CN106086213B - 口腔中幽门螺杆菌pcr检测方法 - Google Patents

口腔中幽门螺杆菌pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，本发明提供了口腔中Hp的PCR检测方法的构建方法；本发明以幽门螺杆菌铁蛋白基因为检测靶基因建立了口腔中Hp的PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；本发明通过建立口腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病患者的病因诊断提供了新的依据。本发明所公开的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对阳性对照稀释倍数是104～1010的7组不同浓度标准阳性菌液进行检测，本发明通过实验证实，患者胃病由幽门螺杆菌感染引起的，可以通过本方法检测到幽门螺杆菌，并且所建立的PCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好。

Description

口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法
技术领域
本发明涉及口腔中幽门螺杆菌的检测方法，具体涉及口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的人群在全球范围内约有50％以上，是引起人类消化性溃疡、慢性胃炎、胃黏膜出现淋巴瘤和胃癌的关键病因。Hp感染相关的病原菌，在广范围内可以大量的繁殖，生长条件要求低，可以通过不同的途径进行传播，其感染还具有传染性、致癌性、普遍性和隐蔽性，严重威胁人们的身体健康。在世界范围内，与癌症有关的致死率中，Hp感染引起的胃癌高居第二。目前，Hp已被世界卫生组织(WHO)列为第一类致癌因子，因此，加快对Hp感染的研究十分重要和必要。
Hp的宿主主要是人类，人体胃幽门是Hp特定的定居部位。1983年Warern和Marhsall首次从活动性慢性胃炎患者的胃黏膜中成功培养出Hp，两人因此还在2005年获得了诺贝尔奖。Hp是目前所知的唯一一种能在人胃中生存的微生物。1989年，Krajedn从口腔唾液和牙菌斑生物膜中首次成功分离出Hp，从此口腔作为Hp的第二个宿主部位引起人们的关注。口腔Hp可以伴随口腔中的食物和唾液经消化系统的吞咽过程进入胃内，反之，胃内Hp可通过反酸与食物返流的方式流入到消化道后进入口腔[4]。后来经证实，口腔Hp和胃内Hp具有较高的同源性。
胃中Hp感染和口腔Hp检出确实存在着一定的联系。检测口腔Hp的存在与否也许会在不同程度的胃炎疾病的鉴定和癌前病变方面有一定的作用。研究发现慢性萎缩性胃炎(CAG)患者的口腔中Hp的检出率要高于浅表性胃炎和消化性溃疡(PU)患者。因口腔和胃内Hp有着较高同源性，故唾液和牙菌斑可作为诊断Hp感染类型的可靠的非侵入性检查的标本。此外，亦可通过对唾液中Hp抗原和抗体的检测给胃部疾病的诊断提供依据。综上所述，根除口腔Hp可能是防止胃内Hp感染的重要措施，检测口腔Hp的存在与否将会在临床上有着非常重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了口腔中Hp的PCR检测方法的构建方法；在此基础上建立了口腔中Hp的PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；本发明通过建立口腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病患者的病因诊断提供了新的依据。
本发明的技术方案是：口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，其特征是：以幽门螺杆菌铁蛋白基因为检测靶基因。
根据权利要求1所述的幽门螺杆菌的PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
样品的采集：样品来源于口腔唾液和牙菌斑；早晨空腹未刷牙前，研究对象戴无菌手套手持无菌EP管，向无菌EP管中收集唾液，及时用封口膜密封管口，以防交叉污染；
样品的处理：样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，沸水浴的过程中勿让沸水进入无菌EP管中；煮沸后，封口膜封口，置于4℃保存备用；
普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：5μL菌液模板，2.5μL 10×PCRBuffer，2μL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水；
其中，正向引物F为：5′-TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3′
反向引物R为：5′-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3′。
根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的幽门螺杆菌目的基因为铁蛋白基因，基因片段为SEQ ID No.1：
ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTCCATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACGAGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAGCACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAACATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACGAGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCTGACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCC。
所述普通PCR扩增时的反应程序为：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s；分别运行29个循环，72℃终延伸10min。
