WO2016171533A1 - 항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법 - Google Patents

항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법 Download PDF

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WO2016171533A1
WO2016171533A1 PCT/KR2016/004312 KR2016004312W WO2016171533A1 WO 2016171533 A1 WO2016171533 A1 WO 2016171533A1 KR 2016004312 W KR2016004312 W KR 2016004312W WO 2016171533 A1 WO2016171533 A1 WO 2016171533A1
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shuden
formula
hydrogen
methyl group
pseudane
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PCT/KR2016/004312
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김영옥
남보혜
김동균
안철민
이종석
김우중
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대한민국(관리부서:국립수산과학원)
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/20—Oxygen atoms
    • C07D215/22—Oxygen atoms attached in position 2 or 4
    • C07D215/233—Oxygen atoms attached in position 2 or 4 only one oxygen atom which is attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Definitions

  • the present invention relates to a novel microorganism having an antimicrobial activity, and more particularly to a novel microorganism having an antimicrobial activity and a sudden production method using the same.
  • 4-quinolone alkaloids are compounds that are mainly isolated from plants and microorganisms and have antimicrobial activity.
  • 2-alkyl-4 (1H) -quinolones (AQs) and 1-methyl-2-[( 4Z) -tridecenyl] -4 (1H) -quinolone and evocarpine and their structural isomers are known as Evodia.
  • rutaecarpa was isolated from Helicobacter pylori extract and reported antimicrobial activity (Hamasaki et al ., Microbiol . Immunol . 44: 9-15, 2000, Rho et al ., Biol . Pharm. Bull . 22: 1141 -1143, 1999).
  • pseudane and its derivatives are quinolones compounds so far Pseudomonas methanica , P. aeruginosa , marine Chromobacterium sp. , marine Pseudomonas sp. And sponge Suberea It has been reported in species such as creba and has been shown to show various biological antimicrobial activity and has recently been attracting attention for research on quinolone antibiotics (Heeb et al ., FEMS Microbiol. Rev. 35: 247-274. 2011).
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2011-0011968 discloses a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases or infectious diseases comprising a quinolone alkaloid compound derived from Evodia fructus as an active ingredient.
  • the present invention is to solve a number of problems including the above problems, it is an object of the present invention to provide a novel strain having excellent antimicrobial active material production capacity and a Shuden production method using the same.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a novel Pseudoalteromonas sp . M2 strain deposited with accession number KCCM11518P, is provided.
  • the step of culturing the strain comprising: Extracting an ethyl acetate extract fraction from the cultured cells or culture medium; and
  • a Shuden production method comprising the step of purifying the Shuden series compound by chromatography using the extraction fraction.
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is methyl group
  • a skin whitening agent having a Shuden series compound having the following structural formula 1 or 2 as an active ingredient:
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R is hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • a cosmetic composition for skin whitening containing the Shuden series compound having the formula 1 or 2 as an active ingredient:
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R is hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • FIG. 1 is a diagram showing the molecular tree showing the molecular taxonomic location of the novel Pseudoaltermonas sp.
  • M2 of the present invention Pseudoaltermonas sp.
  • Figure 2 confirm the structure of the main component syuden (pseudane) to produce pseudo al Terre Pseudomonas in M2 (Pseudoaltermonas sp. M2) of the present invention.
  • pseudane-V bottom left
  • pseudane-se bottom right
  • base peak 6.08 minutes, 7.54 minutes
  • Figure 3 shows the structure of the novel Pseudoaltermonas sp. M2 (pseudoaltermonas sp. M2) culture extract of the present invention and the psudane derivatives and novel metabolites using LC-MS / MS.
  • Figure 4 confirms the structure of two novel substances produced by Pseudoaltermonas sp. M2 of the novel pseudoaltermonas genus of the present invention by LC-MS / MS.
  • LC-MS / MS was used to determine the structure of 2-isopentylquinolin-4-one (bottom left) and 2- (2,3-dimethylbutyl) quinolin-4-one (bottom right). The following shows the mass spectrometry and MS / MS spectral patterns of each base peak (5.99 minutes, 6.67 minutes).
  • Figure 5 is a graph confirming the structure of the two new substances produced by the novel pseudoaltermonas genus M2 ( Pseudoaltermonas sp. M2) of the present invention by 1H-NMR.
  • Figure 6 is a photograph observing the antimicrobial activity against the fish pathogenic microorganisms strain Pseudoaltermonas sp. M2 of the novel Pseudoaltermonas of the present invention.
  • Figure 7 is a graph showing the cytotoxicity (A) and melanin synthesis inhibitory activity (B) of the Shuden series compounds according to an embodiment of the present invention.
  • Red dullfish ( Halocynthia) aurantium is one of the primary color animals, the off-white river, and it is called sea peach because it has a peach-like form. It is mainly distributed in the Japanese Hokkaido, the Bering Sea, the Alaska Peninsula, the northern coast of Canada, and the Korean East Coast. The spawning season is known between September and December The habitats on the east coast of Korea are attached to rocks or artificial reefs and distributed in colonies, with a depth of about 20 to 100 m.
  • Pseudoaltermonas Pseudoaltermonas sp. M2 Psudoalteromonas is an excellent antibacterial secondary metabolite production from red sea urchin gut on the east coast. sp . The strain was finally selected as a new species of the genus).
  • pseudane refers to a quinoline derivative having the general formula of 2-n-alkyl-4-hydroxyquinoline, which has antibacterial activity secreted by Pseudomonas genus.
