TWI656881B - 用於廣效、未分類或混合型臨床應用之治療組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提供用於被動免疫之改良組合物及方法。在實施例中，提供包括存於載劑基質中之特異性多株抗體之協同組合的組合物。本揭示內容提供用於在廣效、未分類或混合型臨床應用中治療腹瀉及腸道感染之有效經濟組合物及方法。

Description

用於廣效、未分類或混合型臨床應用之治療組合物及方法
本揭示內容提供用於被動免疫之組合物及方法。在實施例中，提供包括特異性多株抗體與載劑基質之協同組合的組合物。本揭示內容提供用於在廣效、未分類或混合型臨床應用中治療病原感染之有效及經濟組合物及方法。在一實施例中，提供用於治療腹瀉及腸道感染之組合物及方法。
本案件主張2010年11月23日提出申請之美國臨時申請案第61/416,667號(頒予Boulder,Colorado之Timothy W.Starzl，標題為「Compositions and Methods for Treatment in Broad-Spectrum,Undifferentiated or Mixed Clinical Applications」，其全部內容以引用方式併入本文中)之優先權。
抗體、免疫球蛋白及其他生物免疫因子(在本文中統稱為抗體，包含天然及其合成類似物二者)係人類及動物中之已知治療劑。抗體藉由在抗體上之抗原結合位點與稱為抗原決定簇或表位之抗原部分之間結合(經由非共價力)來發揮作用。抗體能夠具有高度特異性。舉例而言，單株抗體領域已在產生甚至更具特異性及精確結合特性之推動下大力發展。然而，此高特異性可產生過度受限之結合屬性，其中功 能相同之藥劑或抗原並不以相同方式與免疫試劑或免疫治療劑進行反應。另一方面，交叉反應性通常視為達成結合特異性中之誤差或失敗，其係抗原與針對相似但不同抗原生成之抗體之間的反應。受控交叉反應性可有利地用於拓寬抗體之結合範圍。
初乳以特異性方式在哺乳動物中天然產生，從而以極濃之低體積形式將其組份遞送至新生兒之胃腸道並穿過胃腸道。已知初乳含有諸如IgA、IgG及IgM等抗體。初乳之其他組份包含乳鐵蛋白、溶菌酶、乳過氧化物酶、補體及富含脯胺酸之多肽(PRP)。在初乳中亦發現諸多細胞激素(控制免疫系統之小信使肽)，包含介白素、腫瘤壞死因子、趨化激素及其他細胞激素。初乳亦含有諸多生長因子，例如胰島素樣生長因子I及II、轉化生長因子α、β1及β2、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、顆粒球-巨噬細胞刺激生長因子、血小板源生長因子、血管內皮生長因子及菌落刺激因子-I。
初乳中之抗體及輔因子可經由哺乳來向接受者提供被動免疫性。通常，抗體及輔因子自母親傳送至新生兒並提供針對病原體之第一保護。生長因子亦刺激腸之發育及修復。
可藉由使用被動免疫性解決之一種病狀係腹瀉。腹瀉主要由病原體之攝入引起。根據世界衛生組織(World Health Organization)(WHO)，全世界88%之腹瀉病例係因水不安全、衛生情況不佳或不夠衛生而引起。該等病例每年導致約150萬人死亡，大部分死者為兒童(Pruss-Urstun等人，Safer water,better health：costs,benefits and sustainability of interventions to protect and promote world health世界衛生組織，Geneva,2008.ISBN 978 92 4 1596435)。
全球尤其關注發展中國家中傳染性腹瀉之病例，其尤其在兒童群體中係當前極高發病率及死亡率之病因。舉例而言，根據2009聯合國人類發展報告(2009 United Nations Human Development report)，印 度具有世界上最高之嬰兒死亡率之一。舉例而言，救助兒童會(Save the Children)(國際非盈利組織)報導，在印度每15秒死亡一個兒童，且該等死亡中之90%係由諸如腹瀉等可預防疾病所致。WHO推薦輪狀病毒(Rotavirus)及麻疹疫苗、使用肥皂洗手、改良飲用水供應及社區衛生情況來用於預防腹瀉；然而，該等措施不能有效治療疾病。
在世界上大部分地區，用於兒童腹瀉之標準治療方案包含同時投與抗生素及口服補液療法。出於許多原因，抗生素係處方藥物。抗生素不能有效治療病毒感染。舉例而言，輪狀病毒估計會引起世界上由5歲以下兒童之腹瀉所致之所有住院的約40%(Weekly Epidemiological Record，第83卷，第47期，2008年11月21日)。抗生素之不恰當應用可促進細菌之抗性菌株。因此，感染可由細菌之抗性菌株引起。即使在最好之情形下，使用恰當之抗生素可能需要數天方能減小腹瀉症狀之嚴重程度。
抗生素之另一缺點在於，投與可破壞在胃腸道中發現之可進一步引起內毒素脂多糖釋放的病原及良性細菌。(Holzheimer,The significance of endotoxin release in experimental and clinical sepsis in surgical patients--evidence for antibiotic-induced endotoxin release？Infection.1998 Mar-Apr；26(2)：77-84)。該等內毒素具有不良全身性效應(包含發燒、白血細胞計數變化、彌漫性血管內凝血、低血壓、休克及死亡、吸收不良)之宿主；實際上，直接注射極小劑量之內毒素會導致大部分哺乳動物死亡。Todar K.Bacterial Endotoxin.Textbook of Bacteriology.2008。textbookofbacteriology.net。
根據WHO，推薦藉由口服補液療法與鋅以及連續餵食(包含哺乳)來治療兒童腹瀉。通常以約15mg/日至30mg/日之劑量使用鋅糖漿或鋅強化口服補液溶液(ORS,40mg/L)。鋅較為便宜，但具有適當效能。鋅糖漿使急性腹瀉之持續時間僅減小約25%，且使治療失敗或死 亡減小40%。(Bhutta等人，Therapeutic effects of oral zinc in acute and persistent diarrhea in children in developing countries：pooled analysis of randomized controlled trials.The American Journal of Clinical Nutrition.2000；72(6)：1516-22)。一個研究評估鋅強化(40mg/L)ORS在患有急性腹瀉之1,219兒童中之效能及安全性。與僅接受標準ORS之對照組相比，鋅強化ORS組之臨床結果得到適度改良。在該研究中，鋅-ORS組中排便之總數低於對照組之總數。發現對腹瀉持續時間或延長腹瀉之風險並無實質性效應。(Bahl R、Bhandari N、Saksena M等人，Efficacy of zinc-fortified oral rehydration solution in 6- to 35-month-old children with acute diarrhea.J Pediatr 2002；141：677-82)。
已知抗生素不能有效治療諸如輪狀病毒感染等病毒感染。其他幹預具有有限功效。另外，辨別腹瀉病因之適當診斷工具並不總是易於獲得或提供。
顯而易見，期望用於治療未分類腹瀉之快速、有效及經濟的替代方式。業內仍需要用於在廣效、未分類或混合型臨床應用中治療腹瀉及腸道感染之有效、經濟組合物及方法。
本揭示內容提供被動免疫之組合物及方法，其中將特異性結合分子(例如特異性免疫球蛋白)與載劑基質組合以提供經口或黏膜投與以用於管控微生物(包含治療或預防病原感染或不期望菌株)之組合物。在實施例中，將組合物投與非新生個體。
在一實施例中，本揭示內容提供投與非新生兒人類以用於管控微生物之組合物，該組合物包括至少一種源於動物之適應性免疫系統之特異性結合分子或其片段，其中該特異性結合分子選自免疫球蛋白、抗體、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子或其混合物；及載劑基 質，其包括非人類哺乳動物之先天性免疫系統之兩種或更多種組份，其中該基質可選自或源於初乳、奶、血清、血漿、唾液、淋巴液、黏液或淚液之組份；其中該基質及該特異性結合分子源於不同物種。
在一較佳實施例中，載劑基質包括牛初乳。在另一實施例中，基質包括先天性免疫系統之選自以下之組份：溶菌酶、磷脂酶、防禦素、調理素、補體系統組份、β-溶解素、富蛋白肽(PRP)、(PRPs)、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、細胞激素、介白素、趨化激素、干擾素、TNF-α、纖連蛋白、白血球、白血細胞、吞噬細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性球、多形核細胞、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、自然殺手(NK)細胞、淋巴因子激活之殺手(LAK)細胞、防禦素、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶及NADPH氧化酶。
在各個實施例中，組合物包含醫藥上可接受之載劑。在其他實施例中，組合物包含食物級載劑。在實施例中，組合物可經由經口遞送、經鼻遞送、眼部遞送或其組合來投與。
在其他實施例中，組合物並不包含以外源方式添加之聚合物、共聚物、脂質體、水凝膠或纖維蛋白。在其他實施例中，組合物並不包含微球體或微膠囊。在另一實施例中，組合物並不包含以外源方式添加之抗原。
在另一實施例中，特異性結合分子特異性結合至病原、病原相關性毒素、病原相關性黏著要素、不期望菌株或其組合。在一態樣中，病原包括引起胃腸炎之人類或獸醫之腸或胃腸道病原。在各個態樣中，病原或不期望菌株選自由以下組成之群：空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、沙門菌屬(Salmonella)、腸道沙門氏菌傷寒血清型(Salmonella enterica serovar Typhi)、痢疾志賀氏桿菌(Shigella dystenteriae)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloide)、大腸桿菌(Escherichia coli)[包含(EPEC)腸病原性大腸桿菌、(ETEC)腸毒性大 腸桿菌、(EaggEC)腸凝集性大腸桿菌、(EIEC)腸侵襲性大腸桿菌及(EHEC)出血性大腸桿菌]、難辨梭菌(Clostridium dificile)、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、霍亂弧菌O1(Vibrio cholerae O1)、弧菌O139(Vibrio O139)、非O1弧菌(Non-O1 Vibrio)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、親水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringen)、難辨梭菌(Clostridium difficile)、腸肝螺旋桿菌(Helicobacter)(包含幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、輪狀病毒、冠狀病毒、諾羅病毒(norovirus)、杯狀病毒、腸腺病毒、巨細胞病毒、星狀病毒、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、帶狀皰疹病毒(herpes zoster virus)、鐮胞菌(Fusarium spp.)及棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)。
在一具體態樣中，病原相關性毒素包括內毒素或外毒素。
在另一具體態樣中，病原相關性黏著要素包括黏著素、鈣黏著素、纖毛、原纖維、病毒黏著結構或其組合。
在各個實施例中，以有效用於治療或預防未分類腹瀉、旅行者腹瀉、輪狀病毒腹瀉、毒素介導之腹瀉、霍亂、難辨梭菌感染、痢疾、傷寒、消化性潰瘍、或用於胃腸道菌叢管控的量經口投與組合物。在另一態樣中，有效量之組合物賦予個體被動免疫性。
在另一實施例中，本揭示內容提供藉由以下步驟來製備本揭示內容之組合物之方法：(a)自動物獲得至少一種結合特定抗原之特異性結合分子或其片段，其中該特異性結合分子選自免疫球蛋白、抗體、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子及其混合物；(b)獲得至少一種載劑基質，該至少一種載劑基質包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非 特異性免疫球蛋白、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白；(c)製備載劑基質及特異性結合分子或其片段之固體形式；及(d)混合載劑基質之固體形式與特異性結合分子或其片段之固體形式。
在另一實施例中，本發明提供製備賦予免疫性之組合物之方法。該方法包含(a)獲得至少一種外源特異性靶向免疫因子；(b)製備該至少一種外源特異性靶向免疫因子之粉末化形式；(c)獲得至少一種外源載劑基質，視需要混合外源載劑基質與支持外源特異性靶向免疫因子並與其相互作用之試劑混合物；(d)製備該至少一種外源載劑基質之粉末化形式；及(e)混合步驟(b)之粉末化形式與步驟(d)之粉末化形式，由此獲得賦予被動免疫性之組合物。在一態樣中，賦予被動免疫性之組合物包含劑量受控調配物。在各個態樣中，賦予被動免疫性之組合物包含醫藥上可接受之載劑。在各個態樣中，賦予被動免疫性之組合物並不包含聚合物、共聚物、脂質體、水凝膠或纖維蛋白。在各個態樣中，賦予被動免疫性之組合物並不包含微球體或微膠囊。在各個態樣中，賦予被動免疫性之組合物並不包含免疫原或抗原。
本發明包含下列辨別屬性中之至少一者：(a)其使得能夠獲得用於指定或靶向疾病之基質、特異性因子及活化事件的定製設計；(b)其使得能夠獲得各種組份混合物之可針對效應進行調整或調節之劑量受控調配物；(c)其使得能夠獲得提供超過天然系統中可達成之正常生理學含量之指定組份的劑量受控調配物；(d)其使用複雜多組份多路徑相互作用產生模擬天然免疫系統反應之系統效應；(e)其使得能夠產生可以其強化狀態投與之預調節或強化被動免疫反應，且隨後藉由存在目標病原體、毒素、疾病狀態或症候群予以活化；(f)其使得能夠產生具有界定特異性或廣效效應之調配物，從而符合特定目標疾 病狀態或症候群或擬使用產物之實際環境的需要；及(g)其使得能夠產生可靶向用於預防以及治療幹預之調配物。
在另一態樣中，藉由調節組合物中諸如多株抗體等特異性結合分子之量，可製備劑量受控調配物。
在一較佳實施例中，至少一種特異性結合分子包括源於免疫雞之IgY。在其他具體態樣中，IgY包括至少以下物質之特異性IgY組：腸毒性大腸桿菌、大腸桿菌K99菌毛黏著因子、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌類毒素、沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)、輪狀病毒及冠狀病毒。
在另一實施例中，將組合物局部投與黏膜。
在另一實施例中，病原包括引起陰道炎之病原。在各個態樣中，病原選自由以下組成之群：加德納菌(Gardnerella spp.)、淋病雙球菌、砂眼披衣菌(Chlamydiaceae trachomatis)、黴漿菌(Mycoplasma spp.)、空腸彎曲桿菌、陰道鞭毛滴蟲(Trichomonas vaginali)、皰疹病毒類型1、皰疹病毒類型2、白色念珠菌(Candida albican)、禿髮念珠菌(Candida glabrata)、熱帶念珠菌(Candida tropicali)、嗜酸性念珠菌(Candida parapsilosi)及克魯斯氏念珠菌(Candida krusei)。