该方法包括以下步骤:(1)样品的采集：样品来源于口腔唾液和牙菌斑；(2)样品的处理：样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，煮沸后，封口膜封口，置于4℃保存备用。其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：5μL菌液模板，2.5μL 10×PCRBuffer，2μL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水。其中，正向引物F为：5′-TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3′反向引物R为：5′-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3′。
所述的口腔中幽门螺杆菌PCR检测方法，阳性菌液的最适稀释梯度是107，检测幽门螺杆菌的极限是6×108CFU/mL
本发明的积极有益效果：
本发明通过设定靶基因为Hp铁蛋白基因，根据靶基因设计合成正向引物、反向引物，摸索PCR的退火温度、循环次数、模板量，建立了口腔中Hp的PCR检测方法，为临床上胃病患者的病因提供新的诊断方法。
本发明所公开的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对阳性对照稀释倍数是104～1010的7组不同浓度标准阳性菌液进行检测，结果显示：本发明中Hp的检测方法对阳性对照稀释倍数是105～109都可以检测到(图1)，检测下限为11CFU/mL；利用建立的PCR检测方法进行重复性试验，具有较好的重复性；利用不同的细菌和不同动物的血清进行PCR检测，都未扩增出Hp目的条带(图2)，说明本发明具有较好的特异性；另外本技术方案还具有样品采集和处理方便、检测通量高、操作简便、成本低以及定量准确等特点。
本发明通过实验证实，患者胃病由幽门螺杆菌感染引起的，可以通过本方法检测到幽门螺杆菌，并且所建立的PCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好。
附图说明
图1PCR检测方法灵敏性电泳结果；
图2PCR检测方法特异性电泳结果；
图3不同退火温度的相同样品PCR电泳结果；
图4不同循环次数相同样品PCR电泳结果；
图5～13PCR检测方法对不同样品的PCR检测电泳结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
实施例1.含有外源转入Hp铁蛋白的大肠杆菌菌液的稀释与计数
用高压灭菌移液器枪头从含Amp(100μg/mL)的LB固体选择培养基上挑取含有外源转入Hp铁蛋白的大肠杆菌DH5α单菌落，接种于1mL含Amp(100μg/mL)的LB液体选择培养基进行激活培养，在微需氧条件下37℃、140r/min振荡培养约12h后，取1mL菌液加入9mL的生理盐水中，进行1～10倍的梯度稀释。稀释后，分别从4～10倍的稀释梯度下(一个稀释梯度做三个平行，外加一个空白对照)取1mL菌液于相应的无菌平皿中，然后再向平皿中倒入9mL尚未凝固的含Amp(100μg/mL)的LB固体选择培养基，将其与菌液进行混匀，静置。待其凝固后置于电热恒温培养箱进行培养18～24h。计数。剩余的不同稀释梯度下的菌液用来进行PCR扩增后检测，用来确定此检测方法的灵敏度，还可作为本研究最终的阳性模板。
结果表明，含有外源插入Hp铁蛋白的大肠杆菌菌液在培养基中的，计数结果见表1。
表1阳性对照不同稀释梯度菌液平板计数
根据平板菌落计数和报告原则，可知在菌液稀释梯度为105梯度下Hp菌液量为1.03×102CFU/mL；在菌液稀释梯度为106梯度下Hp菌液量为70CFU/mL；在菌液稀释梯度为107梯度下Hp菌液量为60CFU/mL；在菌液稀释梯度为108、109、1010梯度下Hp单菌落量不在30～300之间，不统计。
实施例2样品的收集及处理
在2016年1月～2016年3月期间，以新乡学院生命科学技术学院的学生为研究对象，取人口腔唾液和牙菌斑共50例。
口腔唾液收集要求及方法：早晨空腹未刷牙前，让研究对象戴着无菌手套手持无菌EP管，向无菌EP管中收集唾液，及时用封口膜密封管口，以防交叉污染。
口腔牙菌斑收集要求及方法：早晨空腹未刷牙前，戴着无菌手套用无菌牙签在研究对象磨牙及磨牙邻间隙内刮取牙菌斑，刮取后及时置入含灭菌PBS的无菌EP管中，立即用封口膜密封管口，以防交叉污染。
样品收集结束后，立即将样品置于沸水煮沸25min，沸水浴的过程中要小心，勿让沸水进入到无菌EP管中。防止在煮沸的过程中无菌EP管崩开。煮沸后，封口膜封口，4℃保存备用。
实施例3靶基因的确定及引物设计
将幽门螺杆菌铁蛋白基因作为本研究PCR检测方法的靶基因，所述的基因片段的基因序列为SEQ ID No.1：
ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTCCATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACGAGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAGCACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAACATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACGAGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCTGACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCC。
根据所述的基因序列设计引物，正向引物F为：5′-
TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3′；反向引物R为：5′-GGA CTT ACG GGA CTT GGCGAT GCC-3′。
实施例4PCR检测方法体系组成及反应程序的确定
所述的PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：5μL菌液模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP(2.5mmol/L)，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水。
所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s；分别运行29个循环，72℃终延伸10min。
实施例5最适退火温度的摸索
取已处理过的样品进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性对照(含有外源转入HP铁蛋白的大肠杆菌DH5α菌液模板作阳性对照)。PCR反应体系见表2和表3。
