CN1965665A - IgY抗体免疫奶或奶粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备新型免疫奶粉的方法，为解决全球尚无可完全代替母乳的奶粉以及普通奶粉不含免疫抗体之问题，本发明方法中，分析母乳抗体构成选择相对应的病原体并研究确定最常见的感染性疾病之病原体。分别培养这些病原体，或者应用基因工程制备表达蛋白，再用特殊方法制备相应的复合抗原；然后，用这些抗原免疫产蛋禽类，对于婴儿奶粉则制备跟母乳所含的抗体种类相一致的复合IgY，对于普通免疫奶粉则制备抗相应病原体的特异性IgY或根据不同功效要求组合成各种复合IgY。取所得的IgY加入卵磷脂，再通过特殊的干粉混合法或液态混合法与奶粉或奶水按适当比例进行混合(后者需喷雾干燥)，即可制成可代替母乳的婴儿免疫奶粉或具防治疾病功效的免疫奶粉。

Description

IgY抗体免疫奶或奶粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体及其新型免疫奶或奶粉，特别是涉及一种抗多种病原体复合IgY及其含这种抗体的新型免疫奶或奶粉。

背景技术

迄今为止，全世界尚无真正能代替母乳的牛奶或奶粉。因此，国际医疗卫生机构一向主张用母乳哺育婴儿，并认为除非母亲因健康原因或外出工作，才不得已给婴儿喂食奶粉。其理由十分清楚，就是因为母乳营养丰富，含抗体及免疫球蛋白，可减低婴儿患上哮喘、肠泻的机会。实际上在科技高度进步的今天，制作符合营养丰富的要求的奶粉是很容易做到的，目前市面上的优质婴儿奶粉在营养成份方面，已经完全可以达到跟母乳一样了；但是目前就还无法做到后一条，即含有母乳中特有的抵抗多种病原体的一系列抗体及免疫球蛋白。

近年来，有些商家将牛初乳粉加入奶粉中制成一种“含有免疫球蛋白”的新奶粉；作为一种可代替母乳的奶粉来宣传及推广。其实这是一种误导，原因如下：

1、人的病原体和牛的病原体许多是不同的，因而人奶的抗体所针对的病原体跟牛初乳中的免疫球蛋白所针对的病原体有很大差别；例如，人轮状病毒对牛往往并不致病，牛初乳中也就不会有致婴幼儿秋季腹泻的人轮状病毒的抗体。

2、牛初乳奶粉只是将牛初乳(其中只有微量“非特异性免疫球蛋白”)冻干后按一定比例添加到奶粉中，并没有将其中的“非特异性免疫球蛋白”浓缩后单独提取出来加入；更没有预先制作与母乳抗体成份相对应的抗原免疫母牛产生高浓度“特异性免疫球蛋白”；因此，其中的免疫球蛋白含量不但十分低，而且不是“特异性”的，更无法做到与母乳抗体成份相对应。

3.存在将某些哺乳动物相同的病原体带入人体，造成感染的风险。

综上所叙，含牛初乳的奶粉是不能替代母乳的。

发明内容

针对现有奶粉产品的上述缺陷，本发明要解决现有奶粉不含母乳中特有的抵抗多种病原体的一系列抗体及免疫球蛋白的问题，以提供一种真正能代替母乳的奶粉。

本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种制备免疫奶或奶粉的方法，其中包括以下步骤：

(S1)全面分析母乳抗体构成选择相对应的病原体并研究确定最常见的感染性疾病之病原体；

(S2)培养所述病毒和/或细菌；

(S3)利用所述培养的病毒和/或细菌，制备相应的复合抗原；

(S4)利用所述复合抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋；

(S5)取所述免疫蛋的蛋黄，制备相应的特异性IgY粗提物；

(S6)对所述特异性IgY粗提物进行纯化，再进行过滤处理以滤除各种细菌和病毒，得到相应的特异性IgY成品；

(S7)取所述特异性IgY成品与适当比例的奶或奶粉原料混合，制成相应的免疫奶或奶粉。

本发明中，所述免疫奶或奶粉可以是婴儿免疫奶或奶粉；此时，在所述步骤(S1)中，选定以下一种或多种病毒和/或细菌：引起腹泻的大肠杆菌、沙门氏菌、婴幼儿轮状病毒，引起过敏和哮喘的尘螨，引起感冒的鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等感冒病毒，以及，引起龋齿变形链球菌；所述感冒病毒包括代表性的1A、2、5、14、23、29、31七种血清型鼻病毒，229E、OC43两型的冠状病毒，以及7、3、4三种型的腺病毒。

为制备上述婴儿免疫奶或奶粉，在所述步骤(S4)中，制得抗腹泻免疫蛋、抗过敏免疫蛋、抗感冒免疫蛋、抗龋齿免疫蛋这四种免疫蛋中的一种或多种；在所述步骤(S5)中，制得抗腹泻特异性IgY、抗过敏细菌特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY这四种特异性IgY粗提物中的一种或多种；在所述步骤(S6)中，制得抗腹泻特异IgY、抗过敏特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY这四种特异性IgY成品中的一种或多种。

本发明中，所述免疫奶或奶粉可以是普通免疫奶或奶粉；此时，在所述步骤(S1)中，选定以下一种或多种病毒和/或细菌：(1)引起胃病的幽门杆菌和幽门球菌，(2)引起腹泻的大肠杆菌和沙门氏菌，(3)引起感冒和流感、禽流感的感冒病毒和流感、禽流感病毒，(4)引起龋齿和牙周病的细菌，(5)引起哮喘和过敏的尘螨以及若干种致敏花粉浸出液或萃取剂，(6)引起咽喉炎的金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、溶血性链球菌，(7)引起鼻炎的细菌、真菌和病毒；

在所述步骤(S3)中，制备以下一种或多种抗原：(1)幽门杆菌和幽门球菌复合抗原，(2)腹泻抗原，(3)感冒和流感、禽流感抗原，(4)龋齿和牙周病抗原，(5)致敏抗原，(6)咽喉炎抗原，(7)鼻炎抗原。

为制备上述普通免疫奶粉，在所述步骤(S4)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌免疫蛋，抗腹泻免疫蛋，抗感冒和流感、禽流感免疫蛋，抗龋齿和牙周病免疫蛋，抗过敏免疫蛋，抗咽喉炎免疫蛋，抗鼻炎免疫蛋这七种免疫蛋中的一种或多种；

在所述步骤(S5)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物，抗腹泻特异性IgY粗提物，抗感冒和流感特异性复合IgY粗提物，抗龋齿和牙周病特异性IgY粗提物，抗过敏特异性IgY粗提物，抗咽喉炎特异性IgY粗提物，以及，抗鼻炎特异性复合IgY粗提物这七种特异性IgY粗提物中的一种或多种；

在所述步骤(S6)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY成品，抗腹泻特异性IgY成品，抗感冒和流感特异性复合IgY成品，抗龋齿和牙周病特异性IgY成品，抗过敏特异性IgY成品，抗咽喉炎特异性IgY成品，以及，抗鼻炎特异性复合IgY成品这七种特异性IgY成品中的一种或多种。

在本发明的所述步骤(S7)中，可采用干粉混合法制备免疫奶粉，步骤如下：取通过前述步骤所制得特异性IgY成品干粉的中的一种或多种，用干粉混合机充分搅拌后得到IgY复合抗体干粉；再把这种IgY复合抗体粉以适当比例添加到婴儿免疫奶粉或普通免疫奶粉中，采取等量放大匀化法用干粉搅拌机充分混和匀化，即制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶粉或普通免疫奶粉。

