CN112341412B - 一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用，属于生物制药技术领域。该类脂肪族聚酮化合物从昆虫内生真菌来源的发酵物中分离纯化得到。该类聚酮化合物对酪氨酸酶具有较强的抑制作用，因此该类脂肪族聚酮化合物可作为酪氨酸酶抑制剂的先导化合物，并在制备酪氨酸酶抑制剂中得到应用。本发明制备的聚酮化合物，可制备成新型酶抑制剂或先导化合物，克服现有抑制剂低效、副作用大等缺点。本发明制备的聚酮化合物可以利用微生物进行发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。

Description

一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用，具体涉及从一种中国传统药材昆虫鼠妇分离得到共生真菌(Pidoplitchkoviella terricola)的大米固体发酵物中提取的一类聚酮化合物及其制备方法和应用。
背景技术
昆虫共生真菌是指来源于昆虫体表或体内的一类真菌，主要包括虫生病原真菌、虫寄生菌、以及与各种昆虫共生的共生菌。昆虫物种的多样性和分布的复杂性造成了昆虫体内共生菌的多样性，导致其次生代谢产物结构和活性的多样性。目前从昆虫共生菌代谢产物中分离得到的主要结构类型有生物碱、萜类、聚酮、甾体、多肽，同时具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制、杀虫、抗氧化活性。因此昆虫共生真菌已成为寻找新颖生物活性物质的重要来源之一。
酪氨酸酶是广泛存在于动植物体内及微生物中的一种含铜离子的氧化还原酶，这类酶具有单酚酶和双酚酶的特性，是合成黑色素及产生色斑的关键酶。酪氨酸酶的代谢功能紊乱会导致雀斑、晒斑、黄褐斑、妊娠斑及老年斑等色素沉着问题的产生。通过抑制酪氨酸酶的催化活性可以抑制黑色素的生物合成，因此，酪氨酸酶抑制剂作为黑色素抑制剂广泛应用于医药、美容和食品等行业。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用。从华山一只药用昆虫鼠妇(Phlomis umbrosa)的体内分离到真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的大米固体发酵物中提取到几个具有显著酪氨酸酶活性的脂肪族聚酮化合物和苯并吡喃酮类化合物。本发明的目的具体体现在三个方面：
1.提供具有酪氨酸酶抑制活性的脂肪族聚酮化合物piterrione C；
2.提供一种提取、分离脂肪族聚酮化合物和苯并α-吡喃酮的方法。
3.提供聚酮化合物在抑制酪氨酸酶中的应用。
其技术方案如下：
一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物，所述化合物是从昆虫内生真菌固体发酵提取物中分离得到的脂肪族聚酮化合物piterrione A-G和苯并-α-吡喃酮化合物，其结构式为：
Figure BDA0002758386790000021
一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.将从华山捕捉的一只药用昆虫鼠妇中分离、纯化得到内生真菌的菌块接种到土豆液体培养基中，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，再将培养好的液体发酵液适量倒入大米培养基中，28℃静置培养30天；
步骤2.将步骤1所得大米发酵物用甲醇浸泡两次，将真空浓缩干燥后的提取物萃取五次过滤浓缩后，真空浓缩干燥得棕色粗浸膏F；
步骤3.对步骤2所得浸膏F进行硅胶柱层析分段，采用石油醚/乙酸乙酯(50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1)和二氯甲烷/甲醇(100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16)梯度洗脱，得到7个组分F1-F7；
步骤4.对浸膏F1-F3、F6多次采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20以及反相C-18柱层析分离纯化得到含有7个新化合物的部位F1.1、F2.3、F3.2.2、F3.3.4和F6.1；
步骤5.对浸膏F1.1用高压液相色谱法(色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：乙腈/水＝18/82，流速：2.0mL/min)分离得到piterrione B保留时间tR＝16.5min；piterrione C(保留时间tR＝23.0min)。
步骤7.对浸膏F2.3用高压液相色谱法(色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝22/78，流速：2.0mL/min)分离得到piterrione E(保留时间tR＝38.3min)；piterrione F(保留时间tR＝52.4min)。
步骤8.对浸膏F3.2.2用高压液相色谱法(色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝30/70，流速：2.0mL/min)分离得到piterrione A(保留时间tR＝15.5min)；piterrione D(保留时间tR＝17.5min)；对浸膏F3.3.4用高压液正相色谱法(色谱柱：welch SiO2column,Ultimate,5μm,10×250mm)；流动相：正己烷/乙醇＝92/8，流速：2.0mL/min)分离得到dihydroaltenuene A(8)(保留时间tR＝34.3min)；dihydroaltenueneB(9)(保留时间tR＝38.5min)。