  • a novel Pseudoaltermonas genus M2 ( Psudoalteromonas) deposited with accession number KCCM11518P sp . M2) strains are provided.
  • the strain has a nucleic acid sequence in which 16S rDNA is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the step of culturing the strain comprising: Extracting an ethyl acetate extract fraction from the cultured cells or culture medium; and
  • a Shuden production method comprising the step of purifying the Shuden series compound by chromatography using the extraction fraction.
  • the Shuden series compound may be Shuden-IV, VI, VII, VIII, VIII, 2-isopentylquinolin-4-one or 2- (2,3-dimethylbutyl) quinolin-4-one.
  • the chromatography may be high performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography (LC), gas chromatography (GC), paper chromatography (PC), or ultra performance liquid chromatography (UPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC liquid chromatography
  • GC gas chromatography
  • PC paper chromatography
  • UPLC ultra performance liquid chromatography
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is methyl group
  • a skin whitening agent having a Shuden series compound having the following structural formula 1 or 2 as an active ingredient:
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R is hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • a cosmetic composition for skin whitening containing the Shuden series compound having the formula 1 or 2 as an active ingredient:
  • R 1 is hydrogen or methyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R is hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • the present inventors secured indigenous microorganisms from the red sea urchin gut on the east coast and selected and identified strain M2 with excellent antimicrobial activity secondary metabolite production ability among the obtained microorganisms.
  • Pseudoaltermonas sp. M2 From the newly isolated Pseudoaltermonas sp. M2, the main components of the secondary metabolite were identified as pseudane and its derivatives by LC-MS / MS and NMR analysis.
  • the present invention has been completed by performing antimicrobial activity.
  • the marine broth 2261 (Difco) to which 0.3% yeast extract (Difco) and 0.5% protease peptone (Difco) were added, and red sea urchin (Donghae Gangneung) intestine was plated on agar medium for about 5 days at 20 ° C.
  • agar medium for about 5 days at 20 ° C.
  • 400 morphologically different strains were selected first. After incubating the strain for 48 hours in YPM liquid medium, the culture supernatant was concentrated 10 times and Vibrio was measured for antimicrobial activity.
  • Anguillarum bacteria were plated on BHI agar medium, 50 ⁇ l of the concentrated culture supernatant was dispensed on 0.8 cm paper-disk, and then low strains were formed to select 10 strains showing strong antibacterial activity.
  • the selected strains were obtained by pure passage through several passages in Marine agar medium, named M2, and the culture solution was extracted and subjected to liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • the nucleic acid sequence for the 16S rRNA gene sequence was determined using the BLAST program (SEQ ID NO: 1), and the sequence and the known sequence
  • SEQ ID NO: 1 the sequence and the known sequence
  • the M2 strain is Psudoalteromonas sp.) and Psudoalteromonas compared to other strains of this genus prydzensis with 98.69%, Psudoalteromonas atlantica with 98.38% and Psudoalterpmonas 98.33% homology with espejiana (Fig. 2).
  • the isolated strain is Pseudoalteromonas Pseudoaltermonas sp. M2), which was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on February 6, 2014, received accession number KCCM11518P, and the 16S rDNA sequence of the strain was registered with GenBank on 00 00 2014 (GenBank). Access number: KJ407077).
  • the syuden (pseudane) extracts were produced from the separation o a pseudo identification al Terre Pseudomonas genus M2 according to one embodiment of the present invention was prepared.
  • inoculate M2 in Pseudo-Altermonas to 50 ml of marine broth 2261 (Difco) to which 0.3% yeast extract (Difco) and 0.5% proteose peptone (Difco) were added, and then, at 20 ° C. and 200 rpm. Incubated for 48 hours with reciprocating shaking. The culture solution was centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes to separate the medium supernatant and the microorganism. The medium supernatant was extracted three times with the same amount of ethyl acetate and shaken to extract the ethyl acetate soluble part, and the extract was extracted in a 50 ° C. water bath. Concentrated under reduced pressure.
  • the yield of pseudane series extract obtained by the above method was confirmed to be about 90 mg / L.
  • Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS) was performed to identify the components of the culture extract of Pseudo-altermonas M2 prepared in Example 3.
  • LC-MS / MS analysis conditions were carried out LC at a rate of 0.4 ml / min using acetonitrile and water containing 0.1% formic acid as a mobile phase, the mass spectrometer (Finnigan LTQ-Orbitrap XL system) ) And electrospray ionzation (ESI) ionization methods were used.
  • LC-MS / MS analysis of the culture extract showed a maximum absorption wavelength of 244 nm, and nine peaks showing the same maximum absorption wavelength were identified. The nine component peaks were obtained by mass spectrometry.
  • the base peak and its fragmentation pattern were respectively Shuden-IV (5.31 min; m / z 202, [M + H] + ), 2-isopentylquinolin-4-one. (5.59 min; m / z 216 [M + H] + ), Shuden-V (6.08 min; m / z 216, [M + H] + ), 2- (2,3-dimethylbutyl) quinolin-4-one (6.67 min; m / z 230 [M + H] + ), Shuden-VI (6.83 min; m / z 230, [M + H] + ), Shuden-Jap (7.54 min; m / z 244, [M + H] + ), Shuden-VIII (8.28 min; m / z 258, [M + H] + ), Shuden-IX (8.98 min; m / z 272, [M + H] + ) and Shuden-X ( 9.71 min
  • Example 5 from strain Shuden ( pseudane ) Series tablets
  • Purden series extract was purified from Pseudo-Altermonas genus M2 isolated according to one embodiment of the present invention.
