BR112015020695B1

BR112015020695B1 - Composição, aditivo alimentar ou um aditivo para água potável e desinfetante ou um produto de limpeza

Info

Publication number: BR112015020695B1
Application number: BR112015020695-6A
Authority: BR
Inventors: Bo Kyung Son; Gi Duk Bae; Jae Won Kim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2023-03-28
Also published as: TR201906890T4; WO2014133323A1; DK2961835T3; KR101381797B1; EP2961835A1; US9745555B2; JP6110515B2; EP2961835A4; PH12015501887A1; US20160076004A1; PH12015501887B1; CN105008525A; EP2961835B1; CN105008525B; ES2724298T3; BR112015020695A2; JP2016518810A

Abstract

NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO ANTIBACTERIANA COMPREENDENDO O MESMO A presente invenção se refere a um novo bacteriófago ?CJ21 (KCCM11363P). A presente invenção se refere ainda a uma composição antibacteriana, compreendendo o bacteriófago ?CJ21 (KCCM11363P) como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Clostridium perfringens em animais, exceto seres humanos, utilizando o bacteriófago ?CJ21 (KCCM11363P) ou a composição antibacteriana compreendendo o bacteriófago ?CJ21 (KCCM11363P) corno um ingrediente ativo.

Description

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um novo bacteriófago com uma atividade bactericida específica contra o patogênico Clostridium perfringens, e uma composição antibacteriana compreendendo o mesmo. A presente invenção se refere ainda a um método de prevenção e tratamento de doenças de animais utilizando o novo bacteriófago ou a composição antibacteriana.

Antecedentes da Invenção

O Clostridium perfringens (CP), que é um bacilo anaeróbio obrigatório grande gram-positivo, é conhecido como uma bactéria que não possui flagelos e forma um esporo. O Clostridium perfringens, que é uma bactéria causadora de diarreia, ou similar, particularmente em animais domésticos tais como frango, porco, etc., e similares, tem sido reconhecida como uma das bactérias patogênicas perigosas e fatais na indústria animal, tal como a Salmonella, causando a febre tifoide aviária.

Atualmente, uma das doenças frequentemente geradas nas indústrias de aves e suínos é a enterite necrótica por Clostridium perfringens. Sabe-se que a enterite necrótica é frequentemente gerada por uma coinfecção de Clostridium perfringens e Coccídeo, e como sintoma principal da enterite necrótica, produz diarreia com sangue devido a lesões necróticas graves em uma porção inferior do intestino delgado de frangos, suínos e similares. Esta enterite necrótica gera sintomas de desidratação, diarreia periódica e sintomas similares no animal infectado, de acordo com a gravidade da doença, e gradualmente debilita o corpo do animal, causando atraso no crescimento, dentre outros problemas, de tal modo que a enterite necrótica tornou-se um problema significativo na indústria animal. Além disso, como o Clostridium perfringens é facilmente propagado através de fezes de animais, a transmissão entre animais num espaço comum de reprodução pode ser facilmente gerada por infecção oral através do solo, alimentos contaminados ou situações similares. Particularmente, a incidência em animais jovens é elevada, de tal modo que o Clostridium perfringens tornou-se um grande problema.

Por sua vez. o bacteriófago é um tipo especializado de vírus que infecta e destrói somente bactérias, e pode se autorreplicar somente dentro de bactérias hospedeiras. O bacteriófago apresenta forte especificidade hospedeira em comparação com os antibióticos e. recentemente, o aparecimento de uma estirpe resistente a antibióticos tornou-se um grave problema, de tal modo que o interesse no uso prático do bacteriófago tem aumentado (Documentos não patentários 1 e 2).

Portanto, pesquisas relativas a bacteriófagos foram ativamente conduzida em vários países de todo o mundo e, além de pedidos de patentes para bacteriófagos, houve um aumento gradual nos pedidos de aprovação encaminhados ao Food and Drug Administration (FDA) para composições contendo o bacteriófago.

Com relação aos bacteriófagos disponíveis no estado técnica, o Documento Patentário 1 revela um bacteriófago com uma atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens, e o Documento Patentário 2 revela um bacteriófago com uma atividade bactericida específica contra Staphylococcus aureus. Além destes, o Documento Patentário 3 descreve uma proteína lítica derivada de um bacteriófago que destrói especificamente a estrutura do peptidoglicano da membrana celular bacteriana, e bactérias lisadas pela proteína lítica.

Entrentanto. apesar da existência dos referidos documentos no estado da técnica, urna tecnologia associada com o bacteriófago para prevenir e/ou tratar doenças infecciosas, particularmente a enterite necrótica por Clostridium perfringens, que é ainda um problema importante na indústria animal, incluindo as indústrias de aves e suínos, é ainda insuficiente, de modo que um bacteriófago e uma tecnologia associada com o bacteriófago devem ser desenvolvidos.