在本发明的所述步骤(S7)中，还可采用液态混合法制备免疫奶或奶粉，步骤如下：取通过前述步骤所制得特异性IgY成品液体的中的一种或多种，制成特异性IgY混合液体；然后按一定比例与鲜奶汁混合，置入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶或普通免疫奶。再用60-85℃温度进行喷雾干燥，即可制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶粉或普通免疫奶粉。

由上述方案可知，本发明针对现有奶粉类产品的缺陷，在全面研究母乳成份的基础上，研制了一系列跟母乳所含的抗体种类相一致的免疫球蛋白，然后将其加入普通奶或奶粉中，以制成可代替母乳的新一代婴儿免疫奶或奶粉；又针对成人特别是老年人所特别需要补充的某种抗体，研制相应的特异性免疫球蛋白，将其添加到奶或奶粉中，制成一系列具不同功效的普通免疫奶或奶粉。

具体实施方式

蛋黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，简称IgY)同样属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构像，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。研究表明，IgY具有以下其它抗体所没有的优点：

(1)、不会产生交叉血清反应或过敏反应；

(2)、不会将某些跟人病原体相同的哺乳动物的病原体带入人体内；

(3)、试验证明IgY可抵抗胃蛋白酶和肠道胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶对其活性的破坏，能通过胃到达小肠被人体吸收；

(4)、其灵敏度和抗体活性比一般哺乳动物包括牛的IgG高得多；

(5)、所制的抗体具有类似单克隆抗体的一致性；

(6)、抗体制备成本比从牛等哺乳动物中制备低得多；

(7)、鸡蛋黄中含有丰富卵磷脂，对婴幼儿大脑发育很有益，可制备一种含卵磷脂的IgY抗体。

因此，本专利中选择IgY作为制作所需抗体的最理想物质。

一、婴儿免疫奶或奶粉的制备

1.1制作含相当母乳所含主要抗体的免疫球蛋白IgY

1.1.1选定有代表性的几种病原体

根据流行病学调查，确定婴幼儿最易感染的疾病为：腹泻；过敏和哮喘；感冒；龋齿。

1.1.2分析引致这些疾病的病原体，主要是：

腹泻—大肠杆菌、沙门氏菌、婴幼儿轮状病毒；

过敏和哮喘—导致婴幼儿过敏的最主要致敏原为屋尘螨；

感冒—鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等感冒病毒；

龋齿—变形链球菌。

1.1.3分别培养相应病毒和细菌

1.1.3.1腹泻病原体：委托中国江西省分子医学重点试验室从患者体内取得大肠杆菌、沙门氏菌，然后分别用常规方法培养。而轮状病毒则采用常规鸡胚尿囊法，在鸡胚尿囊中培养；收取含有轮状病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化病毒。

1.1.3.2过敏和哮喘致敏原—从屋尘中分离得到螨虫，然后在雅臣药业集团(远东)有限公司位于「香港生物科技研究院」实验室培养。

1.1.3.3感冒病原体—向美国病毒中心(ATCC)购买最常见有代表性的1A、2、5、14、23、29、31七种血清型鼻病毒和229E、OC43两型的冠状病毒以及7、3、4三种型的腺病毒；然后分别按以下方法培养。

1.1.3.3.1培养常见的、有代表性的七种血清型鼻病毒

将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒方法如下：将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存。

1.1.3.3.2培养常见的、有代表性的两种血清型冠状病毒

将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒。培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存。

1.1.3.3.3培养常见的、有代表性的三种血清型腺病毒

将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型7型、3型和4型腺病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的多种灭活腺病毒在4℃或-20℃保存。

1.1.3.4致龋变形链球菌—委托中国江西省分子医学重点试验室在有乳瓶蛀牙的幼童唾液中分离得到变形链球菌，然后用常规方法培养。

1.1.4分别制备四种不同的复合抗原

1.1.4.1腹泻复合抗原

先将培养好的大肠杆菌(2×109/ml)和沙门氏菌(2×109/ml)按1-10∶10-1比例混合，最佳比例为1∶1；再将这两种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒液按10-1∶1-10比例混合，最佳比例为2∶1；将所制得的腹泻抗原混合液，充分混和均匀，然后，按10-1∶1-10比例加入福氏佐剂，最佳比例为：1∶1，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得腹泻复合抗原。

1.1.4.2致敏抗原

将培养好的螨虫用超声粉碎后按10-1∶1-10比例与福氏佐剂混合，最佳比例为1∶1，然后加入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成致敏抗原。

1.1.4.3感冒复合抗原

1.1.4.3.1将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。

1.1.4.3.2将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。

1.1.4.3.3将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。

1.1.4.3.4接着将分别制成的鼻病毒混和物、冠状病毒混和物、以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物。最佳比例为鼻病毒混和物：冠状病毒混和物：腺病毒混和物为5∶3∶2。

1.1.4.3.5将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，最佳比例为1∶1。然后，加入高速匀浆机中以8,000-30,000rpm转速进行高速粉碎匀化，形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原。

1.1.4.4龋齿抗原

将培养好的变形链球菌(2×109/ml)按10-1∶1-10比例与福氏佐剂混合，最佳比例为1∶1；然后置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成龋齿抗原。

1.1.5制备四种不同的免疫蛋

将采用上述方法制备的四种不同的抗原和复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记，即分别得到抗腹泻免疫蛋、抗过敏免疫蛋、抗感冒免疫蛋、抗龋齿免疫蛋。

以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋火鸡、或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。

1.1.6抗腹泻特异性IgY、抗过敏细菌特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY共四种特异性IgY粗提物的制备：首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间。

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗腹泻特异性IgY粗提物、抗过敏特异性IgY粗提物、抗感冒特异性IgY粗提物和抗龋齿特异性IgY粗提物；最后，将所制备的四种不同的特异性IgY粗提物进行编码标记。

应用SDS-PAGE电泳测定法，分别对按以上工艺所制得的四种不同特异性IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量均为50％以上。

1.1.7抗腹泻特异性IgY、抗过敏特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY共四种特异性IgY粗提物的纯化：分别将以上四种粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即分别制得抗腹泻特异IgY成品、抗过敏特异性IgY成品、抗感冒特异性IgY成品、以及抗龋齿特异性IgY成品。

1.1.8对所制得的抗腹泻特异性IgY、抗过敏特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY，参照常规「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)分别进行活性检测。

检测结果显示，抗腹泻特异性IgY对大肠杆菌和沙门氏菌的抗体结合效价都达到1∶2048以上，对轮状病毒的抗体结合效价则达到1∶4,096；抗过敏特异性IgY对螨虫的抗体结合效价也达到1∶1,024；抗感冒特异性IgY对前述7种有代表性的血清型的鼻病毒、2种有代表性血清型的冠状病毒以及3种有代表性血清型的腺病毒的抗体结合效价都达到了1∶1024以上。同样，抗龋齿特异性IgY对变形链球菌的抗体结合效价也都在1∶2048以上。以上测试样本的IgY浓度均为1mg/ml。

1.2制作含相当母乳中主要抗体的IgY婴儿免疫奶或奶粉

1.2.1干粉混合法：

将所制得的抗腹泻特异性IgY干粉、抗过敏特异性IgY干粉、抗感冒特异性IgY干粉、抗龋齿特异性IgY干粉按1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，一般可按1∶1∶1∶1比例混合；用干粉混合机充分搅拌后得到IgY复合抗体干粉。然后以适当比例添加到婴儿免疫奶粉中，采取等量放大匀化法用干粉搅拌机充分混和匀化，即制成含相当母乳抗体之免疫球蛋白的、最接近母乳的婴儿免疫奶粉。