  • FT-IR (KBr, cm -1 ): 3430, 3255, 3067, 2954, 2872, 2784, 1641, 1596, 1548, 1504, 1473, 1442, 1355, 1322, 1248, 1174, 1137, 1112, 1024, 839 , 760
  • the novel strain isolated from the gut gut according to one embodiment of the present invention was identified as quinolones compound (pseudane) and its derivatives.
  • the pseudodene (pseudane) and its derivatives can be used as a natural antibiotic since it has excellent biological antimicrobial activity.
  • the present inventors analyzed their cytotoxicity and whitening activity to investigate the use of the isolated Shuden series compounds as cosmetic materials.
  • cytotoxicity was performed through crystal violet staining.
  • Melan-A a mouse melanoma cell line, was cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum and with antibiotics (100 ⁇ g / ml streptomycin and 100 ⁇ g / mldml penicillin).
  • the inventors investigated the melanin synthesis inhibitory ability to determine whether the Shuden series compounds according to an embodiment of the present invention can be used as a whitening agent or cosmetic raw material for skin whitening.
  • the Melan-A cells were seeded in each well of a 24-well plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells, and then cultured overnight. Then, the cells were further cultured for 4 days after replacing with fresh medium containing various concentrations of the test sudden compound. After incubation, cells were washed with PBS, lysed with 250 ⁇ l of 0.85 N KOH solution and the lysates were transferred to 96 well plates. Melanin content was quantified by measuring absorbance at 405 nm.
  • Fig. 8 (B) the concentration-dependent melanin synthesis inhibitory ability was confirmed in all test Sudden compounds.
  • 2- (2,3-dimethylbutyl) quinolin-4-one, pseudane-VI and pseudane-VII showed melanin synthesis inhibition of 23.0%, 28.2% and 42.7%, respectively.
  • pseudane-VII showed the highest melanin synthesis inhibition of 42.7% among the test Shuden compounds at a concentration of 8 ⁇ g / ml.
  • ginsenosides extracted from ginseng leaves showed 35.5% melanin synthesis inhibition at a concentration of 80 ⁇ M (Lee et al ., Int . J. Mol. Sci . 16: 1677-1690, (Cong et al ., Biol . Pharm . Bull . 31: 946-948, 2008), reported that cinnamic acid extracted from cinnamon and ginseng has 29% melanin synthesis inhibitory activity at high concentrations of 500 ⁇ M. Very few anti-melanin synthetic compounds are present. Compared to ginsenosides and cinnamic acid, pseudane-VII exhibited very strong melanin synthesis inhibition at concentrations of 8-33 ⁇ M.
  • the Shuden-based compound according to an embodiment of the present invention in particular pseudane-VII can be said to be highly developed as a useful whitening material.
  • the microorganism according to an embodiment of the present invention and the Shuden series compounds showing excellent antimicrobial activity produced therefrom may be usefully used as an animal feed additive as well as medicines such as antibiotics.
  • SEQ ID NO: 1 is a novel pseudoaltermonas genus M2 ( Psudoalteromonas) which is a microorganism according to an embodiment of the present invention.
  • sp . M2 is a nucleic acid sequence of 16S rDNA of strain.

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Abstract

본 발명은 붉은멍게 내장시료로부터 분리된 항균활성물질 생산능이 우수한 미생물인 신규 슈도알테르모나스 속 M2 균주, 상기 균주로부터 생산되는 슈덴 계열 화합물 및 상기 슈덴계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백제를 제공한다.

Description

항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법
본 발명은 항균활성을 갖는 신규 미생물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법에 관한 것이다.
4-퀴놀론 알칼로이드(quinolone alkaloid)는 주로 식물과 미생물로부터 분리되고, 항균활성을 갖고 있는 화합물로, 예를 들어 2-alkyl-4(1H)-quinolones(AQs) 와 1-methyl-2-[(4Z)-tridecenyl]-4(1H)-quinolone 및 에보카파인(evocarpine)과 이들의 구조이성질체(structural isomer)들은 오수유(Evodia rutaecarpa) 추출물에서 분리되어 헬리코박터(Helicobacter pylori)에 대한 항균활성이 보고되었다(Hamasaki et al., Microbiol . Immunol. 44:9-15, 2000, Rho et al., Biol . Pharm. Bull. 22:1141-1143, 1999). 특히, 슈덴(pseudane)과 그 유도체들은 퀴놀론계(quinolones) 화합물로써 지금까지 Pseudomonas methanica , P. aeruginosa , marine Chromobacterium sp., marine Pseudomonas sp. 및 sponge Suberea creba 등의 종에서 보고되었고 다양한 생물학적 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 최근까지 퀴놀론계 항생제 연구 등으로 관심을 받아오고 있다(Heeb et al., FEMS Microbiol. Rev. 35: 247-274. 2011).
대한민국 공개특허 제2011-0011968호는 오수유(Evodia fructus)로부터 유래된 퀴놀론 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있다.