在另一實施例中，病原係A群鏈球菌(Group A Streptococcus bacteria)。
在另一實施例中，病原包括選自由以下組成之群之引起結膜炎之病原：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、淋病雙球菌、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、腺病毒、單純皰疹(herpes simplex)、帶狀皰疹病毒、腸道病毒、鐮刀菌(Fusarium spp)、念珠菌(Candida spp.)及棘阿米巴。
在另一實施例中，本揭示內容之組合物用作營養組合物來投與有需要個體，該有需要個體患有產生特殊飲食需求之疾病，例如兒童 腹瀉、克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎。
圖1展示對於實例1A之組合物而言在5天時間內兩個現場試驗測試組與陰性對照相比的平均日排便頻率。在試驗1(n=29)及試驗2(n=31)中，在三天內每天一次投與實例1A組合物以及抗生素及經口補液鹽(ORS)。在陰性對照(n=28)中，僅投與抗生素及ORS而不投與本揭示內容之組合物。
圖2以1-5等級(1=正常且5=液體)展示與圖1相同之三個組在相同5天時間內之平均日糞便硬度。
圖3以1-5等級(1=正常且5=病情嚴重)展示與圖1相同之三個組在相同5天時間內之平均醫師評價身體狀況。
圖4展示在5天時間內三個現場研究(試驗)測試組之平均日排便頻率。試驗1及2及陰性對照如針對圖1所述。在試驗3(n=140)中，向患者投與實例1B之組合物以及抗生素及ORS。
圖5以1-5等級(1=正常且5=液體)展示與圖4相同之四個組在相同5天時間內之平均日糞便硬度。
圖6以1-5等級(1=正常且5=病情嚴重)展示與圖1相同之四個組在相同5天時間內之平均醫師評價身體狀況。
圖7展示在5天時間內試驗1及2、陰性對照、試驗3的平均日排便頻率，將試驗3分成6個亞組，即(ES204A)：經3天投與2g噴霧乾燥蛋與4g初乳；(ES204B)：經2天投與2g噴霧乾燥蛋與4g初乳；(MT204A)：經3天投與2g熱乾燥蛋與4g初乳；(MT304A)：經3天投與3g熱乾燥蛋與4g初乳；(MS204A)：經3天投與2g噴霧乾燥蛋與4g初乳；(MS304A)：經3天投與3g噴霧乾燥蛋與4g初乳。
圖8以1-5等級(1=正常且5=液體)展示與圖7相同之各組在相同5天時間內之平均日糞便硬度。
圖9以1-5等級(1=正常且5=病情嚴重)展示與圖7相同之各組在相同5天時間內之平均醫師評價身體狀況。
定義
本文所用之術語「預防」(prevention、prevent、preventing、prophylaxis)係指在疾病狀態或病狀之臨床表現發作之前開始以預防或減小該疾病狀態或病狀之該臨床表現的作用過程(例如投與本揭示內容之化合物或醫藥組合物)。該預防及阻抑無需絕對有用。
本文所用之術語「治療」(treatment、treat及treating)係指在疾病狀態或病狀之臨床表現發作之後開始以消除或減小該疾病狀態或病狀之該臨床表現的作用過程(例如投與化合物或醫藥組合物)。該治療無需絕對有用。
本文所用之術語「需要治療」係指藉由護理者作出之患者需要治療或自治療受益的判斷。此判斷係基於護理者專業領域中之各種因素作出的，且其包含患者由於本發明方法、化合物或醫藥組合物可治療之症狀而患病或將患病的知識。
本文所用之術語「需要預防」係指藉由護理者作出之患者需要預防或自預防受益的判斷。此判斷係基於護理者專業領域中之各種因素作出的，且其包含患者由於本發明方法、化合物或醫藥組合物可預防之症狀而將患病或可能患病的知識。
本文所用之術語「個體」(individual、subject)或「患者」係指任一動物，包含鳥或哺乳動物，例如小鼠、挪威大鼠、棉鼠、沙鼠、天竺鼠、倉鼠、其他齧齒類動物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬或靈長類動物及人類。該術語可規定為雄性或雌性或二者，或不包含雄性或雌性。在一態樣中，患者係成人。在另一態樣中，患者係非新生兒人類嬰兒。在另一態樣中，患者係人類幼兒、兒童或青年人。
術語「新生」(neonate或newborn)係指在出生後最初28天中之嬰兒。術語「非新生」係指大於28天之動物。
本文所用之術語「有效量」係指藥劑(單獨或作為醫藥組合物之一部分)之能夠對於疾病狀態或病狀之任一症狀、態樣或特性具有任一可檢測陽性效應的量。該效應無需絕對有益。
本文所用之術語「包含」不限制範圍，從而使得除彼等所列示者外可能涵蓋其他要素；此術語在任一情形下皆可理解為「包含但不限於」。
術語「免疫」、「主動免疫」(actively immunize、actively immunizing及active immunization)意指藉由將個體暴露於抗原(例如，源於微生物(例如但不限於病毒或細菌)之抗原)來有意免疫個體；該暴露可藉由將個體暴露於以下物質來實施：完整有機體、減毒有機體、有機體之一部分、有機體上存在之一或多種抗原或前述物質之組合。
術語「被動免疫」(passively immunize、passively immunizing及passive immunization)意指向個體提供針對抗原(例如，源於微生物(例如但不限於病毒或細菌)之抗原)之抗體，而無需在個體之有機體中誘發免疫反應。被動免疫提供直接保護，但個體並不因此產生記憶細胞。
本文所用之術語「被動免疫性」係指藉由將抗體轉移至個體達成之人工獲得的免疫性。術語「蛋」或「蛋產物」各自意指鳥源全殼蛋(習用、免疫或其他形式)或源於其之任一產物或部分。
術語「免疫蛋」或「免疫蛋產物」各自意指自維持於免疫狀態之產蛋動物獲得之全蛋或源於其之任一產物或部分。
術語「抗原」係指可誘導有機體、尤其動物中之免疫反應之實體或其片段。該術語包含負責抗原性或抗原決定簇之免疫原及其區域。
術語「多株抗體」係指如下抗體：其係源於使用抗原或其抗原功能衍生物免疫之動物之血清之抗體分子的異質群體。為產生多株抗體，可藉由使用抗原注射來免疫各種宿主動物。端視宿主物種，可使用各種佐劑來增加免疫反應。
術語「單株抗體」已在業內充分識別，且係指作為在實驗室中自單一純系產生之物質且僅識別一種抗原的抗體。通常藉由將正常短暫、產生抗體之B細胞融合至快速生長細胞(例如癌細胞，有時稱為「永生」細胞)來製備單株抗體。所得雜交細胞或雜交瘤迅速繁殖，從而產生用以產生大量抗體之純系。「單株抗體」係針對特定抗原或表位之抗體之實質上均質群體。其可藉由任一技術獲得，該任一技術藉由培養物中之連續細胞系來產生抗體分子。單株抗體可藉由彼等熟習此項技術者已知之方法獲得。舉例而言，參見Kohler等人，Nature 256：495-497,1975及美國專利第4,376,110號。
術語「結晶」係指已藉由結晶(例如藉由分批結晶)純化之抗體(例如單株抗體)。可使用結晶抗體來生成較小體積之高濃度形式。(Yang等人，2003,Crystallline antibodies for subcutaneous delivery.PNAS 100(12)：6934-6939)。
術語「未分類腹瀉」意指未診斷出腹瀉之致病因子。
術語「抗體片段」涵蓋如同抗體一般藉由結合至特定抗原以形成複合物來發揮作用的任一合成或基因工程蛋白。舉例而言，抗體片段包含分離片段、由重鏈及輕鏈之可變區域組成之「Fv」片段、輕鏈及重鏈可變區域藉由肽連接體連接之重組單鏈多肽分子(「scFv蛋白」)及由模擬超變區域之胺基酸殘基組成之最小識別單元。抗體片段包含抗體之一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv及諸如此類。不管結構如何，抗體片段與由完整抗體識別之相同抗原結合。
術語「轉移因子」係指由胺基酸(其引起抗原特異性細胞介導之免疫性、主要係遲髮型超敏反應且產生淋巴因子)構成且結合至抗原本身之約5000道爾頓的免疫分子。(Kirkpatrick 1993,Structural nature and functions of transfer factors.Ann.N.Y.Acad.Sci.685：362-368)。
術語「可變淋巴細胞受體」係指在諸如七鰓鰻及八目鰻等無頜脊椎動物中發現之淋巴細胞源分子。該等動物具有大量可變淋巴細胞受體，該等可變淋巴細胞受體自僅少量基因產生且以與抗體相似之方式且以相同特異性程度結合至病原抗原。(Alder等人，2005,Diversity and function of adaptive immune receptors in a jawless vertebrate.Science,310(5756)：1970-1973)。
術語「細胞受體」係指B細胞受體之配體結合部分，其係一種同種型之膜結合免疫球蛋白分子(例如，IgD、IgM、IgE)。除存在整合膜結構域外，該等部分與其分泌形式相同。
在特異性結合分子(亦稱為特異性靶向免疫因子，例如抗體、抗體片段、可變淋巴細胞受體或轉移因子)之特性的上下文中，術語「特異性結合」係指能夠優先結合不同抗原之均質混合物中存在之特定抗原。在某些實施例中，特異性結合相互作用可辨別試樣中之期望與不期望抗原(例如，「靶」及「非靶」抗原)，在一些實施例中，與期望抗原之結合係與非期望抗原之結合的約10倍至100倍以上或更高(例如，約1000倍或10,000倍以上)。在一些實施例中，與非共享表位相比，特異性結合分子可特異性結合至微生物之不同物種或菌株之間共享之表位。在某些實施例中，在抗體與抗原以抗體-抗原複合物形式特異性結合時，兩者間之親和力之特徵在於KD(解離常數)小於10-6M、小於10-7M、小於10-8M、小於10-9M、小於10-10M、小於10-11M或小於約10-12M或更小。
術語「先天性免疫系統」或非特異性免疫系統係指以非特異性 方式使宿主抵禦來自其他有機體之感染之細胞、分子組份及機構。先天性免疫系統之細胞及分子組份以一般方式識別病原體並作出反應，但與適應性免疫系統不同，其並不賦予個體長效或保護免疫性。先天性免疫系統提供針對感染之直接防禦。脊椎動物具有第二保護層-適應性免疫系統，其藉由先天性反應活化。
術語「適應性免疫系統」係指識別抗原並作出反應以(例如)消除、中和或預防病原生長之高度特異性、全身性細胞及過程。系統因體細胞高度突變(加速體細胞突變之過程)及V(D)J重組(抗原受體基因區段之不可逆遺傳重組)而具有高適用性。適用性免疫性亦稱為獲得性免疫性並產生免疫記憶。適應性免疫反應具有病原及抗原特異性且在暴露及最大反應之間存在延遲時間。適應性免疫反應係基於選殖識別原理，從而在首先暴露於抗原後，致敏淋巴細胞分化成免疫效應細胞或形成記憶細胞之擴展組，該等記憶細胞藉由產生擴大及更快速反應對相同抗原之次級暴露作出反應。
術語「動物」係指動物界定義。
所有代詞意欲給出其最廣泛含義。除非另有所述，否則雌性代詞涵蓋雄性代詞，雄性代詞涵蓋雌性代詞，單數代詞涵蓋複數代詞，且複數代詞涵蓋單數代詞。
無論是否特別揭示，本文所用數值範圍皆意欲包含該範圍內所包含之每一數值及數值子集。另外，該等數值範圍應解釋為對針對該範圍內之任一數值或數值子集之闡述提供支持。舉例而言，1至10之揭示內容應解釋為支持2至8、3至7、5至6、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等範圍。
本文所引用之所有專利、專利公開案及同行評審公開案(亦即，「參考文獻」)以引用方式明確併入，其併入程度如同每一個別參考文獻明確且單獨地聲明以引用方式併入一樣。在本揭示內容及併入之 參考文獻之間發生衝突之情形下，以本揭示內容為主。
本揭示內容之方式
本揭示內容提供用於管控不期望菌株或病原微生物之組合物及方法。
本發明一實施例係基於產生嵌入或包含於載劑基質內之基於靶向抗體之調配物的方法，其中該等抗體使用與多個相關靶抗原團簇之交叉反應性的受控形式，且其中該載劑基質含有增強抗體效應之載體及輔因子。該等抗體/基質調配物之用途可包含在以下條件或情形下提供廣效治療幹預：已知或懷疑致病因子、但非確切或特異性致病因子之種類，或多個(混合)致病因子係活性的。
已研發以此方式使用抗體之新穎方式，其中利用抗體之特異性及交叉反應性屬性，且然後進一步利用載劑基質內之組份生成多組份原位免疫反應。在此實施例中，將抗體設計為結合至表示抗原之結構相關性團簇之若干密切相關表位的全部。該等抗原可在其他方面顯著不同，且可源於不同來源、有機體或物種。
本發明一實施例涉及載劑基質內之特異性結合分子(免疫因子，例如抗體)之方法，其中該等特異性結合分子對相關抗原種類具有特異性，且對該種類成員之不同實例具有特異性交叉反應性。不管何種有機體或病原作為抗原來源，靶抗原之相關團簇皆存在一定程度之結構相似性。結構相似性可引起稱為「交叉反應性」(反應性分子與除預期抗原外之抗原之立體結合)之現象。交叉反應性通常係無意的，且在大部分情形下可視為誤差及非特異性之來源。然而，在此實施例中，藉由各種方式來控制交叉反應性之範圍及程度以限制並引導其表現，從而提供期望特性。
此治療賦予患者被動免疫性。治療性質使得有關風險因素與食用來自收穫抗體之來源的食物時相當(例如，風險因素與食用一個蛋 及一杯奶時相似)。此係毒性小於當前可用替代性幹預之有效治療。
本發明係基於如下潛在發現：可使用外源(含有自不同於擬治療動物之動物獲得之組份)載劑基質以及外源(自不同於擬治療動物之動物獲得或對應於自不同於擬治療動物之動物獲得之免疫因子)特異性靶向免疫因子以向有需要個體輸送及引入有效多參數免疫性。
在一態樣中，本揭示內容提供組合物，其包括：a)非新生兒人類有效量之至少一種特異性結合分子或其片段，其自動物獲得且特異性結合至抗原，其中該特異性結合分子選自免疫球蛋白、抗體、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子及其混合物；及b)載劑基質，其包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非特異性免疫球蛋白、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白，其中至少一種特異性結合分子及載劑基質之至少兩種組份係自不同動物獲得。
在另一態樣中，本揭示內容提供製備組合物之方法，其包括(a)自動物獲得至少一種結合至特定抗原之特異性結合分子或其片段，其中該特異性結合分子選自免疫球蛋白、抗體、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子及其混合物；(b)獲得至少一種載劑基質，其包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非特異性免疫球蛋白、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白；(c)製備載劑基質及特異性結合分子或其片段之固體形式；及(d)混合載劑基質之固體形式與特異性結合分子或其片段之固體形式。
