CN105209610B - 噬菌体、包括其的组成物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新颖噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)、包括其的组成物及其应用。另外，提供一种含有所述噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的抗细菌组成物，例如为抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。此外，提供一种通过使用所述噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)或含有所述噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的抗细菌组成物来预防和/或治疗除人类以外的动物的由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)导致的传染病的方法。本发明的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)可以具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性，并且具有极好的耐酸性、耐热性以及耐旱性。

Description

噬菌体、包括其的组成物及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有针对致病性产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的特异性杀菌活性的新颖噬菌体和包括所述新颖噬菌体的抗细菌组成物。另外，本发明涉及一种使用所述新颖噬菌体或抗细菌组成物来预防或治疗动物疾病的方法。
背景技术
革兰氏阳性(gram-positive)大型专性厌氧芽孢杆菌(bacillus)产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens；CP)已知为不具有鞭毛并且形成孢子的细菌。尤其在家畜(如鸡、猪等等)中导致腹泻等等的细菌产气荚膜梭菌已经被认为是家畜行业中密切关注的重要并且致命的病原性细菌(如导致禽伤寒的沙门氏菌属(Salmonella))中的一种。
目前，在家禽和猪肉行业中频繁产生的疾病中的一种是由产气荚膜梭菌导致的坏死性肠炎(necrotic enteritis)。已知坏死性肠炎频繁地由产气荚膜梭菌与球虫(coccidium)的协同感染产生，并且坏死性肠炎的主要症状有血性腹泻，其是由于在鸡、猪等等的小肠下部中的严重坏死病变。
这一坏死性肠炎根据疾病严重程度而在感染动物中产生脱水症状、周期性腹泻等等，使动物的身体逐渐虚弱，并且导致生长迟缓等等，以使得坏死性肠炎已经变成家畜行业中的重要问题。此外，因为产气荚膜梭菌易于通过动物粪便传播，在公共饲养空间里的动物之间的传播可以容易地由通过土壤或污染的饲料等等的经口感染而产生。确切地说，幼龄动物中的发病率较高，以使得产气荚膜梭菌已经成为问题。
同时，噬菌体是一种仅感染并且破坏细菌，并且可以仅在宿主细菌内自我复制的特定病毒类型。噬菌体与抗生素相比具有强宿主特异性，并且最近，针对抗生素的菌株耐受性的出现问题较为严重，以使得对噬菌体的实际使用的兴趣已经增加(非专利文献1和非专利文献2)。
因此，对噬菌体的研究已经在全世界的多个国家中积极地进行，并且除了针对噬菌体的专利申请之外，获得对含有噬菌体的组成物的食品和药物管理局(Food and DrugAdministration；FDA)批准的尝试已经逐渐增多。
作为噬菌体的相关技术文献，专利文献1中已经公开具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性的噬菌体，并且专利文献2中已经公开一种具有针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的特异性杀菌活性的噬菌体。此外，专利文献3中已经公开衍生自特异性地破坏细菌细胞膜的肽聚糖结构的噬菌体的溶解蛋白，以及由所述溶解蛋白产生的细菌溶解物。
然而，尽管存在以下相关技术，但与噬菌体相关联的用于预防和/或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病，尤其是坏死性肠炎(其在家畜行业，包含家禽和猪肉行业中仍然是重要的问题)的技术仍然不充足，以使得应该开发噬菌体和与噬菌体相关联的技术。
[相关技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)韩国专利特许公开公开案第10-2012-0076710A号
(专利文献2)韩国专利登记公开案第10-0910961B1号
(专利文献3)韩国专利特许公开公开案第10-2009-0021475A号
[非专利文献]
(非专利文献1)西斯罗M(Cislo M)等人，免疫与治疗学实验文献(Arch.Immunol.Ther.Exp.)2：175-183，1987
(非专利文献2)金胜勋(Sung Hun Kim)等人，噬菌体，新颖替代抗生素(Bacteriophage，Novel Alternative Antibiotics)，生物波(BioWave)第7卷第15期，2005，BRIC
发明内容
