BR112015020697A2

BR112015020697A2 - novo bacteriófago e composição antibacteriana compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BR112015020697A2
Application number: BR112015020697A
Authority: BR
Inventors: Kyung Son Bo; Duk Bae Gi; Won Kim Jae
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2019-11-19
Also published as: PL2961834T3; JP6130935B2; JP2016510979A; EP2961834A4; US9758767B2; BR112015020697B1; CN105209610A; US20160076003A1; ES2737599T3; PH12015501888A1; PH12015501888B1; EP2961834B1; KR101381798B1; WO2014133322A1; CN105209610B; EP2961834A1

Abstract

"novo bacteriófago e composição antibacteriana compreendendo o mesmo" a presente invenção se refere a um novo bacteriófago 1cj22 (kccm 1 1364p). a presente invenção se refere ainda a uma composição antibacteriana, compreendendo o bacteriófago dcj22 (kccm1 1364p) como um ingrediente ativo. além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por closiridium perfrrngens em animais, exceto seres humanos, utilizando o bacteriófago ddcj22 (kccm 11364p) ou a composição antihacteriana compreendendo o 10 bacteriófago dcj22 (kccm 1 1364p) como um ingrediente ativo

Description

‘'NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO ANTIBACTERIANA COMPREENDENDO O MESMO'’

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um novo bacteriófego com uma atividade bactericida 5 específica contra o patogênico Cáwvásm pebrfegtw, e uma composição antibacteriana compreendendo o mesmo. A presente invenção se refere ainda a um método de prevenção e tratamento de doenças de animais utilizando o novo baeteriõfãgo ou a composição antibacteriana.

An tecedentes da Invenção

O Cfevnafem (CP), que é um bacilo anaeróbio obrigatório grande granipositivo, é conhecido como uma bactéria que não possuí flageles e forma um esporo. Q CfoAndws /w#wgcn.v. que é uma bactéria causadora de diarréia, ou similar, partícularmente em animais domésticos tais como frango, porco, etc., e similares, tem sido reconhecida como uma das bactérias patogênicas perigosas e fatais na indústria animal,, tal como a causando a febre tifbide aviária.

Atualmente, uma das doenças frequentemente geradas nas indústrias de aves e suínos é a entente necrótíca por Goxmàfíw? Sabe-se que a enterite necrótíca é frequentemente gerada por uma -coinfecção de Chs/rídmm perfmgtw e Coeeúfe», e como sintoma principal da entente necrótíca, produz diarréia com sangue devido a lesões 20 necródcas graves em uma porção inferior do intestino delgado de frangos, suínos e similares.

Ιϊ-sta entente necrótica gera sintomas de desidratação, diarréia periódica e sintomas similares no animal infectado, de acordo com a gravidade da doença, e gradualmente debi lita o corpo do animal, causando atraso no crescimento, dentre outros problemas, de tal modo que a enterite necrótíca tornou-se um problema significativo na Indústria animal. Além disso, 25 como o Cfo.wrá:/fetf? /Moringen.? è facilmente propagado através de fezes de animais, a

2/28 transmissão entre animais num espaço comum de reprodução pode ser .facilmente gerada por infecção oral através do solo, alimentos contaminados ou situações similares. Partícularmente, a incidência ran animals jovens é elevada, de tal modo que o perftàígenf tomou-se um grande problema.

Por sua vez, o bacteriófago é um tipo especializado de vírus que infecta e destrõi somente bactérias, e pode se autorrepficar somente dentro de bactérias hospedeiras. O bacieríófago apresenta forte especificidade hospedeira em comparação com os antibióticos e, recentemente, o aparecimento de uma estirpe resistente a antibióticos tornou-se um grave problema, de tal modo que o interesse no uso prático do hacteriòfago tem aumentado ΙΌ (Documentos não patentários I e 2).

Portanto, pesquisas relativas a bacterióiagos foram âtivamente conduzida em vários países de todo o mundo e, além de pedidos de patentes para bacterióiagos. houve um aumento gradual nos pedidos de aprovação encaminhados ao Food and Drug Administration (FDÁ) para composições contendo o baeteriótago.

Com relação aos bacterióiagos disponíveis no estado técnica, o Documento Patentário revela um baeteriótago .com uma atividade baciericida específica contra o C/osa-àAmí? perpúígens. e o Documento Patentário 2 revela um baeteriótago com .uma atividade bactericide especifica contra asms. Além destes, o Documento Patentário 3 descreve uma proteína lírica derivada de um baeteriótago que destróí especificamente a estrutura do peptidogiicano da membrana celular bacteriana, e bactérias Usadas pela proteína íitica.

E-ntrentanto, apesar da existência dos referidos documentos no estado da técnica, uma tecnologia associada com o baeteriótago para prevenir e/ou tratar doenças infecciosas, partieularmente a entente necrótíca por Clostridium jxfrfrmg&w, que é ainda, um problema 25 importante na indústria animal, inclidnda as indústrias de aves e suínos, é ainda insuficiente.

3/28 de modo que um bacteriófàgo e uma tecnologia associada com o bacteríófago -devem ser desenvolvidos.

Documentos disponíveis no estado ds ténica

Doca meo tos Pa tea tá rios

-Documento Patentário 1: Patente coreana publicada No. 10-2'01.2-0076710 A

-Documento Patentário 2: Patente coreana registrada No. 10-0910961 BI

-Documento Patentário 3: Patente coreana publicada No. 10-2009-0021475 A

Documentos «ãn Patentários

-Documento nMo Patentário I: C/sZoM e/arA, Arch. Z/me»/. 77?er. Ζ2φ. 2.275-/¾ /.9R7

-Documento não Patentário 2; Sm·?# /-/oo.»-? Áríw et oZ, «owí <wfo7órímç a/temorívost ÃioíEave /<>/. 7 0625, 2005, 2JZZ.Z0 Divulgação

Problema Técnico

Os inventores da presente invenção realizaram estudos para -solucionar problemas 15 eomo a presença de bactérias resistentes a antibióticos, a. presença de antibióticos remanescentes na carne, além de prevenir e tratar efícientemente doenças infecciosas causadas por Cfostríc/àrm e, como .resultado, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteríófago ΦΟ22 (KCCMl 1364-P) que possui .uma atividade bactericida específica contra o tVvbrídmm perÁb?gén.y presente- nu natureza.