在另一態樣中，本揭示內容之組合物用於治療或預防微生物感染。在實施例中，微生物感染包含彼等由以下引起者：空腸彎曲桿菌、沙門菌、腸道沙門氏菌傷寒血清型、痢疾志賀氏桿菌、類志賀鄰單胞菌、大腸桿菌、腸病原性大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌、腸凝集性 大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、難辨梭菌、小腸結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌O1、弧菌O139、非O1弧菌、腸炎弧菌、親水產氣單胞菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、腸肝螺旋桿菌、幽門螺旋桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯菌、輪狀病毒、冠狀病毒、諾羅病毒、杯狀病毒、腸腺病毒、巨細胞病毒及星狀病毒。在實施例中，組合物用於治療或預防例如以下病狀：未分類腹瀉、旅行者腹瀉、輪狀病毒腹瀉、毒素介導之腹瀉、霍亂、難辨梭菌感染、痢疾、傷寒、消化性潰瘍、陰道炎，或用於胃腸道菌叢管控。
在一具體實施例中，本揭示內容之組合物及方法用於治療或預防腹瀉。存在多種引起腹瀉之有機體，包含病毒、細菌、寄生蟲及原生動物。細菌感染之主要病因(例如在印度)包含大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌、腸黏著性大腸桿菌、產氣單胞菌(Auromonas spp.)、空腸彎曲桿菌、志賀菌(Shigella spp.)、弧菌、霍亂弧菌O1、腸炎弧菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、難辨梭菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌及小腸結腸炎耶爾森菌。二級病因包含難辨梭菌(毒素A或B)，病毒腹瀉之主要病因係輪狀病毒感染；但杯狀病毒、星狀病毒、諾沃克病毒(Norwalk virus)及腺病毒亦已知導致腹瀉。病毒腹瀉之二級病因包含腸腺病毒、單純皰疹病毒及病毒肝炎。(John B.Sullivan及Gary R.Krieger,Clinical Environmental Health and Toxic Exposures，第2版，Lippincott Williams & Wilkins,2001，第1040頁)。
亦已知患病率具有區域及季節差異。舉例而言，在印度Pranam，一份研究報導，輪狀病毒造成平均15-25%之兒童腹瀉病例。腸毒性大腸桿菌引起總腹瀉病例之10%至20%，其中腸病原性大腸桿菌引起約1%至5%之病例。空腸彎曲桿菌感染引起約10%至15%，且志賀菌估計引起兒童腹瀉病例之5%至15%。霍亂弧菌引起約5%至10%之病例。沙門菌(非傷寒)引起約1%至5%之病例。原生動物 感染主要由隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)引起(5-15%)。在約20%至30%之病例中鑑別出非病原病因。(Fricker,Children in the Tropics,Putting an end to diarrheal diseases,1993-第204期：1-66)。
在印度之不同地區，兒童腹瀉之細菌病例係由具有不同程度患病率之不同病原體所致。舉例而言，印度Orissa中之研究在866份培養物-陽性試樣中發現大腸桿菌(75.5%)、病原大腸桿菌(13.2%)、氣單胞菌(2%)、志賀菌(4.5%)、霍亂弧菌O1(17.3%)、霍亂弧菌O139(1%)及沙門菌(0.7%)。find-health-articles.com/rec_pub_18806340-incidence。
由於各種病因，期望治療未分類腹瀉之有效、廣效、經濟及安全方法。大部分兒童腹瀉情形似乎由細菌及病毒感染引起，但期望抗生素及抗病毒藥劑之替代方式。
A. 組合物
本揭示內容之一態樣涉及用於治療、預防或管控微生物菌叢之組合物。在實施例中，組合物用於治療尤其胃腸道之病原感染。
在實施例中，本揭示內容提供組合物，其包括：a)非新生有效量之至少一種特異性結合分子或其片段，其係自動物獲得且特異性結合至抗原，其中該特異性結合分子選自免疫球蛋白、抗體、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子及其混合物；及，b)載劑基質，其包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非特異性免疫球蛋白、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白，其中至少一種特異性結合分子及載劑基質之至少兩種組份係自不同動物獲得。
特異性結合分子
本揭示內容之組合物及方法提供自動物獲得且特異性結合至抗原之特異性結合分子或其片段。特異性結合分子包含抗體、抗體片 段、肽、可變淋巴細胞受體、轉移因子及其混合物。
抗體
抗體、免疫球蛋白及其他生物免疫因子(統稱為抗體，包含天然及其合成類似物二者)係人類及動物中之已知治療劑。
抗體藉由在抗體上之抗原結合位點與稱為抗原決定簇或表位之抗原部分之間結合(經由非共價力)來發揮作用。抗體能夠具有高度特異性。舉例而言，單株抗體領域已在產生甚至更具特異性及精確結合特性之推動下大力發展。然而，此高特異性可產生過度受限之結合屬性，其中功能相同之藥劑或抗原並不以相同方式與免疫試劑或免疫治療劑進行反應。另一方面，交叉反應性通常視為誤差或失敗，其係抗原與針對相似但不同抗原生成之抗體之間的反應。受控交叉反應性可有利地用於拓寬抗體之結合範圍。
本揭示內容之一實施例係基於產生嵌入或包含於載劑基質內之基於靶向抗體之調配物的方法，其中該等抗體使用與多個相關靶抗原團簇之交叉反應性的受控形式，且其中該載劑基質含有增強抗體效應之載體及輔因子。該等抗體/基質調配物之用途可包含在以下條件或情形下提供廣效治療幹預：已知或懷疑致病因子、但非確切或特異性致病因子之種類，或多個(混合)致病因子係活性的。已研發以此方式使用抗體之新穎方式，其中利用抗體之特異性及交叉反應性屬性，且然後進一步利用載劑基質內之組份生成多組份原位免疫反應。在此實施例中，將抗體設計為結合至表示抗原之結構相關性團簇之若干密切相關表位的全部。該等抗原可在其他方面顯著不同，且可源於不同來源、有機體或物種。
出於本揭示內容之目的，抗體可為源於任一動物之單株、多株、片段、嵌合、人類化或任一其他形式，且抗體可為任一同種型：例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM(胎盤哺乳動物)、IgY(雞)或其他形 式，其可為雙特異性或雙功能或多特異性或多功能抗體或其片段。在實施例中，特異性結合分子可選自三個主要類別中之一者：哺乳動物單株抗體、哺乳動物多株抗體及鳥多株抗體；或為源於其之維持結合至病原組份之能力之任一片段。
本發明一實施例係其在產生廣效治療劑中之用途。一種產生此類反應性調配物之方法涉及產生自適當免疫動物收穫之多株抗體，且其中然後將該等抗體嵌入載劑基質中。多株抗體(或抗血清)係源於不同B細胞系之抗體。其通常係自免疫動物之血清、奶、初乳、蛋或生物流體大量收穫。其係針對特定抗原或抗原組分泌且識別各種不同表位之免疫球蛋白分子的混合物。單一抗原(結合至不同表位)可能具有多個抗體，或單一抗體可能因交叉反應性而結合至多個抗原。多株抗體可自已使用源於目標組份之抗原接種疫苗或接種之例如以下動物獲得：牛、綿羊、馬、山羊、豬、兔、雞、鴨、鵝或火雞。抗體可自(例如)藉由接種動物產生或源於接種動物之組織、血清、奶或蛋收穫。此與單株抗體形成對比，單株抗體係相同及單特異性；且藉由一類免疫細胞(其係單一母細胞之所有純系)產生。
本發明中所使用之抗體可自血清、血漿、初乳、奶、蛋或其他適宜生物源流體或自細胞培養基、上清液等收集。本發明中所使用之抗體可以任一適宜方式進行處理以準備用於調配及應用，其包含但不限於分離、血漿去除術、乾燥過程、凍乾、巴氏消毒(pasteurization)及保存方法。本發明中所使用之抗體可端視其最終預期應用而以各種方式進行處理、濃縮、分離或純化。
藉由將抗體混合物改變為彼等適用於各個實施例者，本揭示內容提供適用於治療或預防其他胃腸道感染(例如霍亂、難辨梭菌、痢疾、沙門氏鼠傷寒桿菌(傷寒)及幽門螺旋桿菌(消化性潰瘍))之組合物及方法。
在一實施例中，較佳藉由(例如)多次皮下(sc)或腹膜腔內(ip)注射相關抗原及視需要之佐劑，而在動物中產生抗體。在一態樣中，可有用地將相關抗原(尤其在使用合成肽時)結合至在擬免疫物種中具有免疫原性之蛋白質。舉例而言，可使用雙功能或衍生化試劑將抗原結合至鑰孔血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，該雙功能或衍生化試劑係(例如)馬來醯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半脒胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R N=C=NR(其中R及R係不同烷基)。針對抗原、免疫原性結合物或本文所述之衍生物對動物實施免疫。在其他實施例中，抗體可為合成或半合成抗體，如在噬菌體呈現文庫中所獲得，或以人類化或嵌合抗體形式所製備。
與傳統上用於產生抗體之哺乳動物相比，鳥(例如產蛋母雞)係高度成本有效之抗體產生者。鳥抗體具有優於哺乳動物抗體之生物化學優點。哺乳動物及鳥之間之免疫差異使得在免疫分析中可提高敏感性並減小背景；且在投與哺乳動物個體時具有高特異性且無互補免疫效應。與哺乳動物抗體相比，鳥抗體既不經由主要或經典路徑活化人類補體系統，且其亦不與類風濕性因子、人類抗小鼠IgG抗體、葡萄球菌蛋白A或G或細菌及人類Fc受體發生反應。然而，鳥抗體可活化非發炎性替代路徑。因此，鳥抗體提供優於哺乳動物抗體之許多優點。
在一較佳實施例中，特異性分子係在使用一種病原組份或病原組份混合物接種之母雞之蛋中製得的多株抗體。特定抗原之各種製劑亦可用於接種。接種後，母雞產生在蛋黃中含有大量特異性IgY免疫球蛋白、且在白蛋白中含有少量IgM及IgA免疫球蛋白的蛋。因此，蛋係大量經濟地產生、高特異性及穩定抗體之極佳來源。在一實施例中，使用雞產生鳥抗體；然而，可替代性使用火雞、鴨、鵝、鴕鳥等。在一態樣中，如本文所述，藉由業內已知之任一方法來對母雞實 施接種。舉例而言，可經肌內或皮下注射抗原。鳥中用於注射之較佳肌肉係胸肌。可使用之其他投與方法包含皮下注射、靜脈內注射、腹膜腔內注射、皮內、直腸栓劑、氣溶膠或經口投與。
較佳地，藉由免疫及以固定時間間隔重複投與適當劑量之加強免疫來在目標動物中誘導並維持特異性免疫狀態。時間間隔較佳地為在1-12個月時間中之1-8週間隔。選擇介於約0.01-5毫克抗原之間之劑量。在一態樣中，劑量為0.01mg至1.0mg抗原/母雞接種，較佳為100mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg或750mg抗原/母雞接種。在12個月時間中之總接種數可選自1、2、3、4、5或6。通常，在第1天實施第一接種，且在第10天及第20天進行加強免疫接種。可根據需要藉由監測蛋中之特異性抗體濃度或力價(例如，藉由ELISA)對母雞再次接種疫苗。用於母雞之典型皮下劑量體積選自約0.2mL至1.0mL、0.3mL至0.7mL或0.5mL。然而，重要的是，投與加強免疫不會引起免疫耐受性。該等過程已為業內所熟知。
可使用其他接種維持程序或程序組合，例如，用於初次免疫之肌內注射及用於加強免疫注射之靜脈內注射。其他程序包含同時投與微膠囊化及液體免疫原、或用於初次免疫之肌內注射及藉由經口投與之加強免疫劑量或藉由微膠囊化方式之非經腸投與。彼等熟習此項技術者已知初級及加強免疫之若干組合。
佐劑(亦稱為醫藥載劑)或其功能等效物可包含於免疫溶液/疫苗組合物中以增強動物之特異性免疫反應。已闡述大量佐劑並用於生成實驗室動物(例如小鼠、大鼠、兔及雞)中之抗體。在該設置中，副作用之耐受性相當高，此乃因主要目的為獲得較強抗體反應。
本揭示內容所涉及之佐劑可根據其來源進行分類，包括礦物、細菌、植物、合成或宿主產物。此分類下之第一組係礦物佐劑，例如鋁化合物。使用鋁鹽沉澱之抗原或與預形成鋁化合物混合或吸附至預 形成鋁化合物之抗原已廣泛使用以增強動物及人類中之免疫反應。在一實施例中，免疫組合物中之佐劑係來自細菌來源。可純化及合成具有細菌來源之佐劑(例如胞壁醯二肽、脂質A)且已選殖宿主介質(介白素1及2)。細菌來源之活性組份之若干佐劑的已知化學純化包含：百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、脂多糖、弗羅因德完全佐劑(Freund's Complete Adjuvant)(FCA)及弗羅因德不完全佐劑(Freund's Incomplete Adjuvant)(Difco實驗室，Detroit,Mich.)及默克佐劑65(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company公司，Rahway,N.J.)。在一具體態樣中，將弗羅因德完全佐劑或弗羅因德不完全佐劑用於本揭示內容之免疫組合物中。本發明之其他適宜佐劑係(例如)Titermax經典佐劑(SIGMA-ALDRICH)、ISCOMS、Quil A、ALUN(參見美國專利第58767號及第5,554,372號)、脂質A衍生物、霍亂毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質、GMDP及亦與免疫刺激劑組合之其他佐劑(美國專利第5,876,735號)。百日咳博德特菌係本發明背景中之令人感興趣之佐劑，此乃因其能夠經由對於T淋巴細胞群體之作用來調節細胞介導之免疫性。弗羅因德完全佐劑係大部分實驗研究中之標準。可向接種組合物中添加礦物油以防止抗原快速分解代謝。
許多其他類型材料可用作本揭示內容之免疫原性或免疫組合物中之佐劑。其包含植物產物(例如皂苷)、動物產物(例如殼多糖)及諸多合成化學物質。
藉由肌內途徑免疫之雞可在免疫後第28天時於其蛋中產生高特異性抗體含量，且在多於200天期間繼續產生特異性抗體，此使得抗體製劑可在短時間內(例如小於4-5週)使用。蛋含有至多約50mg/蛋至約100mg/蛋之IgY抗體濃度。可自一個蛋獲得100mg以上之純化IgY。一個蛋黃中抗原特異性抗體之百分比可為至多約2%至10%。 (daSilva等人，IgY：A promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy.Veterinary Immunol.Immunopath.,135(2010)：173-180)。一隻高產蛋品系雞可產生約20個蛋/月。蛋重約33克至約77克，其中約10.5%係全殼蛋。蛋黃佔全蛋重量之約31%。乾燥後，可自72個蛋產生約1kg乾燥全蛋粉末。因此，在此計算中，一個蛋可返回約13.9g乾燥全蛋。在另一態樣中，一個免疫蛋可返回10g至約15g乾燥全蛋。在另一態樣中，本揭示內容之免疫蛋係40mL/蛋至55mL/蛋，其中具有約1-2mg/mL總IgY/蛋。在另一態樣中，本揭示內容之免疫蛋含有約0.01mg/mL至0.05mg/mL特異性IgY/蛋。因此，在一態樣中，在處理後，一個乾燥全免疫蛋含有約80mg至110mg總IgY及約6mg至10mg總混合抗原特異性IgY(例如，來自使用(例如)混合抗原製劑免疫之雞)。
可經由彼等熟習免疫學技術者已知之諸多方法來測定疫苗是否在產蛋動物中誘發免疫反應。該等方法之實例包含酶聯免疫吸附分析(ELISA)、用以刺激抗原之抗體之存在的測試及設計用於評估來自宿主之免疫細胞對於抗原作出反應之能力的測試。誘導免疫反應所需之最小免疫原劑量取決於所用之接種程序，包含所用佐劑及免疫原調配物之類型以及用作宿主之產蛋動物之類型。
在一實施例中，使用適於商業產蛋之母雞來產生多株抗體。可使用適於產蛋之任一品種之雞。舉例而言，可選擇洛島紅雞(Rhode Island Red)、白來航雞(White Leghorn)、褐來航雞(Brown Leghorn)、新羅曼褐雞(Lohmann Brown hen)、性別相關性雜交體或適於產生較大蛋尺寸、高容積蛋及便於處理之其他品種。在一態樣中，如對小雞之標準疾病(例如沙門菌、禽流感或新城病毒(Newcastle virus)等)一般對雞實施接種。在一態樣中，可對任一年齡之雞實施接種。按照藉由最終產物之量及定時預先確定之方案對即將達到產蛋年齡(對於雞而 言為約15-19週)或在之前或之後之任一預選時間之母雞實施接種以得到穩定連續的生產流。通常，在約2至4週之適宜分離及適應時間後，每組將進入接種程式中，其中使用各種抗原或包括抗體所期望之特定抗原之免疫組合物。