技术问题
本发明人进行了研究以便解决如在使用抗生素之后出现的耐受性细菌、残留在肉中的抗生素等等的问题，并且有效地预防和治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病，并且因此，本发明人从自然中分离出了具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性的新型噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)。
另外，本发明人鉴别了新颖噬菌体的形态、生物化学以及遗传特征，并且确认了所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性、耐旱性等等，从而使用所述新颖噬菌体开发抗生素、消毒剂、饲料添加剂以及其它组成物。此外，本发明人开发了用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物，和使用所述组成物预防或治疗所述疾病的方法。
本发明提供一种新颖噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)，其具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性。
另外，本发明提供一种用于预防和/或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分。
此外，本发明提供一种含有噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
此外，本发明提供一种使用噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)或含有噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的组成物来预防和/或治疗除人类以外的动物的由产气荚膜梭菌导致的传染病的方法。
问题的解决方案
根据本发明的一个示范性实施例，提供一种新颖噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)，其具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物，所述组成物含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的方法，其包括向除人类以外的动物投予如上文所描述的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)或含有噬菌体ΦCJ22的组成物。
本发明的有利作用
根据本发明的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)可以具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性。
另外，根据本发明的噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)具有极好的耐酸性、耐热性以及耐旱性，以使得所述噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)可以用作用于在各种温度或pH范围中、在湿气条件下等等预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的物质，并且用作抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂、清洁剂等等。
此外，根据本发明，由产气荚膜梭菌导致的传染病可以通过向除人类以外的动物投予噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)或含有噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)作为活性成分的组成物来预防或治疗。
附图说明
图1是新颖噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P，下文称作′ΦCJ22′)的电子显微镜照片。
图2示出新颖噬菌体ΦCJ22的脉冲场凝胶电泳(pulsed field gelelectrophoresis；PFGE)的结果。
图3示出新颖噬菌体ΦCJ22的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)的结果。
图4是示出新颖噬菌体ΦCJ22的耐酸性测试结果的曲线图。
图5是示出新颖噬菌体ΦCJ22的耐热性测试结果的曲线图。
图6是示出新颖噬菌体ΦCJ22的耐旱性测试结果的曲线图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。因为所属领域或类似领域的技术人员可以充分认识和推断出本说明书中未描述的内容，所以将省略其描述。
在一个大体方面中，本发明提供一种新颖噬菌体ΦCJ22(KCCM11364P)，其具有针对产气荚膜梭菌(CP)的特异性杀菌活性。
已知革兰氏阳性大型专性厌氧芽孢杆菌产气荚膜梭菌不具有鞭毛并且形成孢子。在动物中，尤其在家畜(如家禽、猪等等)中导致腹泻等等的细菌产气荚膜梭菌已经被认为是家畜行业中危险并且致命的病原性细菌(如导致禽伤寒的沙门氏菌属)中的一种。