Documentos disponíveis no estado da ténica Documentos Patentários -Documento Patentário 1: Patente coreana publicada No. 10-2012-0076710 A -Documento Patentário 2: Patente coreana registrada No. 10-0910961 BI -Documento Patentário 3: Patente coreana publicada No. 10-2009-0021475 A Documentos não Patentários -Documento não Patentário 1: Cislo M, et al.. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987 -Documento não Patentário 2: Sung Hoon Kim et al, Bacteriófago, novos antibióticos alternativos, BioIVave Vol. 7 No. 15. 2005, BRIC

Divulgação Problema Técnico

Os inventores da presente invenção realizaram estudos para solucionar problemas como a presença de bactérias resistentes a antibióticos, a presença de antibióticos remanescentes na carne, além de prevenir e tratar eficientemente doenças infecciosas causadas por Clostridium perfringens e. como resultado, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteriófago ΦCJ2I (KCCM11363P) que possui uma atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens presente na natureza.

Além disso, os inventores da presente invenção identificaram características morfológicas, bioquímicas e genéticas do novo bacteriófago e confirmaram que o bacteriófago tem uma excelente resistência a ácidos, resistência ao calor, resistência à seca e a condições similares, desenvolvendo assim um antibiótico, um desinfetante, um aditivo alimentar, e outras composições usando o novo bacteriófago. Além disso, os inventores da presente invenção desenvolveram uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por Clostridium peiffingens e um método para prevenir ou tratar a doença utilizando a composição.

A presente invenção visa proporcionar um novo bacteriófago ΦCJ21 (KCCMI1363P) com uma atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens.

A presente invenção visa proporcionar ainda uma composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por Clostridium perfringens contendo o bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI I363P) como um ingrediente ativo.

Ademais, a presente invenção visa proporcionar um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI I363P) como um ingrediente ativo.

Além disso, a presente invenção visa proporcionar um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por Clostridium perfringens em animais, exceto para os seres humanos, utilizando o bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI I363P) ou uma composição contendo o mesmo (KCCM11363P) corno um ingrediente ativo.

Solução Técnica

De acordo com uma configuração, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI I363P) com uma atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doença infecciosa causada por Clostridium perfringens. a dita composição contendo o bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI 1363P) como um ingrediente ativo, conforme acima descrito.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ2I (KCCMI 1363P) como um ingrediente ativo. conforme acima descrito.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doença infecciosa causada por Clostridium perfringens compreendendo a administração do bacteriófago ΦCJ21 (KCCM11363P) ou da composição contendo o mesmo, conforme acima descrito, para os animais, exceto para os seres humanos. Efeitos Vantajosos

O bacteriófago ΦCJ21 (KCCM11363P) de acordo com a presente invenção tem o efeito específico de matar o Clostridiumperfringens.

Além disso, o bacteriófago ΦCJ21 (KCCM1I363P) de acordo com a presente invenção tem uma excelente resistência a ácidos, resistência ao calor e resistência à seca, de tal modo que o bacteriófago ΦCJ21 (KCCM1 1363P) pode ser usado para prevenir ou tratar doenças infecciosas por Clostridium perfringens em vários níveis de temperatura ou de pH e condições de humidade, podendo ser utilizado como um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante, um produto de limpeza ou similar.

Ademais, de acordo com a presente invenção, doenças infecciosas causadas por Clostridium perfringens podem ser prevenidas ou tratadas através da administração do bacteriófago ΦCJ2I (KCCM11363P) ou da composição contendo o mesmo (KCCM11363P) como um ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos.

Descrição das Figuras

FIG. 1 é uma fotografia, obtida de um microscópio de elétrons, do novo bacteriófago ΦCJ21 (K.CCM 11363P. doravante denominado “ΦCJ21 ”).

FIG. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago ΦCJ2 I.

FIG. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do bacteriófago ΦCJ21.

FIG. 4 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago ΦCJ21.

FIG. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦCJ21.

FIG. 6 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência à seca do novo bacteriófago ΦCJ21.

Configuração Ideal

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

Em uma configuração, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ21 (KCCMI 1363P), com uma atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens (CP).

E sabido, que o Clostridium perfringens, que é um bacilo anaeróbio obrigatório grande gram-positivo, não possui flagelos e forma um esporo. O Clostridium perfringens, que é uma bactéria que causa diarreia ou problemas similares em animais, particularmente em animais domésticos tais como aves domésticas, suínos e similares, tem sido reconhecida como uma das bactérias patogênicas perigosas e fatais na indústria animal, tal corno a Salmonella, causando a febre tifoide aviária.

Um bacteriófago é um vírus bactéria-específico que infecta bactérias específicas para suprimir e inibir o crescimento da bactéria, e constitui um vírus contendo ácido desoxirribonucleico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (RNA) como um material genético.

O bacteriófago ΦCJ21 de acordo com a presente invenção, que é um bacteriófago específico para infectar seletivamente o Clostridium perfringens, tem uma cápside isométrica e uma cauda não contrátil e, morfologicamente, pertence à Siphoviridae (FIG. I). Os dados da análise de homologia de sequências de ácidos nucleicos entre o bacteriófago ΦCJ21 e outros bacteriófagos estão ilustrados na Tabela 1. A atividade do bacteriófago ΦCJ21 permaneceu estável na faixa de pH4apH 9,8 (resistência a ácidos, ver FIG. 4). O ΦCJ21 reteve sua atividade por 2 horas quando foi exposto a 60 °C (resistência ao calor, ver FIG. 5), e seu título foi reduzido cerca de 1/10 após a secagem (ver FIG. 6). A sequência de ácido nucleico do bacteriófago ΦCJ2I é a mesma da SEQ ID NO: 1.