1.2.2液态混合法：

将1.5所制得的四种特异性IgY液体经过过滤除菌后，不要冷冻干燥而按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，通常可选1∶1∶1∶1比例，而得到特异性IgY混合液体；然后，按一定比例与普通鲜奶汁混合，置入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即制得含相当母乳抗体之免疫球蛋白的、最接近母乳的婴儿免疫奶。将这种婴儿免疫奶采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)，就可制成含相当母乳抗体之免疫球蛋白的、最接近母乳的婴儿免疫奶粉。

由于IgY可抵抗胃蛋白酶和肠道胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶对其活性的破坏，同时，鉴于婴幼儿胃部的pH值较高(pH＞4)，不会影响IgY的活性；因此，IgY可顺利到达小肠而为人体吸收。只要给婴幼儿喂食这种含丰富的高活性类母乳抗体的奶粉，其中所含的免疫球蛋白就会被有效吸收，这就相当于从母体获得所需的抗体；从而，弥补婴幼儿体内抗体不足的缺陷。鉴于本发明的四种免疫球蛋白都是特别采用高免疫措施进行免疫启动而制得高活性免疫球蛋白，其抗体活性比母乳和牛初乳高得多；因此，婴幼儿食用了这种高活性抗体后，可大大提升身体抵抗力，明显改善婴幼儿体质；彻底改变婴幼儿因免疫系统发育尚未健全而容易患上腹泻、过敏、感冒等疾病的状况。另外，由于鸡卵黄中含有丰富的卵磷脂，让婴幼儿食用含IgY的免疫奶或奶粉，就可补充卵磷脂成份，对婴幼儿大脑发育很有益；同时，本发明的免疫奶或奶粉还特别含有抗龋齿特异性IgY和抗过敏特异性IgY以及抗轮状病毒特异性IgY，这是一般母乳也很少有的抗体；因此，还可以比喂母乳更有效地防止奶瓶蛀牙和轮状病毒腹泻，预防婴幼儿发生各种敏感症甚至哮喘等严重危害身心健康的疾病，这是牛初乳和一般母乳所不可能做到的。

二、特殊免疫奶粉的制备

市面上的奶粉有补钙、补铁等功能性奶或奶粉，但尚没有补充抗体，直接提升食用者免疫能力的功能奶或奶牛粉。本发明采用独特的免疫启动方法和抗体提取技术，制备多种特异性IgY抗体，然后将其加入奶或奶粉中，制成一系列可有效提高免疫功能的、具不同功效的多种保健奶或奶粉。具体制作方法如下：

2.1根据流行病学调查，确定最常发生的感染性疾病，并研究确定最常见的感染性疾病之病原体；然后，制备七种不同的特异性免疫球蛋白IgY，包括：抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY；抗腹泻特异性复合IgY；抗感冒和流感、禽流感特异性复合IgY；抗龋齿和牙周病特异性复合IgY；抗过敏特异性IgY；抗咽喉炎特异性IgY；抗鼻炎特异性IgY

2.2抗原制作

2.2.1幽门杆菌和幽门球菌复合抗原

2.2.1.1以技术合作形式由「新加坡国立大学」提供培养好的幽门杆菌和幽门球菌。

2.2.1.2将培养好的幽门杆菌(2×109)和幽门球菌(2×109)按1-10∶10-1比例混合，最佳比例为1∶1，制成幽门菌混合物。

2.2.1.3将幽门菌混合物按1-10∶10-1比例(最佳比例1∶1)与福氏佐剂混合，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成幽门杆菌和幽门球菌复合抗原。

2.2.2腹泻抗原

将照前叙方法培养好的大肠杆菌(2×109/ml)和沙门氏菌(2×109/ml)按1-10∶10-1比例混合，最佳比例为1∶1；将所制得的腹泻抗原混合液，充分混和均匀，然后，按10-1∶1-10比例加入福氏佐剂，最佳比例为：1∶1，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得腹泻复合抗原

2.2.3感冒和流感、禽流感抗原

2.2.3.1感冒和流感、禽流感病毒培养

2.2.3.1.1感冒病毒培养

2.2.3.1.1.1培养常见的、有代表性的七种血清型鼻病毒

将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型1A、2、5、14、23、29、31型的7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒方法如下：将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒。培养好的灭活鼻病毒分别在4℃或-20℃保存。

2.2.3.1.1.2培养常见的、有代表性的两种血清型冠状病毒

将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒。培养好的灭活冠状病毒在4℃或-20℃保存。

2.2.3.1.1.3培养常见的、有代表性的三种血清型腺病毒

将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将购自当地国家病毒中心或病毒研究机构(如中国国家疾病预防控制中心病毒研究所)的血清型7型、3型和4型腺病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液

稀释至100TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。培养好的灭活腺病毒4℃或-20℃保存。

2.2.3.1.2流感、禽流感病毒培养或抗原成份制作

2.2.3.1.2.1根据流行病学调查，选定有代表性的最常出现的流行性感冒病毒。

A型流感病毒H3N2株、H1N1株、H2N2株，禽流感病毒H5N1、H9N2(通过学术合作由新加坡国立大学提供)，B型流感病毒B-Vactoria株(通过学术合作由新加坡国立大学提供)

2.2.3.1.2.2培养2.3.1.2.1所列有代表性的流感、禽流感病毒并提纯

本发明将病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化病毒。

2.2.3.1.2.3制作抗原成份

本发明采用四种方法制作新型的抗原成份。

2.2.3.1.2.3.1病毒裂解法：

分别取上述提纯的各种流感病毒分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即分别得到上述各种流感病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。检测确定含有血凝素重链(HA1)、血凝素轻链(HA2)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P1、P2、P3)、基质蛋白(M1、M2)和非结构蛋白(NS、NS2)。与Enami M等的实验结果一致。

2.2.3.1.2.3.2直接取用培飬并纯化的多种流感病毒成份。

2.2.3.1.2.3.3基因工程重组流感病毒多肽HA2：

用RT-PCR方法从甲型流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28℃摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时，以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的流感病毒HA2抗原。

2.2.3.1.2.3.4上面所说的流感病毒也可以直接应用目前世界上已研制成功「流感三价疫苗」和「禽流感多价疫苗」，前者疫苗已包含有H3N2、H2N2两种A型流感病毒两种亚型抗原成份以及B型流感病毒抗原成份，后者疫苗则包括了H5N1、H9N2等禽流感抗原成分。直接采用这两种疫苗，或者分别将其采用上述病毒裂解法裂解后再用，作为流感、禽流感复合抗原的材料。

2.2.3.2感冒和流感、禽流感抗原制作

2.2.3.2.1感冒病毒复合抗原制作

2.2.3.2.1.1将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物。

2.2.3.2.1.2将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物。

2.2.3.2.1.3将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物。

2.2.3.2.1.4接着将分别制成的鼻病毒混和物和冠状病毒混和物以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物。最佳比例为鼻病毒混和物∶冠状病毒混和物∶腺病毒混和物为5∶3∶2。

2.2.3.2.1.5将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀，最佳比例为1∶1。然后，加入高速匀浆机中以8,000-30,000rpm转速进行高速粉碎匀化，形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原。

2.2.3.2.2流感、禽流感病毒复合抗原制作

2.2.3.2.2.1病毒裂解成分复合抗原

将本发明上述裂解方法制备的H3N2、H1N1、H2N2、B-Vactoria 4种流感病毒裂解液以及H5N1和H9N2禽流感病毒裂解液，按1.0∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.5的比例混合均匀，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种流感、禽流感病毒裂解成份的病毒复合抗原。

2.2.3.2.2.2病毒成分复合抗原

将本发明上述方法制备的H3N2、H1N1、H2N2、B-Vactoria 4种流感病毒液以及H5N1和H9N2禽流感病毒液，按1.0∶0.5∶0.5∶1.0∶1.0∶0.5的比例混合均匀，制成混合液，再按1∶1的比例在混合液中加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含多种流感、禽流感病毒成份的病毒复合抗原。