噬菌体是遏制并且抑制细菌生长的细菌特异性病毒感染性特异性细菌，并且意指包含单股或双股脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)或核糖核酸(ribonucleicacid；RNA)作为遗传物质的病毒。
本发明的噬菌体ΦCJ22，其为具有选择性感染产气荚膜梭菌的物种特异性的噬菌体，是具有等距衣壳和非收缩尾部的噬菌体，并且在形态上属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)(图1)。噬菌体ΦCJ22与其它噬菌体之间的核酸序列同源性分析数据在表1中示出。噬菌体ΦCJ22的活性在pH 4到pH 9.8范围下稳定2小时(耐酸性，参看图4)。ΦCJ22在其暴露于60℃时保持其活性2小时(耐热性，参看图5)，并且其效价在干燥之后减小约2个对数(参看图6)。噬菌体ΦCJ22的核酸序列与SEQ ID NO：1相同。
噬菌体ΦCJ22，其为由本发明人新分离的噬菌体，是在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，简称为KCCM)(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号(361-221，Hongjedong，Seodamun-gu，Seoul，Korea))以保藏编号KCCM11364P于2013年1月30日保藏。
在另一个大体方面中，本发明提供一种用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分。作为组成物的一个优选实例，本发明提供一种抗生素。
因为噬菌体ΦCJ22具有能够特异性地杀死产气荚膜梭菌的抗细菌活性，但噬菌体ΦCJ22可以用于预防或治疗由产气荚膜梭菌感染产生的疾病。作为由产气荚膜梭菌导致的能够使用噬菌体ΦCJ22治疗的传染病的合适的实例，有坏死性肠炎，但本发明不限于此。
由产气荚膜梭菌导致的主要传染病中的一种，坏死性肠炎，对应于最频繁地在家畜、尤其是家禽中产生并且导致显著损害的细菌疾病。所述疾病可以在家禽(尤其是实质上所有年龄的鸡)中产生，但主要在地面饲养的鸡(2周龄到5周龄)中产生并且也在笼中饲养的鸡(12周龄到16周龄)中频繁地产生。
因为产气荚膜梭菌在小肠中过度增殖，所以产生坏死性肠炎的症状，并且造成胃肠道粘膜坏死、突然腹泻等等。举例来说，在猪中，在极其急性的坏死性肠炎情况下，在发病之后的1到2天，产生猪死亡，并且在急性坏死性肠炎的情况下，在血性腹泻之后2到3天，产生猪死亡。此外，在亚急性坏死性肠炎的情况下，腹泻(不存在血性粪便)持续5到7天，并且接着造成虚弱和脱水，并且在慢性坏死性肠炎的情况下，造成间歇性腹泻，并且可以产生生长病症。
如本文所用的术语“预防”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ22和/或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物以遏制对应疾病或延迟疾病出现的所有动作。
如本文所用的术语“治疗”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ22和/或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物从而使得由感染导致的对应疾病的症状好转或减轻的所有动作。
作为由产气荚膜梭菌导致的可以向其施加噬菌体ΦCJ22和/或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物的传染病的一个实例，有坏死性肠炎，但本发明不限于此。
根据本发明的用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物可以以优选地5×102pfu/ml(空斑形成单位/毫升)到5×1012pfu/ml、更优选地1×106pfu/ml到1×1010pfu/ml的含量含有噬菌体ΦCJ22。
根据本发明的用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物可以进一步含有药学上可接受的载剂并且与所述载剂一起配制从而以食物、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等等的形式提供。
如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”意指既不刺激活有机体也不抑制所投予的化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。
本发明中可用的载剂种类不受特定限制，并且可以使用任何载剂，只要其通常用于所属领域并且是药学上可接受的。作为载剂的非限制性实例，有生理盐水、无菌水、缓冲盐水、林格氏(Ringer′s)溶液、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等等。可以使用这些载剂中的一种或至少两种的混合物。
另外，必要时，可以进一步添加并且使用另一种通用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或其类似物，并且组成物可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或其类似物来配制成注射配制品(如水溶液、悬浮液、乳液等等)、丸剂、胶囊、粒剂、片剂等等，并且接着被使用。