O bacteriófago ΦCJ21 isolado pela primeira vez pelos inventores da presente invenção foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (361-221, Hongjedong, Seodaemun-gii. Seul, Coréia) sob o número de depósito KCCM I I363P em 30 de janeiro de 2013.

Em outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Clostridium perfringens contendo o bacteriófago ΦCJ21 como um ingrediente ativo. Como um exemplo preferível da composição, a presente invenção proporciona um antibiótico.

Uma vez que o bacteriófago ΦCJ2I tem uma atividade antibacteriana capaz de matar especificamente o Clostridium perfringens, o bacteriófago ΦCJ21 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas pela infecção de Clostridium perfringens. Um exemplo típico de doença infecciosa causada por Clostridium perfringens que pode ser tratada com a utilização do bacteriófago ΦCJ21, é a enterite necrótica, mas a presente invenção não se limita ao tratamento da mesma.

A enterite nccrótica, que é uma das principais doenças infecciosas provocadas por Clostridium perfringens, se caracteriza por ser uma doença bacteriana cuja ocorrência mais frequente se dá em animais de criação doméstica, particularmente aves domésticas, causando danos significativos. A doença pode atacar aves domésticas, particularmente frangos em todas as idades, mas se manifesta principalmente em galinhas (2 a 5 semanas de idade) criadas soltas e também com frequência em galinhas (12 a 16 semanas de idade) criadas em gaiolas.

Como o Clostridium perfringens é excessivamente proliferado no intestino delgado, ocorrem os sintomas de enterite necrótica causando a necrose da mucosa gastrointestinal, diarreia súbita, e efeitos similares. Por exemplo, suínos com enterite necrótica muito aguda morrem após I a 2 dias de ocorrência, e no caso de enterite necrótica aguda seguida de diarreia com sangue, os animais morrem após 2 a 3. Além disso, no caso de enterite necrótica subaguda, a diarreia (sem sangue nas fezes) prossegue durante 5 a 7 dias e, em seguida ocorre fraqueza e desidratação, e no caso de enterite necrótica crônica, ocorre diarreia intermitente que pode causar distúrbio de crescimento.

O termo "prevenção", tal como utilizado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações relacionadas com a aplicação do bacteriófago ΦCJ21 e/ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos, a fim de suprimir a doença correspondente ou retardar a ocorrência da doença.

O termo "tratamento", tal como utilizado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações relacionadas com a aplicação do bacteriófago ΦCJ2I e/ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para animais, exceto para seres humanos, a fim de permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causada pela infecção.

Um exemplo de doença infecciosa causada por Clostridium perfringens na qual o bacteriófago ΦCJ21 e/ou a composição contendo o mesmo como ingrediente ativo podem ser aplicados, é a enterite necrótica. mas a presente invenção não está limitada a ela.

A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Clostridium perfringens de acordo com a presente invenção, pode conter o bacteriófago ΦCJ21 com um teor preferível de 5x106 a 5x101' pfu/mé', mais preferivelmente, de IxlO6 a 1x1010 pfu/mtf.

A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Clostridium perfringens de acordo com a presente invenção pode ainda conter um excipiente farmacêutico aceitável e ser formulada juntamente com o excipiente para, dessa forma, ser fornecida como alimento, um fármaco, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, e similares. O termo "excipiente farmacêutico aceitável", tal como utilizado no presente relatório descritivo, significa uma substância ou um diluente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica e as propriedades de uma composição administrada.

O tipo de excipiente que pode ser utilizado na presente invenção não é limitado a um tipo específico, podendo ser utilizada qualquer substância comumente utilizada na técnica como excipiente farmacêutico aceitável. Como exemplos não restritivos do excipiente, podemos citar solução salina, água esterilizada, solução de Ringer, soro fisiológico tamponado, solução injetável de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol. etanol. e outros similares. Estes podem ser utilizados isoladamente ou como uma mistura de pelo menos dois destes.

Além disso, se necessário, outros aditivos em geral, tais como um antioxidante, uma solução tampão, e/ou um agente bacteriostático. etc., também podem ser utilizados, e a composição pode ser preparada com urna formulação para injeção, tal como solução aquosa, suspensão, emulsão, ou similares, pílulas, cápsulas, grânulos, comprimidos, ou similares, através da adição de um diluente, um dispersante, um surfactante e/ou um lubrificante, etc., para então serem utilizados.

Um método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por Clostridium perfringens não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer método comumente utilizado na arte pode ser utilizado. Como exemplo não limitativo do método de administração, a composição pode ser administrada por via oral ou parentérica

Como exemplos não restritivos da formulação para a administração por via oral, podemos citar trociscos, pastilhas, comprimidos, suspensões aquosas, suspensões oleosas, pó preparado, grânulos preparados, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes, elixires ou similares.