2'0 Além disso, os inventores da presente invenção identificaram características morfòlógicas, bioquímicas e. genéticas do novo bacteríófago e confirmaram que o bacteríófago tem uma excelente resistência a ácidos, .resistência ao calor, resistência à seca e a condições similares, desenvolvendo assim um antibiótico, um desinfetante,- um aditivo alimentar, e outras composições usando o novo bacteriófago. Além disso, os inventores da 25 presente invenção desenvolveram uma composição para a prevenção ou tratamento de

4/28 doenças infecciosas por Cfosffitâwn /wynugmv e um método, para prevenir ou tratar a doença utilizando a composição.

Λ presente invenção visa proporcionar um novo bacteriófago ΦΟ22 (KCCM1I364P) com uma atividade bactericida.específicacontra o C/tw/rófe»?pe/friagens.

A presente invenção visa proporcionar ainda uma composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por Cfosirtâiiím perpfageas contendo o bacteriófago ΦΟΙ22 (KCCM1I364P) como um ingrediente ativo.

Ademais, a presente invenção visa proporcionar um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água, potável· um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o 10 bacteriófago ΦΟ22 (KCCM113641·*) como um ingrediente ativo.

Além disso, a presente invenção visa proporcionar um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por Cfatfrtâfam /wyHwgw em animais, exceto para os seres humanos, utilizando o bacteriófago ΦΟ22 (KCCM11364?) ou uma composição contendo-c bacteriófago ΦΟ22 (KCCM II364?) como um ingrediente ativo.

Solução Técnica

De acordo com uma configuração, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago <Í*CJ22 (KCCM 11364?) com uma atividade baeterícida específica contra o

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição .20 para a prevenção ou tratamento de doença infecciosa causada por Cfemrk&Km a dita composição contendo o bacteriófago Φ<?,122 (Kt t M11364P) como um ingrediente ativo, conforme acima descrito.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante ou um produto de 25 limpeza contendo o bacteriófago Φ€Ι2.2 (KCCM 11364?) conto um ingrediente ativo,

5/28 conforme acima descrita

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doença infecciosa, causada por CZmrrüÃM/w jjer/nwgem compreendendo a administração do bacteriófago <PCJ22 (KCCMlI36-4P) ou da composição 5 contendo o bacteriófago $CJ22, conforme acima descrito, para, os animais, exceto para os seres humanos.

Efeitos Vantajosos

O bacteriófago $CJ22 (KCCMI136-4P) de acordo com a presente invenção pode ter um efeito bactericida específico contra o Cfes/mZ?w perfetogrw.

Além disso, o bacteriófago <bCJ22 (K.CCMH364P) de acordo com a presente invenção tem um excelente resistência a ácidos, resistência ao calor e resistência à seca, de tal modo que o bacteriófago <hC.I22 (KCCM i 13640) pode ser usado para prevenir ou tratar doenças infecciosas por CtotoWíwí em vários níveis de temperatura ou de pH e condições de humidade, podendo ser utilizado como um antibiótico, «m aditivo alimentar.

tmi aditivo para água potável, um desinfetante, um produto de limpeza eu similar.

Ademais, de acordo cóni à presente invenção, doenças infecciosas causadas por Ctostoàfnw podem ser prevenidas ou tratadas através da administração do bacteriófago <!*C.I22 (KCCM 11364P) ou da composição contendo o bacteriófago <1022 (KCCMI1364I⁵) como um ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos.

Descrição das Figuras

FIG. 1 é uma fotografia, obtida de um microscópio de elétrons, do novo bacteriófago ’> C2sL> < ΜΠ'<ΜΡ óe> ο Ά'ocromip ιΛ> 4K '

FIG. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago <&CJ22.

FIG. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecíi sulfato

6/28 de sódio (SDS-PAGE) do bacteriófago <3>CJ22.

FIG, 4 é um gráfico mostrando o resultado de urn teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago Φ(1Ι22.

FIG. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦΟ22.

FIG. 6 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de. resistência à seca do novo bacteriófago ΦΟ22.

Co»fig»ração IdeaI

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes,. Considerações óbvias e facilmente interp-retáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

Em um aspecto geral, a presente invenção proporciona um novo bacteríófãgo d>CJ22 (KCCM11364P), com uma atividade bactericida específica contra o Cfo.tírií/iwn pe^íngens (CP).

E sabido, que o Ctortrit/iM?? perfiifígemr que é um bacilo artaeróbio obrigatório grande gram-positivo, não possui fiagelos e forma um esporo. O CZmwíZiíw peryHngens, que é urna bactéria que causa diarréia ou problemas similares em animais, partícularmente em animais domésticos tais como aves domésticas, suínos e similares, tem sido reconhecida como uma das bactérias patogênicas perigosas e fetais na indústria animal tal como a /i/fíg-igeha, causando a febre tifeáde aviária.

Um bacteriófago é um vírus bactéria-especifico que infecta bactérias específicas pata suprimir e inibir o crescimento da bactéria, e constitui um viras contendo ácido dgsoxirribonudeico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (SNA) como um material genético.

() bacteriófago <1>CJ22 de acordo com a presente invenção, que é um bactériófego específico para infectar seletivamente o C Vwridíw? per/íwgem, tem urna cápside ísométrica

7/28 e uma cauda não contrâiil e, morfologicamente, pertence ã Sójómvmáíe (FIG. I). Os dados da análise de homologia de sequências de ácidos nUcleicos entre o bacteriófago ΦΟ22 e outros bacteriófagos estão ilustrados na Tabela l. A atividade do bacteriófago '$CJ22 permaneceu estável por 2 horas na faixa de pH 4 a pH 9J (resistência a ácidos, ver FIG. 4).

Ο Φ€.Ι22 reteve sua atividade por 2 horas quando foi exposto a 60 *C (resistência ao calor, ver FIG. 5), e seu titulo foi reduzido etn 2 log após a secagem (ver FIG. 6). A sequência dc ácido nueleico do bacteriófago <t>CJ22 ê a mesma da SEQ ID NO: 1.