用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物的投予方法不受特定限制，但可以使用通常用于所属领域的任何方法。作为投予方法的非限制性实例，组成物可以经口或肠胃外投予。
作为用于经口投予的配制品的非限制性实例，有糖衣片、口含片、片剂、水性悬浮液、油状悬浮液、制备的粉剂、粒剂、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆、酏剂等等。
为了将根据本发明的组成物配制成配制品，如片剂、胶囊等等，配制品可以进一步含有粘合剂，如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素、明胶；赋形剂，如磷酸二钙等等；崩解剂，如玉米淀粉、甘薯淀粉等等；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰反丁烯二酸钠、聚乙二醇蜡等等。在胶囊配制品的情况下，所述配制品可以另外含有除了上文所提到的物质之外的液体载剂，如脂肪油。
作为肠胃外投予方法，可以使用静脉内投予方法、腹膜内投予方法、肌肉内投予方法、皮下投予方法、局部投予方法等等。另外，还可以使用将组成物施加或喷涂到疾病部位上的方法，但本发明不限于此。
用于肠胃外投予的配制品的实例可以包含用于皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等等的注射配制品；栓剂配制品；喷雾配制品，如能够通过呼吸系统被吸入的气雾剂配制品等等，但本发明不限于此。为了将组成物配制成注射配制品，根据本发明的组成物可以与稳定剂或缓冲剂在水中混合从而制备溶液或悬浮液，并且接着，所制备的溶液或悬浮液可以以用于安瓿或小瓶的单位剂量配制。在将组成物配制成喷雾配制品(如气雾剂配制品等等)的情况下，推进剂等等可以与添加剂混合以使经水分散的凝结物或湿粉剂分散。
用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的组成物的合适的施加、喷涂或投予剂量可以取决于如投予标靶动物的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、食物的种类、排泄速率等等，以及配制所述组成物的方法、投予方法、投予时间和/或途径的因素来不同地确定。一般来说，在所属领域中具有一般技术的兽医可以容易地确定并且规定用于所需治疗的有效剂量。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的抗生素。
如本文所用的术语“抗生素”意指能够以药物形式向动物(包含人类)提供从而杀死细菌的药剂，并且对应于总体而言指示防腐剂、消毒剂以及抗菌剂的概念。
含有根据本发明的噬菌体ΦCJ22作为活性成分的抗生素可以具有与根据相关技术的抗生素相比对产气荚膜梭菌的高特异性从而不杀死有益细菌但杀死特异性病原性细菌，并且不诱发抗药性，以使得根据本发明的抗生素可以作为具有与根据相关技术的抗生素相比延长的生命期的新颖抗生素提供。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的饲料添加剂和饮用水添加剂。
根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂可以以其中噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22的组成物以饲料添加剂或饮用水添加剂形式单独地制备并且接着与饲料或饮用水混合的方式使用，或以其中噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22的组成物在制备饲料或饮用水时直接添加的方式使用。
用作根据本发明的饲料添加剂或饮用水添加剂的噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22的组成物可以处于液态或干燥状态，并且优选地呈干燥粉剂形式。
用于制备呈干燥粉剂形式的根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂的干燥方法不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的方法。作为干燥方法的非限制性实例，有天然空气干燥方法、天然干燥方法、喷雾干燥方法、冷冻干燥方法等等。可以单独使用这些方法中的一种方法或至少两种方法可以彼此一起使用。
另一种非致病性微生物可以另外添加到饲料添加剂或饮用水添加剂中。能够添加的微生物的非限制性实例可以由以下各种组成的族群中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的芽孢杆菌属(bacillus sp.)，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等等；在厌氧条件(如牛的胃)下具有针对有机物质的生理活性和降解活性的乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；具有增加家畜体重、乳产量以及饲料消化率的作用的霉菌真菌，如米曲菌(Aspergillus oryzae)等等；以及酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等等。可以使用这些微生物中的一种或至少两种的混合物。