A fim de formular a composição de acordo com a presente invenção em uma formulação tal como um comprimido, uma cápsula, ou similar, a formulação pode ainda conter um aglutinante tal como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol. amido, amilopectina, celulose, gelatina; um excipiente tal como fosfato dicálcico. ou similar; um desintegrante tal como amido de milho, amido de batata doce, ou similar: um lubrificante tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearil fumarato de sódio, cera de polietilenoglicol, ou similares. No caso de formulação cm cápsula, a formulação pode ainda conter um excipiente líquido, além dos materiais acima mencionados.

Como um método de administração parentérica. é possível utilizar um método de administração intravenoso, um método de administração intraperitoneal, um método de administração intramuscular, um método de administração por via subcutânea, um método de administração local, etc.. Além disso, também é possível utilizar um método de aplicação ou pulverização da composição sobre o local da doença, embora a presente invenção não esteja limitada a tal método.

Exemplos de formulações para administração parentérica podem incluir formulações injetáveis para serem aplicadas por meio de injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intramuscular, ou similares; formulações para supositórios; formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol, que podem ser inaladas através do sistema respiratório, ou similares, embora a presente invenção não esteja limitada a tais formulações. A fim de preparar a composição para a formulação de injeção, a composição de acordo com a presente invenção pode ser misturada com um estabilizador ou urna solução tampão em água para preparar uma solução ou suspensão e, em seguida, a solução preparada ou suspensão pode ser formulada em dose individual para uma ampola ou frasco. No caso da composição formulada para pulverização, tal como a formulação de aerossol ou similar, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em pó seja dispersa.

Uma aplicação apropriada, spray, ou dose de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por Clostridium perfringens pode ser diferentemente determinada dependendo de fatores tais como a idade, peso, sexo, grau dos sintomas da doença, tipo de alimentação e taxa de excreção dos animais sujeitos à administração, ou condições similares, bem como o método de formulação da composição, o método de administração, o tempo de administração e/ou via de administração. De modo geral, um veterinário com conhecimentos na técnica pode facilmente determinar e prescrever uma dose eficaz para o tratamento pretendido.

Em outra configuração, a presente invenção pode proporcionar um antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ21 como um ingrediente ativo.

O termo "antibiótico", tal como utilizado no presente relatório descritivo, significa um agente capaz de ser ministrado em animais, incluindo seres humanos, em forma de droga para matar as bactérias, e corresponde a um conceito representando coletivamente um conservante, um desinfetante, e um agente antibacteriano.

O antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ21 como ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção, pode apresentar uma elevada especificidade para o Clostridium perfringens se comparado com outros antibióticos disponíveis no estado da técnica, com a capacidade de não matar bactérias benéficas, mas apenas bactérias patogênicas específicas, sendo caracterizado ainda por não induzir resistência à droga, de modo que o antibiótico de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como um novo antibiótico com tempo de vida consideravelmente maior quando comparado com os antibióticos disponíveis no estado técnica.

Em outra configuração, a presente invenção pode proporcionar um aditivo alimentar e um aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ21 como um ingrediente ativo.

O aditivo alimentar e o aditivo para água potável de acordo com a presente invenção pode ser utilizado de tal forma que o bacteriófago ΦCJ21 ou a composição contendo o mesmo seja preparado individualmente como um aditivo alimentar ou para água potável, e em seguida misturado a um alimento ou água potável, ou de tal forma que o bacteriófago ΦCJ2I ou a composição contendo o mesmo seja diretamente adicionada no momento da preparação do alimento ou da água potável.

O bacteriófago ΦCJ2I ou a composição contendo o mesmo utilizada como aditivo alimentar ou para água potável de acordo com a presente invenção pode ser formulado no estado líquido ou sólido, preferivelmente em forma de pó seco.

Um método de secagem para a preparação do aditivo alimentar e do aditivo para água potável sob a forma de pó seco de acordo com a presente invenção não apresenta limitações e um método comumente utilizado pelos peritos na arte pode ser utilizado. Como exemplos não limitativos do método de secagem, podemos usar um método de secagem com ar, um método de secagem natural, um método de secagem por pulverização, um método de secagem por congelamento, ou métodos similares. Um destes métodos pode ser utilizado sozinho ou pelo menos dois destes métodos podem ser utilizados em conjunto.

Outro micróbio não patogênico pode ser adicionado ao aditivo alimentar ou aditivo para água potável. Como exemplo não restritivo do micróbio a ser adicionado, é possível escolher um micróbio selecionado dentre um grupo compreendendo Bacillus Subtilis, capaz de produzir, protease, lipase e/ou enzima de conversão de açúcar, tal corno Bacillus Subtilis ou similares; um Lactobacillus sp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbicas, tal como o estômago de vaca; fungo de mofo com capacidade de aumentar o peso de um animal doméstico, a produção de leite, e a digestão de alimentos como Aspergillus oryzae, ou similares; e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, ou similares. Estes podem ser utilizados isoladamente ou pela combinação de pelo menos dois deles.