在一實施例中，自經接種雞收集蛋並處理成全蛋。將蛋儲存於致冷條件下直至收集到足夠蛋用於製備批料為止。將來自預定雞組之蛋批料粉碎，自殼分離內容物並混合，且較佳地實施巴斯德滅菌(pasteurized)以消除來自雞之病原微生物的潛在污染。
在一態樣中，對免疫蛋產物實施巴斯德滅菌。在衛生設施中處理蛋產物。藉由自動設備將帶殼蛋處理成免疫蛋產物，該自動設備自平面蛋架(flat)中取出帶殼蛋，洗滌並對殼進行消毒，將蛋打破。視需要，將蛋黃與蛋白分離。視需要過濾液體蛋產物，視需要與其他成份混合，且然後在其他處理前冷凍。然後使所得蛋產物液體接受致命性處理(例如巴斯德滅菌)或加熱至乾燥形式。在美國，1970蛋製品檢驗法案(1970 Egg Products Inspection Act)(EPIA)要求對所有分配用於消費之蛋製品實施巴斯德滅菌。
在巴斯德滅菌後，使用標準商業方法將總蛋內容物乾燥，例如使用環境空氣或熱空氣之噴霧乾燥、熱乾燥、冷凍乾燥或凍乾。在一態樣中，乾燥經巴斯德滅菌之液體蛋之適當方法將對於蛋中抗體及分子組份之危害降至最低，從而使產物具有高營養值且能夠賦予被動保護。
在一態樣中，測試乾燥蛋以測定總力價或抗體含量。使用標準測試程序，例如ELISA、FIA(螢光免疫分析)、RIA(放射免疫分析)或諸如此類。在另一態樣中，將批料與來自雞組之其他平均產量下的批料摻和，從而產生含有標準量抗體之批次。可將含有特異性多株抗體之乾燥蛋在室溫下儲存於密封容器中，然後調配成本揭示內容之組合 物。在實施例中，將乾燥蛋材料用作全蛋且並不分離出。在實施例中，全乾燥蛋材料含有至少5mg/蛋之特異性IgY。
在另一實施例中，分離IgY。分離IgY之第一步驟係使水溶性蛋白與脂蛋白分離。水溶性蛋白質構成蛋黃中總蛋白質之42.4%(Osuga 等人，「Egg Proteins：In Food Proteins」,J.R.Whitaker及S.R.Tannenbaum編輯，AVI Pub.公司，Westport,Conn.(1977))。
已使用許多方法來分離及純化來自蛋黃之免疫球蛋白(Martin等人，Can J.Biochem.Physiol.35：241(1957)；Martin等人，Can.J.Biochem Physiol.36：153(1958)；Jensenius等人，J.Immunol.Methods 46：63(1981)；Bade等人，J.Immunol.Methods 72：421(1984)；Polson等人，Immunol.Invest.14：323(1985)；Hassl等人，J.Immunol.Methods 110：225(1988))。Hatta等人(Agric.Biol.Chem.54：2531(1990))使用食物級天然樹膠(例如，角叉菜膠)去除沉澱物形式之蛋黃脂蛋白並自蛋黃回收水溶性部分中之IgY。自雞蛋黃回收抗體之方法在業內已眾所周知。可使用若干方法自蛋黃提取IgY，且可使用商業提取套組(van Regenmortel,M.H.V.(1993)。Eggs as protein and antibody factories.In Proceedings of the European Symposium on the Quality of Poultry Meat，第257-263頁。Tours,France：INRA)。
在另一實施例中，立體特異性結合分子可為對病原組份具有特異性之單株抗體。
單株抗體可使用首次由Kohler等人在Nature,256：495(1975)中闡述之雜交瘤方法來製備，或可藉由重組DNA方法(U.S.4,816,567)來製備。在雜交瘤方法中，根據上文所述對小鼠或其他適宜宿主動物(例如倉鼠)實施免疫以誘發產生或能產生與免疫所用蛋白質特異性結合之抗體的淋巴細胞。另一選擇為，可在活體外對淋巴細胞進行免疫。免疫後，分離淋巴細胞且然後利用適宜融合劑(例如聚乙二醇)使其與 骨髓瘤細胞融合，從而形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59至103頁(Academic Press,1986))。
在生長有雜交瘤細胞之培養基中分析針對抗原之單株抗體之產生。較佳地，雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性係藉由免疫沉澱或活體外結合分析(例如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定。單株抗體之結合親和力可(例如)藉由Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)中所述之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。
藉由習用抗體純化程序以適當方式將亞純系分泌之單株抗體與培養基、腹水或血清分離，例如親和力層析(例如，使用蛋白質A或蛋白質G-瓊脂糖)或離子交換層析、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析等。
編碼單株抗體之DNA係使用習用程序容易地加以分離及測序(例如藉由使用能特異性結合編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針來實施)。雜交瘤細胞可用作該DNA之較佳來源。分離後，可將DNA立即置於表現載體中，然後將其轉染至原本不產生抗體蛋白之宿主細胞(例如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以在重組宿主細胞中實現單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA之細菌中重組表現的綜述文章包含Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5：256-262(1993)及Plckthun.Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)中所述技術生成之抗體噬菌體文庫中分離。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)闡述使用噬菌體文庫分別分離鼠類及人類抗 體。後續公開案闡述藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人類抗體(Marks等人，Bio/Technology.10：779-783(1992))以及作為構造極大噬菌體文庫之策略之組合感染及活體內重組(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))。因此，該等技術係分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術之可行替代方式。
亦可藉由(例如)用人類重鏈及輕鏈恆定結構域(CH及CL)序列來替代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))或藉由使非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列融合來對編碼抗體之DNA進行修飾以產生嵌合或融合抗體多肽。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗體之恆定結構域，或其可替代抗體上一個抗原結合位點之可變結構域以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包括一個對抗原具有特異性之抗原結合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原結合位點。
用於免疫以製備特異性結合蛋白之抗原
選擇用於免疫之抗原可為動物之免疫系統將作出反應之細菌、病毒、原生動物、真菌、寄生蟲、細胞或任一其他物質。在一態樣中，藉由使用佐劑來增強抗原之免疫原性。
在一態樣中，使用病原組份、抗原或免疫原以接種組合物、接種劑或疫苗形式來對動物實施接種。在一態樣中，病原組份或特定抗原可獲得自或源於諸如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)等商業來源。在另一態樣中，可自野生型菌株分離病原組份。在另一態樣中，病原組份或不期望菌株存在於混合抗原製劑中。源於各種不期望菌株或病原組份之任一抗原或抗原組合可用於免疫組合物中。
在一態樣中，所選接種劑、抗原或免疫原係靶向抗原團簇之常見或保存組份或區域，而忽略相關抗原團簇之個別成員之可變或辨別 組份或區域。該方法涉及製備適當免疫原，其特性在於，誘發產生對該表位之期望實例具有交叉反應性但對於其他表位並無反應性之抗體；及將產生細胞或有機體接種或暴露至該免疫原以產生抗體，其中所得抗體嵌入適宜投與用載劑基質內。可研發此類調配物，該等調配物使用根據此方法產生之抗體混合物以提供寬覆蓋率之一種以上的靶抗原團簇。舉例而言，在不相關抗原之兩種團簇與疾病或病狀有關且期望產生單一調配物來解決此疾病或病狀之情形下，可使用同時提供兩種寬範圍反應性之此方法製備兩種抗體、免疫球蛋白或生物免疫因子之混合物。此實施例之一實例係用於產生與結構相關毒素之團簇具有特異性反應性之抗毒素抗體。
在一實施例中，使用此方式製備來自任一革蘭氏陰性(Gram-negative)細菌(大腸桿菌、沙門菌、志賀菌、及其他腸桿菌(Enterobacteriaceae)、假單胞菌(Pseudomonas)、摩拉克氏菌(Moraxella)、螺桿菌、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)及其他細菌)之脂多糖(LPS)(內毒素)之廣泛反應性抗體，或製備(例如)AB5毒素(包含彎曲桿菌腸毒素、霍亂毒素、不耐熱腸毒素(LT及LT-II)(大腸桿菌)、百日咳毒素、志賀毒素(志賀菌)、志賀樣毒素(或維羅毒素(verotoxin)))之廣泛反應性抗體。
在一較佳態樣中，該等實例性抗毒素抗體具有一定效應，不管產生毒素之物種如何。在另一態樣中，所產生抗體係中和抗體，其能夠中和或純化靶毒素之生物活性。可使用此一廣效中和抗體幹預介導症狀之毒素係靶向團簇之一(在該等實例中，AB5或LPS)之病理學情形(例如某些類型之腹瀉)，且無需知曉何種有機體致病。另外，若所製得之混合物含有臨床有效量之抗AB5抗體及抗LPS抗體，則可使用調配物幹預活性毒素係AB5或LPS或二者之情形。
此方法可擴展至包含任一數量(在此實例中)之毒素團簇，且包含 其他毒素樣反應(例如病毒毒素樣現象)之介質之廣效中和抗體，從而廣泛應用於幹預(在此實例中)可在並不知曉傳染性病因之情形下管控症狀及病理學、或存在多個傳染性病因的腹瀉。在一態樣中，本揭示內容提供包括抗毒素抗體與載劑基質之協同組合之組合物。
在一些實施例中，將本發明之方法及組合物用於各種病原體或藥劑，包含但不限於霍亂毒素(霍亂弧菌)、大腸桿菌(包含腸毒性大腸桿菌(ETEC))、志賀菌、沙門菌、彎曲桿菌、難辨梭菌、寄生蟲(例如，賈第蟲(Giardia)、溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、隱孢子蟲(Cryptosporidiosis)、環孢子蟲(Cyclospora))及腹瀉病毒(例如，輪狀病毒)。
進入胃腸道後，許多病原體(包含但不限於諸如大腸桿菌等細菌)結合(黏著)至上皮、黏膜或其他組織並嵌入胃腸道組織(例如腸壁)中。結合至胃腸道中之組織後，病原體發生複製，從而藉由直接產生或間接增加病原細胞裂解(藉由免疫系統作用)使得毒素濃度增加。藉由抑制病原體結合至胃腸道組織之能力，可促進在形成尺寸足以引起損傷及其他症狀之純系前病原體進行更有效地移動、消化及分泌。藉由封阻用於黏著至胃腸道之病原上之受體及配體的種類(包含但不限於黏著素、鈣黏著素、纖毛、原纖維及/或病毒黏著結構)，可預防或最小化至胃腸道組織之黏著，從而最終實質上降低來自利用此作用模式之病原體的病況。
在各個實施例中，病原選自引起胃腸炎之一種人類或獸醫之腸或胃腸道病原體或其組合。在各個態樣中，病原選自由以下組成之群：空腸彎曲桿菌、沙門菌、沙門氏鼠傷寒桿菌、腸道沙門氏菌傷寒血清型、痢疾志賀氏桿菌、類志賀鄰單胞菌、大腸桿菌[包含(EPEC)腸病原性大腸桿菌、(ETEC)腸毒性大腸桿菌、(EaggEC)腸凝集性大腸桿菌、(EIEC)腸侵襲性大腸桿菌及(EHEC)出血性大腸桿菌]、小腸 結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌O1、弧菌O139、非O1弧菌、腸炎弧菌、親水產氣單胞菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、難辨梭菌、腸肝螺旋桿菌(包含幽門螺旋桿菌)、金黃色葡萄球菌、克雷伯菌、輪狀病毒、冠狀病毒、諾羅病毒、杯狀病毒、腸腺病毒、巨細胞病毒及星狀病毒。在另一態樣中，病原相關性毒素包含內毒素或外毒素。在另一態樣中，病原相關性黏著要素包含黏著素、鈣黏著素、纖毛、原纖維、病毒黏著結構或其組合。
在各個具體態樣中，病原組份、免疫原或抗原可源於(例如)輪狀病毒、冠狀病毒、C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌(細胞)、大腸桿菌之腸毒性菌株及來自大腸桿菌之腸毒素、具有K99、K88、987P或F41菌毛黏著因子抗原之任一細菌、藉由大腸桿菌及沙門氏鼠傷寒桿菌(通常係革蘭氏陰性)引起之內毒素(或LPS)。在一特定態樣中，使用源於一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種或許多種病原微生物之抗原或毒素對母雞實施接種。
在一態樣中，在抗原源與接種疫苗動物之免疫系統之間之距離增加時，免疫反應更加有效。
在一具體實施例中，使用第一混合抗原製劑對第一雞群組實施接種。在一態樣中，使用第二混合抗原製劑(含有與第一混合抗原製劑不同之抗原組)對第二雞群組實施接種。在另一態樣中，使用第三混合抗原製劑對第三雞群組實施接種。在另一態樣中，使用第四混合抗原製劑對第四雞群組實施接種。儘管並不意欲限制本發明範圍，但據信可有利地使用不同抗原免疫不同群組以避免抗原過量。
自每一群組收集蛋，視需要測定特異性及/或總IgY之力價，視需要分離及/或純化，且單獨處理以製備乾燥粉末。在另一態樣中，將來自第一及第二群組、第一、第二及第三群組或第一、第二、第三及第四群組之乾燥蛋粉末與載劑基質摻和或封裝在一起以製備本揭示內 容之組合物。在一態樣中，第一抗原製劑包括牛輪狀病毒(血清型G6及G10)、牛冠狀病毒、大腸桿菌中具有K99菌毛黏著因子之腸毒性菌株及C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。可視需要對混合抗原製劑實施佐劑化以增強免疫反應。
在另一態樣中，第二抗原製劑包括藉由C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌產生之β毒素及大腸桿菌中產生不耐熱毒素或具有K99、K88、987P或F41黏著因子之腸毒性菌株。
在一態樣中，第三抗原製劑包括大腸桿菌及沙門氏鼠傷寒桿菌。JVAC減小由大腸桿菌及沙門氏鼠傷寒桿菌引起之內毒素血症的發病率及嚴重程度。通常與其內毒素有關者係腸桿菌乳腺炎(Coliform Mastitis)及與內毒素血症有關之其他革蘭氏陰性疾病。