视需要，含有根据本发明的噬菌体ΦCJ22作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂可以进一步含有其它添加剂。作为可用添加剂的非限制性实例，有粘合剂、乳化剂、防腐剂等等，其经添加以便预防饲料或驱动水的质量退化；氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂、寡糖等等，其经添加以便增加饲料或饮用水的效用。另外，添加剂可以进一步包含饲料混合剂等等。可以使用这些添加剂中的一种或至少两种的混合物。
以饲料的100重量份计，可以以0.05重量份到10重量份、更优选地0.1重量份到2重量份的含量含有饲料添加剂。以饮用水的100重量份计，可以以0.0001重量份到0.01重量份、更优选地0.001重量份到0.005重量份的含量含有饮用水添加剂。在上文所提到的范围内，噬菌体ΦCJ22针对产气荚膜梭菌的活性可以充分展现。
在另一个大体方面中，本发明提供一种饲料或饮用水，其是通过添加含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或直接添加噬菌体ΦCJ22而制备。
用于本发明的饲料不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何饲料。饲料的非限制性实例可以包含植物饲料，如谷物、根部以及果实、食物加工副产物、藻类、纤维、药学副产物、脂肪、淀粉、葫芦科或谷物副产物；以及动物饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物质、单细胞蛋白质、动物浮游生物或食物。可以使用这些饲料中的一种或至少两种的混合物。
用于本发明的饮用水不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何饮用水。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的配制品不受特定限制，而可以将所述消毒剂或清洁剂配制成所属领域中已知的任何配制品。
可以将消毒剂喷洒到动物生活的区域、屠宰场、死亡产生区域(mortalitygeneration area)、烹饪场所或烹饪设备等等以便去除产气荚膜梭菌，但本发明不限于此。
清洁剂可以用于洗涤动物(尤其是家禽或猪)身体暴露于或将暴露于产气荚膜梭菌的皮肤表面或部位中的每一种，但本发明不限于此。
在另一个大体方面中，本发明提供一种通过使用噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物来预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的方法。传染病可以优选地是坏死性肠炎，但本发明不限于此。预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病的标靶可以是家禽或猪，但本发明不限于此。
详细地说，根据本发明的预防或治疗传染病的方法可以包含向感染产气荚膜梭菌或处于感染产气荚膜梭菌风险下的除人类以外的标靶以药学上有效的剂量投予噬菌体ΦCJ22或包括噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物。所属领域的技术人员将显而易见，当向患者投予药学组成物时，合适的总日剂量可以由主治医生或兽医在合理的医学判断范围内确定。
对于特定动物，噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物的特定药学上有效剂量可以通过考虑噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22的组成物的投予时间和投予途径；组成物的分泌速率；治疗持续时间段等等；以及所需反应的种类和程度；对应个体的年龄、体重、大体健康状态、性别或饮食来确定。另外，药学上有效剂量可以根据各种因素不同地改变，如同时或独立地使用的药物或其它组成物的成分，以及在医学领域中熟知的类似因素。
根据本发明的噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物可以以药学形式(经鼻喷雾)向动物投予，或以直接添加到动物的饲料或饮用水并且接着饲喂所述饲料或饮用水的方法投予。另外，噬菌体ΦCJ22或含有所述噬菌体ΦCJ22的组成物可以以饲料添加剂或饮用水添加剂的形式混合在饲料或饮用水中并且接着投予。
根据本发明的噬菌体ΦCJ22或含有噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物的投予途径和投予方法不受特定限制，而可以使用任何投予途径和投予方法，只要噬菌体ΦCJ22或含有所述噬菌体ΦCJ22的组成物可以到达对应的标靶组织。即，噬菌体ΦCJ22或含有所述噬菌体ΦCJ22作为活性成分的组成物可以通过各种经口或肠胃外途径投予。作为投予途径的非限制性实例，可以进行经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下以及经鼻投予、吸入等等。
在下文中，将通过实例详细描述本发明。然而，这些实例仅为了说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实例。