O aditivo alimentar ou aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ2I como ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção, pode ainda conter outros aditivos, conforme necessário. Como um exemplo não restritivo de aditivo, é possível utilizar um aglutinante, um emulsificante. um conservante, e similares, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nitrogenadas não proteicas, silicatos, soluções tampão, agentes corantes, agentes extratantes. oligossacarídeos, e similares, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável. O aditivo pode incluir ainda um agente de mistura para alimentos, ou similar. Estes aditivos podem ser utilizados isoladamente ou pela combinação de pelo menos dois deles.

O aditivo alimentar pode ser adicionado num teor de 0,05 a 10, preferivelmente de 0,1 a 2 partes por peso com base em 100 partes por peso do alimento. O aditivo para água potável pode ser adicionado num teor entre 0,0001 a 0,01. preferivelmente de 0.001 a 0.005 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. A atividade do bacteriófago ΦCJ21 contra o Clostridium perfringens pode ser suficientemente demonstrada nas faixas acima mencionadas.

Em outra configuração, a presente invenção permite elaborar um alimento ou água potável pela adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o mesmo como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ΦC.I21 no alimento ou na água potável.

O alimento utilizado na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer outro alimento comumente usado pelos peritos na arte pode ser utilizado. Um exemplo não restritivo do alimento pode incluir alimentos vegetais como grãos, raízes e frutas, subprodutos de processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, gorduras, amidos, cucurbitáceas ou subprodutos de cereais; e alimentos para animais, tais como proteínas, materiais inorgânicos, gorduras, minerais, proteínas de células individuais, plânctons animais ou alimentos. Estes podem ser utilizados isoladamente ou pela combinação de pelo menos dois deles.

A água potável usada na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável pode ser usada na presente invenção.

Em outra configuração, a presente invenção pode fornecer um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ21 como um ingrediente ativo. Uma formulação do desinfetante ou produto de limpeza não apresenta limitações, de tal sorte que o desinfetante ou o produto de limpeza podem ser preparados com qualquer formulação conhecida na arte.

O desinfetante pode ser pulverizado de modo a eliminar o Clostridium perfringens em uma região onde vivem os animais, em um matadouro, em uma área de mortalidade, em uma cozinha ou em um equipamento de cozinha, ou similares, não estando a presente invenção limitada a estes exemplos.

O produto de limpeza pode ser usado para lavar as superfícies da pele ou todos os locais dos corpos dos animais expostos ou a serem expostos ao Clostridium perfringens, particularmente aves domésticas ou suínos, não estando a presente invenção limitada a estes exemplos.

Em outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas por Clostridium perfringens, utilizando o bacteriófago ΦCJ21 ou a composição contendo o mesmo como um ingrediente ativo. A doença infecciosa pode ser preferivelmente a enterite necrótica, não estando a presente invenção limitada ao tratamento e prevenção desta doença. O objetivo de prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas por Clostridium perfringens pode ser aplicado a aves domésticas ou suínos, não estando a presente invenção limitada ao tratamento destes animais.

Especificamente, o método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas de acordo com a presente invenção pode incluir a administração do bacteriófago ΦCJ21 ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para animais infectados ou que estão em risco de infecção por Clostridium perfringens, em urna dosagem farmacêutica eficaz, exceto para os seres humanos. Será evidente para os peritos na arte que, quando a composição farmacêutica é administrada ao paciente, a dose total diária adequada pode ser determinada por um médico assistente ou veterinário de acordo com sua avaliação médica.

Uma dose farmaceuticamente eficaz específica do bacteriófago ΦCJ21 ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para um determinado animal, pode ser determinada considerando-se o tempo de administração e a via de administração do bacteriófago ΦCJ21 ou da composição contendo o mesmo, a taxa de secreção da composição, o período de duração de tratamento, ou fatores similares, somados ao tipo e ao grau de resposta desejada, a idade, peso, estado geral de saúde, sexo, ou dieta de determinado animal. Além disso, a dose farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores, tais como os ingredientes das drogas ou de outras composições usadas simultaneamente ou separadamente, e outros fatores similares bem conhecidos na área médica.

O bacteriófago ΦCJ2I de acordo com a presente invenção ou a composição contendo o mesmo como ingrediente ativo pode ser administrado como uma forma farmacêutica (spray nasal) para animais ou administrado como um método de adição direta em um alimento ou na água potável dos animais, que em seguida comem o alimento ou bebem a água potável. Além disso, o bacteriófago ΦCJ2I ou a composição contendo o mesmo podem ser misturados em um alimento ou na água potável em forma de aditivo alimentar ou aditivo para água potável, para então ser administrados.

A via de administração e o método de administração do bacteriófago ΦCJ21 de acordo com a presente invenção ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo não apresentam limitações, de tal sorte que qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦCJ21 ou a composição contendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado. Isto é, o bacteriófago ΦCJ21 ou a composição contendo o mesmo como o ingrediente ativo pode ser administrado através de várias vias oral ou parentérica. Exemplos não restritivos da via de administração podem ser a via oral, retal, local, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação, etc..

Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. Entretanto, estes exemplos são apenas ilustrativos e não têm o propósito de limitar o escopo da presente invenção.

[Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago infectando Clostridiumperfringens <Exemplo l-l> Seleção do bacteriófago e isolamento de um único bacteriófago

Foi isolada uma amostra de 50m/1 de fezes colhida na empresa Samwhaw Gps. Breeding Agri. Inc., uma fazenda agrícola de galinhas e porcos da província de Chungchong do Sul, República da Coréia, introduzida numa garrafa centrífuga e centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45μm para preparar uma solução da amostra, e em seguida foi aplicado um método de sobreposição de ágar macio utilizando a solução da amostra preparada. O método de sobreposição de ágar macio é um método de observação da ação da lise do bacteriófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre um meio sólido com 0,7% de ágar).

Especificamente, 18m£ de amostra filtrada foi misturada com 150/JC de uma solução agitada da cultura (OD6oo = 2) de Clostridium perfringens, (CP, BCCP 17-1) isolada na Agência de Quarentena de Animais e Plantas local, e 2m^ de infusão de 1 OXBrain-heart (doravante denominado meio 'BHI') (composta para gerar um volume final de 1 L) e cultivada a 37°C por 18 horas. Em seguida, a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45ym. Em seguida, uma mistura de 5m<? de ágar a 0,7% (w/v) e 150/./f da solução agitada da cultura (OD60o = 2) de Clostridium perfringens (BCCP 17-1) foi despejada e endurecida numa placa BHI (BHI + 0.2% de sangue de ovelha), da solução filtrada da cultura da amostra foi derramada sobre a mesma, seguida por uma cultura a 30 °C por 18 horas. Em seguida, confirmou-se a formação de uma placa.

Depois de filtrada, a solução da cultura da amostra na qual a lise foi gerada, foi adequadamente diluída e misturada com 150μ£ de solução agitada da cultura (ODeoo ~ 2) de Clostridium perfringens (BCCP 17-1), o método de sobreposição em ágar macio foi realizado, obtendo-se assim uma única placa. Considerando-se que uma única placa foi formada a partir de um único bacteriófago, foi selecionada uma única placa para purificar e isolar o único bacteriófago, colocada em 400μf de uma solução SM (NaCl 5,8 g/l; MgSO47H2O 2g / I ; 1 M de Tris-CI (pH 7.5), 50m(?; H2O, composta de modo a gerar um volume final de IL), e deixada à temperatura ambiente durante 4 horas, purificando e isolando assim um único bacteriófago.

A fim de garantir uma grande quantidade do bacteriófago isolado, lOOtz/? de um sobrenadante de uma única solução de bacteriófago foram selecionados e misturados com 12nU? de 0,7% de ágar e 500μ(? da solução agitada da cultura de Clostridium perfringens (BCCP 17-1), sendo realizado em seguida o método de sobreposição de ágar macio em um meio LB com um diâmetro de 150 mm. Depois de derramar a solução de 1 Smé2 da solução SM em uma placa em que a lise foi completamente gerada, a placa foi suavemente agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, descarregando assim o bacteriófago no ágar de superfície. A solução SM em que o bacteriófago foi descarregado foi recuperada, sendo adicionado clorofórmio numa quantidade de 1% do volume final e adequadamente misturada durante 10 minutos, seguida por centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido tal como descrito acima foi filtrado com um filtro de 0.45μm e armazenado a uma temperatura fria.

<Exemplos l-2> Cultura em grande escala c purificação de bacteriófago

O bacteriófago selecionado foi cultivado em grande escala, utilizando Clostridium perfringens (BCCP 17-1) e, em seguida, o bacteriófago foi purificado.

Especificamente. 1% da solução agitada da cultura de Clostridium perfringens (BCCP 17-1) foi inoculada num meio de cultura líquida para produção em massa e, ao mesmo tempo, o bacteriófago foi colocado no seu interior em multiplicidade de infecção (MOÍ) de 0.1. simultaneamente com a inoculação de Clostridium perfringens (BCCP 17-1), realizando assim a coinfecção. Em seguida, a cultura estática foi realizada a 30°C sob condições anaeróbias. Em seguida, a centrifugação foi realizada a 4°C e 12.000 rpm por 20 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45gni. Em seguida. NaCI e polietilenoglicol (PEG) foram adicionados ao sobrenadante filtrado de modo a obter uma concentração final de IM e 10% (w/v) respectivamente, e a mistura foi deixada a uma temperatura de 4°C durante 8 horas ou mais. Em seguida, foi realizada uma centrifugação a 4°C e 12.000 rpm por 20 minutos, o sobrenadante foi removido e os precipitados foram obtidos.

O precipitado obtido foi ressuspendido em 5m(? da solução SM e foi deixado a uma temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0.45gm, e foi realizada uma ultracentrifugação (35.000rpm. 1 hora, 4°C) utilizando um método de gradiente de densidade de glicerol (densidade: 40%, 5% de glicerol), purificando assim o bacteriófago ΦCJ21. Depois do ΦCJ21 purificado ser ressuspendido em 500yt? da solução SM, um título foi medido.

Os inventores da presente invenção denominaram o bacteriófago obtido através da extração da amostra de fezes com atividade bactericida específica contra o Clostridium perfringens de "Bacteriófago ΦCJ21", e depositaram o bacteriófago no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (361-221. Hongjedong. Seodaemun-gu, Seoul, Coréia) em 30 de janeiro de 2013 sob o número de depósito KCCM11363P.