O bacteriófago <t*CJ22 isolado pela primeira vez pelos inventores da presente invenção foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microrganísmos (361-221, 10 Hongjedong, Seodaemun-gu, Seul, Cot eia) sob o námero de depósito KCCM11364? em 30 de janeiro- de 2013,

Em outro aspecto geral, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por OartrÁâw? per/róTgeos contendo o bacieriotugo $CJ22 como um ingrediente ativo. Como um exemplo preferível da .15 composição, a presente invenção proporciona um antibiótico.

Uma vez que o bacteriófago ΦΟ.Ι22 tem uma atividade antibacteriana capaz de matar especifícamente o Qo.ww</õ»a o bacteriófago ΦΟ322 pode ser -utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas pela infecção de per/ríngens-. Um exemplo típico de doença infecciosa causada por (J/osvrW?wu per/rmgímv que pode ser tratada com a 20 utilização do bacteriófago Φ022, ê a entente neurótica, mas a presente invenção não se limita ao tratamento da mesma.

A entente necrótíça, que é uma das principais doenças infecciosas provocadas por GasírAm per/rmgcm, se caracteriza por ser uma doença bacteriana cuja ocorrência mais frequente se dá em animais de criação doméstica, partícularmente aves domésticas, causando 25 danos significativos. A doença pode atacar aves domésticas, partí eu larmente frangos em

8/28 todas as Idades, mas se manifesta principalmente em galinhas (2 a 5 semanas de idade) .criadas soltas e também com frequência e.m galinhas (.1.2 a 16 semanas de idade) criadas em gaiolas, 'Como o -Cl&stridíum pefpingens è excess! vamente proliferado no intestino delgado, ocorrem os sintomas de enterite necrótica causando a necrose da mucosa gastrointestinal, diarréia súbito, e efeitos, similares. Por exemplo, suínos com enterite necrótica muito aguda morrem após l a 2 dias de ocorrência, e no caso de enterite necrótica aguda seguida de diarréia com sangue,, os animais morrem após 2 a 3, .Além disso, no caso de enterite necrótica Sub-aguda, a diarréia (sem sangue nas fezes) prossegue durante 5 a 7 dias e, em seguida ocorre fraqueza e .desidratação, e no caso de enterite necrótica. crônica, ocorre diarréia intermitente que pode causar distúrbio de crescimento.

O termo ’’prevenção, tal como utilizado no presente .relatório descritivo, se refere a todas as ações relacionadas com a aplicação do bacteriófago ΦΟ22 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦΟ22 como ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos, a fim de suprimir a doença correspondente ou retardar a ocorrência da doença.

() termo ’’tratamento, tal como utilizado no presente relatório descritivo, se refere -a todas as ações relacionadas com a aplicação d.o bacteriófago OCJ22 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦΌ22 como ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos, para permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causada pela infecção,

Um exemplo de doença infecciosa causada por tta qual o bacteriófago Φ€’122 e/ou a composição contendo o bacteriófago <1>CJ22 .como ingrediente ativo podem ser aplicados, é a enterite necrótica, mas -a presente invenção não está Ihmtada a ela.

A composição para a. prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por CWvÁÚw de acordo com a presente invenção, pode conter o bacteriófago

9/28

ΦΟ22 com ten teor preferível de 5xUF a 5xl0’³ pfu/®fo mais preferivelmente, de 1 x 1.0” a. 1x10’·'·' ptufofo

A composição para a prevenção on tratamento de doenças infecciosas provocadas por CAxs/nJhuu piírpfngtífj* de acorda com a presente invenção pode ainda conter um excipiente 5 farmacêutico aceitável e ser formulada juntamente com o excipiente para, dessa forma, ser fornecida como alimento, um fármaco, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável e similares, O termo excipiente farmacêutico aceitável”, tal como utilizado no presente relatório descritivo, significa um excipiente ou um diíuente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica eas propriedades de uma composição administrada.

.10 O tipo de excipiente que pode ser utilizado na presente invenção não é limitado a um tipo especifico, podendo ser utilizada qualquer substância, comumente utilizada na técnica como excipiente farmacêutico aceitável. Como exemplos não restritivos do excipiente, podemos citar solução salina comum, água esterilizada, soro fisiológico tamponado, solução de Ringer, solução .injetável de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol, e outros similares. Um ou uma mistura de pelo menos dois destes exçipíentes podem ser usados.

Além disso, se necessário, outros aditivos em geral, tais, como um antioxidante, uma solução tampão, um agente bacteriostâtico, e/ou similares, também podem ser adicionados ou utilizados, e a composição pode ser preparada com. uma formulação para injeção, tal como 20 solução aquosa, suspensão, emulsão, ou similares, pílulas,. cápsulas, grânulos. comprimidos, ou similares, através da adição de um diíuente, um díspersanie, um surfeetante, um aglutínante, um lubrificante, e similares, para então serem utilizados.

Um método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por Cfosíráfíum per/ríagem não apresenta limitações, de tal sorte que 25 qualquer método comumente utilizado na arté pode ser utilizado. Como exemplo não

10/28 limitativu do método de administração, a composição pode ser administrada por via orai ou parentética.

Como exemplos não restritivos- da formulação para a administração por via oral, podemos citar trociscos, pastilhas,, comprimidos, suspensões.-aquosss, suspensões oleosas, pó 5 preparado, grânulos preparados, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes, elixires ou similares.

A fim de formular a composição de acordo com a presente, invenção em uma formulação tal como um comprimido, uma cápsula, ou similar, a formulação pode ainda conter um aglutinaras tal como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectína, 10 celulose, gelatina; um excípiente tai como fosfato dicálçíco, ou similar: um des integrante tal como amido de milho, amido de batata doce, ou similar; um lubrificante tal como ©stearato de magnésio, estearato de cálcio, estear! I fomarafo de sódio, cera de polietilenoglicol, ou similares. No caso de formulação em cápsula, a formulação pode ainda conter um excípiente liquido, além dos materiais, acima mencionados.

Como um método de administração parentética, é possível utilizar um método de administração intravenoso, um método de administração intraperitoneal, um método de administração intramuscular, um método de administração por via subcutânea, um método de administração local, etc.. Além disso, também é possível utilizar um método de aplicação ou pulverização da composição sobre o local da doença, embora a presente invenção não esteja 20 Iimitada a tal método.