[实例1]-噬菌体感染性产气荚膜梭菌的分离
<实例1-1>
噬菌体的筛分和单个噬菌体的分离
在将从三合Gps.育种农业公司(Samwhaw Gps.Breeding Agri.Inc.)(其为忠清南道(South Chungchong Province)的鸡和猪农场)的粪便样品分离的50毫升样品移动至离心瓶并且在4,000转/分钟下离心10分钟之后，用0.45微米过滤器过滤上清液以制备样品溶液，并且接着使用所制备的样品溶液进行软琼脂覆盖方法。软琼脂覆盖方法是使用生长在顶部琼脂中的宿主细胞(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)观察噬菌体的溶解作用的方法。
详细地说，将18毫升样品滤液与在动植物检疫机关(Animal and PlantQuarantine Agency)分离的产气荚膜梭菌(CP，BCCP 17-1)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)和2毫升10×脑心浸液(下文中称为′BHI′培养基(经构成以具有1升的最终体积)混合，并且在37℃下培养18小时。接着，在4,000转/分钟下离心培养物溶液10分钟，并且使用0.45微米过滤器过滤上清液。
在其之后，在将5毫升0.7％(w/v)琼脂与产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)的混合物倾倒并且硬化到BHI培养板(BHI+0.2％羊血)上之后，将10微升样品培养物滤液溶液滴落到其上，接着在30℃下培养18小时。接着，确认形成空斑。
在将其中产生溶解的样品培养物滤液溶液适当稀释并且与产气荚膜梭菌(BCCP17-1)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合之后，进行软琼脂覆盖方法，从而获得单个空斑。因为认为单个空斑是由单个噬菌体形成，所以为了纯化并且分离单一噬菌体，选择单个空斑，将其放入400微升SM溶液(NaCl(5.8克/升)；MgSO47H2O(2克/升)；1M Tris-Cl(pH7.5，50毫升)；H2O，其经构成以具有1升的最终体积)，并且保持在室温下4小时，从而纯化并且分离单个噬菌体。
为了保证大量的经分离噬菌体，选择100微升单个噬菌体溶液上清液并且将其与12毫升0.7％琼脂和产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)的500微升摇晃培养物溶液混合，接着在直径为150毫米的LB培养基中进行软琼脂覆盖方法。在将15毫升SM溶液倾入其中溶解完全产生的培养板中之后，在室温下轻轻摇晃培养板4小时，从而排出在顶部琼脂中的噬菌体。回收噬菌体所排出到的SM溶液，并且以最终体积的1％的量向其添加氯仿，并且适当地混合10分钟，接着在4,000转/分钟下离心10分钟。用0.45微米过滤器过滤如上文所描述获得的上清液，并且存储在低温下。
<实例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)大规模培养所选择的噬菌体，并且接着自其纯化噬菌体。
详细地说，将产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)的1％摇晃培养物溶液接种到液体培养基中以用于大量生产，并且同时，以0.1的感染复数(multiplicity of infection；MOI)将噬菌体放入其中，同时进行产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)的接种，从而进行协同感染。接着，在厌氧条件下在30℃下进行静态培养。
在其之后，在4℃和12,000转/分钟下进行离心20分钟，并且接着用0.45微米过滤器过滤上清液。在将NaCl和聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)添加到经过滤的上清液以便分别具有1M和10％(w/v)的最终浓度，并且彼此混合之后，将混合物进一步保持在4℃下8小时或高于8小时。接着，在于4℃和12,000转/分钟下进行离心20分钟之后，接着去除上清液，并且获得沉淀物。
使用5毫升SM溶液再悬浮所获得的沉淀物并且保持在室温下20分钟。在其之后，用0.45微米过滤器过滤上清液，并且进行使用甘油密度梯度方法(密度：40％，5％甘油)的超速离心法(35,000转/分钟，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体ΦCJ22。在使用500微升SM溶液再悬浮经纯化的ΦCJ22之后，测量效价。
本发明人将通过从粪便提取样品而获得的具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性的噬菌体称为“噬菌体ΦCJ22”，并且于2013年1月30日以保藏编号KCCM11364P将所述噬菌体保藏在韩国微生物保藏中心(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号)。
<实例2>
ΦCJ22的形态观察