2.2.3.2.2.3HA2表达蛋白抗原：

将本发明上述基因工程技术所制得纯化的A型流感病毒HA2表达蛋白(200微克/ml)按2∶1的比例和B-Vactoria流感病毒提纯液混和均匀制成混合物，然后将所得混合液按1∶1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得含A型流感病毒HA2表达蛋白的抗原。

2.2.3.2.2.4利用现成「流感三价疫苗」、「禽流感多价疫苗」制作抗原

从香港卫生署购置「流感三价疫苗」和「禽流感多价疫苗」，将这两种疫苗混合均匀，或者进一步采用病毒裂解法裂解；再将这种混合液或裂解液按1∶1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制得「疫苗式」的复合抗原。

2.2.4龋齿和牙周病抗原

2.2.4.1病原体培养

2.2.4.1.1变形链球菌培养—委托中国江西省分子医学重点试验室在有乳瓶蛀牙的幼童唾液中分离得到变形链球菌，然后用常规方法培养。

2.2.4.1.2牙周病致病菌培养

2.2.4.1.2.1选择牙周病主要致病菌为：牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、粘性放线菌、放线共生放线菌、CO₂噬杆菌。

2.2.4.1.2.2委托中国江西省分子医学重点试验室采用「厌氧细菌培养箱」以常规方法培养上列五种有代表性的致牙周病细菌。

2.2.4.2抗原制作

将培养好的五种牙周病致病菌先按1∶1∶1∶1∶1比例混合均匀，再将这种牙周病致病菌混合液以1-10∶10-1比例与变形链球菌(2×109)混合均匀，最佳比例为2∶1；然后再将这种混合液与福氏佐剂按10-1∶1-10比例混合，最佳比例为1∶1，并置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成龋齿和牙周病复合抗原。

2.2.5致敏抗原

2.2.5.1筛选成人哮喘主要致敏原：主要致敏原除了与儿童相同的螨虫外，引致成人过敏和哮喘的常见致敏原还有多种花粉等；欧美国家主要为豚草花粉、蒿草花粉、法国梧桐花粉等，而中国最常见的为蒿草花粉。

根据筛选出的致敏花粉种类，选用已商品化的若干种致敏花粉浸出液或萃取剂作为有代表性的致敏原。

2.2.5.2采用常规方法培养螨虫

2.2.5.3将蒿草花粉浸出液、豚草花粉浸出液、法国梧桐花粉浸出液按1∶1∶1比例混合均匀，再以1∶1比例与培养好的螨虫混合并充分混匀；然后，以1-10∶10-1比例与福氏佐剂混合，最佳比例为1∶1，再置入高速匀浆机中以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得致敏抗原。

2.2.6咽喉炎抗原

2.2.6.1筛选咽喉炎主要致病菌

根据流行病学调查，选择以下三种细菌为咽喉炎主要致病菌：金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、溶血性链球菌。

2.2.6.2培养致病菌

委托中国江西省分子医学重点试验室从患者咽喉部摄取以上三种细菌，然后分别用常规方法培养。

2.2.6.3制作抗原

将培养好的金黄色葡萄球菌(2×109)、肺炎双球菌(2×109)、溶血性链球菌(2×109)按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，最佳比例为1∶1∶1；充分搅拌均匀后再以1-10∶10-1比例与福氏佐剂混合，最佳比例为1∶1，置入高速匀浆机中以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成咽喉炎复合抗原。

2.2.7鼻炎抗原

2.2.7.1筛选鼻炎主要病原体

2.2.7.1.1细菌：A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他球菌、流感杆菌、草绿色链球菌、白色葡萄球菌等；

2.2.7.1.2真菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌以及构巢曲霉菌和白色念珠菌等；

2.2.7.1.3病毒：鼻病毒5型、14型、29型、冠状病毒229E型和OC43型等；

2.2.7.2分别制备各种病原体复合抗原：

2.2.7.2.1细菌复合抗原

购买市售的A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他球菌、流感杆菌、草绿色链球菌、白色葡萄球菌等7种菌种，用细菌培养基分别在细菌培养箱中常规培养，将培养好的细菌按以下比例混合匀化：

肺炎双球菌           占        20-5％

A簇B型溶血性链球菌   占        35-50％

流感杆菌             占        10-25％

金黄色葡萄球菌       占        15-5％

草绿色链球菌         占        10-5％

白色葡萄球菌         占        约5％

卡他球菌             占        约5％

然后加入福氏佐剂，再放进高速匀浆机中以10,000-30,000rpm转速高速粉碎匀化，则制得全菌和菌体成分混合的细菌复合抗原。

2.2.7.2.2制备真菌复合抗原

购买市售的烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、构巢曲霉菌以及白色念珠菌、毛霉菌等6种真菌菌种，采用真菌培养基在培养箱中常规培养。

将培养好的真菌按以下比例混合匀化：

烟曲霉菌         占        35-15％

黄曲霉菌         占        20-10％

黑曲霉菌         占        30-15％

米曲霉菌         占        10-20％

构巢曲霉菌       占        10-15％

白色念珠菌       占        约10％

然后加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10,000-30,000rpm转速高速粉碎匀化，则制得全菌和真菌菌体成分的复合抗原。

2.2.7.2.3制备含病毒、细菌和真菌的综合性复合抗原

2.2.7.2.3.1优选引致急性鼻炎的有代表性的病原体：鼻病毒5型、14型、29型三种(可根据情况变更优选的鼻病毒种类和数目)，冠状病毒229E型和OC43型两种(可根据情况变更优选的冠状病毒种类和数目)，再加上引致鼻炎和鼻窦炎的主要致病菌A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、金黄色葡萄球菌，另加1-3种引致鼻腔炎症的主要真菌：烟曲霉菌、黑曲霉菌和白色念珠菌；

2.2.7.2.3.2先将5型、14型和29型鼻病毒和229E型、OC43型冠状病毒各自培养并灭活后混匀，然后把鼻病毒和冠状病毒按1-10∶1-10比例混合均匀，制成病毒抗原混合物；

2.2.7.2.3.3再将A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、金黄色葡萄球菌分别培养好后，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，制成致病菌抗原混合物；

2.2.7.2.3.4然后，将烟曲霉菌、黑曲霉菌和白色念珠菌培养好后按1-10∶1-10∶1-10的比例混匀，制成真菌抗原混合物；

2.2.7.2.3.5最后，将病毒抗原混合物、致病菌抗原混合物、真菌抗原混合物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合搅拌均匀，再按1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，然后一道放进高速匀浆机中以10,000-30,000rpm转速高速粉碎匀化，则制得一种含病毒、细菌和真菌的综合性复合抗原；

2.2.3免疫蛋制作

将采用上述方法制备的7种不同的抗原和复合抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记，即：抗幽门杆菌和幽门球菌免疫蛋；抗腹泻免疫蛋；抗感冒和流感、禽流感免疫蛋；抗龋齿和牙周病免疫蛋；抗过敏免疫蛋；抗咽喉炎免疫蛋；抗鼻炎免疫蛋。

以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。

2.2.4七种不同的特异性IgY制备

首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将七种免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；

将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得：(1)抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物，(2)抗腹泻特异性IgY粗提物，(3)抗感冒和流感特异性复合IgY粗提物，(4)抗龋齿和牙周病特异性IgY粗提物，(5)抗过敏特异性IgY粗提物，(6)抗咽喉炎特异性IgY粗提物，以及，(7)抗鼻炎特异性复合IgY粗提物；最后，将所制备的七种不同的特异性IgY粗提物进行编码标记。

应用SDS-PAGE电泳测定法，分别对按以上工艺所制得的七种不同特异性IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量均为50％以上。

分别将以上七种粗提物溶解于pH7.0、0.01PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得这七种不同的特异性IgY成品。