<Exemplo 2> Observação morfológica do ΦCJ21

O bacteriófago ΦCJ2I purificado foi diluído em solução de gelatina a 0,01%, e em seguida fixado em solução de glutaraldeído a 2,5%. O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm) durante 10 minutos e lavado com água destilada estéril. Uma película de carbono foi disposta sobre uma grelha de cobre, tingida com 4% de acetato de uranilo durante 30 a 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-101 I, 80kV. ampliação: XI20.000 para X200.000) (FIG.l).

A FIG. 1 mostra uma fotografia do bacteriófago ΦCJ21 feita pelo microscópio de elétrons onde é possível observar que, como o bacteriófago não tem uma cápside isométrica e uma cauda contrátil, o bacteriófago pertence morfologicamente à Siphoviridae.

<Exemplo 3> Análise do tamanho do DNA genômico do ΦCJ21

O DNA genômico foi extraído a partir do bacteriófago ΦCJ21 purificado por ultracentrifugação. O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, pH 8,0), proteinase K e 5 dodecilsulfato de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução da cultura do bacteriófago ΦCJ2 I purificado de modo a ter uma concentração final de 20 mM, ôOjUg/mé1, e 0.5% (w/v) respectivamente e, em seguida, foram colocados em estado estacionário a 50°C por 1 hora. Depois disso, um volume igual de fenol (pH 8,0) foi adicionado, agitou-se, e centrifugou-se em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante.

O sobrenadante foi misturado com um volume igual de PC (fenol: clorofórmio =1:1) e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante foi misturado com um volume igual de clorofórmio e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi misturado sequencialmente com 10% (v/v) de 15 acetato de sódio 3M e um duplo volume de etanol frio a 95% com base no volume total, e deixado a -20°C durante I hora. Em seguida foi realizada centrifugação a 0°C e 12.000 rpm por 10 minutos, e o precipitado foi obtido por remoção do sobrenadante. Em seguida, 50μ£ de Tris-EDTA (TE) solução tampão (pH 8,0) foi adicionado à mesma, para assim dissolver o precipitado obtido. O DNA extraído foi diluído 10 vezes e a concentração foi mensurada 20 medindo-se a absorção em OD26o-

Em seguida, 1/ig de DNA foi carregado em 1% de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), em gel de agarose, e a eletroforese foi realizada em temperatura ambiente durante 20 horas utilizando um programa do sistema BIORAD PFGE, programa 7 (tamanho: 25-100 kb; tempo de comutação: 0.4-2.0 segundos, forma linear; tensão direta: 180V; tensão 25 inversa: 120V) (FIG. 2).

A FIG. 2 é uma fotografia da eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do DNA genômico do bacteriófago ΦCJ21, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do bacteriófago ΦCJ21 tem um tamanho de cerca de 56kb,

Análise do padrão da proteína do ΦCJ2I I5td? da solução do bacteriófago ΦCJ21 purificado (título 1010pfu/ml) foi misturada com de uma solução de amostra 5X SDS e aquecida durante 5 minutos. Em seguida, a proteína total do bacteriófago ΦCJ21 foi expandida em 15% de gel SDS-PAGE e. em seguida, o gel foi tingido em temperatura ambiente durante 1 hora usando uma solução de corante azul de coomassie (FIG. 3).

A FIG. 3 é uma fotografia da eletroforese mostrando o resultado da SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦCJ21, sendo observadas proteínas principais com tamanhos de cerca de 40kDa, 51kDa, 53kDa e 70kDa. Na FIG. 3, M é urna proteína que se torna um padrão para medir o peso molecular.

<Exemplo 5> Análise da sequência do gene do ΦCJ21

A fim de confirmar características genéticas do bacteriófago ΦCJ2I purificado, o DNA do bacteriófago ΦCJ2I foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise do gene. Genes foram montados em Macrogen INC. utilizando GS e o software “de novo assembler" (Roche). A análise da sequência de um quadro aberto de leitura foi realizada utilizando GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02, e software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi realizada usando BLASTP e programa InterProScan.

A sequência do genoma do novo bacteriófago obtido apresentava várias semelhanças com as dos bacteriófagos existentes, mas foi confirmado que um bacteriófago com todas as frações (100%) iguais às do bacteriófago da presente invenção não existia. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago de acordo com a presente invenção foi isolado.

Dados da análise de homologia da sequência de ácido nucleico entre o bacteriófago ΦCJ21 e outros bacteriófagos estão ilustrados na tabela I. [Tabelai]

A sequência parcial do genoma do bacteriófago ΦCJ2I é a mesma para SEQ ID No: 1. A sequência do genoma foi determinada por analisador genético.

<Exeπiplo 6> Teste de estabilidade do ΦCJ2I dependendo do pH

A fim de confirmar a estabilidade do bacteriófago ΦCJ2I em um ambiente de baixo pH, foi realizado o teste de estabilidade sobre uma larga gama de pH (pH 4,0 / 5,5 / 6,4 / 6,9 / 7,4 / 8,2 / 9,0 e 9,8).