Exemplos de formulações para administração parentérica podem incluir formulações injetáveis para serem aplicadas por meio de injeção, subcutânea, injeção íntravenosa, injeção intramuscular, ou similares; formulações para supositórios; formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol, que podem ser inaladas através do sistema respiratório, 25 ou similares, embora a presente invenção não esteja limitada a tais formulações. Á fim -de

11/28 preparar a composição para a formulação de injeção, a composição de acordo com a presente invenção pode ser misturada com um estabilizador ou uma solução tampão em água para preparar uma solução ou suspensão e, em seguida, a. solução preparada ou suspensão pode ser formulada em dose individual para uma ampola ou fiasco. No caso da composição formulada 5 para pulverização, tal como a formulação de aerossol ou similar, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em pó seja dispersa.

Uma aplicação apropriada, spray, ou dose de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por Cfatâríítíufn per/Hngíms pode ser 10 díférentemente determinada dependendo de fatores tais como a idade, peso, sexo, grau dos sintomas da doença, tipo de alimentação e taxa de excreção dos animais sujeitos à administração, ou condições similares, bem como o método de formulação da composição, o método de administração, o tempo de administração e/ou via de administração. De modo geral, um veterinário com conhecimentos na técnica pode facilmente determinar e prescrever 15 uma dose eficaz para o tratamento pretendido.

Em outro aspecto geral, a presente invenção pode proporcionar usí antibiótico contendo o bacteriòfago ΦΟ22 como urn ingrediente ativo,

O termo antibiótico, tal comó utilizado no presente relatório descritivo, significa um agente capaz de ser ministrado em animais, incluindo seres humanos, em forma de droga 20 para matar as bactérias, e corresponde a um conceito representando coletivamente um conservante, um desinfetante, e um agente antíbacteriano.

O antibiótico contendo o bacteriòfago ΦΟ22 como .ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção, pode apresentar uma elevada especificidade para o pc.fortegcnx se comparado com outros antibióticos disponíveis no estado da técnica, com a 25 capacidade de não matar bactérias benéficas, mas apenas bactérias patogênicas especificas.

12/28 sendo caracterizada ainda por não induzir resistência à droga, de modo que o antibiótico de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como um novo antibiótico com tempo de vida maior quando comparado com os antibióticos disponíveis no .estado técnica.

Em outro-aspecto gerai, apresente invenção pode proporcionar um aditivo alimentar e 5 ura aditivo para água potável contendo o .bacterióíago »>CJ22 como um .ingrediente ativo.

O aditivo alimentar e o aditiva para.água potável de acordo com a presente invenção pode ser utilizado de tal forma que o bacteríófago ΦΟ22 ou a composição contendo o mesmo seja preparado individualmente como mn aditivo alimentar ou para água potável-,, e em seguida misturado a ara alimento ou água potável, ou de tal forma que o bacteríófago 10 ΦΟ22 ou a composição contendo o bacteríófago <IX,J22 -seja d/reiamente adicionada no momento da preparação do alimente ou da água potável.

O bacteriófago foCJ22 ou a composição contendo o bacteríófago Φ('122 utilizada como aditivo alimentar ou para água potável de- acordo com a presente invenção pode ser formulado no-estado líquido ou sólido, preferivelmente em fbr.ma.de pó seen.

Um método de secagem para a preparação da aditivo alimentar e do aditivo para água potável sob a. forma de pó seco de açordo com a presente invenção não apresenta limitações e um método comumente utilizado pelos peritos na arte pode ser utilizado. Como exemplos não limitativos do método de secagem, podemos usar um método de secagem natural com ar, um método de secagem natural, um método de secagem por pulverização, um .método de 20 secagem pôr congelamento, ou métodos similares, üm destes métodos pode ser ui.it i-zado sozinho au pela menos dois destes métodos podem ser utilizados em conjunto.

Outro micróbio não patogênico pode ser adicionado ao aditivo alimentar ou aoitivo para água potável» Como exemplo não restritivo do micróbio a ser adicionado, é possível escolher ura micróbio selecionado dentre um grupo compreendendo Boei/fos sp... capaz de 25 produzir, protease, lipase e/ou enzima de conversão de açúcar, tal como Brrefows fofoo/ís ou

13/28 similares; um vp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbíças, tal como o estômago de vaca; fungo de mofo com capacidade de aumentar o peso de um animal doméstico, a produção de leite, e a digestão de alimentos como Aspergí/iw e^w, ou similares; e leveduras como 5 &ce/?í?romj^fCi<v tvreràw, ou similares. Um ou a combinação de pelo menos dois destes micróbios podem ser utilizados,

O aditivo alimentar ou aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦΟΙ22 como ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção, pode ainda conter outros aditivos, conforme necessário. Como um. exemplo não restritivo de aditivo, é possível utilizar 10 um aglutinante, um emalsíficante, um conservante, e similares, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nítrogenadas não proieicas, silicates, soluções tampão, agentes corantes, agentes ©xtratantes, oligossacarídeos. e similares, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável. O aditivo pode incluir ainda um 15 agente de mistura para alimentos, ou similar. Um ou a combinação dé pelo menos dois destes aditivos podem ser utilizados.

O aditivo alimentar pode ser adicionado num teor de 0,05 a 10, preferivelmente de 0,1 a 2 parles por peso. com base em 100 partes por peso do alimento. O aditivo para âguá potável pode ser adicionado num teor entre 0,0001 a 0,01, preferivelmente de 0,001 a 0,005 2(1 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. A atividade do bacteriófago d>CJ22 contra o CfoxfràZwn per/r/ngens pode ser suficientemente demonstrada nas faixas acima mencionadas.

Em outro aspecto geral, a presente invenção proporciona um alimento ou água potável preparados pela adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o 25 bacteriôfâgo ®CJ22 como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ¢(5.122..

14/28

O alimento utilizado na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer outro alimento comumente usado pelos peritos nâ arte pode ser utilizado. Urn exemplo não restritivo do alimento pode incluir alimentos vegetais como grãos, raízes e frutas, -subprodutos de processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos- farmacêuticos, gorduras, amidos, euewbitáceas ou subprodutos de cereais; e alimentos para animais, tais como proteínas. materiais inorgânicos-, gorduras, minerais, proteínas de células individuais, plânctons animais ou alimentos. Um ou a combinação de pelo menos dois destes -alimentos podem ser utilizados,

A água potável usada na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável pode ser usada na presente invenção.