2.2.4.1对所制得的这七种不同的特异性IgY，参照常规「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)分别进行活性检测。

检测结果显示，抗幽门杆菌和幽门球菌特异性IgY对幽门杆菌和幽门球菌的抗体结合效价为1∶4,096以上；抗腹泻特异性IgY对大肠杆菌和沙门氏菌的抗体结合效价都达到1∶2,048以上；抗过敏特异性IgY对螨虫的抗体结合效价也达到1∶1,024，对几种主要致敏原抗体结合效价为1∶1,024；抗感冒和流感、禽流感特异性IgY对前述7种有代表性的血清型的鼻病毒、2种有代表性血清型的冠状病毒以及3种有代表性血清型的腺病毒以及有代表性的四种流感病毒、两种禽流感病毒的抗体结合效价都达到了1∶1,024以上。同样，抗龋齿特异性IgY对变形链球菌的抗体结合效价在1∶2,048以上，而对牙周病致病菌的抗体结合效价也在1∶2,048以上；抗咽喉炎特异性IgY对三种主要致病菌的抗体结合效价都在1∶2,048以上；抗鼻炎特异性复合IgY对有代表性的致病细菌、致有真菌、致病病毒的抗体结合效价都在1∶1,024以上。以上测试样本的IgY浓度均为1mg/ml。

2.2.5制作多种不同功效的免疫奶或奶粉

2.2.5.1干粉混合法：

2.2.5.1.1将所制得的抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY干粉，抗腹泻特异性IgY干粉，抗感冒和流感、禽流感特异性复合IgY干粉，抗龋齿和牙周病特异性IgY干粉，抗过敏特异性IgY干粉，抗咽喉炎特异性IgY干粉以及抗鼻炎特异性复合IgY干粉；根据需要选其中一种，再按一定比例加入到各种成人奶粉中，采用等量放大匀化法，置入干粉搅拌机充分混匀，就可制成一系列具不同功效的保健奶粉，如：防治胃病的保健奶粉、防治腹泻的保健奶粉、抗感冒和流感、禽流感保健奶粉、防龋齿和牙周病保健奶粉、抗过敏和哮喘保健奶粉以及防治咽喉炎或鼻炎保健奶粉等等。

2.2.5.1.2也可以将这七种特异性IgY根据需要任选其中二种或三种或4-7种按一定比例混合均匀，用干粉混合机充分搅拌后得到IgY复合抗体干粉；然后，以一定比例添加到成人奶粉中，采用等量放大匀化法，用干粉搅拌机充分混和均匀，即制成含相应抗体的、具多种不同功效的保健奶粉，如：防治肠胃病保健奶粉(含抗幽门菌和抗腹泻两种IgY)、抗呼吸道感染保健奶粉(含抗感冒、流感、禽流感和抗咽喉炎两种IgY)、抗过敏性鼻炎保健奶粉(含抗过敏和抗鼻炎两种IgY)等等。

2.2.5.2液态混合法：

2.2.5.2.1将2.4所制得的七种特异性IgY液体经过「过滤除菌」后，不要冷冻干燥，根据需要选其中一种按一定比例添加到各种普通鲜奶水中，用搅拌机充分搅拌均匀，即制得含相应抗体的、具不同功效的保健奶，。将这种保健奶采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)，则可制成含相应抗体的、具不同功效的保健奶粉，如：防治胃病的保健奶粉、防治腹泻的保健奶粉、抗感冒和流感、禽流感保健奶粉、防龋齿和牙周病保健奶粉、抗过敏和哮喘保健奶粉以及防治咽喉炎或鼻炎保健奶粉等等。

2.2.5.2.2也可以将以上七种特异性IgY液体经过「过滤除菌」后，不要冷冻干燥，根据需要任选其中二种或三种或4-7种按一定比例混合，并置入搅拌机充分混合均匀，再将这种特异性IgY混合液体按一定比例与普通鲜奶汁混合，置入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即制成一系列含相应抗体的、具多种不同功效的保健奶。将这些保健奶采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)，则可制成一系列含相应抗体的、具多种不同功效的保健奶粉，如：防治肠胃病保健奶粉(含抗幽门菌和抗腹泻两种IgY)、抗呼吸道感染保健奶粉(含抗感冒、流感、禽流感和抗咽喉炎两种IgY)、抗过敏性鼻炎保健奶粉(含抗过敏和抗鼻炎两种IgY)等等。

由于本发明的七种免疫球蛋白都是针对成人经常发生的疾病，采用相应的病原体作为抗原免疫禽类制成的，食用含有这种特异性免疫球蛋白的奶或奶粉，就可得到免疫保护，有效预防和治疗相应的疾病。例如，食用含抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY的免疫奶或奶粉，就可抑制胃内造成胃溃疡的幽门菌，并在胃部形成一层免疫蛋白保护膜，达到防治胃病的效果；由于幽门杆菌对抗生素的耐药性相当严重，幽门杆菌又会变为生存能力更强的幽门球菌使胃药失效，因此，胃病复发率很高；按本说明书所制得的抗体是可同时抑灭幽门杆菌和幽门球菌的新一代复合IgY，为解决胃病难于根治的问题开辟了一条新途径，将这种新型抗体加入奶或奶粉中，让人们在喝奶的过程轻松达到治疗胃病的目的，必将为千百万长期受胃病折腾的患者带来福音。经常食用含抗腹泻特异性IgY的奶或奶粉则可预防和治疗各种细菌性腹泻。经常食用含抗感冒和流感、禽流感特异性复合IgY的奶或奶粉，相当于在人体内增多了许多对抗感冒和流感、禽流感病毒的抗体；从而，大大提高抵抗感冒和流感的能力，一旦犯上感冒或流感，也会很快愈痊。更重要的是，流感病毒和禽流感病毒变异很快，流感、禽流感疫苗研制速度跟不上流感病毒、禽流感病毒的变异，使流感、禽流感疫苗效果成疑；而本发明根据流感病毒和禽流感病毒内存在保守区、而保守区不会变异的特点，采用病毒裂解蛋白抗原和制作HA2多肽蛋白抗原两种方法，解决了流感、禽流感病毒变异的难题；使所制成的免疫球蛋白抗体对流感、禽流感病毒抑制作用更强。同样，龋齿和牙周病是患病率最高的非传染性疾病，迄今并无有效的防治方法，将专门抑制龋齿和牙周病的抗体加入奶或奶粉中，人们就可在喝牛奶的同时又预防了蛀牙和牙周病。过敏症特别是哮喘给无数患者带来极大痛苦，目前所用的药物都是以各类激素为主的烈性药，副作用相当大；有了含抗过敏特异性IgY的奶或奶粉后，患者只要经常饮用这种奶饮料，就可获得抵制各种主要致敏原的侵袭的能力，避免鼻敏感、皮肤敏感甚至哮喘的发生。另外，各种急慢性咽喉炎以及鼻炎也是最常见疾病，特别是许多人长期受慢性咽炎或鼻炎的困扰；现在，只要喝含抗咽喉炎特异性IgY或抗鼻炎特异性IgY的奶或奶粉就可避免咽炎或鼻炎，既使已出现了咽炎或鼻炎也可显着减轻症状。以上所叙的多种IgY抗体还可以根据需要任意组合，制成综合多种不同功效的保健奶或奶粉(后面所叙的实施例3就是抗感冒特异性IgY和抗过敏特异性IgY以及抗咽喉炎特异性IgY三种不同IgY抗体组合的实例之一)。由于这种IgY抗体是从鸡蛋黄中提取的，是一种天然物质，大量试验已证明是没有任何毒副作用的安全食物，可以长期食用；因此，完全可将其加入奶或奶粉中制成各种具特效防治常见疾病功能的奶或奶粉，使人们在日常食用牛奶的过程中自然而然地增强免疫能力，并达到防治常见疾病的特殊效果；又避免了服用副作用很大的药物。这一点对于抵抗力较差的中老年人意义更大。另外，由于这些抗体都是专门针对人类相应的病原体采用高免疫特殊方法制得的高活性特异性免疫球蛋白，一般牛奶和牛初乳中并非都有这些抗体；既使有，其抗体并不是针对人之病原体的，抗体活性也低得多，实际上对导致婴幼儿或成人发生各种感染性疾病的人病原体抑制作用很差；因此，食用普通牛奶和牛初乳是完全不可能有饮用本发明的IgY免疫奶同样的效果的。