将纯化的噬菌体ΦCJ22稀释于0.01％明胶溶液中，并且接着通过2.5％戊二醛溶液固定。将固定的噬菌体滴落到碳涂布云母培养板(约2.5×2.5毫米)上，对其进行适应10分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤。将碳膜安放在铜栅格上，用4％乙酸铀酰染色30秒到60秒，将其干燥，并且使用透射电子显微镜(JEM-1011，80千伏，放大率：×120,000到×200,000)研究(图1)。
图1示出噬菌体ΦCJ22的电子显微镜照片，并且可以了解，因为所述噬菌体不具有等距衣壳和收缩尾部，所以所述噬菌体在形态上属于长尾噬菌体科。
<实例3>
ΦCJ22的基因组DNA大小分析
从通过超速离心法纯化的噬菌体ΦCJ22提取基因组DNA。
详细地说，将乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA，pH 8.0)、蛋白酶K以及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate；SDS)添加到纯化噬菌体ΦCJ22的培养物溶液中以便分别具有20mM、50微克/毫升以及0.5％(w/v)的最终浓度，并且接着保持在50℃下1小时。在其之后，添加等体积的苯酚(pH 8.0)并且搅拌，接着在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。
将所述上清液与等体积的PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。将所述上清液与等体积的氯仿混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。将所获得的上清液依次与10％(v/v)3M乙酸钠和双倍体积的冷95％乙醇(以总体积计)混合，并且保持在-20℃下1小时。接着，在0℃和12,000转/分钟下进行离心10分钟，并且通过去除上清液来获得沉淀物。接着，向其添加50微升Tris-EDTA(Tris-EDTA；TE)缓冲液(pH 8.0)从而使所获得的沉淀物溶解。稀释所提取的DNA10次，并且通过测量在OD260下的吸光度来测量浓度。
接着，将1微克DNA装载到1％脉冲场凝胶电泳(PFGE)琼脂糖凝胶上，并且使用伯乐(BIORAD)PFGE系统程序7(大小范围：25kb到100kb；切换时间斜坡：0.4到2.0秒，线性形状；正向电压：180伏；反向电压：120伏)在室温下进行电泳20小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ22的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)照片，并且可以确认噬菌体ΦCJ22的基因组DNA具有约56kb的大小。
<实例4>
ΦCJ22的蛋白质图谱分析
将15微升纯化噬菌体ΦCJ22溶液(1010pfu/ml效价)与3微升5×SDS样品溶液混合，并且加热5分钟。在15％SDS-PAGE凝胶中使噬菌体ΦCJ22的总蛋白膨胀，并且接着在室温下使用考马斯(coomassie)蓝染料溶液染色凝胶1小时(图3)。
图3是示出对噬菌体ΦCJ22进行的SDS-PAGE的结果的电泳照片，并且观察到具有约40kDa(千道尔顿)、51kDa、53kDa以及70kDa大小的主要蛋白质。在图3中，M是变成用于测量分子量的标准的DNA。
<实例5>
ΦCJ22的基因序列分析
为了确认纯化噬菌体ΦCJ22的遗传特征，使用基因分析设备FLX钛定序器(罗氏(Roche))分析噬菌体ΦCJ22的DNA。基因是在千年基因公司(Macrogen INC.)使用GS和重新装配软件(罗氏)装配。开放阅读框的序列分析是使用GeneMArk.hmm、Glimmer v3.02以及FGENESB软件来进行。开放阅读框的鉴别是使用BLASTP和InterProScan程序来进行。
噬菌体的基因组序列与现存经报告的噬菌体的基因组序列具有各种类似性，但确认了不存在所有碎片都与本发明噬菌体的碎片完全(100％)相同的噬菌体。因此，可以确认所述噬菌体是新分离的噬菌体。
噬菌体ΦCJ22与其它噬菌体之间的核酸序列同源性分析数据在表1中示出。
表1
[表1]
噬菌体ΦCJ22的部分基因组序列与SEQ ID NO：1相同。基因组序列是通过遗传分析仪测定。
<实例6>
取决于pH的ΦCJ22的稳定性测试
为了确认噬菌体ΦCJ22在低pH环境中的稳定性，在宽pH范围(pH 4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0以及9.8)内进行稳定性测试。
为了测试，分别以0.2M的浓度制备各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 4.0、pH 5.5以及pH 6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH 6.9和pH7.4)以及Tris-HCl溶液(pH 8.2、pH9.0、以及pH9.8))。
在将90微升所述pH溶液中的每一个与效价为1.0×109pfu/ml的10微升噬菌体溶液混合以使得pH溶液中的每一个的浓度都变为1M之后，将所述pH溶液中的每一个都保持在室温下30分钟、1小时以及2小时。接着，逐步稀释反应溶液，在每个步骤滴落10微升经稀释的溶液并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图4)。