表2阳性菌液和样品PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000051
表3阴性对照PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000061
将上述PCR各组分分别加入灭菌EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以下反应程序：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃，30s；55℃、56℃、57℃、58℃，30s；72℃，40s；运行29个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，取PCR产物各5μL，用1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL EB)进行电泳检测。最后在紫外线凝胶成像系统上观察结果，确定最适的退火温度。
紫外凝胶成像系统结果见图3，结果显示退火温度在58℃时，目的条带最亮，故确定最适退火温度为58℃。
实施例6最适循环次数的确定
取已处理过的样品进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性对照(含有外源转入HP铁蛋白的大肠杆菌DH5α菌液模板作阳性对照)。PCR反应体系见表4和表5。
表4菌液模板和样品PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000062
表5阴性对照PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000071
将上述PCR各组分分别加入灭菌EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以下反应程序：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃，30s；上述确定的最适退火温度，30s；72℃，40s；分别运行25、26、27、28、29、30个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，取PCR产物各5μL，用1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL EB)进行电泳检测，确定最适的循环次数。
结果如图4所示，结果表明循环次数在29个和30个时目的条带都符合要求，相对来说循环次数越低，PCR扩增效果越好，故确定最合适的循环次数为29次。
实施例7阳性模板量的确定
将105～1010不同稀释梯度下的菌液进行PCR扩增，同时需要阴性对照和阳性样品做参比。PCR反应体系见表6和表7。
表6菌液和样品PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000072
表7阴性对照PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000081
将上述PCR各组分分别加入灭菌EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以下反应程序：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃，30s；上述确定的最适退火温度，30s；72℃，40s；运行上述确定的最适循环次数，72℃终延伸10min。反应结束后，取PCR产物各5μL，用1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL EB)进行电泳检测。紫外线凝胶成像系统上观察结果，将不同稀释梯度下的成像条带和样品成像条带进行对比，以确定最适稀释梯度下的菌液为本研究的阳性模板，用来做阳性对照。
结果如图2所示，结果表明107条带与阳性样品含量最为相近，故确定阳性对照菌液的最适稀释梯度在107。
实施例8样品PCR扩增检测
将已处理过的所有样品进行PCR扩增，需要阴性对照和已确定的阳性模板作为阳性对照。PCR反应体系见表8和表9。
表8样品和阳性模板PCR反应体系
Figure BDA0001073831730000082
表9阴性对照PCR反应体系
将PCR各组分分别加入灭菌的EP管中进行瞬时离心混匀，在PCR扩增仪上执行以下反应程序：94℃预变性5min，进行以下循环：94℃，30s；上述确定的最适退火温度，30s；72℃，40s；运行已确定的最适循环次数，72℃终延伸10min。反应结束后，取PCR产物各5μL，用1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL EB)进行电泳检测。最后在紫外凝胶成像系统上观察实验结果。
紫外凝胶成像系统结果如图6～14，在分子量约500bp处出现了特异的核酸条带，与理论值500bp基本相符，阳性率达到82％。
实施例9PCR方法灵敏度的检测
将105～1010的不同稀释梯度下的菌液用来进行PCR扩增后检测，以确定此检测方法的灵敏度，过程与实施例8相同。
结果如图1所示，结果表明此检测方法灵敏度高，可以检测最低限度为11CFU/mL。
实施例10PCR方法特异性的检测
分别用酵母菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、小鼠血清和人血清进行PCR检测方法特异性的检测，观察PCR产物中是否有此铁蛋白基因的存在。
结果如图2所示，结果表明此检测方法特异性强，只能用于检测幽门螺杆菌。
实施例11PCR方法重复性的检测
应用本研究建立的PCR方法，重复5次检测阳性样品，观察5次PCR检测结果是否一致，据此判断本研究建立的PCR方法的重复性。
结果表明重复5次检测阳性样品，检测结果一致，结果表明此检测方法重复性好。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.口腔中幽门螺杆菌检测用PCR试剂盒，其特征是：包括2.5μL 10×PCR Buffer，2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA聚合酶；所述正向引物F为：5′-TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3′；所述反向引物R为：5′-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3′。
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