试验例1

采用常规方法培养大肠杆菌和沙门氏菌以及婴幼儿轮状病毒，先将大肠杆菌(2×109)、沙门氏菌(2×109)按1∶1比例混合，然后将所得细菌混合液以1∶1比例与轮状病毒再混合，然后加入福氏佐剂制作复合抗原。用这种抗原免疫鸡，并采用本说明书前叙方法制备含抗腹泻特异性IgY免疫奶粉。最后，以分别以大肠杆菌、沙门氏菌、婴幼儿轮状病毒作检测抗原，用常规「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)检测所制得的含抗腹泻特异性IgY免疫奶粉调配液和普通母乳对这三种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗腹泻特异性IgY免疫奶粉	母乳
	大肠杆菌	1∶2,048			1∶4
沙门氏菌			1∶2,048	1∶4
	轮状病毒	1∶4,096			0

(注：测试样本中的浓度均为1mg/ml)

从以上检测结果可以看出，采用本方案的免疫方法和制备技术制成的含抗腹泻特异性IgY的婴儿免疫奶粉调配液，对大肠杆菌、沙门氏菌以及轮状病毒等腹泻病原体有很高的抗体结合效价；反之，普通母奶对轮状病毒没有任何作用，对大肠杆菌和沙门氏菌虽然有一点点效价，但是跟我们所制备的含特异性IgY的婴儿免疫奶粉调配液相比，效果差得多。这也从一个方面解释了秋季腹泻发病率高居不下的原因。

试验例2

按本说明书第二部分特殊免疫奶粉的制备中致敏抗原制作方法制备致敏抗原，再按本发明方法制备含抗过敏特异性IgY免疫奶粉。然后分别以螨虫、蒿草花粉浸出液、豚草花粉浸出液以及法国梧桐花粉浸出液作为检测抗原，应用常规「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)逐一检测所制得的含抗过敏特异性IgY免疫奶粉调配液和母乳对这些抗原的抗体结合效价。检测结果为下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗过敏特异性IgY免疫奶粉	母乳
	螨虫	1∶1,024			1∶4
蒿草花粉浸出液			1∶1,024	0
	豚草花粉浸出液	1∶1,024			0
法国梧桐花粉浸出液			1∶1,024	0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从以上检测结果看出，采用本方案的方法制备的含抗过敏特异性IgY的婴儿免疫奶粉调配液对引致过敏的一系列常见致敏原都有很高的抗体结合效价，即具有很强的抑制作用，而母乳则只有少许抗体结合效价。

试验例3

按本说明书前述的方法制备引致感冒和流感、禽流感的致病病毒复合抗原，再制备含抗感冒和流感、禽流感病毒特异性复合IgY婴儿免疫奶粉。然后分别以血清型1A型鼻病毒，血清型229E型冠状病毒，血清型7型腺病毒以及H3N2、H5N1、H9N2作为检测抗原，应用常规「ELISA法」(酶联免疫吸附试验)逐一检测所制得的抗感冒病毒含特异性IgY婴儿免疫奶粉调配液和母乳对这些病原体的抗体结合效价。检测结果为下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗感冒病毒受体特异性IgY的婴儿免疫奶粉	母乳
	1A型鼻病毒	1∶1,024			64
229E型冠状病毒			1∶2,048	32
	7型腺病毒	1∶2,048			16
H3N2			1∶1,024	0
	H5N1	1∶1024			0
H9N2			1∶1024	0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从以上试验结果看出，采用本方案的方法制备的含抗感冒病毒受体特异IgY的婴儿免疫奶粉调配液对引致普通感冒的有代表性的主要鼻病毒、冠状病毒和腺病毒以及流感病毒、禽流感病毒都具有较强的抑制作用，完全达到预期的效果。母乳对感冒病毒虽有少量抗体结合效价；但是，效价比含特异性抗体的婴儿免疫奶粉调配液低得多。而母乳对流感、禽流感病毒则没有抗体结合效价，即母乳对流感、禽流感病毒没有抑制作用。试验结果证明给婴幼儿喂食婴儿免疫奶粉调配液可达到十分理想的抵御感冒和流感病毒侵袭的效果。

试验例4

采用本说明书所叙方法制作咽喉炎抗原，然后制备含抗咽喉炎特异性IgY免疫奶粉。再分别以肺炎双球菌、A型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌作为检测抗原，检测所制得的IgY免疫奶粉调配液和普通奶粉调配液对这些有代表性的引致咽喉炎的细菌的抗体结合效价。结果如下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗咽喉炎特异性免疫奶粉	普通奶粉
	肺炎双球菌	1∶2.048			0
A型溶血性链球菌			1∶4,096	0
	金黄色葡萄球菌	1∶4,096			0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从上表看出，采用本方案的方法制备的含抗咽喉炎特异性IgY的免疫奶粉调配液，对引起咽喉感染常见致病菌有理想的抗体结合效价；反之，普通奶粉的调配液则完全没有抗体结合效价，显示普通奶粉对咽喉炎根本没有作用，两者有很大差别。

试验例5

采用本说明书所叙方法制作幽门杆菌和幽门球菌复合抗原，然后制备含抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY免疫奶粉。再分别以幽门杆菌、幽门球菌作为检测抗原，检测所制得的IgY免疫奶粉调配液和普通奶粉调配液对幽门杆菌和幽门球菌的抗体结合效价。结果如下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗幽门杆菌和幽门球菌特异性IgY免疫奶粉	普通奶粉
	幽门杆菌	1∶4,096			0
幽门球菌			1∶4,096	0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从上表看出，采用本方案的方法所制备的含抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY的免疫奶粉之调配液，对引起胃病的幽门菌有很高的抗体结合效价；反之，普通奶粉调配液对这些致病菌则完全没有抗体结合效价，显示普通奶粉对胃病根本没有作用，两者有很大差别。

试验例6

采用本说明书所叙方法制作龋齿和牙周病抗原，然后制备含抗龋齿和牙周病特异性IgY免疫奶粉。再分别以变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、粘性放线菌、放线共生放线菌、CO₂噬杆菌作为检测抗原，检测所制得的IgY免疫奶粉调配液和母乳对这些有代表性的引致口腔疾病的细菌的抗体结合效价。

结果如下表

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗龋齿和牙周病特异性IgY免疫奶粉	母乳
	变形链球菌	1∶2,048			0
牙龈卟啉单胞菌			1∶2,048	0
	具核梭杆菌	1∶2,048			0
粘性放线菌			1∶2,048	0
	放线共生放线菌	1∶2,048			0
CO2噬杆菌			1∶2,048	0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从上表看出，采用本方案的方法制备的含抗龋齿和牙周病特异性IgY免疫奶粉调配液，对引起龋齿和牙周病的致病菌有理想的抗体结合效价；反之，母乳则完全没有抗体结合效价，显示母乳对龋齿和牙周病并没有作用，两者有很大差别。这也说明了为什么儿童中龋齿患病率高达90％，幼儿中“奶瓶蛀牙”那么多的原因。