图4示出噬菌体ΦCJ22的耐酸性测试的结果。如图4中示出，可以确认，噬菌体ΦCJ22在4.0到9.8的pH范围中未失去其活性并且保持稳定高达2小时。
<实例7>
取决于温度的ΦCJ22的稳定性测试
进行测试，其用于确认在使用噬菌体作为所述噬菌体的配制品中的饲料添加剂配制品的情况下，针对在所述噬菌体的配制过程期间产生的热的稳定性。
详细地说，将效价为1.0×108pfu/ml的200微升噬菌体ΦCJ22溶液保持在60℃下0分钟、10分钟、30分钟、60分钟以及120分钟。接着，逐步稀释以上溶液，滴落10微升经稀释的溶液中的每一个并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图5)。
图5示出噬菌体ΦCJ22的耐热性测试的结果。如图5中示出，可以了解，直到噬菌体ΦCJ22暴露于60℃ 2小时，活性才显著减小。
<实例8>
ΦCJ22针对干燥的稳定性测试
进行测试，其用于确认在使用噬菌体作为所述噬菌体的配制品中的饲料添加剂配制品的情况下，针对在所述噬菌体的配制过程期间产生的干燥条件的稳定性。
详细地说，使用快速真空浓缩器5301(艾本德(Eppendorf))在60℃下干燥效价为1.0×108pfu/ml的100微升噬菌体溶液120分钟。在4℃下以等于初始溶液量的量将干燥之后获得的丸粒放入并且再悬浮于SM溶液中，持续一天。
接着，逐步稀释以上溶液，在所述步骤中的每一个中滴落10微升经稀释的溶液并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图6)。
图6示出噬菌体ΦCJ22的耐旱性测试的结果。如图6中示出，可以了解，噬菌体ΦCJ22在干燥之后减小约2个对数值。
<实例9>
关于产气荚膜梭菌野生型菌株的ΦCJ22的感染谱测试
除用于实验的产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)以外，还对于由动植物检疫机关和建国大学(Kunkuk University)分离的45个产气荚膜梭菌野生型菌株测试了噬菌体ΦCJ22是否具有溶解活性。
详细地说，滴落效价为1.0×1010pfu/ml并且与所述菌株中的每一个的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合的10微升噬菌体ΦCJ22溶液，并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时。接着，观察是否形成空斑。实验结果是，在45个产气荚膜梭菌野生型菌株中，42个菌株被感染，以使得感染率是约93.3％并且溶解率是约75.6％。结果在表2和表3中示出。
表2
[表2]
CP来源 CP菌株 感染性
建国大学 HLYS-1 -
Kunkuk University HLYS-3 ++
Kunkuk University JSH-1 +
Kunkuk University KCCM 40947T +++
Kunkuk University KJW-2 +++
Kunkuk University OYS-2 -
Kunkuk University KCCM 12098 ++
表3
[表3]
申请人或代理人的文件参考号P13-5112 国际申请编号
涉及保藏微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)

Claims (10)

1.一种噬菌体ΦCJ22，其保藏编号为KCCM11364P，其具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀菌活性，其中所述噬菌体具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
2.一种组成物，用于预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的传染病，其包括噬菌体ΦCJ22作为活性成分，其中所述噬菌体具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的组成物，其中所述传染病是坏死性肠炎。
4.一种抗生素，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22作为活性成分。
5.一种饲料添加剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22作为活性成分。
6.一种饮用水添加剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22作为活性成分。
7.一种消毒剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22作为活性成分。
8.一种清洁剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22作为活性成分。
9.一种根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ22或根据权利要求2所述的组成物作为制备预防或治疗由产气荚膜梭菌导致的除人类以外的动物传染病药物的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述传染病是坏死性肠炎。
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