在另一態樣中，藉由業內已知之任一方式來製備抗原。例如，來自野生型來源(例如患有(例如)大腸桿菌腹瀉之動物)之細胞。可將分離細胞在37℃下於(例如)胰化酪蛋白大豆培養液(Trypticase Soy Broth)(TSB)中培養過夜並藉由離心濃縮。可使用0.4%甲醛將所得沉澱物再懸浮於PBS緩衝液中並在37℃下培育以鈍化。可藉由離心去除甲醛。可將沉澱物再懸浮於PBS中並用作抗原。在一態樣中，在接種前使用等體積之佐劑來乳化抗原。
在另一實施例中，抗原選自引起結膜炎之彼等病原有機體。已知致病病原體闡述於Gambotto等人之US 2008/0031903中，其以引用方式併入本文中。
流行性角結膜炎(EKC)係在全世界發現之眼睛之衰竭性傳染疾病。該疾病主要由腺病毒(尤其血清型8、19及37)引起。血清型3、4及11亦與一些EKC流行病有關。該疾病影響所有年齡組，在學校、游泳池、兒科部門及帳篷中高度傳染並迅速蔓延。當前，治療為症狀型，此乃因沒有有效治療。期望研發有效抗病毒局部藥劑來治療疾病 並預防流行病。
結膜炎亦可由諸多其他細菌、病毒、真菌及原生動物因素引起，包含但不限於：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、淋病雙球菌、砂眼披衣菌、腺病毒、單純皰疹、帶狀皰疹病毒、腸道病毒、鐮刀菌、念珠菌及棘阿米巴。可使用抗病毒藥物產物(例如西多福韋(cidofovir))治療某些病毒感染(例如腺病毒感染)。通常，藥物產物具有副作用，例如與西多福韋有關之眼部及腎副作用。藥物產物會帶來其他後勤問題，包含穩定性、生產成本等。因此，期望用於治療眼部感染之便宜、易獲得、廣泛接受且穩定之藥物產物。
在一態樣中，本揭示內容提供用於治療結膜炎或紅眼之組合物，其包括該等病原體之多株抗體與下文所述載劑基質之組合。如本文所述產生抗體。
在另一實施例中，抗原選自引起陰道炎之彼等病原有機體。該感染可為細菌、真菌(酵母)或寄生感染。細菌陰道炎可(例如)由加德納菌、淋病雙球菌、砂眼披衣菌、黴漿菌、空腸彎曲桿菌引起。寄生陰道炎可由(例如)陰道鞭毛滴蟲引起。病毒陰道炎可由(例如)皰疹病毒類型1或類型2引起。念珠菌陰道炎由酵母樣真菌念珠菌引起。已闡述170種以上之酵母樣真菌。白色念珠菌係在85-90%之女性中最常見之念珠菌陰道炎之致病因子。禿髮念珠菌(5-10%)、熱帶念珠菌(3-5%)、嗜酸性念珠菌(3-5%)及克魯斯氏念珠菌(1-3%)亦在其他念珠菌中具有臨床顯著性。可選擇該等病原體中之任一者作為本文所述用於多株抗體產生之抗原來源。
念珠菌性外陰陰道炎通常由諸多誘病因素引起，例如長期且不受控地使用抗生素、皮質類固醇、細胞抑制劑、經口避孕藥、輻射療法、嚴重傳染性疾病、內分泌病症、免疫缺陷狀態等。廣效抗生素處方不僅阻抑病原細菌，且亦阻抑黏液陰道腐生菌：乳酸桿菌 (lactobacilli)及雙歧桿菌(bifidobacteria)。因此，陰道pH升高(朝向鹼性範圍)，且發生自清潔過程之擾動。另外，念珠菌能夠使用一些抗生素作為營養受質。因此，在雌性生殖器官中產生念珠菌之活性過度生長的有利條件。在一態樣中，本揭示內容提供用於治療陰道炎之組合物，其包括一或多種所述病原體之多株抗體與下文所述之載劑基質之組合。
在一具體態樣中，包括存於載劑基質中之特異性多株抗體之混合物之本揭示內容組合物提供治療細菌、病毒、真菌或寄生陰道炎的廣效方法。在另一態樣中，可使用本揭示內容之組合物治療有需要個體之未分類陰道炎。
其他特異性結合分子
本揭示內容之組合物及方法包含其他特異性結合分子，包含轉移因子、可變淋巴細胞受體及細胞受體。轉移因子係由胺基酸(其引起抗原特異性細胞介導之免疫性、主要係遲髮型超敏反應且產生淋巴因子)構成且結合至抗原本身之約5000道爾頓的免疫分子。(Kirkpatrick 1993,Structural nature and functions of transfer factors.Ann.N.Y.Acad.Sci.685：362-368)。可變淋巴細胞受體係在諸如七鰓鰻及八目鰻等無頜脊椎動物中發現之淋巴細胞源分子。該等動物具有大量可變淋巴細胞受體，該等可變淋巴細胞受體自僅少量基因產生且以與抗體相似之方式且以相同特異性程度結合至病原抗原。(Alder等人，2005,Diversity and function of adaptive immune receptors in a jawless vertebrate.Science,310(5756)：1970-1973)。
載劑基質
本揭示內容提供用於治療或預防個體之病原感染之組合物。該等組合物包括特異性結合分子(例如多株抗體)與載劑基質之組合。儘管並不意欲限制本發明範圍，但載劑基質用於雙重目的。首先，用於 (例如)在經口投與後且在非新生個體之胃腸道內保護其預期功能環境中之抗體；且進一步提供組份(例如，先天性免疫系統之組份)以協同方式與抗體反應以管控感染。
術語「載劑基質」或保護性/反應性基質係指以適當比率及濃度含有要素、輔因子或其他組份之任一受質、化合物、調配物、或補充混合物(不論天然或合成)，其供應繁殖、促進、支持或增強原位免疫型反應、級聯或反應所需之要素。該等要素可個別地促進裂解及突變反應、集合及複合物之形成、消耗及吸附功能，供應基本要素、生物產品或化合物，及提供活性要素或組份之保護功能。載劑基質可含有或可不含內源性抗體(免疫因子)，該等抗體可對靶向抗原具有特異性或可不具有特異性。
在一實施例中，載劑基質選自或源於來自非人類哺乳動物之血清、血漿、初乳、奶、唾液、淋巴液、黏液或淚液。
天然存在之載劑基質之實例係初乳。初乳以特異性方式在哺乳動物中天然產生，從而以極濃之低體積形式將其組份遞送至新生兒之胃腸道並穿過胃腸道。「初乳」(Colostrum或first milk)係藉由哺乳動物在產後立即產生。抗體及輔因子自母親傳送至新生兒並提供針對病原體之第一保護。生長因子亦刺激腸之發育及修復。
初乳含有免疫-互補因子之宿主。其包含干擾素、免疫球蛋白(包含IgG及分泌型IgA)、多形核白血球、巨噬細胞及淋巴細胞。初乳亦含有富脯胺酸多肽或PRP(T細胞活化劑)。已知初乳與奶相比具有高免疫球蛋白含量。已知哺乳動物中之初乳含有諸如IgA、IgG及IgM等抗體。IgA被吸收至腸上皮，穿過血液，且分泌至其他類型1黏膜表面上。應注意，在任何地方，牛初乳具有6%至20%之免疫球蛋白；主要係IgG1及IgG2。在一態樣中，全牛初乳用作載劑基質。
初乳亦幫助調節腸環境，從而使得其抵抗外來病原體。初乳含 有乳鐵蛋白，乳鐵蛋白係防止細菌及病毒獲得複製所需之鐵之鐵結合蛋白。初乳亦選擇性地富含某些益生菌物質以繼而幫助抵禦感染。其係兩種主要生長因子轉化生長因子(TGF)α及β之唯一天然來源，且係胰島素生長因子1及2之來源。該等因子促進組織修復及發育。初乳亦係肝細胞生長因子之來源，肝細胞生長因子刺激腸壁細胞之生長及擴增。初乳經天然設計用作胃腸道環境內之載劑基質。載劑基質之合成形式亦包含於此揭示內容中。由天然及合成組份二者構成之載劑基質亦包含於本揭示內容內。
初乳高度富含蛋白質、維他命A及氯化鈉，但所含碳水化合物、脂質及鉀之量低於正常奶。初乳中之大部分有關生物活性組份係生長因子及抗微生物因子。初乳中之抗體提供被動免疫性，而生長因子刺激腸之發育。其被傳送至新生兒並提供針對病原體之第一保護。來自母親之被動免疫性轉移至新生兒。
新生兒具有極小之消化系統，且初乳以極濃之低體積形式遞送其營養。新生兒之胃腸道尤其易於接受來自初乳之免疫性的被動轉移。出生時，胃pH範圍在6-8之間有所變化，此乃因在胃中殘留羊膜液。胃pH然後降至在24小時至48小時內pH為1.5至3。因此，新生兒之GI條件有利於被動免疫。此外，新生兒及早產嬰兒之胃排空時間有所延長，其中在6-8個月年齡時達到成人值。在某些情形(例如，哺乳)下，初乳中之抗體及輔因子可向接受者提供被動免疫性；此對於新生兒而言尤其適應。在經口投與免疫球蛋白時，非新生幼兒、兒童、青年人及健康成人之胃腸道係更有害之環境。
初乳之其他免疫組份包含先天性免疫系統之主要組份，例如乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、溶菌酶、乳過氧化物酶、補體及富脯胺酸多肽(PRP)。在初乳中亦發現諸多細胞激素(控制免疫系統之小信使肽)，包含介白素、腫瘤壞死因子、趨化激素及其他細胞激素。初乳亦含有 諸多生長因子，例如胰島素樣生長因子I及II、轉化生長因子α、β1及β2、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、顆粒球-巨噬細胞刺激生長因子、血小板源生長因子、血管內皮生長因子及菌落刺激因子-1。
在一態樣中，載劑基質包括初乳之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、或六種或更多種、或七種或更多種非免疫球蛋白組份。在另一態樣中，載劑基質包括已進行處理以去除大部分免疫球蛋白之初乳。在實施例中，載劑基質包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非特異性免疫球蛋白、補體系統組份、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白，其中至少一種特異性結合分子及至少兩種載劑基質之組份係自不同動物獲得。
在另一態樣中，基質包括兩種或更多種選自以下之試劑：溶菌酶、磷脂酶、防禦素、調理素、富脯胺酸多肽(PRP)、β-溶解素、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、細胞激素、介白素、趨化激素、干擾素、TNF-α、纖連蛋白、富脯胺酸多肽、胰島素生長因子類型1、胰島素生長因子類型2、衍生血小板生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞血小板生長因子、轉化生長因子α、轉化生長因子β、神經生長因子、瘦素、白血球、白血細胞、吞噬細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性球、多形核細胞、及樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、自然殺手(NK)細胞、淋巴因子激活之殺手(LAK)細胞、陽離子蛋白(包含防禦素)、蛋白水解酶(包含彈性蛋白酶)、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶、NADPH氧化酶組份或其組合。在另一態樣中，基質包含來自先天性免疫系統之試劑之混合物。在一較佳態樣中，載劑基質包括非超免疫牛初乳。
牛初乳係母牛針對其新生小牛所產生。在許多奶牛群中，小牛並不允許哺乳；相反，向其餵送初乳，且隨後依次自瓶、桶餵送奶。 收集初乳並處理以用於商業應用。包含初乳之各種組合物及製備初乳之方法已揭示於美國專利第US 5,846,569號、第US 6,410,058號、第US 6,475,511號、及第US 6,521,277號中，其全部內容以引用方式併入本文。乾燥牛初乳可於市面購得。在一具體態樣中，載劑基質係市售乾燥牛初乳。
家畜管理人/育種者通常儲備其動物之初乳。在其自身場所內產生之初乳被視為優於來自其他來源之初乳，此乃因其係藉由已暴露於(且由此產生抗體)該等場所中出現之病原體之動物所產生。通常，來自暴露於相關病原體之動物之初乳將具有優良免疫特性。
牛初乳及其組份對於人類消耗而言係安全的，惟對於乳糖或其他組份耐受不良或過敏之背景除外。端視對於許多人類病原體之天然暴露，來自食草母牛之牛初乳含有對該等病原體具有特異性之免疫球蛋白，該等病原體包含大腸桿菌、小隱孢子球菌(Cryptosporidium parvum)、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、沙門菌、葡萄球菌及輪狀病毒。在研發抗生素之前，初乳係用於抵抗感染之免疫球蛋白之主要來源。
超免疫初乳代表藉由使用特定病原對母牛實施免疫來增強天然牛初乳之有效性的嘗試。此方式較有前途，此乃因抗體係針對原始激發中所使用之特異性病原體或抗原產生。然而，初乳之各種抗原反應、生物可變性及低生產率限制了其臨床及商業用途。
在一態樣中，本揭示內容提供包括初乳之組合物，該初乳並非超免疫初乳或不含可量測或顯著量之對於病原或靶抗原組份具有特異性之抗體。在另一態樣中，本揭示內容提供組合物，其中載劑基質含有不含顯著量特異性或非特異性抗體之先天性免疫系統之各種組份。
在一實施例中，可(例如)藉由以下方式處理初乳以去除大部分免疫球蛋白：以批料或管柱形式將抗體吸收於親和樹脂(例如蛋白質G或 蛋白質A瓊脂糖凝膠或蛋白質A或蛋白質G瓊脂糖)並保留洗脫液用於進一步處理。亦可藉由凝膠過濾層析在Sephadex G-200或DEAE Sephadex A-25離子交換層析上來去除免疫球蛋白。(Lloyd及Soulsby，Immunology,The role of IgA immunoglobulin in the passive transfer of protection to Taenia taeniaeformis in the mouse.34,939-945)該等過程可以管柱或批料形式藉由業內已知之各種方法及技術來運行。
在一具體實施例中，載劑基質包含初乳。在一態樣中，將市售初乳用作支持性/反應性基質。在一較佳態樣中，市售牛初乳係僅自最初擠出之初乳產生之聚集及速調、巴斯德滅菌、全脂、全初乳粉末。在另一態樣中，在低壓及低溫下處理初乳，且使用間接蒸汽實施噴霧乾燥以維持最大生物活性。在另一態樣中，市售初乳來自無抗生素之來源。在另一態樣中，對初乳實施微生物分析且發現相對於各種病原體為陰性或低於可接受值。在各個其他態樣中，分析初乳之其他污染物(例如硝酸鹽、黃麴黴毒素、硝基呋喃、戴奧辛(dioxin)、三聚氰胺及重金屬)且發現為陰性或低於指定值。
在一實施例中，本發明可由若干超免疫來源之初乳構成，該等初乳各自靶向不同之抗原團簇或種類，其中混合該等初乳以提供廣效抗體調配物。
在另一實施例中，載劑基質包括重構或人工黏膜分泌物，例如淚液、鼻或枝氣管黏液、頸部黏液、精漿、汗液、血漿或唾液。已知體液含有不同量之若干組份。(Schenkels等人，Biochemical composition of human saliva in relation to other fluids,Crit.Rev.Oral Biol.Med.,1995,6(2)：161-175)。唾液含有黏蛋白、酸性PRP、α-澱粉酶、鹼性PRP、鹼性PRG、分泌型IgA、血清胱蛋白、富酪蛋白、IgG、腮腺外糖蛋白(EP-GP)、VEGh(脂質運載蛋白)、富組蛋白、溶 菌酶、激肽釋放酶、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、結合咕啉、β-微精液蛋白、IgM、白蛋白及Zn-α2-糖蛋白。在一態樣中，載劑基質包括體液之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、或七種或更多種組份。
淚液(tear fluid或lachrymal fluid)具有許多與唾液相同之組份且具有尤其高濃度之分泌型IgA、VEGh、溶菌酶及乳鐵蛋白。在一態樣中，如本文所述，使用所述體液之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種組份來強化含有鹽(例如氯化鈉及諸如此類)作為主要成份之人工淚液或業內已知含有羥乙基纖維素、硫酸軟骨素或透明質酸或黃原膠之滴眼劑(US 7,875,271，以引用方式併入本文中)，並用作經純化多株抗體之載劑基質。在一態樣中，組合物可用於治療眼睛之微生物感染(例如紅眼)。
頸部黏液含有黏蛋白、α-澱粉酶、溶菌酶、乳過氧化物酶、白蛋白及β-微精液蛋白。藉由組合作為組合物中載劑基質之該等組份中之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多與立體特異性結合分子(例如抗細菌或抗真菌多株抗體，藉由本揭示內容之方法製得)來形成基質。