试验例7

采用本说明书所叙方法分别制作引致鼻炎的细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原，然后制备含抗鼻炎特异性复合IgY免疫奶粉。再分别以有代表性致病细菌、致病真菌、致病病毒作为检测抗原，检测所制得的含抗鼻炎特异性复合IgY免疫奶粉调配液和普通奶粉调配液的抗体结合效价。结果如下表：

检测用抗原	抗体结合效价
			含抗鼻炎特异性复合IgY免疫奶粉	普通奶粉
	A簇B型溶血性链球菌	1∶2,048			0
肺炎双球菌			1∶2,048	0
	流感杆菌	1∶1,024			0
金黄色葡萄球菌			1∶2,048	0
	白色念珠菌	1∶1,024			0
烟曲霉菌			1∶1,024	0
	黑曲霉菌	1∶1,024			0
5型鼻病毒			1∶2,048	0

229E型冠状病毒

1∶2,048

0

(注：测试样本的浓度均为1mg/ml)

从检测结果可以看出，采用本方案的方法所制得的含抗鼻炎特异性复合IgY的免疫奶粉调配液无论对引致鼻炎的常见的病毒，还是常见的致病菌，或者常见的几种真菌都有理想的抗体结合效价，表明有很好的抑制效果。反之，普通奶粉调配液对这些病原体则完全没有抗体结合效价，显示喝普通奶粉调配的奶水对鼻炎的改善毫无帮助，两者比较有很大差别。

试验例8

含抗婴幼儿轮状病毒IgY的免疫奶粉治疗婴幼儿秋季腹泻临床效果观察

1.观察对象：

二岁以下婴幼儿，病程三天内，临床诊断为秋季腹泻并经粪便ELISA检测为婴幼儿轮状病毒抗原阳性者。共218例，随机分成IgY免疫奶粉组104例(71男，33女)，常规药物对照组114例(87男，27女)

2.观察方法：

2.1IgY免疫奶粉组服含抗婴幼儿轮状病毒IgY的免疫奶粉调配液，一日3次。

2.2常规药物对照组则应用一至数种药物，如干扰素、病毒唑、思密达、丽珠肠乐、丁胺卡那霉素、头疱哌酮等。

2.3两组进行补液治疗，纠中脱水，调整酸碱平衡。有营养不良者给予支持疗法。

2.4列入观察的患儿均采集新鲜粪便做常规化验轮状病毒ELISA检测确认，必要时检测电解质。血气分析，详细询问病史及体格检查，填写临床观察表。

3.疗效判断标准：

3.1治愈：

每日粪便次数≤2或次数恢复到正常次数，粪便性状恢复正常，临床症状完全消失，计算至第4天。

3.2无效：

经过4天治疗后，腹泻次数虽有减少但仍＞2次或性状无明显好转，甚至病情加重。

4.临床观察结果：

4.1两组住院时发病天数见表1

          两组入院时发病天数(例数)比较

组别	1天	2天	3天	4天
					IgY免疫奶粉组对照组	2131	3541	4842	104114

4.2临床表现见表2

                      两组入院时临床症状(例数)比较

组别	1天		2天		3天		4天
										大便次数		体温		呕吐		脱水
	＜10/d	≥10/d	正常	发热	有	无	无	轻～中	重
										IgY免疫奶粉组对照组	5860	4654	2319	8195	6856	3658	17	101106	21
X2P	0.22＞0.05		1.04＞0.05		5.86＜0.05		2.79＞0.05

4.3治疗效果

IgY免疫奶粉组治愈91例，常规药物治疗组则(对照组)治愈71例。两组治疗效果比较见下表：

                                                              两组治疗效果比较

	1天				2天				3天				4天
																	IgY组		对照组		IgY组		对照组		IgY组		对照组		IgY组		对照组
	n	％	n	％	n	％	n	％	n	％	n	％	n	％	n	％
																	治愈未愈	174	80.9519.05	1813	58.0641.94	287	80.020.0	2219	53.6646.34	462	95.834.17	3111	73.8126.19	9113	87.512.5	7143	62.2837.72
X2	2.03				5.82				7.10				18.12

P

＞0.05

＜0.05

＜0.01

＜0.01

平均止泻天数，IgY免疫奶粉组(2.98±1.41)对照组(4.19±1.52)，经统计学处理n＝6.10，P＜0.01，两组差异有非常显着意义。

临床试验表明，让婴幼儿食用含抗婴幼儿轮状病毒特异性IgY的免疫奶粉确实使婴幼儿获得了被动免疫保护，又免除了打针吃药之苦；而且，效果十分显着，治疗总有效率和平均止泻天数均明显优于对照组。

实施例1用干粉混合法制备9,000g IgY抗体婴儿免疫奶粉

1.先按普通方法制备营养成份齐全含各种脱脂奶、维生素、氨基酸、双歧杆菌等的优质普通婴幼儿奶粉8,991g，并经巴氏消毒。

2.将按本说明书所叙方法制得的抗腹泻特异性IgY干粉，抗过敏特异性IgY干粉，抗感冒特异性IgY干粉，抗龋齿特异性IgY干粉；各取2.25g充分混合均匀，制成复合IgY抗体混合粉。

3.用等量放大匀化法将所制得的IgY抗体混合物加入已制好的优质普通婴幼儿奶粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀。

4.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例2用液态混合法制备9,000g IgY抗体婴儿免疫奶粉

1.先按普通方法制备营养成份齐全含各种脱脂奶、维生素、氨基酸、双歧杆菌等的优质普通婴幼儿奶水，并经巴氏消毒。

2.将按本说明书所叙方法制得的未经冷冻干燥的以下IgY浆料：抗腹泻特异性IgY浆料，抗过敏特异性IgY浆料，抗感冒特异性IgY浆料，抗龋齿特异性IgY浆料；按1∶1∶1∶1比例充分混合均匀，得到IgY抗体混合浆料。

3.将所制得的IgY抗体混合浆料加入已制好的优质普通婴幼儿奶水中，置入搅拌机充分搅拌均匀。

4.采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)。即制成含相当母乳抗体之免疫球蛋白的、最接近母乳的婴儿免疫奶粉。

5.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例3用干粉混合法制作90,000g抗胃病保健奶粉

1.先按普通方法制备营养成份丰富的优质普通奶粉计89,910g，并经巴氏消毒。

2.按本说明书所叙方法制备抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY共90g。

3.用等量放大匀化法将所制得的复合IgY抗体90g加入89,910g的优质普通奶粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀。即制成含抗幽门杆菌和幽门球菌免疫球蛋白IgY的、可防治胃病的保健奶粉。

4.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例4用液态混合法制作90,000g抗胃病保健奶粉

1.先按普通方法制备营养成份丰富的优质普通奶水，并经巴氏消毒。

2.按本说明书所叙方法制备未经冷冻干燥的抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY浆料。

3.将所制得的复合IgY抗体浆料按千分之一比例加入优质普通奶水中，置入搅拌机搅拌均匀。

4.采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)。即制成含抗幽门杆菌和幽门球菌免疫球蛋白IgY的、可防治胃病的保健奶粉。

5.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例5用干粉混合法制备抗呼吸道感染和过敏保健奶粉

1.先按说明书所叙方法制备以下三种IgY抗体：

抗感冒和流感、禽流感病毒特异性IgY-30g，

抗过敏特异性IgY-30g，

抗咽喉炎特异性IgY-30g，

然后将以上三种抗体干粉充分混合。

2.按常规方法制作营养成份丰富的优质普通奶粉89,910g。

3.用等量放大匀化法将步骤一所制得的IgY混合抗体90g加入89,910g的优质普通奶粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀。即制成含抗感冒和流感、禽流感免疫球蛋白IgY以及抗过敏免疫球蛋白IgY的、可防治呼吸道感染和过敏的保健奶粉。

