 디스크(paper disk)법으로 측정하였다. 실시예 1에서 제조된 세균현탁액 100 ㎕를 각 배지에 분주하여 유리봉으로 골고루 도말한 다음 세균현탁액이 배지에 스며들도록 실온에 잠시 보관하였다. 탱자즙 50 ㎕를 포함한 페이퍼 디스크를 도말된 배지의 표면에 부착시키고, 각 공시균의 최적온도에서 24시간 배양한 다음, 형성된 억제환의 크기로 항균력 정도를 확인하였다.
표 2에 나타난 바와 같이, 병원성 세균 22종에 대한 본 발명 탱자즙의 항균활성을 페이퍼 디스크법으로 확인한 결과, 탱자즙은 공시한 전 균주에 대해 항균활성을 나타내었으며, 특히 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium zerosis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi) 등의 그람양성세균 6종, 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 등의 그람음성세균 7종에 대하여 비교적 높은 항균활성을 보였으며, 이들 균종들에 대하여 모두 뚜렷한 억제환을 나타내었다 (도 1 참조).
한편, 성숙과인 탱자즙을 기능성 식품으로 직접 이용할 수 있는 가능성을 제시하기 위하여 식중독 원인균을 포함한 병원성 세균을 대상으로 항균활성을 검색하여 본 결과 다양한 그람양성 세균과 그람음성 세균에 항균활성을 나타내어 비교적 넓은 범위의 항균 스펙트럼을 나타내었다. 특히 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi)의 그람양성균 2종, 4종의 비브리오 균주 및 예르시니아 엔테로콜리티카 등에는 15 mm 이상의 억제환을 형성하여 높은 항균성을 나타내었다.
탱자즙의 병원성 미생물에 대한 항균 활성
균주 탱자즙
그람 양성균 Bacillus cereusATCC 11778 Bacillus subtilisATCC 17686 Corynebacterium zerosis ATCC 9755 Listeria monocytogenes(isolates from food) Micrococcus luteusATCC 9341 Rhodococcus equiATCC 6939 Staphylococcus aureusATCC 65389 Staphylococcus epidermidisATCC 12228 그람 음성균 Citrobacter freundiiATCC6750 Enterobacter cloacaeATCC13047 Escherichia coliATCC9637 Escherichia coliO157 (isolates from patient) Klebsiella pneumoniaeATCC10031 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 Salmonella enteritidisATCC13076 Salmonella typhi(isolates from patient) Shigella sonneiATCC9290 Vibrio alginolyticus(isolates from sea water) Vibrio cholerae(isolates from patient) Vibrio parahaemolyticus(isolates from patient) Vibrio vulnificus(isolates from patient) Yersinia enterocoliticaATCC29729 14.22a 13.3612.0412.0819.3120.38++ ++++10.2510.48+++17.0418.7818.9219.0415.04
+: 약한 활성; a: 투명환의 직경 (mm)
실험예 2: 병원성 세균에 대한 본 발명 탱자즙의 최소억제 농도
공시균에 대한 본 발명 탱자즙의 최소억제농도(MIC, minimum inhibitory concentration)를 확인하기 위하여 10%, 5%, 2.5%, 1.25%, 0.625% 및 0.313%가 되도록 탱자즙을 첨가한 뮤엘러 힌톤 아가에 조제된 세균현탁액을 Steers 등(Steers, W., E. L. Flotz and B. S. Grabes. 1969. An inocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiot. Chemother., 2: 307-311)의 방법에 따라 복합 접종기(multiple inoculator)로 접종한 다음, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 탱자즙의 최소억제농도는 탱자즙을 포함한 평판배지에서 균이 성장하지 않는 최소농도로 결정하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 공시된 22종의 병원성 세균에 대한 탱자즙의 최소억제농도를 조사한 결과, 전 공시균은 10% 및 5% 농도가 첨가된 배지에서 성장하지 못한 반면, 0.625%이하의 농도에서는 모두 성장하였다. 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토제네스, 마이크로코커스 루테우스, 로도코커스 에퀴, 스타필로코커스 에피더미스, 시트로박터 프레운디 및 슈도모나스 아에루기노사 등의 세균들에 대한 탱자즙의 최소억제농도는 2.5%였으며, 비브리오 콜레라에, 비브리오 파라헤모리티쿠스, 비브리오 불니피쿠스 및 예르시니아 엔테로콜리티카 등의 세균들에 대한 탱자즙의 최소억제농도는 1.25%로 다소 낮았다. 상기의 결과는 비브리오 균주와 예르시니아 엔테로콜리티카 등은 다른 병원성 균종보다 탱자즙에 대하여 감수성이 높다는 것을 의미하며, 탱자즙을 이용하여 이와 같은 균종들을 제거할 수 있는 기능성 식품 및 천연살균제의 개발 가능성을 시사하여 준다.