步骤9.对浸膏F6.1用高压液相色谱法(色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝15/85，流速：2.0mL/min)分离得到piterrione G(保留时间tR＝20.3min)。
进一步，步骤1中，内生真菌的分离、纯化方法具体步骤为：
先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分。将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10-1，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10-2，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌。
进一步，所述昆虫鼠妇内生真菌在PDA平板上，菌落生长缓慢，厚度中等，质地硬实，菌丝不太发达，中间凸起，成熟的菌落为灰黑色，边缘黄棕色，背面土黄色，产生深黄色色素，经形态及分子生物学鉴定为Pidoplitchkoviella terricola。
本发明所述的聚酮化合物在黑色素抑制剂制备过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明所述聚酮化合物具有显著酪氨酸酶抑制作用，因此可作为一种新型酶抑制剂先导化合物被开发利用。
与现有技术相比，本发明具有下述突出优点：
1.本发明制备的新颖聚酮化合物，可制备成新型酶抑制剂或先导化合物，克服现有抑制剂低效、副作用大等缺点。
2.本发明制备的新颖聚酮化合物可以利用微生物进行发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的分离与纯化
鼠妇采集于中国陕西省。先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分。将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10-1，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10-2，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水)上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌SF13，经分子生物学及形态学鉴定为Pidoplitchkoviella terricola，现保藏在陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学化学与药学院，保藏编号为SF13，保藏日期为2017年5月17日。
实施例2：昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的固体发酵
昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)，将新鲜的菌体块接种到1000ml锥形瓶中，每瓶含有400ml的土豆液体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，1L蒸馏水)，共接种140瓶于摇床上，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，然后将发酵液适量接入大米培养基中,在28-30℃条件下静置培养30天。
实施例3：脂肪族聚酮化合物的提取与分离
实施例2中所得固体发酵物用甲醇浸泡，浓缩物再用乙酸乙酯萃取五次，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F。对浸膏F进行硅胶柱层析，采用石油醚/乙酸乙酯(50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1)和二氯甲烷/甲醇(100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16)，得到7个洗脱部分F1-F7。然后对浸膏F1用Sephadex LH-20(甲醇)进行分离，得到F1.1，然后经反相C18(MeOH-H2O,v/v,25％-100％)和半制备液相(CH3CN-H2O,v/v,18:82)得到化合物2(24.3mg)和3(4.2mg)；浸膏F3经硅胶柱层析[CH2Cl2-MeOH(100:1-100:4,v/v)]得到F3.2和F3.3，再经ODS柱洗脱CH3OH/H2O(v/v,25％-100％)分别划分成7个段(F3.2.1-F3.2.7和F3.3.1-F3.3.7)，对F3.2.2进行薄层制备色谱板[CH2Cl2/CH3OH(v/v,100:4)]制备后再用半制备液相纯化得到化合物1(13.0mg)和4(8.5mg)；再对F3.3.4用高效液相(C6H14-CH3CH2OH,92:8,v/v)分离得到8(7.2mg)和9(3.3mg)。。浸膏F2的分离用反相C18(MeOH-H2O,25-100％,v/v)划分成4个段(F2.1-F2.4),再对F2.3用凝胶LH-20(甲醇)进行分离成4个段(F2.3.1-F2.3.4)然后对Fr.2.3.3用高效液相(MeCN-H2O,22:78,v/v)分离得到5(2.7mg)和6(3.5mg)。化合物7(3.8mg)是通过反相C18(MeOH-H2O,25-100％,v/v)和HPLC(MeOH-H2O,15:85,v/v)分离得到。高压液相半制备色谱柱：Aligent C18柱(EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm)。
实施例4：脂肪族聚酮化合物的结构鉴定
脂肪族聚酮化合物的结构是根据它们的质谱、红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、Mosher法及计算ECD谱确定的。
光谱学数据如下：