그러나 아직까지 자연계에서 발굴된 천연 항생물질은 그 종류가 한정되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 항균활성물질 생산능이 우수한 신규 균주와 그를 이용한 슈덴 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 기탁번호 KCCM11518P로 기탁된, 신규 슈도알테르모나스 속 M2(Psudoalteromonas sp. M2) 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균체 또는 배양액으로부터 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출 분획을 추출하는 단계; 및
상기 추출 분획을 이용하여 크로마토그래피로 슈덴 계열 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 슈덴 생산방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1을 갖는, 신규 화합물이 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000001
(구조식 1)
(상기 구조식 1에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백제가 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000002
(구조식 1),
Figure PCTKR2016004312-appb-I000003
(구조식 2)
(상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000004
(구조식 1),
Figure PCTKR2016004312-appb-I000005
(구조식 2)
(상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 해양생물체로 부터 분리한 미생물을 이용하여 우수한 항균활성을 나타내는 슈덴 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 신규한 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2)의 분자 분류학적 위치를 보여주는 분자계통수를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2)이 생산하는 슈덴(pseudane) 주성분의 구조를 확인한 것이다. LC-MS/MS를 이용하여 pseudane-V(왼쪽 하단)과 pseudane-Ⅶ(오른쪽 하단)의 구조를 결정한 결과로서, 위는 크로마토그램 결과이고, 아래는 각각의 기초피크(6.08분, 7.54분)의 질량분석 스펙트럼과 MS/MS 스펙트럼 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규한 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2) 배양액 추출물에 포함된 슈덴(psudane) 유도체와 신규한 대사체들을 LC-MS/MS를 이용하여 구조를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 신규한 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2) 이 생산하는 신규물질 2종의 구조를 LC-MS/MS로 확인한 것이다. LC-MS/MS를 이용하여 2-isopentylquinolin-4-one(왼쪽하단)과 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one(오른쪽 하단)의 구조를 결정한 결과로서, 위는 크로마토그램 결과이고, 아래는 각각의 기초피크(5.99분, 6.67분)의 질량분석 스펙트럼과 MS/MS 스펙트럼 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 신규한 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2)이 생산하는 신규물질 2종의 구조를 1H-NMR로 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 신규한 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2)균주의 어류 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 슈덴 계열 화합물의 세포독성(A) 및 멜라닌 합성 저해능(B)를 나타낸 그래프이다.
A: pseudane-IV, B: 2-isopentylquinolin-4-one, C: pseudane-Ⅴ, D: 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one, E: pseudane-Ⅵ, F: pseudane-Ⅶ, G: pseudane-VⅢ, H: pseudane-Ⅸ.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "붉은멍게(Halocynthia aurantium)"는 원색동물문 미색강 측성멍게목 우렁쉥이과에 속하며 영명으로는 복숭아와 유사한 형태를 보이기 때문에 바다복숭아로 불리고 있다. 일본 북해도, 미국 베링해, 알래스카 반도, 캐나다 북부 연안과 한국 동해안에 주로 분포하고 있으며 산란기는 9월과 12월 사이에 알려져 있다. 우리나라 동해안에서의 서식형태는 암반이나 인공어초 등에 부착하여 군락으로 분포하며, 서식수심은 대략 20 ~ 100 m 정도로 나타난다.
본 문서에서 사용되는 용어 "슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2)"는 동해안의 붉은멍게 내장으로부터 분리한 미생물 중 항균활성 이차대사산물 생산능이 우수한 슈도알테르모나스(Psudoalteromonas sp.)속의 신규 종으로 최종적으로 선별된 균주이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "슈덴(pseudane)"은 슈도모나스 속(Pseudomonas) 속 세균이 분비하는 항균활성을 갖는 2-n-alkyl-4-hydroxyquinoline의 일반식을 가진 수산화퀴놀린 유도체를 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 기탁번호 KCCM11518P로 기탁된, 신규 슈도알테르모나스 속 M2(Psudoalteromonas sp. M2) 균주가 제공된다.
상기 균주는 16S rDNA가 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 배양하는 단계; 상기 배양된 균체 또는 배양액으로부터 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출 분획을 추출하는 단계; 및
상기 추출 분획을 이용하여 크로마토그래피로 슈덴 계열 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 슈덴 생산방법이 제공된다.
상기 슈덴 계열 화합물은 슈덴-Ⅳ, Ⅵ, VII, VⅢ, Ⅸ, Ⅹ, 2-isopentylquinolin-4-one 또는 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one일 수 있다.
상기 크로마토그래피는 HPLC(high performance liquid chromatography), LC(liquid chromatography), GC(gas chromatography), PC(paper chromatography) 또는 UPLC(ultra performance liquid chromatography)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1을 갖는, 신규 화합물이 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000006
(구조식 1)
(상기 구조식 1에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백제가 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000007
(구조식 1),
Figure PCTKR2016004312-appb-I000008
(구조식 2)
(상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이 제공된다:
Figure PCTKR2016004312-appb-I000009
(구조식 1),
(구조식 2)
(상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
본 발명자들은 동해안의 붉은멍게 내장으로부터 토착 미생물을 확보하고 확보된 미생물중 항균활성 이차대사산물 생산능이 우수한 균주 M2을 선별하여 동정한 결과, 기존에 알려지지 않은 새로운 미생물 종임을 확인하고 슈도알테르모나스 속 (Pseudoaltermonas sp. M2)라 명명하였다. 신규로 분리한 슈도알테르모나스 속 (Pseudoaltermonas sp. M2)로부터 이차대사산물의 주성분이 슈덴(pseudane)류와 그 유도체임을 LC-MS/MS 및 NMR 분석법으로 확인하였고, 이들 이차대사산물을 이용하여 항균활성을 수행함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 신규 균주의 분리
본 발명의 일 실시예에 따라 붉은 멍게로부터 항균활성 이차대사산물의 생산능이 우수한 신규 미생물을 분리하였다.