在一態樣中，本揭示內容提供包括樹膠之組合物，該樹膠能夠固定水或可在水中膨脹、含有與作為滲透劑之纖維素組合之羧甲基澱粉，該羧甲基澱粉在與水接觸時幾乎立即形成凝膠且易於適用於陰道應用。包括本揭示內容之抗體/基質組合物之錠劑可(例如)包括羧甲基澱粉及纖維素，如US 4,808,415中所述，其以引用方式併入本文中。在特定態樣中，在基質中組合抗細菌及抗真菌多株抗體並調配以提供用於陰道病之廣效治療。在一態樣中，使用組合物來治療陰道細菌感染(例如滴蟲感染)或真菌陰道病(例如念珠菌感染)。
唾液係存在於口腔中之黏膜分泌物且藉由唾液腺產生。唾液發 揮保護功能，例如牙齒之組織包覆、潤滑、增濕及再礦化。唾液亦以免疫活性、抗細菌、抗病毒及抗真菌活性發揮宿主防禦功能。唾液亦以消化酶、食團(bolus)形成及味道發揮消化活性。唾液含有各種蛋白質，例如富組蛋白及唾液中獨特之酸性富脯胺酸蛋白。唾液亦含有存在於其他體液中之蛋白質，例如溶菌酶、黏蛋白、富酪蛋白及免疫球蛋白。唾液含有源於血漿之蛋白質，例如白蛋白及Zn-α-2-糖蛋白。牛唾液具有已知治療價值。(Varshney等人，1997,Therapeutic value of bovine saliva in wound healing：a histomorphological study.,Indian J.Biol.1997年5月，35(5)：535-7)。在一態樣中，唾液組份可用於(例如)牙膏或漱口藥或用於經口黏膜投與之其他製劑中。
枝氣管黏液含有黏蛋白、α-澱粉酶、鹼性富脯胺酸多肽(PRP)、血清胱蛋白、富酪蛋白、EP-GP、溶菌酶、β-微精液蛋白及白蛋白。在一態樣中，本揭示內容提供包括立體特異性結合分子及載劑基質之組合物，該載劑基質包括唾液或枝氣管分泌物之兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種組份。在一態樣中，以乾燥形式將具有載劑基質之組合物與立體特異性結合分子(例如根據本揭示內容製得之抗A群鏈球菌多株抗體)進行封裝。在一態樣中，將乾燥調配物重構於(例如)鹽水溶液中，並以咽喉噴劑形式投與以用於治療膿毒性咽喉炎。
可製備其他載劑基質以用於其他應用環境中，例如用於氣溶膠化(吸入)、眼部、局部或其他製劑。
在一具體實施例中，特異性結合分子及載劑基質源於不同物種。在另一態樣中，特異性結合分子及載劑基質源於非人類物種。在另一態樣中，特異性結合分子源於非哺乳動物。在另一態樣中，載劑基質源於非人類哺乳動物。
調配物及組合物
在一實施例中，自接種動物或人工產生系統(例如細胞培養物)之 血漿、血清或血液、初乳、蛋或其他組份收穫抗體，然後純化或處理，並添加至載劑基質(例如初乳)中。組合物容許用作遞送介質來(例如)經口投與抗體調配物。此方式可提供以此方式可靠地按比例放大調配物之抗體產生的有效方式，從而控制力價、連續性及連續可用性以用於商業應用。在一實施例中，自接種動物之蛋收穫抗體，且可純化或處理或保留於蛋材料中，並添加至牛初乳中。
迫切需要用於許多胃腸道病原體之低成本及有效治療，且經口投與之抗體係用於此作用之候選者。除具有所示效能外，經口投與之抗體通常係非免疫原性。通常認為其耐受良好且並未報導不良副作用，且與可比之所攝入食物產物相比並無不同反應。顯而易見，含有經口投與之抗體之若干產物具有FDA所接受之GRAS(一般認為安全(Generally Recognized as Safe))證明。
本發明一實施例係廣效治療性或預防性抗毒素調配物，其由廣效中和抗體之混合物構成，該廣效中和抗體嵌入載劑基質內且根據此方法產生，該廣效治療性或預防性抗毒素調配物係用於在導致毒素介導之腹瀉之各種未知或未診斷條件中有效投與之目的。
本發明一實施例係廣效治療性或預防性抗病原調配物，其嵌入載劑基質內且含有根據此方法產生之廣效抗病原抗體之混合物。
本發明一實施例係廣效治療性或預防性抗黏著素調配物，其嵌入載劑基質內且含有根據此方法產生之廣效抗黏著素抗體之混合物。
本發明一實施例係廣效治療性或預防性調配物，其嵌入載劑基質內且含有根據此方法產生之廣效抗毒素、抗病原且抗黏著素抗體之混合物。
使用基於天然食物之產物之一個重要限制在於，製劑受限於天然過程所容許之結果。本發明容許選擇性增加特異性抗體及一般免疫因子(調配物)之含量，使其顯著高於通常可在自然界中獲得之生理學 含量。本發明亦容許以增強對靶向疾病、病原體或物質之特異性之方式來權衡各種因子。
在一實施例中，包括特異性結合分子之調配物係乾燥固體(蛋粉末)調配物。將粉末化調配物密封於氣密包中，視需要使用惰性氣體分層。可將調配物在室溫下、在致冷或冷凍溫度下儲存延長之時期。在其他實施例中，將乾燥組合物調配成膠囊或錠劑用於經口投與。在另一實施例中，將調配物壓縮成可咀嚼錠劑。
本發明另一實施例係關於用於調配組合物之醫藥上可接受稀釋劑，其中該等醫藥上可接受稀釋劑選自由以下組成之群：乳糖、甘露醇、山梨醇、微晶纖維素、蔗糖、檸檬酸鈉、磷酸二鈣或具有相似性質之任一其他成份(單獨或以其適宜組合)；黏合劑，其選自由以下組成之群：黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、甲基纖維素、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮、澱粉或具有相似性質之任一其他成份(單獨或以其適宜組合)；賦形劑，其選自由以下組成之群：瓊脂、碳酸鈣、碳酸鈉、矽酸鹽、海藻酸、玉米澱粉、馬鈴薯/木薯澱粉、澱粉羥基乙酸鈉或具有相似性質之任一其他成份(單獨或以其適宜組合)；潤滑劑，其選自由以下組成之群：硬脂酸鎂、硬脂酸鈣(calcium stearate or steorote)、滑石粉、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉或具有相似性質之任一其他成份(單獨)；助流劑，其選自由以下組成之群：膠體二氧化矽或具有相似性質之任一其他成份(單獨或以其適宜組合)；甜味劑，其選自由以下組成之群：例如蔗糖、糖精或具有相似性質之任一其他成份(單獨或以其適宜組合)；矯味劑，其選自由以下組成之群：薄荷、水楊酸甲酯、橙味矯味劑、香草矯味劑或任一其他醫藥上可接受之矯味劑(單獨或以其適宜組合)；潤濕劑，其選自由以下組成之群：乙醯基醇、單硬脂酸甘油酯或任一其他醫藥上可接受之潤濕劑(單獨或以其適宜組合)；吸收劑，其選自由以下組成之群：高嶺土、膨潤土或任一其 他醫藥上可接受之吸收劑(單獨或以其適宜組合)；阻滯劑，其選自由以下組成之群：蠟、石蠟或任一其他醫藥上可接受之阻滯劑(單獨或以其適宜組合)。
在另一態樣中，藉由量化特異性抗體之任一方法來正規化用於非新生兒人類之日劑量。在一態樣中，藉由使用ELISA評估調配物中特異性抗抗原抗體之濃度來正規化組合物之劑量。在一態樣中，有效治療病原感染之經口組合物之一個劑量含有以下量之抗原特異性結合分子：約0.0001mg至20mg、0.001mg至15mg、0.01mg至10mg、0.05mg至5mg、0.1mg至1mg混合抗原特異性結合分子。
術語「固體形式」係指特異性結合分子之乾燥形式或載劑基質之乾燥形式或包括乾燥特異性結合分子及載劑基質之固體劑型(呈粉末、壓縮錠劑、含片或膠囊)。在一態樣中，固體劑型意欲用於經口投與。在一態樣中，粉末係用於懸浮液之調配物。在一態樣中，將粉末化乾燥免疫蛋及粉末化乾燥初乳封裝於氣密包中。在即將經口投與前，將包之內容物懸浮或溶解於大致液體中並經口投與。
在一態樣中，亦可以液體投與形式來提供組合物。
在一態樣中，一個劑量含有1g、2g、3g、4g、5g、5g、6g或7g乾燥免疫蛋及1g、2g、3g、4g、5g、5g、6g或7g乾燥牛初乳。在一態樣中，乾燥劑型之一個劑量含有3g乾燥免疫蛋產物及4g乾燥牛初乳。在一態樣中，乾燥劑型之一個劑量含有2g乾燥免疫蛋產物及4g乾燥牛初乳。在一態樣中，乾燥劑型之一個劑量含有4g乾燥免疫蛋產物及4g乾燥牛初乳。在另一態樣中，將單一劑量包之內容物溶於約2盎司水中並經口投與。
經口使用之調配物亦可呈含片、可咀嚼錠劑、或硬明膠膠囊形式，其中活性成份與惰性固體稀釋劑(例如馬鈴薯澱粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或其可呈軟明膠膠囊形 式，其中活性成份與水性或油性介質(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。可使用上文在錠劑及膠囊下提及之成份以習用方式使用(例如)混合器、流體床裝置或噴霧乾燥設備來製備粉末及微粒。
在各個實施例中，本揭示內容之調配物提供相對於先前技術之各種優點。在一態樣中，本揭示內容之包括抗原特異性IgY及牛初乳載劑基質之調配物之優點在於，在鑑別目標抗原後在約6週之快速時間內製備該調配物。此使得雞接種方案可容易地再現及正規化。在一具體態樣中，使用單一、混合抗原製劑分別對不同雞群組實施接種疫苗，且然後組合用於廣效組合物以用於治療病原感染。在一具體態樣中，使用單獨之混合抗原製劑對三個雞群組實施接種疫苗，然後彙集以製備用於在並不知曉致病微生物病原體之情形下治療未分類腹瀉的廣效組合物。此方法之優點在於，可根據需要針對特定發作、地區或季節來調整組合物中抗原特異性抗體之混合物。最後，在實施例中，特異性結合分子無需與全乾燥蛋分離以用於快速製備及長期儲存。
在另一態樣中，本揭示內容之組合物有效用於經口投與以治療非新生兒之病原感染。如本文所述，非新生兒之胃腸道酸性極高且吸收性小於新生兒。在本揭示內容之實例中，組合物有效用於治療6個月至5歲年齡非新生兒童之未分類腹瀉。在另一態樣中，本揭示內容之組合物有效治療或預防成人之旅行者腹瀉。載劑基質係與抗原特異性結合分子組合之保護性及反應性基質。在另一態樣中，以粉末化、固體形式提供本揭示內容之組合物以用於在即將投與前之懸浮液。在一態樣中，懸浮或重構劑型之優點在於對於嬰兒及兒童而言極可口，即使在患有病原感染之症狀時。此具有容易地投與全劑量並由患有病原感染之個體攝入的優點。
在另一態樣中，本發明組合物可用於投與廣效被動免疫性以治療或預防病原感染。在一態樣中，低程度之雞免疫可足以製備具有有 效量在與載劑基質一起投與時產生有效、廣效調配物之抗抗原特異性結合分子的組合物。
病原感染之治療或預防
本揭示內容之組合物包括嵌入載劑基質內之特異性結合蛋白。可在適當載劑基質內以適於特定免疫原性或生物或免疫反應性特性之任一方法投與組合物，包含經口、靜脈內、經頰、經鼻、黏膜、經皮或其他方法。一具體實施例涉及經口投與本揭示內容之組合物。
在各個實施例中，以預防性或治療性組合物形式來投與組合物。在各個態樣中，組合物包含醫藥上可接受之載劑。在各個態樣中，組合物不含聚合物、共聚物、脂質體、水凝膠或纖維蛋白。在各個態樣中，組合物不含微球體或微膠囊。在各個態樣中，組合物不含免疫原或抗原。本發明組合物可經由經口遞送、經鼻遞送、眼科遞送、眼部遞送、黏膜遞送或其組合投與。
本發明一實施例使用經口投與。在人類及動物系統中已顯示，經口(攝入)投與抗體、免疫球蛋白及其他生物免疫因子可對於胃腸道系統、其中、與之有關或由其影響之疾病的病程、嚴重程度及持續時間具有可量測效應。
將廣效抗體之混合物嵌入載劑基質(例如初乳)內以用於經口投與。初乳用於向抗體調配物提供協同保護及有效屬性。抗體之任一組合皆可用於載劑內，包含但不限於抗病原、抗毒素及抗黏著素抗體之組合。
在一態樣中，使用本揭示內容之組合物來治療患有各種病原感染之患者。用於經口投與之組合物及調配物可在連續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天內每天投與一次、兩次、三次或四次以用於治療病原感染。在一態樣中，在5天內每天投與組合物兩次以用於治療病原感染。在另一具體態樣中，在連續三天內每天一次投與組合 物以用於有效治療非新生兒童之未分類腹瀉，或治療非新生兒童或成人之旅行者腹瀉。在另一態樣中，可規則地投與組合物以用於預防病原感染。
在用於藉由局部投與黏膜來治療黏膜之病原感染之組合物的情形下，可在3至12天時間內每天投與組合物二至六次。
在一較佳實施例中，本揭示內容提供有效用於治療非新生兒人類之未分類腹瀉之組合物。該組合物利用有效多株抗體產生策略(雞接種，使用經由蛋之抗體收穫)生成靶向若干腹瀉病理學病因之高特異性抗體。在一具體實施例中，組合物包括存於載劑基質(其係市售牛初乳)中之特異性多株抗體。
在一較佳實施例中，本揭示內容提供用於有效治療未分類兒童腹瀉之經濟組合物。該組合物包括多株抗體(主要係IgY)之混合物，該等多株抗體對於以下物質具有特異性：大腸桿菌、沙門菌、輪狀病毒、革蘭氏陰性細菌、由病原體產生之毒素及能夠引起胃腸道中之病原附接及定植之黏著素。
在一具體態樣中，組合物包括等效重量量之乾燥免疫蛋產物，該乾燥免疫蛋產物來自使用不同抗原或不同混合抗原製劑接種之三個群組中之每一者，且與特定重量量之市售乾燥非超免疫牛初乳共封裝。在一態樣中，將0.5g至3g、0.7g至2.0g、1.0g、1.3g或1.5g來自每一群組之乾燥免疫蛋產物添加至單一劑量包中。較佳地，將1.0g或1.3g每一免疫蛋產物添加至一個劑量包中。在另一態樣中，將1g至5g、2g至4g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g或5g乾燥初乳添加至相同包中。
在使用前，將包或藥囊之內容物混合至大約2盎司純化水或一些其他口服液中。將整個重構調配物經口投與個體。可經二至十天每天投與組合物一至四次。在一具體實施例中，連續3天每天一次投與組 合物。本揭示內容提供治療未分類兒童腹瀉之方法，其係藉由在二、三或四天內每天一次投與本揭示內容之組合物來達成。
在一態樣中，以輔助療法形式投與本揭示內容之組合物以用於抗生素治療。在此態樣中，可在治療之最初三天內每天一次投與組合物。在另一態樣中，使用經口補液溶液(ORS)投與本揭示內容之組合物。在另一態樣中，將本揭示內容之組合物與口服鋅調配物共投與。在另一態樣中，將本揭示內容之組合物以輔助劑形式投與抗生素治療以預防抵抗抗生素之特定病原有機體的過度生長。如實例中詳細所述，組合物及方法有效地快速解決未分類兒童腹瀉之症狀，從而顯著降低腹瀉之糞便體積、排便頻率及持續時間，且顯著改良醫師報告身體狀況。
在一替代實施例中，使用本揭示內容之組合物來治療旅行者腹瀉。TD之發作通常發生於旅行之第一週內，但可發生於旅行中之任一時間，且甚至發生於返回家中之後。風險之最重要決定因素係旅行者之目的地。高風險目的地係拉丁美洲、非洲、中東及亞洲之發展中國家。具有尤其高風險之人員包含青少年、經免疫阻抑之人員、具有發炎性腸病或糖尿病之人員及服用H-2封阻劑或抗酸藥之人員。大部分TD病例會突然開始。病況通常增加排便頻率、體積及重量。通常亦具有變化之糞便硬度。通常，旅行者每天經歷4至5次鬆散或水性腸蠕動。其他常見之相關症狀係噁心、嘔吐、腹瀉、腹部絞痛、胃氣脹、發燒、尿急及全身乏力。
感染劑係TD之主要病因。細菌腸病原體引起大約80%之TD病例。在所調查國家中分離之大部分常見致病因子係腸毒性大腸桿菌(ETEC)。ETEC產生與絞痛有關之水性腹瀉及低級發燒或無發燒。除ETEC及其他細菌病原體外，各種病毒及寄生腸病原體亦係潛在之致病因子。
在一態樣中，連續三天每天一次將本揭示內容之組合物投與個體作為旅行者腹瀉之抗生素治療的替代方式或輔助療法。有限之現場研究證據表明，腹瀉症狀在第一劑量之24小時或48小時內有所改良。另一選擇為，在第1天投與每天兩個劑量之本揭示內容之組合物，隨後在第2天及第3天投與單一劑量。在一態樣中，以交替之每日或每週方案或以減小之劑量方案來投與本揭示內容之組合物以預防旅行者腹瀉。
在另一替代實施例中，舉例而言，在投與益生菌前，使用本揭示內容之組合物作為個體之胃腸道菌叢管控的「益菌素」。本文所用之術語「益菌素」係指容許胃腸道微生物菌叢(其賦予個體之身體狀況及健康益處)之組成及/或活性具有特定變化的組合物。在一態樣中，組合物用於管控胃腸道菌叢以減小或消除細菌之一或多種不期望菌株。在一態樣中，調整抗抗原性免疫球蛋白組合物以管控胃腸道菌叢，從而減小或消除細菌之一或多種不期望菌株。在另一態樣中，將組合物用作傳統益菌素之輔助劑。在另一態樣中，本揭示內容之組合物進一步包括可溶性纖維。在另一態樣中，將組合物單獨用於菌叢管控。