piterrione A(1):无色油状固体；[α]22D,-13.39(c 0.05,CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)261(4.09)nm；IR(KBr)νmax 3424,2974,2931,1750,1602,1359,1254,1167,1085,1030cm-1；(+)-HRESIMS m/z 233.0780[M+Na]+(calcd for C11H14O4Na,233.0784)；1H和13CNMR数据见表1和表2。
piterrione B(2):白色固体粉末；[α]22D,-28.63(c 0.05，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)261(4.30)nm；IR(KBr)νmax 3401,2972,2927,1736,1656,1377,1187,1075,1032cm-1；(+)-HRESIMS m/z 235.0942[M+Na]+(calcd for C11H16O4Na,235.0941)；1H和13C NMR数据见表1和表2。
piterrione C(3):无色油状固体；[α]22D,-8.38(c 0.05，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)282(4.06)nm；IR(KBr)νmax 3436,2970,2926,1749,1597,1358,1255,1176,1084,1035cm-1；(+)-HRESIMS m/z 233.0785[M+Na]+(calcd for C11H14O4Na,233.0784)；1H和13CNMR数据见表1和表2。
piterrione D(4):无色油状固体；[α]22D,13.2(c 0.06，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)229(4.03)nm；IR(KBr)νmax 3439,2969,2925,1745,1361,1169,1088,1041cm-1；(+)-HRESIMS m/z 235.0941[M+Na]+(calcd for C11H16O4Na,235.0941)；1H和13C NMR数据见表1和表2.
piterrione E(5):无色油状固体；[α]22D,+12.89(c 0.05，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)219(4.02)nm；IR(KBr)νmax 3398,2969,2928,1742,1668,1446,1081,1027cm-1；(+)-HRESIMS m/z 235.0941[M+Na]+(calcd for C11H16O4Na,235.0941)；1H和13C NMR数据见表1和表2。
piterrione F(6):无色油状固体；[α]22D,+15.25(c 0.05，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)222(3.98),262(3.84)nm；CD(DMSO)λmax(Δε)261(3.75),296(-3.44),329(2.69),342(2.86)nm；IR(KBr)νmax 3400,2976,2930,1744,1667,1445,1351,1258,1131,1037cm-1；(+)-HRESIMS m/z 235.0943[M+Na]+(calcd for C11H16O4Na,235.0941)；1H和13C NMR数据见表1和表2。
piterrione G(7):无色油状固体；[α]22D,-17.59(c 0.04，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)259(4.16)nm；CD(MeOH)λmax(Δε)207(4.04),220(3.64),257(-4.35)nm；IR(KBr)νmax3398,2971,2932,1740,1658,1449,1347,1189,1142,1017cm-1；(+)-HRESIMS m/z 207.0626[M+Na]+(calcd for C9H12O4Na,207.0628)；1H和13C NMR数据见表1和表2。
表1.piterrione A-G(1-7)的1H NMR数据
Table 1.1H NMR spectral data of piterrione A-G
Figure BDA0002758386790000071
Figure BDA0002758386790000081
Data of 1–3,7were measured at 500MHz,data of 4–6were measured at400MHz.
a Recorded in acetone-d6.
b Recorded in CDCl3.Chemical shifts(δ)are expressed in ppm,and Jvalues are presented in Hz.
s：单峰，d：双重峰，t：三重峰，dd：四重峰，m：多重峰，ddd/ddq/dqd：复合峰。
表2.piterrione A-G(1-7)的13C NMR数据
Table 2.13C NMR spectral data of piterrione A-G
Figure BDA0002758386790000082
Figure BDA0002758386790000091
Data of 1–3,7were measured at 125MHz,data of 4–6were measured at100MHz.
a Recorded in acetone-d6.
b Recorded in CDCl3.Chemical shifts(δ)are expressed in ppm,and Jvalues are presented in Hz.