구체적으로, 0.3% 효모 추출물(Difco)과 0.5% 프로테오스 펩톤(Difco)이 첨가된 marine broth 2261(Difco)에 한천 배지에 붉은 멍게(동해 강릉) 내장을 도말한 후 20℃에서 약 5일간 배양하여 형태적으로 다른 400 균주를 1차 선별하였다. 상기 균주를 YPM 액체 배지에서 48시간 배양 후 배양상등액을 10배 농축하였고 항균활성 측정을 위하여 Vibrio anguillarum 균을 BHI 한천 배지에 도말하고 0.8 cm Paper-disk에 상기 농축 배양상등액 50 ㎕를 분주한 후 저지대를 형성하여 항균활성을 강하게 나타내는 10균주를 2차 선별하였다. 상기 선별된 균주를 Marine agar 배지에서 여러 번의 계대배양을 통해 순수분리 균주를 얻은 후 M2로 명명하였고 배양액을 추출하여 액체크로마토그래피 질량분석(LC-MS/MS)을 수행하였다.
그 결과, 주성분으로 슈덴-V(m/z 216, [M+H]+)와 슈덴-Ⅶ(m/z 243, [M+H]+)의 생산능이 우수한 M2 균주를 최종적으로 선별하였다(도 1).
실시예 2: 상동성 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 M2 균주의 염기서열을 이용하여 상동성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 선별된 M2 균주를 순수 배양하고 16S rDNA를 분리한 후, BLAST 프로그램을 이용하여 16S rRNA 유전자 염기서열에 대한 핵산서열을 결정하였고(서열번호 1), 해당 서열과 종래의 알려진 서열과의 상동성(homology)을 비교하기 위하여 분자계통분류학적 분석을 수행한 결과, 상기 M2 균주는 슈도알테르모나스 속(Psudoalteromonas sp.)에 속하는 균주로서 이 속의 다른 균주들과 비교했을 때, Psudoalteromonas prydzensis와 98.69%, Psudoalteromonas atlantica와 98.38% 및 Psudoalterpmonas espejiana와 98.33%의 상동성을 나타내었다(도 2). 따라서 상기 분리한 균주를 슈도알테르모나스 속 M2(Psudoalteromonas sp. M2)로 명명하였고 이를 2014년 2월 6일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여, 수탁번호 KCCM11518P를 부여받았으며 상기 균주의 16S rDNA 서열을 2014년 00월 00일자로 GenBank에 등록하였다(GenBank 접근 번호: KJ407077).
실시예 3: 배양액 추출물의 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 분리ㅇ동정한 슈도알테르모나스 속 M2로부터 생산되는 슈덴(pseudane) 추출물을 제조하였다.
구체적으로, 0.3% 효모 추출물(Difco)과 0.5% 프로테오스 펩톤(Difco)이 첨가된 marine broth 2261(Difco) 50 ml에 슈도알테르모나스 속 M2를 접종한 후 20℃, 200 rpm의 조건으로 왕복진탕하면서 48시간동안 배양하였다. 상기 배양액을 7000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배지상등액과 미생물로 분리하였고 배지 상등액은 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 3회 진탕 추출하여 에틸아세테이트 가용부를 추출하였고, 추출액을 50℃의 수조에서 감압 농축하였다.
그 결과, 상기의 방법으로 얻어진 슈덴(pseudane) 계열 추출물의 생산량은 약 90 mg/L로 확인되었다.
실시예 4: 배양액 추출물의 구성성분 확인
상기 실시예 3에서 제조된 슈도알테르모나스 속 M2의 배양액추출물의 구성성분을 확인하기 위하여 액체크로마토그래피 질량분석법(LC-MS/MS)을 수행하였다.
구체적으로, LC-MS/MS 분석 조건은 이동상으로 0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 이용하여 0.4 ml/min의 속도로 LC를 수행하였고, 질량분석기(Finnigan LTQ-Orbitrap XL system)와 electrospray ionzation(ESI) 이온화 방법을 사용하였다. 상기 배양액추출물의 LC-MS/MS 분석을 통하여 최대 흡수파장은 244 nm로 확인되었으며, 동일한 최대 흡수파장을 나타내는 9개의 피크를 확인하였다. 상기 9개의 성분 피크는 질량분석법을 통하여 기초피크 및 그 단편화 패턴(MS/MS)이 각각 슈덴-IV(5.31분; m/z 202, [M+H]+), 2-isopentylquinolin-4-one(5.59분; m/z 216[M+H]+), 슈덴-V(6.08분; m/z 216, [M+H]+), 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one(6.67분; m/z 230[M+H]+), 슈덴-VI(6.83분; m/z 230, [M+H]+), 슈덴-Ⅶ(7.54분; m/z 244, [M+H]+), 슈덴-VⅢ(8.28분; m/z 258, [M+H]+), 슈덴-IX(8.98분; m/z 272, [M+H]+) 및 슈덴-X(9.71분; m/z 286, [M+H]+)와 일치함을 확인하였다(도 3). 또한, 지금까지 보고되어진 슈덴 생산균주와는 달리 이성질체(isomer)인 2-isopentylquinolin-4-one과 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one 물질의 생산 확인을 통해 슈도알테르모나스 속 M2의 고유한 특성을 확인하였다(도 4).