Em outro aspecto geral, a presente invenção pode fomece-r um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriòfago ΦΟ22 como um ingrediente ativo, Uma formulação do desinfetante ou produto de limpeza, não apresenta limitações, de vai sorte que o desinfetante ou o produto de limpeza podem ser preparados com qualquer formulação conhecida na arte.

O desinfetante pode ser pulverizado de modo a eliminar o Oosrr/dhí?» /jer/ringmy em uma região onde vivem os animais, em um matadouro, em uma área de mortalidade, em uma cozinha o.u em um. equipamento de cozinha, ou similares, não estando a presente invenção limitada- a este-s exemplos.() produto de limpeza pode ser usado para lavar as superfícies da pele ou todos os locais dos corpos dos animais expostos ou a serem expostos ao CZostrW/u»? /«/glargtouv partícularmente aves domésticas ou suínos, não estando a presente invenção limitada a estes exemplos.

Em outro aspecto gerai, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou atamento de doenças infecciosas provocadas por Cfaimfam pez/rrâgem, utilizando- o

15/28 bacleriófago 0CJ22 ou a composição contendo o bacteriófago Φ€522 como um ingrediente ativo. A doença infecciosa pode ser preferivelmente a enteríte necrótica, não estando a presente invenção limitada ao tratamento e prevenção desta doença. Q objetivo de prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas por Cfe.s/rtóZZum perfrfogem' pode ser aplicado a aves 5 domésticas ou suínos, não estando a presente- invenção limitada ao tratamento destes animais.

Especifica men te, o método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas de acordo com a presente, invenção pode incluir a administração do bacteriófago ΦΟ.Ι22 -ou da composição contendo o bacteriófago ΦΟ22 como ingrediente ativo para animais infectados ou que estão em. risco de infecção por tfessíriífem® em uma dosagem fm•macéuuca eficaz, exceto para os seres humanos. Será evidente para os peritos na arte que, quando a composição farmacêutica é administrada ao paciente, a dose total diária adequada pode ser determinada por um médico assistente ou veterinário de acordo com sua avaliação médica.

Uma dose farmaceuticamente eficaz específica do bacteriófago ΦΟ22 ou da 15 composição contendo- o bacteriófago ΦΟ22 como ingrediente ativo para urn determinado animal, pode ser determinada considerando-se o tempo de administração e a -via de administração do bacteriófago $CJ22 ou da composição contendo o bacteriófago Φ<022, a taxa de secreção da composição, o período de duração de tratamento, ou fatores similares, somados ao tipo e ao grau de resposta desejada^ a idade, peso^ estado -geral de- saúde, sexo, ou 20 diets de determinado animal. Afem disso, a dose farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores, tais como os ingredientes das drogas ou de. outras composições .usadas simultaneamente ou separadamente, e outros fatores similares bem conhecidos na área médica.

O bacteriófago Φ022 de acordo com a presente invenção ou a composição contendo 25 o bacteriófago ΦΟ22 como ingrediente ativo pode ser administrado, como uma forma .16/28 farmacêutica (spray nasal) para animais ou administrado como um método de adição direta em um alimento ou na água potável dos animais, que em seguida comem o alimento ou bebem a água potável. Além disso, o bacterlófago ΦΟ22 ou a composição contendo o mesmo podem ser misturados em um alimento ou na água potável em forma de adííivo alimentar ou aditivo para água potável, para então ser administrados.

A via de- administração e o método de administração do bacteriófago <ÍCJ22 de acordo com a presente invenção ou da composição contendo- o bacteriófago <PCJ22 como ingrediente ative não apresentam limitações, de tal sorte que-qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦΟ22 ou a composição comendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado, isto é, o bacteriófago ΦΟ22 ou a composição contendo o bacteriófago ΦΟ22 como o ingrediente ativo- pode ser administrado através de várias vias oral ou parentérica. Exemplos não restritivos da via de administração podem ser a via oral, retal, local, intravenosa, intraperitoneal intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação, ou similares.

Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. Entretanto, estes exemplos são apenas ilustrativos e não têm o propósito de limitar o escopo da presente invenção.

[Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago infectando C/wrâZfom <Exemplo l-I>

Sçlç£ãndobgçt£|i^

Foi isolada uma amostra de 5(W de fezes colhida na empresa Samwhaw Gps. Breeding Agri. ínc., uma fazenda agrícola d.e galinhas e porcos da província de Chtmgchong do Sul. República da Coréia, Introduzida numa garrafa. centrífuga e centrifugada a 4.000 rpm por IO minutos, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45pm para preparar uma solução da amostra, e em seguida foi aplicado um método de sobreposição de ágãr macio

I 7 3 utilizando a solução da amostra preparada. O método de Sobreposição de ágar macio é um método de observação da ação da li.se do bactériófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre- um meio sólido com 0,7% de ágar).

Específieamente, ISwú de amostra filtrada foi misturada com 150fo? de uma solução 5 agitada da cultura (OD^ ^:::: 2) de CZosrrà/fton pe/Yrfogens, (CP. BCCP 17-1) isolada na Agência de Quarentena de Animais e Plantas local, e 2W^? de infusão de IOXBrain-heart (doravante denominado meio ‘ΒΗΓ) (composta para gerar um volume final de 11.) e cultivada a 37X por 18 horas. Em seguida, a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45«». Em seguida, uma mistura de.5tó’ .0 de ágar a 0,7% (w/v) e 15ÓM da solução agitada da cultura (ODe.« ~ 2) de Cfosfoáfow /íer/rrâgmr (B-CCP 17-1)foi despejada e-endurecida numa-placa BHI (BHI -t 0,2% de s-angue de-ovelha), i(W da solução filtrada da cultura da amostra foi derramada sobre a mesma, seguida por ama cultura a 3(fiC por 18 horas. Em seguida, ocorreu a formação de. uma placa.

Depois de filtrada, a. solução da cultura da amostra, na qual a líse foi gerada, foi adequadamente diluída e misturada com 150fo^; de solução agitada da cultura (OI)^» ~- 2) de êfoztírfoíwj pérfofogws (BCCP 17-1), o método de sobreposição em ágar macio foi realizado, obtendo-se assim uma única placa. Considerando-se que uma única placa foi formada a panic dé um único bactériófago. foi selecionada uma única placa para purificar e isolar o único bactériófago, colocada em 400/./0 de uma solução SM (NaCI 5,8 g/1;

MgSO47H2O 2g / I ; 1 M de Tris-CI (pH 7,5), 5ümfo H2O, composta de modo a gerar um volume final de IL), e deixada, ã temperatura ambiente durante 4 horas, purificando e isolando assim um único bacteriófngo.