在另一態樣中，本揭示內容提供個體中之胃腸道菌叢管控方法，其包括以下步驟：投與本揭示內容之組合物以減小或消除細菌之一或多種不期望菌株，隨後投與益生菌以引入細菌之一或多種期望菌株。在另一態樣中，將本揭示內容之組合物以輔助劑形式投與抗生素治療以預防抵抗抗生素之特定病原有機體的過度生長。
實例1. 用於治療腹瀉之組合物
腹瀉係包含細菌、病毒、原生動物及寄生感染之各種病因之症狀。細菌腹瀉係由多種有機體誘導，包含各種形式之大腸桿菌、沙門菌、霍亂弧菌及腸炎弧菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌及其他。病 毒兒童腹瀉通常由輪狀病毒引起，但亦可由若干其他病毒引起。
已知腹瀉具有多種致病有機體。該等致病有機體可組織成產生結構相關毒素之常見團簇，可產生關於該等常見團簇之一系列廣效中和抗體，該等廣效中和抗體在以臨床有效力價混合成調配物時可用作用於毒素介導之腹瀉的廣效生物獨立性治療幹預。
簡言之，藉由使用抗原對雞實施接種來生成對於腹瀉之致病有機體具有特異性的抗體。收集免疫蛋，且對全蛋實施巴斯德滅菌並噴霧乾燥以獲得粉末化形式。以粉末化形式混合市售牛初乳。將兩種粉末依序添加至單一劑量包中並密封，並以乾燥形式分配用於口服調配物。在投與前，在經口消耗前將粉末化口服調配物與少量水混合。
此治療賦予患者被動免疫性，如本文之實例中所示。治療性質使得有關風險因素與食用來自收穫抗體之來源的食物時相當(例如，風險因素與食用一個蛋及一杯奶時相似)。此係毒性小於當前可用替代醫藥之有效治療。
實例1A. 使用源於以下5種大腸桿菌菌株之純化抗原個別地對雞實施接種：四種ATCC菌株，其含有大腸桿菌黏著菌毛抗原F41、97P、F19及K99；及一種源於奶之野生型大腸桿菌菌株。僅使用一種抗原對每只雞實施接種。在三週內每週一次對雞實施接種。使用弗羅因德佐劑進行第一接種，隨後使用弗羅因德不完全佐劑進行第二及第三接種。每次接種注射兩次，分別使用左胸及右胸。單獨保存蛋；收集蛋，急速巴斯德滅菌並噴霧乾燥。以相等份數混合5種抗體製劑中之每一者。將乾燥蛋粉末抗大腸桿菌抗體製劑冷凍儲存約2年。
使用含有輪狀病毒、冠狀病毒及大腸桿菌抗原之混合抗原製劑對第二雞群組實施接種。使用與上文相同之接種、收集及蛋處理方案。將乾燥蛋粉末抗腹瀉抗體製劑冷凍儲存1.5年。使用ELISA表徵抗體製劑。
將一克乾燥抗大腸桿菌抗體製劑及乾燥抗腹瀉抗體製劑中之每一者與3克或4克市售乾燥全脂牛初乳一起添加於單一劑量包中。
實例1B. 使用不同混合抗原製劑中之每一者對三個雞群組個別地實施接種：第一抗原製劑，其含有輪狀病毒(血清型G6及G10)、冠狀病毒、具有K99菌毛黏著因子之腸毒性大腸桿菌菌株及C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌類毒素以及佐劑；第二製劑，其含有大腸桿菌之具有K99、K88、987P或F41黏著因子之腸毒性菌株；及第三混合抗原製劑，其含有各種大腸桿菌內毒素以及佐劑。三個群組中之每一者僅接受單一混合抗原製劑。收集蛋，清潔，打破，實施巴斯德滅菌並噴霧乾燥或熱乾燥以產生三種乾燥免疫蛋產物。視需要藉由ELISA評估乾燥蛋產物之特異性IgY活性。將相等重量之三種乾燥免疫蛋產物中之每一者與3g或4g乾燥初乳組合於單一劑量包中。如下文所述，每一單一劑量包使用2g、3g或4g組合重量之乾燥免疫蛋產物。在一態樣中，市售乾燥初乳並不展現針對疫苗抗原之特異性活性。
實例1C. 對雞實施免疫以用於IgY產生。
下列免疫方案係自Gallus Immunotech公司之方案改編而來且可用於生成IgY多株抗體。視需要在免疫前收集數個蛋以用作基線對照。若使用牛或豬之混合抗原製劑，則在投與前以1：2、1：4、1：8或1：16進行稀釋。在第0天，向雞注射0.02mg至0.5mg抗原以及弗羅因德完全佐劑。可在多個位點經皮下或肌內注入母雞之胸部組織中。抗原/佐劑混合物之總體積可為約1mL，其中佐劑為該體積之二分之一至三分之二。通常在第14、21及28天使用弗羅因德不完全佐劑及約為初始量一半之抗原重複免疫。通常，可在約第30天時在蛋中檢測到特異性抗體。為延長抗體產生，每隔數月對母雞進行加強免疫。在處理及/或純化IgY前，可將蛋冷藏儲存。在一態樣中，在處理或純化前，可將蛋保持冷藏長達一個月或長達兩個月。在另一態樣中，可使用適當 量之抗原以相似方式在鴨、鵝、駝鳥、鵪鶉或火雞蛋中生成IgY。
實例2. 用於難辨梭菌之攝入抗體治療
在一實施例中，使用本發明方法及組合物來治療難辨梭菌(Clostridium difficile、C.difficile)，該細菌天然存在於大多數人中。難辨梭菌群體之含量保持在腸中其他天然菌叢之控制下。在針對另一醫學病狀投與之抗生素清除腸中之天然菌叢，從而使難辨梭菌群體不受抑制地繁殖時，患者通常出現難辨梭菌感染。儘管難辨梭菌之許多菌株可藉由專門抗生素進行治療，但對抗生素治療產生抗性之難辨梭菌菌株之數量日益增大。此導致患者之康復漫長且困難，且在某些情形下甚至可變得危及生命。使用賦予被動免疫性之攝入抗體中和難辨梭菌群體之方法能夠控制難辨梭菌群體含量，從而恢復天然腸菌叢平衡。
在藉由輪狀病毒及革蘭氏陰性細菌引起之抗腹瀉調配物之情形下，嵌入經特異性調配結合至難辨梭菌或其毒素之載劑基質中之抗體係有效治療方式。此調配物可用於治療進行性感染或預防此一感染發生。因此，該治療可單獨或與抗生素同時投與。此治療不僅有益於自難辨梭菌發作康復之患者，且可以預防性方式投與處於產生難辨梭菌之高風險的患者。
將中和難辨梭菌之抗體攝入載劑基質(意欲「活化」腸中之抗體以及提供有用二級免疫性、保護或營養之蛋白質及酶的混合物)中。在一實施例中，藉由使用抗原或抗原組合對動物實施注射或接種來產生抗體，該抗原或抗原組合可含於或可不含於混合抗原製劑中(可能與佐劑組合以誘發較強免疫反應)。
在一態樣中，抗原係獲得於或源於難辨梭菌抗原或毒素。在另一態樣中，抗原組合含有源於難辨梭菌之多種抗原或毒素中之一者及一或多種其他病毒抗原。在另一態樣中，抗原組合含有一或多種源於 難辨梭菌之抗原或毒素及一或多種其他細菌抗原或毒素。在另一態樣中，抗原組合含有一或多種源於難辨梭菌之抗原及一或多種其他原生動物抗原。在另一態樣中，抗原組合含有一或多種源於難辨梭菌之抗原及一或多種其他真菌抗原。
抗體然後獲得於、分離於或源於來自動物之動物產物(例如奶、蛋或初乳)或直接自動物之(例如)血清、血漿收穫。在一特定態樣中，使用抗原、抗原組合或疫苗對母雞實施接種，且抗體獲得於接種雞之全蛋或蛋黃，或源於接種雞之全蛋或蛋黃或自其純化。在另一態樣中，抗體係多株抗體。
此組合物意欲幫助治療難辨梭菌感染，或預防性抵抗難辨梭菌感染。舉例而言，物質包括特異性靶向難辨梭菌、嵌入載劑基質(舉例而言，初乳)內之抗體。收穫後，可將抗體粉末化。亦可將載劑基質粉末化。然後可充分混合兩種粉末，或單獨添加至單一劑量包或小瓶中，並以乾燥形式進行分配。在一較佳投與方法中，藉由攝入經口投與物質。為進行消耗，在即將消耗前，將粉末化物質與少量液體(例如水、奶、汁液或電解質溶液)混合，且在醫師引導下服用。亦涵蓋其他遞送方法。
用於難辨梭菌感染之當前治療集中於抗生素療法。然而，在強效抗生素係感染之病因之情形下，且在已產生抗生素抗性之情形下，當前可以使用很少替代治療。本實施例試圖藉由利用天然免疫機制而非毒性抗生素來中和難辨梭菌。其優點在於容許天然存在之菌叢在腸中生長同時減小難辨梭菌群體含量。
嵌入載劑基質內以增強抗體有效性之抗體組合當前並未用於任一難辨梭菌疾病治療中。本發明方法賦予患者被動免疫性。治療性質使得有關風險因素與食用來自收穫抗體之來源的食物時相當(例如，風險因素與食用一個蛋及一杯奶時相似)。此係毒性小於當前可用替 代醫藥之有效治療。
在一態樣中，獲得所選抗體，純化且分離並以粉末化形式製備。在另一態樣中，並不純化或分離所選抗體，但處理成完整產物。舉例而言，處理(例如巴斯德滅菌)自接種雞獲得之全蛋之內容物，且以粉末化形式製備，其中並無其他純化步驟。亦以粉末化形式製備活化酶/蛋白質混合物(例如，包含初乳)。充分混合兩種粉末並以乾燥形式進行分配以用於口服調配物。在投與前，於消耗前將粉末化口服調配物與少量水混合。
此治療賦予患者被動免疫性。治療性質使得有關風險因素與食用來自收穫抗體之來源的食物時相當(例如，風險因素與食用一個蛋及一杯奶時相似)。此係毒性小於當前可用替代醫藥之有效治療。
實例3. 用於幽門螺旋桿菌之攝入抗體治療
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori、H.pylori)係可棲息於胃區域之革蘭氏陰性細菌。通常認為幽門螺旋桿菌與十二指腸及胃潰瘍及可能胃癌有關。幽門螺旋桿菌可藉由進入上皮細胞表面中具有更中性pH環境之黏液層中來離開胃管腔之酸性環境。幽門螺旋桿菌可產生結合至上皮細胞之膜相關脂質或碳水化合物之黏著素。胃之內部區域中幽門螺旋桿菌之定植可產生慢性胃炎，慢性胃炎係胃之長期發炎。消化性潰瘍之主要病因係幽門螺旋桿菌感染。
獲得針對幽門螺旋桿菌之所選抗體並以粉末化形式製備。亦以粉末化形式製備活化酶/蛋白質混合物(例如，包含初乳)。充分混合兩種粉末，或依序添加至單一劑量包或小瓶中，並以乾燥形式分配用於口服調配物。在投與前，於消耗前將粉末化口服調配物與少量水混合。
此治療賦予患者被動免疫性。治療性質使得有關風險因素與食用來自收穫抗體之來源的食物時相當(例如，風險因素與食用一個蛋 及一杯奶時相似)。此係毒性小於當前可用替代醫藥之有效治療。
實例4. 臨床研究-未分類腹瀉中之效能
由於各種致病有機體、用於指導治療方案之診斷測試之有限可用性，腹瀉之有效廣效治療係顯著難題。用於嚴重腹瀉病例之當前標準幹預包含普遍投與抗生素及經口補液鹽(ORS)。然而，此方式顯示有限之有效性，且促進抗生素抗性細菌菌株之研發。
實例4A. 現場研究(試驗)1及2。
實施臨床研究以評估實例1A之調配物在治療未分類腹瀉或加速未分類腹瀉之解決中的耐受性及效能。第一開放、單中心、非對比研究招收總共63名患有兒童腹瀉之兩個性別之兒童患者，其年齡在6個月至5歲之間。該研究對測試組A(「試驗1」，接受實例1A之經口調配物，與抗生素及ORS一起投與)與對照組B(僅接受抗生素及ORS)之臨床結果進行比較。第二測試組AA(「試驗2」)在追蹤研究中招收33名患者以在不同季節條件下測試實例1A之調配物。
所有參與之兒童患者皆在5-分標度(參見表1)上呈現「嚴重」(serious或severe)腹瀉特徵(等級4或5)，如藉由主治醫師所評價。對於兒童腹瀉之致病因子或病因並無診斷差異。排除具有血便之米泔水樣便之患者。另外，排除對於奶、雞或蛋產物患有已知過敏之患者。
將招收之兒童(n=63)分為兩組：實驗組研究1，「組A」(招收34名兒童；29名完成試驗)，陰性對照「組B」(招收29名兒童；28名完成 試驗)，及研究2「組AA」(招收31名)。將接受抗生素及ORS之第二對照組「組BB」與組AA一起用作陰性對照，然而，自圖式中刪去結果。
每一測試組接受2g組合蛋粉末及4g初乳(混合於水中，在連續三天內每天一次經口投與)。觀察每一組且收集5天之數據。除抗生素及口服補液補充物(ORS)之標準方案外，組A亦接受來自實例1之組合物，如藉由主治兒科醫師所確定。使用抗生素及ORS之標準方案治療組B。在研究1及研究2之間容許經過6個月之時間視窗以季節性地進行測試。在相同研究中心實施兩個試驗。在每一組中，主治兒科醫師基於具體病例來確定抗生素及ORS處方(表2)。
以5克粉末形式將來自實例1A之組合物封裝於單一劑量藥囊中。經口投與組合物，其中將一包再懸浮於大約2盎司飲用水中。需要患者在完成再懸浮後立即一口氣喝下整個懸浮液，且在所有情形下皆遵循此方案。
此實例中涵蓋之參數(如針對每一患者所量測)包含排便頻率、糞便硬度及醫師評價身體狀況。排便頻率係每24小時時間腹瀉腸蠕動之監護人或醫院報告數。糞便硬度係等級為1-5之硬度，其中1表示正常 且5表示液體。醫師評價身體狀況係等級為1-5之總體病狀，其中1表示健康兒童之正常參數且5表示重病兒童。
在6天過程中，要求參與試驗之患者提供通常之患者進展之經驗，如藉由所述三個參數所量測。將報告值集中至每一參數之單一預期患者進展基線中。基於醫生經驗針對相對於預期結果之改良及針對同時之陰性對照來對患者進行評估。
使用MS Excel及Matlab實施數據分析。藉由卡方測試(Chi-square test)來計算統計學顯著性，其中<0.05之p值視為顯著。結果展示於圖1至3中。
在初始劑量投與之24小時內觀察接受來自實例1A之組合物之患者的顯著改良。在初始劑量投與後之48小時內，患者通常穩定於正常或接近正常值。
如圖1中所展示，在來自實例1之組合物之初始劑量後，在24小時時間中腹瀉腸蠕動之平均數量在組A(試驗1)中自9降低至2。組AA(試驗2)展現自10至3之相似減小。與之相比，組B(陰性對照)中發作之平均數量在相同時間中自11降低至10。組A及AA(試驗1及2)中發作之平均數量自第3天往後保持恆定於2，而組B逐漸減小最終至第5天時展現6次發作/24小時。在組A中，在使用來自實例1之組合物治療之24小時內，排便頻率返回至接近正常值2.32±2.48，胃腸症狀之持續時間與對照群體相比減小86%以上(P<0.001)。在48小時內，排便頻率改良至2.14±2.19。在組AA中，頻率顯示相似穩定速率，其在24小時內中改良至2.56 +/- 0.68且在48小時內為2.00 +/- 0.45，與對照相比顯著改良(P<0.001)。
如圖2中所展示，初始糞便硬度在所有患者中皆係液體。在來自實例1之組合物之第一劑量後，組A及組AA之糞便硬度在24小時中改良至接近正常值。對照組B之硬度在24小時中有所改良但仍係液體， 其中在整個觀察時間中症狀並未完全解決。組A在48小時中獲得正常糞便硬度且研究之剩餘時間亦如此，而組B在第3天時變為幾乎呈液體。組B最終在第6天時達到糞便硬度之接近正常值，而組A之糞便硬度在第3-6天中保持為正常。
令人吃驚的是，在使用來自實例1A之組合物治療之24小時內，糞便硬度比率返回較低值2.05±1.02(對於組A)及1.96 +/- 0.61(對於組AA)，其中胃腸症狀之持續時間與對照群體相比減小86%以上(P<0.001)。在48小時內，組A之糞便硬度進一步降至接近正常值1.41±0.9，且組AA之值為1.17 +/- 0.37。
如圖3中所展示，研究中招收之所有患者由主治醫師評定為重病，該重病達到且包含嚴重脫水、嘔吐及低反應性。在來自實例1之組合物之第一劑量後，組A及組AA中之患者在過夜後顯著改良(P<0.001)至平均身體狀況評價等級為約2。在24小時時，組B患者仍然病情嚴重。組A及組AA患者在48小時時改良至接近正常且在獲得正常條件之第三天繼續改良，而組B患者有所改良但病得極重。在第4-6天，組A中之患者保持完全康復而組B中之患者以線性方式有所改良；然而，在研究結束時其保持中等患病。
總之，醫師報告身體狀況在一天內重新調節至接近健康值，其中組A自初始值4.46±0.51降至1.9±0.9(此值視為屬於此群體之正常參數內)。組AA顯示相似結果，自初始值4.3 +/- 0.46降至2.03 +/- 0.49。與對照群體相比，此共同表示病況持續時間減小86%(p<0.001)。在48小時內，醫師報告身體狀況進一步改良至1.26±0.83(在組A中)及1.4 +/- 0.49(對於組AA)。
獨立於初級試驗評估，在組A(試驗1)內進行檢查以證實針對輪狀病毒之預期患病率之試驗情形的正常分佈。自組A中29名實驗患者之26名及組AA中31名患者之24名收集糞便試樣，且在獨立參考實驗室 中使用確立之商業凝集分析(Slidex Rota-kit,bioMerieux，法國)進行測試。在組A中取樣之26患者中之7名經測試對於輪狀病毒呈現陽性(27%之測試群體)。此兒童輪狀病毒感染患病率與關於季節及參與研究之腹瀉病例之嚴重程度的預期結果相吻合。在組AA中，24名患者中之4名測試為陽性(17%之測試群體)。組AA之輪狀病毒患病率略低於預期值。因此，認為實例1A之組合物可有效投與以治療未分類腹瀉，包含由輪狀病毒感染引起者。