실시예 5: 균주로부터 슈덴 ( pseudane ) 계열 정제
본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 슈도알테르모나스 속 M2로부터 슈덴 계열 추출물을 정제하였다.
구체적으로 상기 실시예 3에서 제조된 슈덴 계열 추출물 0.5 g을 메탄올 2.5 ml에 용해시킨 후 분리정제용 HPLC 컬럼(Kromasil C18 HPLC Column(10 ㎛, 250 x 30 mm), Sigma-aldrich)을 이용한 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 하기와 같은 두 개의 주성분을 분리하였고 하기 화학식 1과 2에 표시하였다.
Figure PCTKR2016004312-appb-C000001
① 물질 성상: 흰색 분말
② 분자량: 215
③ 분자식: C14H17ON
④ 질량분석치: m/z 216.1382 ([M+H]+)
또한, 고 분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 216.1382{([M+H]+),(계산치; 216.1383, 오차 0.3 ppm)}으로 상기 화학식 1로 표시되는 슈덴-V 화합물(IUPAC Name: 2-Pentyl-4-quinolinol)로 판명되었다.
Figure PCTKR2016004312-appb-C000002
① 물질 성상: 흰색 분말
② 분자량: 243
③ 분자식: C16H21ON
④ 질량분석치: m/z 244.1693 ([M+H]+)
또한, 고 분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 244.1693{([M+H]+),(계산치; 244.1696, 오차 1.0 ppm)}으로 상기 화학식 2로 표시되는 슈덴-Ⅶ 화합물(IUPAC Name: 2-Heptyl-4(1H)-quinolinone)로 판명되었다.
실시예 6: 슈덴 계열 신규물질 구조동정
상기 실시예 3에서 제조된 항균활성 이차대사산물 추출물로부터 LC-MS/MS 분석을 통해 상기 실시예 5에서 동정한 주성분 외에 슈덴 유도체 시리즈(슈덴-IV, VI, VⅢ, Ⅸ 및 Ⅹ)의 구조를 동정하였고 LC-MS/MS 분석과 1H-NMR 분석을 통해 신규한 슈덴 유도체인 2-isopentylquinolin-4-one과 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one 구조를 동정하였다(도 5). 상기 신규 슈덴 유도체의 구조는 각각 하기 화학식 3 및 4에 표시하였다.
Figure PCTKR2016004312-appb-C000003
① 물질 성상: 흰색 분말
② 분자량: 215
③ 분자식: C14H17ON
④ 질량분석치: m/z 216.1389 ([M+H]+)
⑤ 핵자기공명(NMR) 분석치
1H-NMR(400 MHz, CD2OD) d 8.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 16.4 Hz, 1H), 6.22 (s, 1H), 2.74 (m, 2H), 1.68 (m, 3H), 0.99 (d, J = 6 Hz, 6H)
⑥ 적외선흡수분광법(FT-IR) 분석치
FT-IR(KBr, cm-1) : 3430, 3255, 3067, 2954, 2872, 2784, 1641, 1596, 1548, 1504, 1473, 1442, 1355, 1322, 1248, 1174, 1137, 1112, 1024, 839, 760
또한, 고 분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 216.1389 {([M+H]+), 계산치; 216.1383, 오차 0.3 ppm)}과 H-NMR 분석으로 상기 화학식 3으로 표시되는 신규화합물 2-isopentylquinolin-4-one로 판명되었다.
Figure PCTKR2016004312-appb-C000004
① 물질 성상: 흰색 분말
② 분자량: 229
③ 분자식: C15H19ON
④ 질량분석치: m/z 230.1537 ([M+H]+)
⑤ 핵자기공명(NMR) 분석치
1H-NMR(400 MHz, CD2OD) d 8.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.68 - 7.74 (m, 1 H), 7.63 (s, 1 H), 7.39 - 7.45 (m, 1 H), 6.24 (s, 1 H), 2.79 - 2.91 (m, 1 H), 2.38 - 2.52 (m, 1 H), 1.92 (br. s., 1 H), 1.64 - 1.76 (m, 1 H), 0.99 (dd, J =11.0 Hz, 6.78 Hz, 6 H), 0.89 (d, J = 6.78 Hz, 3 H)
⑥ 적외선흡수분광법(FT-IR) 분석치
FT-IR(KBr, cm-1) : 3426, 3252, 3064, 2959, 2876, 2795, 1639, 1595, 1549, 1504, 1472, 1442, 1354, 1322, 1251, 1217, 1176, 1138, 1112, 1027, 839, 763
또한, 고 분해능 질량분석(HR-MS) 스펙트럼 분석결과, 질량 분석치 230.1537 {([M+H]+), 계산치; 230.1539, 오차 0.8 ppm}과 H-NMR 분석으로 상기 화학식 4로 표시되는 신규화합물 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one로 판명되었다.
실시예 7: 슈덴 계열 신규물질의 항균 활성 분석
실시예 6에서 동정한 신규 슈덴 유도체인 2-isopentylquinolin-4-one과 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one의 어류 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 할로테스트를 통해 분석하였다. 구체적으로, 어류 병원성 미생물인 Vibrio anguillarum를 BHI 배지에서 배양시킨 후, 상기 배지가 함유된 한천 배지위에 도말하고, 0.8 cm 직경의 종이 디스크를 올린 다음, 정제 또는 합성한 50 mM 2-isopentylquinolin-4-one과 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one을 각각 60 ㎕ 정도 떨어뜨렸다. 그 후, 30℃에서 24시간 배양하고 관찰한 결과, 투명환이 형성되어 V. anquillarum에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 6).