A fim de garantir uma grande quantidade do bactériófago isolado, lOOrfo de um sobrenadante de- uma única solução de bactériófago foram selecionados e misturados com

18/28

12mê de 0,7% de ágar e 500x2 da solução agitada, da cultura de Clostridium per/rfogem (BCCP 17-1), sendo realizado em seguida o método de sobreposição de ãgar macio em um meio LB com um diâmetro de 150 mm. Depois de derramar a solução de ISw? da solução SM em uma placa em que a lise foi co.mpletamen.te gerada, a placa foi suavemente agitada à temperature ambiente durante 4 horas, descarregando assim o bacteriófago no ágar de superfície. A solução SM. em que o bacteríófago foi descarregado foi recuperada, sendo adicionado clorofórmio numa quantidade de 1% do volume final e adequadamente misturada durante 10 minutos, seguida por cenírifugaçâo a 4.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido tal como descrito acima foi filtrado com um filtro de 0,45um e armazenado a uma .10 temperatura fria.

Cultura em grande escala e purificação de bacteriófago

O baeteriótago selecionado foi cultivado em grande escala, utilizando CAuvòVfomz? ner/mígem (BCCP 17-1) e, em seguida, o bacteríófago foi purificado.

Especlfícamente, I % da solução agitada da cultura de per/Hpgen,? (BCCP

17-1) foi inoculada num meio de cultura líquida para produção em massa e, ao mesmo tempo, o baeteriótago foi colocado no seu interior em multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1, simultaneamente com a inoculação de Ç/osírÀ/Orm pcq/wtgms (BCCP Π-l), realizando assim a coinfecção. Em seguida, a cultura estática foi realizada a 3ÍPC sob condições 20 anaeróbias.

Em seguida, a cenírifugaçâo foi realizada a 4·% e .12.000 rpm por 20 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45/zm.. Em seguida, NaCl e poílétilenogfieol (PEG) foram adicionados ao sobrenadante filtrado de modo a obter uma concentração final de IM e 10% (w/v) respectívameníe, e a mistura foi deixada a uma 25 temperatura de 4^eC durante 8 horas ou mais. Em seguida, foi realizada uma cenírifugaçâo a.

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4^aC e 12,00() rprn por 20 minutos, o sobrenadante lbs removido e os precipitados foram obtidos.

O precipitado obtido- foi- ressuspendido em da solução SM e foi deixado a uma temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida. o .sobrenadante foi filtrado com um 5 filtro de 0,45u?s. e foi realizada uma ultracentrifagaçSo (35.000 rpm, 1 bora, 4^eC) utilizando um método de gradiente de densidade de glicerol (densidade: 40%, 5% de .glicerol), purificando assim o bacteriófago Φ€Ι22, Depois do 4>CJ22 purificado ser ressuspendido em 500fo^; da solução SM, um título foi medido.

Os inventores da- presente invenção denominaram o bacteriofago obtido através da 10 extração da amostra de fezes com atividade bactericida especifica contra o Cfcwfrtâíum de ’’Bacteriófago 4>CJ22”, e depositaram o bacteriofago no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (361-221, Hongjedong, Seodaemun-gu. Seoul, Coréia ) em 30 de. janeiro de 2013 sob o número de depósito KCCMI1364P.

Observação morfológlea do ΦΟ22

O bacteriófago ΦΟ22 purificado foi diluído em solução de gelatina- a 0.01%, e em seguida fixado em solução de glutaraldeído a 2,5%, O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm) durante 10 minutos e lavado eom água destilada estéril Uma película de carbono foi disposta sobre uma 20 grelha de cobre, tingida com 4% de acetato de uranilo durante 30 a 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-I0II, 80kV. ampliação: XI 20.000 para X200.00Ü) (FlG.l).

A FIG. 1 mostra ama fotografia do bacteriófago foCJ22 feita pelo microscópio de elétrons onde é possível observar que, como o bacteriófago não tem umacápside isométrica e 25 uma cauda eontrátil, o bacteriófago pertence morfologicamente à < Exemplo 3>

Anahge do tgnranhq dq DNA genômiço do ΦΟ.Ι22

DNA genomico foi extraído a partir do bacteriófago Φ€.Ι22 purificado por uhracentrifugação. Especifícamente, o ácido eti lenodiaminotetra.cético (EDTA, pH 8,0}, proteinase K e dodecil sulfato- de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução- da cultura do bacteriófago ΦΟ22 purificado de modo a ter uma concentração final de 20 mM, 50μ/%, e 0,5% (w/v) respeetívamente e, em seguida, foram deixados a 50°C durante I hora. Depois disso, ura volume igual de fenoi (pFI 8,0) foi adicionado, agitou-se, e centrifugou-se em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um -sobrenadante.

O sobrenadante foi misturado com um volume igual de PC (fenol: clorofórmio ^::: 1:1) e centrifugado em temperatura ambiente- e 12,000' rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim ura sobrenadante. O sobrenadante foi misturado eom um volume igual de clorofórmio e centrifugado era temperatura ambiente- e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim ura sobrenadante. O sobrenadante obtido fói misturado sequencialmente com 10% (v/v) de acetato de sódio 3.M e um duplo volume de etanol frio a 95% com base no volume total, e deixado a -20^aC durante I hora. Em seguida foi realizada centrifugaçãb a 0°C e 12.000 rpm por 10 minutos, e o precipitado foi obtido por remoção do sobrenadante. Em seguida, 50:.% de Tris-EDT/A (TE) solução tampão (pH 8,0) foi adicionado à mesma, para assim dissolver o precipitado obtido. O DNA extraído foi diluído 10 vezes e a concentração foi mensurada medindo-se a absorção em ODs^.

Em seguida, de DNA foi carregado em 1% de eletroforese em gel de campo pulsado f.PFGE), em gel de agarose, e a eletroforese .fói realizada- em temperatura ambiente durante 20 horas utilizando um programa do sistema BIORAD PFGE, programa 7 (tamanho: 25-100 kh; tempo de comutação: 0,4-2,0 segundos, forma linear; tensão direta: 180V; tensão 2-5 inversa: 120V) (FIG. 2).