Para o teste, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH 4.0 / pH 5.5 e pH 6.4), solução tampão de fosfato de sódio (pH 6.9 e pH 7.4), e uma solução de Tris- HCI (pH 8,2 / pl I 9,0 e pH 9,8)] foram preparadas a uma concentração de 0,2 M, respectivamente.

Depois que 9(W de cada uma das soluções de pl I foi misturada com I 0/J£ de solução de bacteriófago com um título 1.0X109pfu/m£, de tal modo que uma concentração de cada solução de pll tornou-se I M, cada uma das soluções de pH foi deixada em temperatura ambiente durante 30 minutos, I hora, e 2 horas. Em seguida, a solução reacional foi diluída passo a passo, l(W da solução diluída em cada passo foi derramada e cultivada a 30°C durante 18 horas através de um método dc sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de lise (FIG. 4).

A FIG. 4 mostra um resultado do teste de resistência ao ácido do bacteriófago ΦCJ21. Conforme ilustrado na FIG. 4, foi confirmado que o bacteriófago ΦCJ2I não perde a sua atividade e permaneceu significativamente estável cm um intervalo de pH de 4,0 a 9.8 por até 2 horas.

<Exemplo 7> Teste de estabilidade do ΦCJ21 dependendo da temperatura

Foi realizado um teste para confirmar a estabilidade contra o calor gerado durante o processo de formulação do bacteriófago, no caso de usar o bacteriófago como uma formulação de aditivo alimentar entre as formulações do bacteriófago.

Especificamente, 200μf? da solução do bacteriófago ΦCJ2I com um título I .OX I O'piu/πi/' foram deixados a 60 °C por 0, 10, 30, 60, e 120 minutos. Então, as soluções acima foram diluídas passo a passo, 10idS de cada uma das soluções diluídas foram derramadas e cultivadas a 30 °C durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de lise (FIG. 5).

A FIG. 5 mostra o resultado de um teste de resistência ao calor do bacteriófago ΦCJ21. Conforme ilustrado na FIG. 5, é possível verificar que a atividade não foi significativamente diminuída até o bacteriófago ΦCJ2I ser exposto a uma temperatura de 60°C durante 2 horas.

<Exemplo 8> Teste de estabilidade do ΦCJ21 contra a secagem

Foi realizado um teste para confirmar a estabilidade contra condições de secagem geradas durante um processo de formulação do bacteriófago, no caso de usar o bacteriófago como uma formulação destinada a aditivo alimentar dentre as demais formulações do bacteriófago.

Especificamente, lOOμf? de solução do bacteriófago ΦCJ2! com um título I .OX 10xpfu/m£ foram secos a 60°C durante 120 minutos, utilizando um concentrador centrífugo a vácuo (Speed-Vaccum Concentrator 5301, Eppendorf). O sedimento obtido após a secagem foi colocado e ressuspendido numa solução de SM a um valor equivalente ao de uma solução inicial a 4°C durante um dia.

Em seguida, as soluções acima foram diluídas passo a passo, lOtzé' da solução diluída em cada passo foi derramada e cultivada a 30°C durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de lise (FIG. 6).

A FIG. 6 mostra o resultado de um teste de resistência à secagem do bacteriófago ΦCJ21. Conforme ilustrado na FIG. 6. é possível notar que o título do bacteriófago ΦCJ21 após a secagem foi reduzido cerca de 1/10 em relação ao título antes da secagem.

<Exemplo 9> Teste de espectro de infecção do ΦC.I21 com relação a estirpes do tipo selvagem de C lostridium perfringens

Tendo ou não atividade lítica, o bacteriófago ΦCJ21 foi testado em 45 estirpes de tipo selvagem de Clostridium perfringens isolados pela Agência de Quarentena Vegetal e Animal e pela Universidade Kunkuk diferentes dos Clostridium perfringens (BCCP 17-1) utilizados 10 no experimento.

Especificamente, IOμ(? de solução do bacteriófago ΦCJ21 com um título l.0X10'”pfu/mí foram misturados com uma solução de 150^ de cultura agitada (ODÔOO = 2) de cada estirpe, sendo derramada e cultivada a 30°C por 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio. Em seguida, observou-se se uma placa foi ou não formada.

Como resultado do experimento, entre 45 estirpes de tipo selvagem de Clostridium perfringens, 44 estirpes foram infectadas, de tal forma que a proporção de infecção foi de cerca de 97,7% e a razão de lise foi de cerca de 97,7%. Os resultados estão nas Tabelas 2 e 3. [Tabela 2]

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender o bacteriófago ΦCJ21 (KCCM11363P) como um ingrediente ativo e um aglutinante selecionado do grupo que consiste em lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso na prevenção ou tratamento de uma doença infecciosa causada por Clostridium perfringens.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela doença infecciosa ser a enterite necrótica.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser um ingrediente ativo para uso como um antibiótico.

5. ADITIVO ALIMENTAR OU UM ADITIVO PARA ÁGUA POTÁVEL, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

6. DESINFETANTE OU UM PRODUTO DE LIMPEZA, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.