상기 결과들로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 멍게 내장으로부터 분리한 신규 균주는 퀴놀론계(quinolones) 화합물인 슈덴(pseudane)과 그 유도체로 확인되었다. 결론적으로 상기 슈덴(pseudane)과 그 유도체는 생물학적 항균활성이 우수하므로 천연 항생물질로 사용할 수 있다.
실시예 8: 슈덴계열 물질의 세포독성 및 미백활성
본 발명자들은 상기 분리된 슈덴계열 화합물의 화장품 소재로의 사용가능성을 조사하기 위해, 이들의 세포독성 및 미백활성을 분석하였다.
구체적으로 세포독성은 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 수행하였다. 마우스 흑색종 세포주인 Melan-A을 10% 우태아혈청이 보충되고 항생제(100 μg/ml의 스트렙토마이신 및 100 μg/mldml 페니실린)가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하다 피검 슈덴 화합물(pseudane-IV, 2-isopentylquinolin-4-one, pseudane-V, 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one, pseudane-Ⅵ, pseudane-Ⅶ, pseudane-VⅢ 또는 pseudane-Ⅸ)을 2 내지 8 μg/ml의 농도로 처리한 후 72시간 경과 후 배양배지를 세거하고 10% 에탄올 수용액에 용해된 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 대체한 후 5분간 상온에서 반응시킨 후, PBS로 세 번 세척하였다. 부착되어 있는 세포에 남아 ㅇlf 있는 크리스탈 바이올렛 염색을 95% 에탄올 수용액으로 추출한 후 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 8(A)에서 나타난 바와 같이, 모든 피검 슈덴 화합물의 경우 8μg/ml의 농도까지 세포독성이 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 슈덴 계열 화합물들은 화장품 원료로 사용하기에 적합함을 알 수 있다.
이어, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 슈덴 계열 화합물들이 미백제나 피부 미백용 화장품 원료로 사용가능한지 확인하기 위해, 멜라닌 합성 저해능을 조사하였다.
구체적으로, 상기 Melan-A 세포를 24-웰 플레이트의 각웰에 1×105 세포의 밀도로 파종한 후, 밤새 배양하여 부착시켰다. 그런다음, 다양한 농도의 피검 슈덴 화합물이 포함된 신선한 배지로 교체한 후 4일간 추가적으로 세포배양을 실시하였다. 배양을 종료한 후 세포를 PBS로 세척한 후, 0.85 N KOH 용액 250 μl로 용해시키고 용해물을 96웰 플레이트로 이동시켰다. 멜라닌 함량은 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 정량하였다.
그 결과, 도 8(B)에서 나타난 바와 같이, 모든 피검 슈덴 화합물에서 농도의존적인 멜라닌 합성 저해능이 확인되었다. 8가지 화합물 중에서, 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one, pseudane-Ⅵ 및 pseudane-Ⅶ의 경우 각각 23.0%, 28.2% 및 42.7%의 멜라닌 합성 저해능을 나타냈다. 특히, pseudane-Ⅶ은 8 μg/ml의 농도에서 피검 슈덴화합물 중 가장 높은 42.7%의 멜라닌 합성 저해능을 나타냈다. 지금까지 인삼 잎에서 추출된 진세노사이드의 경우 80 μM의 농도에서 35.5%의 멜라닌 합성 저해능을 나타낸 것으로 보고된 바 있고(Lee et al., Int . J. Mol. Sci. 16: 1677-1690, 2015), 계피 및 인삼에서 추출되는 신남산이 500 μM의 고농도에서 29%의 멜라닌 합성 저해능을 가지고 있는 것으로 보고되는(Kong et al., Biol . Pharm . Bull. 31: 946-948, 2008) 등 항-멜라닌 합성 화합물은 극소수인 것이 현실이다. 진세노사이드와 신남산과 비교하여, pseudane-Ⅶ는 8-33 μM의 농도에서 매우 강한 멜라닌 합성 저해능을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 슈덴 계열 화합물, 특히 pseudane-Ⅶ는 매우 유용한 미백소재로 개발될 가능성이 크다고 할 수 있다.
제조예 : 화장품의 제조
제조예 1: 유연 화장수의 제조
하기 표 1과 같은 조성으로 유연 화장수(스킨)를 제조하였다.
유연화장수의 제조
원료명 중량%
1,3-부틸렌글리콜 2.0
글리세린 3.0
페닐트리메치콘 2.0
PEG-60 하이드로게네이티드 캐스터오일 0.5
에탄올 6.0
방부제 미량
향료 미량
슈덴-Ⅶ 0.0005
정제수 to 100
제조예 2: 밀크로션의 제조
하기 표 2와 같은 조성으로 밀크로션을 제조하였다.
밀크로션의 제조
원료명 중량%
1,3-부틸렌글리콜 4.0
글리세린 3.0
세타아릴알코올 0.5
폴리소르베이트 20 0.5
에탄올 1.0
방부제 미량
향료 미량
슈덴-Ⅶ 0.0005
정제수 to 100
제조예 3: 영양크림의 제조
하기 표 3과 같은 조성으로 영양크림을 제조하였다.