21/28

A FIG. 2 é uma fotografia da eletrofbrese em gel de campo pulsado (PFGE) do DN-A genômico do bacteriófago foCJ22, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do baeteriófago' 4>CJ22 tem um tamanho de cerca de 56kb.

Anáhe du paprlo d

15/2 da solução do baeteriólãgo ΦΟ22 purificado (título 10^ibpfu/ml) foi misturada com 3í2 de uma solução- de amostra 5.X SDS e aquecida durante 5 minutos. Em seguida, a proteína total- do bacteriófago Φ(?.Ι22 foi expandida em 15% de gel SDS-PAG.E e, em seguida, o gel foi tingido em temperatura ambiente durante 1 hora usando uma solução de corante azul de coomassie (FIG. 3).

A FIG. 3 ê uma fotografia, da eletrofbrese mostrando o resultado cia SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦΟ22, sendo observadas proteínas principais eom tamanhos de cerca de 40kJ)a, 5IkDa, 53kDa e 70kDa. Na FIG. 3. Mé uma proteína que se torna, um padrão para medir o peso molecular, <ExempIe 5>

Aná[íse.da.soquên.cia do gene do Φ€322

A fim de confirmar características genéticas do bacteriófago Φ<322 purificado, o DMA do bacteriófago ΦΟ22 foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise do gene. Genes foram montados em Maerogen INC. utilizando GS e o software novo (Roche·.), A. analise da sequência de um quadro aberto de leitura foi realizada utilizando Gene.MArk.hmm, Glimmer v3.02, c software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi realizada usando BLAS1P e pro g ram a í n ter Pro Scan.

A sequência do gcnoma do novo bacteriófago obtido apresentava, várias semelhanças com as dos baeterióíagos existentes, mas foi confirmado que um bacteriófago com todas as frações (100%) iguais às do bacteriófago da presente invenção- não existia. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago-de acordo com a presente invenção foi isolado.

Dados da análise de homologi-a da sequência de áeido nucieico entre o bacteriófago

ΦΟ22 e outros bacteriófágos estão ilustrados na tabela 1, (Tabela 1]

Fergwsia	ObíW> tosusçsís	È-Vaiue	Etefiíitoks
	<?o«spri mcnía		Fim	.to!.::·.t.->í:i·	ÍX-í.. 1%)
cosíigftWfíf ,p?730íí?3	44!	31	344	Proteína puiaib»: Aqusfes VFSj	317-:4	53;'!?2	34
	<00	1	715	Ρϊί>ί't«ít de <forft!:>C. femííia 55®; 1 áryíwid:;! S-xniiitexig/eii: 1 44441	1&41	141/3 i 5	32
.................. 44:sis30f81í,jpC>33f 1	374	<7	345	Proteins hiposiúca A3ÍA4XS. ,43344 1.3::.:.-: AftslxsrííiR:·! í.)i>SÍÍ?3Xq	7E-47		41
_í jí>.	2S68	24 i íl	2X57	Pwjtffe/í ;<·;? AC 3 2545 IftStri jAílil píí: ·ίήν:^ΐ)ίΐ$: D. . JGWÍS7	7E-55	/43/154	AS
	2«	1	2ü?	S.:.:.·:...·::1«B llArísM<:g* (CtoüiáiíiS! P%!BSÍAS C At'_:.4 ': 1433:	54'22	4?;»9	t-X
e:iHSg34441 .ísj-OTÍÇ	533?	28	!254	PíiXíS :<S de (fefíS :!- fe aí:i:;-> lf 1 «' 1:1::::: í::T: ^; > · ( .< :fs ' 0 . 1 SÍ?3:j	ÍL-É?	2443421	47
s:S4t:g44441 >;rs?í>í7	!W	28	5?5	JWteiaa Sipí/iiLea -WRaI--7434 JÁíXe [SuMetenacesí! fsicfeiMW'i C4431	43-14	Wis-S	A:>
<-«Hí:g4444i wffiÓOs·)	134?	583	753	pAlií:iü<: hípt.íêí:A: !^!CC7434,55i4 K yaüi-tiKss sp >; <. 7424J	13-45	3175?	54
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25/28

Verificou-se que a sequência parcial do genoma do bacteriófago ΦΟ22 é a mesma para SEQ ID'Notl. A sequência do genoma foi determinada por intermédio de um analisador genético.

«Exemplo 6>

Teste de estabilidade-do ΦΟ22 dependendo do pH

A fim de confirmar a estabilidade- do bacteriófago ΦΟ23 em um ambiente de baixo pH. foi realizado o teste de estabilidade sobre uma larga -gama de pH. (pH 4,0 / .5,5 /6,4,' 6,9/ 7,4 / 8.2 / 9,0 e 9,8).

Para o teste, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH 4.0, pH 10 5,5 e pH 6,4), solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,9 e pH 7,4), e uma solução de Tris1-ICI (pH 8,2 / pH 9,0 e pH 9,8)] foram preparadas a uma concentração de 0,2 M, respectívamente.

Depois que 90/ίέ de cada uma das soluções de pH foi misturada com de solução de bacteriófago com um título I .OXHfpfo/W, de tal modo que uma concentração de cada 15 solução de pH tornou-se 1 M, cada uma das soluções de pH foi deixada em temperatura ambiente durante 30 minutos·, 1 hora, e 2 horas. Em seguida, a sohiçlo reaeional foi diluída passo a passo, lOoi? da solução diluída em cada passo foi derramada e cultivada a 30^uC durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio, e o titulo tbi medido através da.presença ou ausência de lise (FIG. 4).

A. FIG. 4 mostra um resultado do teste de resistência ao ácido do bacteriófago $€J22..

Conforme ilustrado na FIG. 4, foi confirmado que o bacteriófago ΦΟ22 não perde a sua atividade e permaneceu sign!ficaiivamente estável, em um intervalo de pH de 4.0 a 9,8 por até 2 h-sma.