탱자즙의 병원성 미생물에 대한 최소억제농도(MIC)
균주 탱자즙의 최소억제농도(%)
10.0 5.0 2.5 1.25 0.625 0.313
Bacillus cereusATCC 11778 Bacillus subtilisATCC 17686 Corynebacterium zerosis ATCC 9755 Listeria monocytogenes(isolates from food) Micrococcus luteusATCC 9341 Rhodococcus equiATCC 6939 Staphylococcus aureusATCC 65389 Staphylococcus epidermidisATCC 12228 Citrobacter freundii ATCC6750 Enterobacter cloacaeATCC13047 Escherichia coliATCC9637 Escherichia coliO157 (isolates from patient) Klebsiella pneumoniaeATCC10031 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 Salmonella enteritidisATCC13076 Salmonella typhi(isolates from patient) Shigella sonneiATCC9290 Vibrio alginolyticus(isolates from sea water) Vibrio cholerae(isolates from patient) Vibrio parahaemolyticus(isolates from patient) Vibrio vulnificus(isolates from patient) Yersinia enterocoliticaATCC29729 ---------------------- - - - -- - -- - - - - - - - ------- - ++ - - - + - - ++++ - ++ - - ---- ++++++++++++++++++ - - - - ++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++
진하게 표시된 부분은 각 세균의 최소억제농도를 말한다.
+: 생장; -: 없음
실시예 3: 본 발명 탱자즙의 열 안정성
본 발명 탱자즙의 항균성이 열처리에 의해 어떠한 영향을 받는지 알아보기 위해, 비브리오 콜레라에를 지시균주(indicator strain)로 사용하여 실시하였다. 본 발명 탱자즙을 30℃, 50℃, 100℃ 및 121℃에서 각각 15분간 처리하여 페이퍼 디스크법으로 항균활성을 측정한 다음, 열처리하지 않은 탱자즙의 항균활성과 비교하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명 탱자즙을 온도별로 열처리한 다음 비브리오 콜레라에를 대상으로 항균활성에 대한 안정성을 확인한 결과, 30℃, 50℃, 100℃ 및 121℃에서 15분간 열처리한 각 탱자즙의 비브리오 콜레라에에 대한 항균성은 열처리하지 않은 탱자즙의 항균성과 동일한 결과를 나타내어 열에 대하여 매우 안정한 것으로 확인되었다. 항균성 물질의 열에 대한 안정성은 기능성 식품 개발에 중요한 요소 중의 하나가 된다. 식품의 안전성 측면에서 살균되어져야 하는 기능성 식품일 경우, 가열 살균함으로써 특정 기능이 소실되어 버린다면 기능성 식품으로서의 의의가 없어지기 때문에 열 안정성은 매우 중요한 의미를 갖는다. 또한, 다양한 온도로 가열 처리한 탱자즙은 비브리오 콜레라에 뿐만 아니라 공시된 나머지 21종의 병원성 세균에 대해서도 가열 처리되지 않은 탱자즙의 항균활성과 비교하여 동일한 결과를 나타내었다 (미도시됨).
본 발명은 항균활성을 가지는 탱자유래의 천연화합물에 관한 것으로, 본 발명 탱자즙은 병원성의 그람양성세균 및 그람음성세균에 대해 비교적 높은 항균활성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 탱자유래의 천연화합물은 열처리하여도 병원성 세균에 대한 항균성은 변하지 않아 열에 대하여 매우 안정하므로 본 발명 탱자유래의 천연화합물을 유효성분으로 하는 천연항균제를 포함한 기능성 제품에 사용될 수 있어 기능성 제품산업상 매우 유용한 발명이다.
도 1은 페이퍼 디스크법을 이용한 본 발명 탱자유래의 천연화합물의 병원성 세균에 대한 항균활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 탱자유래의 천연화합물의 항균활성의 열에 대한 안정성을 그래프로 나타낸 것이다.

Claims (2)

  1. 완숙한 탱자를 과피부분을 제외한 후 착즙하여 착즙액을 얻고 이를 정치시킨 뒤 상층액만을 분리하여 얻은 용액을 1.25 내지 10% 첨가하여 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 세균의 성장을 저해시키는 방법.
  2. 삭제
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