為進一步測定來自實例1之組合物在輪狀病毒陽性組(RV)與非輪狀病毒陽性組(非RV)間之反應的相似性，使用皮爾森產品-時間相關係數(Pearson's Product-Moment Correlation Coefficient)(表示為"R)，其強度表示為範圍-1至1。R之計算使用在每一時間點非RV及RV組之平均值，其中在6天內自每一組之平均值來計算R值。
關於醫師評價身體狀況數據集之RV組以及非RV組的R值為0.99029，此顯示兩個組之間極強之線性依賴性及協方差。非RV及RV患者之行為極好地彼此預測，且顯示在6天之治療及觀察時間中對於治療之極相似反應。該等結果證實來自實例1之組合物在輪狀病毒介導之腹瀉情形中之效能(表3)。
在研究中所招收之96名患者中，88名完成完整之6天研究時間。 在醫師確定腸炎與其他病狀共存或係其他病狀之結果時，4名患者自組A退出，且兩名自組AA退出；如表4中所展示。一名來自組A之患者退出試驗(在其監護人確定患者足以在來自實例1之組合物之第二劑量後退出時)。且一名患者因記錄保持錯誤而自組B退出(表4)。
該等結果表明，來自實例1之組合物可提供對於未分類兒童腹瀉之安全及有效治療。減小腹瀉之持續時間及嚴重程度將預防顯著量之與兒童腹瀉有關之發病率及死亡率，且亦可幫助預防腹瀉相關性並存病在兒童患者中產生。
在使用來自實例1之組合物治療一天後，兒科醫師報告在100%之完成試驗之患者中總身體狀況得以實質性改良。令人吃驚的是，在使用來自實例1之組合物治療兩天後，顯著減小病況之持續時間及嚴重程度將腹瀉發作之時間減小86%。獨立輪狀病毒測試證實來自實例1之組合物A在該等情形中之效能。
來自實例1之組合物A顯示高度有效地治療未分類腹瀉，從而與單獨之習用療法相比大大減小病況之時間及嚴重程度。來自實例1A之組合物耐受良好且並未報告有不良副作用。此研究之結果表示期望現場環境內兒童腹瀉之治療取得重大及有效改良。該等結果提供另外研究本發明組合物防止患者發生未分類腹瀉之大部分嚴重症狀之機制 及生物化學的機會。
實例4B. 現場研究(試驗)3。
使用在試驗3中招收之140名治療患者及30名陰性對照患者實施第三研究試驗。治療組中組合物之日劑量含有總共2g之乾燥全蛋(來自三個群組中之每一者，每一群組單獨使用一市售腹瀉或乳腺炎疫苗進行接種)之等份；及4克乾燥牛初乳(ES204A；MS204A)；或3克乾燥全蛋(來自三個群組中之每一者，每一群組單獨使用一市售腹瀉或乳腺炎疫苗進行接種)之相等重量份數及4克乾燥牛初乳(MS304A)。此外，藉由噴霧乾燥(S)或熱乾燥(T)處理蛋。將各群組飼養於美國之兩個不同地理位置(M)或(E)。
如上所述實施試驗3；在連續三天內每天一次使用組合物治療患者。試驗3與試驗1及2相比之平均結果展示於圖4-9中。使用2g乾燥蛋及4g初乳在兩天內每天一次治療試驗3中具有15患者之小組，且展現在第1及2天每一量測參數顯著改良。此組展現在症狀評分中第4天之醫師報告身體狀況、第3及4天之糞便硬度之輕微平均復發效應(ES204B)。然而，與陰性對照組相比，該等值仍得到顯著改良。
該等結果顯示，用於懸浮液之包括特異性結合分子(其係全乾燥蛋中之抗原特異性IgY抗體)及載劑基質(其係非免疫乾燥牛初乳)之固體調配物係經濟及有效的。本揭示內容之基質乾燥牛初乳可容易地購得且可提供高於奶之含量之各種基質組份。此與(例如)Larrson等人之US 2010/0233162之先前技術之教示內容形成對比。Larsson提供局部投與人類母乳中之分離雞蛋黃免疫球蛋白(IgY)來治療及預防真菌感染的方法。最低限度地，使用人類母乳使Larsson組合物不太經濟且難以快速產生及儲存。另外，在三天之治療後，本揭示內容之組合物顯示顯著較低未分類腹瀉在非新生幼兒及兒童中之持續時間；其中胃腸道之病狀比新生兒嚴重。此與Larsson等人之US 2006/0134101形成 對比，後者提供使用鳥抗體來治療及預防新生嬰兒中之腸道感染的方法。此亦與Sarker等人，2001形成對比，後者報告超免疫化雞蛋黃免疫球蛋白在患有輪狀病毒腹瀉之非新生兒童中的臨床試驗，其顯示腹瀉之持續時間具有較小差異或沒有差異。(Sarker等人，2001,Randomized,placebo-controlled,clinical trial of hyperimmunized chicken egg yolk immunoglobulin in children with rotavirus diarrhea.J.Pediatr.Gastroenterol Nutr.32：19-25)。
此外，本發明組合物利用含有抗原特異性IgY之乾燥全蛋與保護性及反應性載劑基質(例如牛初乳)來(1)保護經口投與期間之抗體，及(2)進一步活化所述之被動免疫性。此與Lee等人之US 2003/0185856形成對比，後者提供產生蛋(含有抗病原細菌特異性IgY)及組合物(呈含有IgY之酸乳酪或冰淇淋形式)的方法；然而，並未闡述保護性及反應性載劑基質。酸乳酪及冰淇淋通常並無足夠高濃度之基質組份存在於源於初乳之基質中。
與免疫調節反應不同，通常可在第一投與之6-12小時內觀察到投與組合物之效應。本揭示內容之組合物係有效的且並不依賴於個體之免疫反應。
實例5. 臨床研究-在傷寒中之意外效能
經由未知先前接種所引起臨床效能之未計劃及意外展現來提供所主張組合物之效能的證據。
在印度之一個現場研究中，對已在臨床上診斷為「傷寒」之較小數量之兒童進行治療。傷寒係最通常由稱為沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhi、S.typhi)之細菌類型引起之感染。此疾病之經典症狀(除腹瀉外)係由其全身性感染期引起。細菌通常首先進入腸中，且然後進入血流中，其中其可遷移至淋巴結、膽囊、肝、脾及身體之其他部分中。該等患者顯示晚期疾病之經典症狀，包含高燒、一般性不 適及腹痛及(顯著地)經典皮疹-「玫瑰疹」(其係位於腹部及胸部上之小紅斑)。
對於此實際環境而言，通常並不對該等患者實施除大體體格檢查外之診斷測試。儘管該等患者並不符合現場研究之納入標準，但在主治醫師之請求下出於同情向其提供實例1B之組合物。
使用三種市售疫苗對於雞之標準接種方案並不特定包含用於沙門菌之抗原，因此僅預期有限之臨床反應。預計因內毒素中和而具有輕度改良，且主要腹瀉症具有少許之相關減輕，但對於疾病本身之過程並無效應。
令人吃驚的是，所有接受實例1B之組合物之傷寒患者皆顯示腹瀉症狀在24至48小時內顯著改良。此改良似乎超出了單獨之內毒素中和所預期。然而，更令人吃驚的是，實際上，所有情形中傷寒之全身性症狀亦在隨後24小時時間內消失，從而產生48至72小時之正常或接近正常狀態的時期。在傷寒中，症狀通常在治療之2至4週內得到改良。
沒有患者在現場試驗觀察時期期間(5天)展現疾病之任一反彈復發。已充分確定，若治療並未完全治癒感染，則症狀可快速恢復。
在連續三天內每天一次使用實例1B之組合物進行治療足以使得(連同標準護理)在相當短之時間內顯著減小疾病症狀(GI及全身)。反應之時間範圍不能由單獨之天然或「標準護理」效應進行解釋。
在試圖研究此意外效能之來源時，仔細審查該批次產生過程之整個經過。發現作為用於商業產蛋母雞之常見但隨意接種方案之一部分，使用沙門菌疫苗對所用之雞實施接種。
儘管如同小雞一般對鳥實施接種疫苗，但發現調配物對於沙門氏鼠傷寒桿菌高度有效。沙門菌並非用於實例1製備之雞之接種方案中之抗原之一。在現場試驗期間，主治醫師極其吃驚地發現該等傷寒 患者對於本揭示內容之組合物之意外反應。
實例6. 蛋粉末特異性IgY及總IgY之定量ELISA。
如下文所述，可使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)藉由修改Liou等人，2011,J.Anim.Vet.Adv.,10(18)：2349-2356之方法來測定總IgY及特異性抗抗原IgY之抗體活性。
使用100uL混合抗原製劑(10ug/孔)來塗覆微量滴定板或使用100uL兔抗雞IgY抗體(10ug/mL,Sigma-Aldrich)進行塗覆(對於對照孔)。將板在4℃下培育過夜。使用PBS-Tween 20緩衝液洗滌後，使用2% BSA封阻板並在4℃下培育過夜。然後使用PBS-Tween 20緩衝液洗滌孔並使用PBS洗滌一次。然後，使用1% BSA連續稀釋經稀釋之乾燥蛋粉末原料(10mg/mL)並以100uL/孔添加至試樣孔中。使用100uL標準IgY之連續稀釋液以(例如)0.015-1ug/mL之濃度範圍填充用於標準曲線之孔並在4℃下培育過夜。使用PBS-Tween 20緩衝液洗滌後，將100uL鹼性磷酸酶結合山羊抗雞IgY添加至孔中並在37℃下培育2小時。使用PBS-Tween 20緩衝液洗滌後，將100uL對硝基苯基磷酸二鈉作為受質添加至每一孔中並使其在37℃下反應10min。在405nm下使用板讀數儀量測吸光度。標準曲線之吸光度提供特異性抗抗原IgY濃度之相對量測。
為量測總IgY，使用兔抗雞IgY抗體(10ug/mL)塗覆微量滴定板之每一孔。如上所述進行培育及洗滌後，添加100uL稀釋之乾燥蛋粉末並如上所述實施分析。
儘管已參照上述實例闡述本發明，但應理解，本發明之精神及範圍內涵蓋修改及變化形式。因此，本發明僅由下列申請專利範圍限制。

Claims (17)

  1. 一種組合物於製備治療腹瀉或腸道感染的藥物之用途，其中該組合物包含：a)對非新生兒人類為有效量之至少一種特異性結合分子或其片段，其中該至少一種特異性結合分子包含對源自於包含每種輪狀病毒、冠狀病毒及大腸桿菌(Escherichia coli)之病原體之抗原具特異性的多株IgY抗體，其中該組合物的一個劑量含有1g至7g之乾燥免疫蛋；及b)載劑基質，其包括獲得於、分離於或源自於初乳，且該載劑基質包括至少兩種自非人類動物獲得之組份，該等組份係選自由以下組成之群：酶、乳鐵蛋白、轉鐵蛋白、非特異性免疫球蛋白、細胞激素、白血細胞、補體組份、干擾素及纖連蛋白，其中該組合物的一個劑量含有1g至7g之乾燥牛初乳；且其中該對非新生兒人類為有效量係用於治療或預防未分類腹瀉、未分類兒童腹瀉、旅行者腹瀉、輪狀病毒腹瀉、毒素介導之腹瀉、霍亂、難辨梭菌(Clostridium difficile)感染、痢疾、傷寒、消化性潰瘍或用於胃腸道菌叢管控。
  2. 如請求項1之用途，其中該組合物適用於口服投與。
  3. 如請求項1之用途，其中該載劑基質之該至少兩種組份係選自由以下組成之群：溶菌酶、磷脂酶、防禦素(defensin)、調理素(opsonin)、富含脯胺酸之多肽(PRP)、β-溶解素、介白素、趨化激素、TNF-α、白血球、吞噬細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性球、多形核細胞、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、自然殺手(NK)細胞、淋巴因子激活之殺手(LAK)細胞、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶、NADPH氧化酶及其組合。
  4. 如請求項1之用途，其中該病原體包括另外引起胃腸炎之人類或獸醫之腸或胃腸道病原體。
  5. 如請求項4之用途，其中該另外病原體係選自由以下組成之群：空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、沙門菌屬(Salmonella)、腸道沙門氏菌傷寒血清型(Salmonella enterica serovar Typhi)、痢疾志賀氏桿菌(Shigella dystenteriae)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、腸病原性大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌、腸凝集性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、難辨梭菌、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、霍亂弧菌O1(Vibrio cholerae O1)、弧菌O139(Vibrio O139)、非O1弧菌(Non-O1 Vibrios)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、親水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、腸肝螺旋桿菌(Helicobacter)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、加德納菌(Gardnerella spp.)、淋病雙淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、砂眼披衣菌(Chlamydiaceae trachomatis)、黴漿菌(Mycoplasma spp.)、陰道鞭毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、皰疹病毒類型1、皰疹病毒類型2、白色念珠菌(Candida albicans)、禿髮念珠菌(Candida glabrata)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、嗜酸性念珠菌(Candida parapsilosis)及克魯斯氏念珠菌(Candida krusei)、A群鏈球菌(Group A Streptococcus spp.)、輪狀病毒、冠狀病毒、諾羅病毒(norovirus)、杯狀病毒、腸腺病毒、巨細胞病毒、星狀病毒、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、帶狀皰疹病毒(herpes zoster virus)、鐮胞菌(Fusarium spp.)及棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)。
  6. 如請求項1之用途，其中該對抗原具特異性的多株IgY抗體衍生自病原相關性毒素，其係內毒素或外毒素。
  7. 如請求項1之用途，其中該對抗原具特異性的多株IgY抗體衍生自病原相關性黏著要素，其係選自黏著素、鈣黏著素、纖毛、原纖維、病毒黏著結構或其組合。
  8. 如請求項1-7中任一項之用途，其中該組合物包括可有效用於治療或預防未分類腹瀉、旅行者腹瀉、輪狀病毒腹瀉、毒素介導之腹瀉、霍亂、傷寒或用於胃腸道菌叢管控的量。
  9. 如請求項8之用途，其中該未分類腹瀉係兒童未分類腹瀉。
  10. 如請求項1之用途，其中該特異性結合分子係以固體粉末形式包含於乾燥全免疫蛋。
  11. 如請求項1之用途，其中該載劑基質包含於固體粉末形式中的牛初乳。
  12. 如請求項1之用途，其中該組合物係呈固體粉末形式。
  13. 如請求項1之用途，其中該牛初乳係非超免疫牛初乳(non-hyperimmune bovine colostrum)。
  14. 如請求項1之用途，其中該牛初乳係乾燥全脂牛初乳。
  15. 如請求項1之用途，其中該組合物進一步包括醫藥上可接受之稀釋劑、黏合劑、賦形劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、潤濕劑或吸收劑。
  16. 如請求項1之用途，其中該組合物的一個劑量含有2g至4g之乾燥免疫蛋。
  17. 如請求項1之用途，其中該組合物的一個劑量含有3g至4g之乾燥牛初乳。
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