实施例5：酪氨酸酶抑制活性的测定
酶活力的测定方法：反应总体系为200μL，加入pH 6.8的60μL磷酸盐缓冲溶液(20mM)，加入不同浓度的样品50μL使其使其终浓度为10、20、40、60、80mM(其中DMSO占总体系的体积分数不超过0.2％)，再加入50μL酪氨酸酶溶液(20μg/mL)，于37℃恒温水浴锅中保温10min，加入40μL底物L-多巴溶液(2.0mM)。再孵育5min后测定OD475，实验平行3次，取其平均值，以曲酸为阳性对照，以磷酸缓冲溶液为空白对照，根据抑制物质量浓度—酶抑制率回归方程求得半抑制浓度(IC50)。酪氨酸酶活性抑制率(％)＝[(A空白-(A样品-A背景)/A空白]×100(A空白：含底物和酶，不加入待测样品反应后的吸光值；A样品：含底物和酶，加入待测样品反应后的吸光值；A背景：含底物和待测样品，不加酶的吸光值)。
表3化合物1-9的酪氨酸酶抑制活性
Figure BDA0002758386790000092
Figure BDA0002758386790000101
﹡作为阳性对照
以上结果提示，已知化合物dihydroaltenuene B(9)具有显著的酪氨酸酶抑制活性，piterrione C(3)和dihydroaltenuene A(8)具有较强的酪氨酸酶抑制活性，因此本发明的脂肪族聚酮化合物可以开发成酪氨酸酶抑制剂先导化合物。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.将从华山捕捉的一只药用昆虫鼠妇中分离、纯化得到昆虫内生真菌的菌块接种到土豆液体培养基中，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，再将培养好的液体发酵液适量倒入大米培养基中，28℃静置培养30天；
步骤2.将步骤1所得大米发酵物用甲醇浸泡两次，将真空浓缩干燥后的提取物萃取五次过滤浓缩后，真空浓缩干燥得棕色粗浸膏F；
步骤3.对步骤2所得浸膏F进行硅胶柱层析分段，采用50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚/乙酸乙酯和100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16的二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到7个组分F1-F7；
步骤4.对浸膏F1-F3、F6多次采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20以及反相C-18柱层析分离纯化得到含有7个新化合物的部位F1.1、F2.3、F3.2.2、F3.3.4和F6.1；
步骤5.对浸膏F1.1用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：乙腈/水＝18/82，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione B
Figure FDA0003983067510000011
保留时间tR＝16.5min；piterrione C
Figure FDA0003983067510000012
保留时间tR＝23.0min；
步骤6.对浸膏F2.3用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝22/78，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione E
Figure FDA0003983067510000013
保留时间tR＝38.3min；piterrione F
Figure FDA0003983067510000021
保留时间tR＝52.4min；
步骤7.对浸膏F3.2.2用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝30/70，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione A
Figure FDA0003983067510000022
保留时间tR＝15.5min；piterrione D
Figure FDA0003983067510000023
(保留时间tR＝17.5min)；对浸膏F3.3.4用高压液正相色谱法，色谱柱：welch SiO2 column,Ultimate,5μm,10×250mm；流动相：正己烷/乙醇＝92/8，流速：2.0mL/min分离得到dihydroaltenuene A(8)
Figure FDA0003983067510000024
保留时间tR＝34.3min；dihydroaltenuene B(9)
Figure FDA0003983067510000025
保留时间tR＝38.5min；
步骤8.对浸膏F6.1用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4×250mm；流动相：甲醇/水＝15/85，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione G
Figure FDA0003983067510000026
保留时间tR＝20.3min。
2.根据权利要求1所述具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，其特征在于，步骤1中，内生真菌的分离、纯化方法具体步骤为：
先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分；将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10-1，装入无菌EP管中；混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10-2，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌。
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