영양크림의 제조
원료명 중량%
트리에탄올아민 0.5
글리세린 5.0
토코페릴 아세테이트 1.0
폴리소르베이트 60 1.0
스쿠알란 5.0
하이드로게네이티드 폴리데센 5.0
마카다미아너트 오일 12.0
솔비탄세스퀴올레이트 1.0
카르복실비닐폴리머 0.2
슈덴-Ⅶ 0.0005
정제수 to 100
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미생물은 및 그로부터 생산된 우수한 항균활성을 나타내는 슈덴 계열 화합물들은 항생제 등 의약은 물론 동물 사료첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
서열번호 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물인 신규 슈도알테르모나스 속 M2(Psudoalteromonas sp. M2) 균주의 16S rDNA의 핵산서열이다.
[규칙 제26조에 의한 보정 11.05.2016]　
Figure WO-DOC-FIGURE-127

Claims (9)

  1. 기탁번호 KCCM11518P로 기탁된, 신규 슈도알테르모나스 속 M2(Psudoalteromonas sp. M2) 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    16S rDNA가 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는, 신규 슈도알테르모나스 속 M2 균주.
  3. 제1항 내지 2항의 균주를 배양하는 단계;
    상기 배양된 균체 또는 배양액으로부터 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출 분획을 추출하는 단계; 및
    상기 추출 분획을 이용하여 크로마토그래피로 슈덴 계열 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 슈덴 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 슈덴 계열 화합물은 슈덴-Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, VⅢ, Ⅸ, Ⅹ, 2-isopentylquinolin-4-one 또는 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one인, 슈덴 생산방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 크로마토그래피는 HPLC(high performance liquid chromatography), LC(liquid chromatography), GC(gas chromatography), PC(paper chromatography) 또는 UPLC(ultra performance liquid chromatography)인, 슈덴 생산방법.
  6. 하기 구조식을 갖는, 신규 화합물:
    Figure PCTKR2016004312-appb-I000012
    (상기 구조식에서 R은 수소 또는 메틸기이다).
  7. 제6항에 있어서,
    2-isopentylquinolin-4-one 또는 2-(2,3-dimethylbutyl)quinolin-4-one인, 화합물.
  8. 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백제:
    Figure PCTKR2016004312-appb-I000013
    (구조식 1),
    Figure PCTKR2016004312-appb-I000014
    (구조식 2)
    (상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
  9. 하기 구조식 1 또는 2를 갖는, 슈덴 계열 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물:
    Figure PCTKR2016004312-appb-I000015
    (구조식 1),
    Figure PCTKR2016004312-appb-I000016
    (구조식 2)
    (상기 구조식에서 R1은 수소 또는 메틸기이고, R2는 메틸기이며, R은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬기이다).
PCT/KR2016/004312 2015-04-23 2016-04-25 항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법 WO2016171533A1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101865356B1 (ko) * 2017-01-06 2018-06-07 조선대학교산학협력단 슈단-ⅶ을 유효성분으로 포함하는 염증 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물
KR102311724B1 (ko) 2017-09-15 2021-10-13 (주)아모레퍼시픽 슈도알터로모나스 펩티도라이티카의 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020068042A1 (en) * 1998-12-22 2002-06-06 Simon Alaluf Skin lightening composition
US20090227626A1 (en) * 2005-08-04 2009-09-10 Palumed S.A. Novel polyquinoline derivatives and therapeutic use thereof
WO2014163622A1 (en) * 2013-04-02 2014-10-09 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Multifunctional quinoline derivatives as anti-neurodegenerative agents

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101106287B1 (ko) 2008-02-13 2012-01-18 한국해양연구원 미생물을 이용한 항암 활성 화합물의 제조방법
KR20100131340A (ko) * 2009-06-05 2010-12-15 대한민국(농촌진흥청장) 식물병 방제능을 갖는 포몹시스 론지콜라(Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｌｏｎｇｉｃｏｌｌａ Ｓ1Ｂ4) 균주
KR101181216B1 (ko) * 2009-07-29 2012-09-07 한국생명공학연구원 오수유 추출물, 이의 분획물 또는 퀴놀론 알칼로이드계 화합물을 포함하는 약학 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020068042A1 (en) * 1998-12-22 2002-06-06 Simon Alaluf Skin lightening composition
US20090227626A1 (en) * 2005-08-04 2009-09-10 Palumed S.A. Novel polyquinoline derivatives and therapeutic use thereof
WO2014163622A1 (en) * 2013-04-02 2014-10-09 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Multifunctional quinoline derivatives as anti-neurodegenerative agents

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI [O] 4 March 2015 (2015-03-04), XP055324760, Database accession no. KJ407077.1 *
HEEB, STEPHAN ET AL.: "Quinolones: from Antibiotics to Autoinducers", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, vol. 35, no. 2, 2011, pages 247 - 274, XP055136554 *
KIM, WOO JUNG ET AL.: "Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-based Rapid Secondary-Metabolite Profiling of Marine Pseudoalteromonas sp. M2", MARINE DMGS, vol. 14, no. 1, 20 January 2016 (2016-01-20), pages 1 - 11, XP055324780 *
LEPINE, FRANCOIS ET AL.: "Electrospray/Mass Spectrometric Identification and An Alysis of 4-Hydroxy-2-Alkylquinolines (HAQs) produced by Pseudomonas Aeruginosa", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY, vol. 15, no. 6, 2004, pages 862 - 869, XP004509278 *
NAM, EUN SOOK ET AL.: "Antarctic Marine Bacterium Pseudoalteromonas sp. KNOUC808 as A Source of Cold-adapted Lactose Hydrolyzing Enzyme", BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 42, no. 3, 2011, pages 927 - 936, XP055324757 *

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