«Exemplo 7>

Tesredemabilidadedu.M^áldepender^J^

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Foi realizado um teste para confirmar a estabilidade -contra o calor gerado durante o processo de formulação do bacteriòfago, no caso de usar o bacteriòfago como uma formulação de aditivo alimentar entre as formulações do bacteriòfago,

Expecificamente, 20ÍW da solução do- bacteriòfago ΦΟ22 com um titulo 5 I.OXHfipfoW foram deixados a 60^aC por 0, 10, 30, 60, e 120 minutos. Então, as soluções, acima foram diluídas passo a passo, KW de- cada uma das soluções diluídas- foram derramadas e cultivadas a 3Q°€ durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de Use (IIG, 5).

A FIG. 5- mostra o resultado obtido através de- um. teste de resistência ao calor do 10 bacterióíàgo ΦΟ22.. Conforme mostra a FIG. 5, é possível verificar que a atividade não foi signíficatívamente diminuída até o bacteriòfago ΦΟ22 ser exposto a 60'% durante 3 horas.

< Exemplo 8>

Teste de estabilidade do 44322 contra a seçaegm foi realizado um teste para confirmar a estabilidade contra condições de secagem 1.5 geradas durante um processo de formulação do bacteriòfago, no caso de usar o bacteriòfago como uma formulação de .aditivo alimentar dentre as demais formulaç-oes do bacteriòfago.

Espec-í ficamente, KXW de solução do bacteriòfago ΦΟ22. com um titmo 1,0X lí)^spfoW foram -secos a 60% durante 120 minutos, utilizando um concentrador centrifugo a vácuo (Speed* V.accum Concentrator 5301, fcppendorf). O -sedimento obtido apos 20 a. secagem foi colocado e ressuspendido- numa solução de SM a um valor equivalente ao de uma solução inicial a 4°C durante um dia.

Em seguida,, as soluções acima foram diluídas passo a passo, ItW da soiuçáo diluída em cada passo foi derramada e cultivada a 30'% por 18 horas pelo método de- sobreposição em ága-r macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de líse (FIG. b).

A FIG. 6 mostra o resultado de um teste de resistência à secagem do bacteriófago ΦΟ22. Conforme ilustrado na FIG. 6, é possível notar que o bacteriófago OCJ22 foi reduzido em cerca de 2 log após a secagem.

«Exemplo 9>

Teste de espectro dc infecção dofoCJ22 com relação a estes JalfooádyaggmJg 'Tendo ou não atividade lítica. o bacteriófago ΦΟ22 foi testado em 45 estirpes de tipo selvagem de C&m7fú:/íwj isolados pela Agência de Quarentena Vegetal e Animai e pela Universidade Kunkuk diferentes dos C/tó'tr«/?mn /wforçgmv (BCCP 17-1) utihzados 10 no ex perirn en to.

Especificameftte, UW de solução do bacteriófago ΦΟ2.2 com um titulo L0X10^K’pfo/8$ foram misturados com uma solução de 150pé^; de cultura .agitada (OIXw,·^::: 2) década uma das estirpes, sendo derramada e cultivada a durante lb horas pelo metouo de sobreposição em ágar macio. Em seguida, observou-se se uma placa foi ou não formada.

Como resultado do experimento, entre 45 estirpes de tipo selvagem, oe. Cfetrafoen per/rfogemç 4-2 estirpes foram infectadas, de tal forma que a proporção de infecção foi de cerca de 93,3% e a razão de lise foi de cerca de 75,6%. Os resultados estão nas Tabelas 2 e 3.

[Tabela 2]

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K unkuk Universitv

University

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kt i M12098

28/28 [Tabela 3]

Origem do ÇP	.surge do t,P	In feet A jj.uk-	ί stírpe tá? CP	Infecdv idade
Agi'Bciu de Onarentena Vegetal e Animal	CP-KJW-I		B( ( P43-I	4/- i
Animal and Plant	P-1\?U	.5.4.4,	B(’CP4-M	+ :
Quaramme Agency	2P 03 x 2	H-r	BCÍ P P-2	r++
	CP-BC-1 k-H·	B( LP4S-3	.44.,4
	CP-BSW-4 H->!	BCCP50-1-3	+7-
CPdiBM-2 -++	BCCP50-1-8
	UP Hl.	4,.4.4,	B< ( PM-J-l
UP-KW-I	4..4..,	BCCP5I-O5
	CP-BS-1		B( < P52-2-8
	CP-HL-I	4..44.	BCCP53-2-3
CP-UN-1		BCCP54-3-8	..............................................
	BCCP17-I	4,4.4	BCCP55-34	-r-t-À-
	Hi i p?Xt	4..4.:.	SIH t P42.O-2	44.,4.
	B( CPU-2		SBICPOJ	4.4.4,
	JU { p^-i	-y-k -x·	SIR ( Pte '
BCCP39-I		SBCCP361	Λ.,λ,.ζ. \ 1 >
	BCCP40-1	ÍÇ-	ELCCP Suksan Kim	χ,-4··
	BCCP4I--3	4.4,4.	EI.CCP6-I Í niesii rms	Η*
	BCUP12-2	.44.4..	Hit P6 ! ápêndite

κι ί\· ιχηκ \çòi s

Claims

1. Um novo bacteriófago 4>CJ22 {KCCM11364P). caracterizado por apresentar uma atividade bacterlcida específica contra o Cfottrídfam pez/r/ngenr.

2. Uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por

5 Cbstridium caracterizada por compreender o bacteriófago ΦΟ.Ι22 (KCCM11364P) da reivindicação I como uni ingrediente ativo.

3. A composição de acordo com a reivindicação 2, earaçtrcizada pelo fato da doença infecciosa ser a enterite necrótica.

4. Um antibiótico, caracterizado por compreender o bacteriófago· <1>CJ22 (KCCMl 1364P) da 10 reivindicação 1 como um ingrediente ativo.

5. Um aditivo alimentar ou um aditivo para àgua potável, caracterizado por compreender o bacteriófago Φ€222 (KCCMl 1364P) da reivindicação l como um ingrediente ativo.

6. Um desinfetante ou um produto de limpeza, caracterizado por compreender o bacteriófago Φ(?322 (KCCMl 1364P) da reivindicação l como um ingrediente ativo.

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7. Um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por <?/os/nzó'a»í pez/ròígemç caracterizado por compreender a administração do bacteriófago ΦΟ22 (KCCM11364P) da reivindicação 1 ou da composição da. reivindicação 2, para animais, exceto seres humanos.

8. O método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da doença infecciosa

20 ser a enterite necrótica.