4.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例6用液态混合法制备抗呼吸道感染和过敏保健奶粉

1.先按说明书所叙方法制备以下三种IgY抗体浆料：抗感冒和流感、禽流感特异性IgY浆料，抗过敏特异性IgY浆料，抗咽喉炎特异性IgY浆料；然后将以上三种抗体浆料按1∶1∶1比例充分混合均匀。

2.按常规方法制作营养成份丰富的优质普通奶粉水。

3.用等量放大匀化法将步骤4.6.1所制得的IgY混合抗体浆料按千分之一的比例加入优质普通奶水中，要在搅拌机中充分搅拌均匀。

4.采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)。即制成含抗感冒和流感、禽流感病毒免疫球蛋白IgY以及抗过敏免疫球蛋白IgY的、可防治呼吸道感染和过敏的保健奶粉。

5.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例7用干粉混合法制备抗龋齿和牙周病保健奶粉

1.先按普通方法制备营养成份丰富的优质普通奶粉89,910g，并经巴氏消毒。

2.按本说明书所叙方法制备抗龋齿和牙周病特异性复合IgY计90g。

3.用等量放大匀化法将所制得的IgY抗体90g加入89,910g的优质普通奶粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀。即制成可防治龋齿和牙周病的保健奶粉。

4.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例8用液态混合法制备抗龋齿和牙周病保健奶粉

1.先按普通方法制备营养成份丰富的优质普通奶水，并经巴氏消毒。

2.按本说明书所叙方法制备未经冷冻干燥的抗龋齿和牙周病特异性IgY浆料。

3.将所制得的IgY抗体浆料按千分之一比例加入优质普通奶水中，置入搅拌机中充分搅拌均匀。

4.用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)。即制成可防治龋齿和牙周病的保健奶粉。

5.包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例9用干粉混合法制备抗咽喉炎和鼻炎保健奶粉

1.先按说明书所叙方法制备以下二种IgY抗体干粉：

抗鼻炎特异性IgY干粉-45g，

抗咽喉炎特异性IgY干粉-45g，

将以上二种抗体干粉充分混合。

2.按常规方法制作营养成份丰富的优质普通奶粉89,910g。

3.用等量放大匀化法将步骤一所制得的IgY混合抗体90g加入89,910g的优质普通奶粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀。即制成含抗鼻炎和咽喉炎复合免疫球蛋白IgY的、可防治鼻炎和咽喉炎的保健奶粉。

4.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

实施例10用液态混合法制备抗鼻炎和咽喉炎保健奶粉

1.先按说明书所叙方法制备以下二种IgY抗体浆料：抗鼻炎特异性IgY浆料，抗咽喉炎特异性IgY浆料；将以上二种抗体浆料按1∶1比例充分混合均匀

2.按常规方法制作营养成份丰富的优质普通奶粉水。

3.将步骤4.10.1所制得的IgY混合抗体浆料按千分之一的比例加入优质普通奶水中，要在搅拌机中充分搅拌均匀。

4.采用60-85℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)。即制成含抗感冒免疫球蛋白IgY和过敏免疫球蛋白IgY的、可防治胃感冒和过敏的保健奶粉。

5.在包装机上包装出厂。

生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。

Claims (10)

1、一种制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S1)全面分析母乳抗体构成选择相对应的病原体并研究确定最常见的感染性疾病之病原体；

(S2)培养相应的病毒和/或细菌；

(S3)利用所培养的病毒和/或细菌，制备相应的复合抗原；

(S4)利用所述复合抗原，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋；

(S5)取所述免疫蛋的蛋黄，制备相应的特异性IgY粗提物；

(S6)对所述特异性IgY粗提物进行纯化，再进行过滤处理以滤除各种细菌和病毒，得到相应的特异性IgY成品；

(S7)取所述特异性IgY成品按适当比例与奶粉原料混合，制成相应的免疫奶或奶粉。

2、根据权利要求1所述的制备免疫奶粉的方法，其特征在于，所述免疫奶或奶粉为婴儿免疫奶或奶粉；

在所述步骤(S1)中，选定以下一种或多种病毒和/或细菌：

引起腹泻的大肠杆菌、沙门氏菌、婴幼儿轮状病毒，

引起过敏和哮喘的尘螨，

引起感冒的鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等感冒病毒，

以及，引起龋齿的变形链球菌；

所述感冒病毒包括代表性的1A、2、5、14、23、29、31七种血清型鼻病毒，229E、OC43两型的冠状病毒，以及7、3、4三种型的腺病毒。

3、根据权利要求2所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，在所述步骤(S2)中，针对感冒病毒，

按以下步骤培养所述七种血清型鼻病毒：将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将血清型1A、2、5、14、23、29、31共7种鼻病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时，将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这7种培养的鼻病毒；

按以下步骤培养所述两种血清型冠状病毒：将Vero E6细胞接种于10％FCSDMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将血清型229E、OC43型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时，将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这2种培养的冠状病毒；

并按以下步骤培养三种血清型腺病毒：将人胚肺二倍体细胞接种于10％FCSDMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml；将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和培养箱中培养成单层细胞；然后弃掉培养液，将血清型7型、3型和4型腺病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100TCID 50/ml；取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24-48小时后，待细胞病变达++++时分别收获病毒；收获病毒时，将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15,000rpm转速离心分离，收集上清；再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这3种培养的腺病毒。

4、根据权利要求3所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，在所述步骤(S3)中，

按以下步骤制备腹泻复合抗原：将培养好的大肠杆菌(2×109/ml)和沙门氏菌(2×109/ml)按1-10∶10-1比例混合；再将这两种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒液按10-1∶1-10比例混合；将所制得的腹泻抗原混合液，充分混和均匀，然后按10-1∶1-10比例加入福氏佐剂；再置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得腹泻复合抗原；

和/或按以下步骤制备致敏抗原：将培养好的螨虫用超声粉碎后按10-1∶1-10比例与福氏佐剂混合，然后加入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成致敏抗原；

和/或按以下步骤制备感冒复合抗原：将培养好的血清型1A型鼻病毒、2型鼻病毒、5型鼻病毒、14型鼻病毒、23型鼻病毒、29型鼻病毒、31型鼻病毒按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成鼻病毒混和物；将培养好的血清型229E型冠状病毒和OC43型冠状病毒按1-10∶1-10的比例混合制成冠状病毒混和物；将培养好的血清型7型、3型和4型腺病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合制成腺病毒混和物；然后将分别制成的鼻病毒混和物、冠状病毒混和物、以及腺病毒混和物按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，制成普通感冒病原体混合物；将制成的普通感冒病原体混合物按1-10∶1-10的比例与福氏佐剂混匀；然后加入高速匀浆机中以8,000-30,000rpm转速进行高速粉碎匀化，形成油包水乳液，即制成普通感冒(Common Cold)致病病毒的复合抗原；

和/或按以下步骤制备龋齿抗原：将培养好的变形链球菌(2×109/ml)按10-1∶1-10比例与福氏佐剂混合；然后置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制成龋齿抗原。

5、根据权利要求4所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，

在所述步骤(S4)中，制得抗腹泻免疫蛋、抗过敏免疫蛋、抗感冒免疫蛋、抗龋齿免疫蛋这四种免疫蛋中的一种或多种；

在所述步骤(S5)中，制得抗腹泻特异性IgY、抗过敏细菌特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY这四种特异性IgY粗提物中的一种或多种；

在所述步骤(S6)中，制得抗腹泻特异IgY、抗过敏特异性IgY、抗感冒特异性IgY、以及抗龋齿特异性IgY这四种特异性IgY成品中的一种或多种。

6、根据权利要求1所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，所述免疫奶粉为普通免疫奶或奶粉；

在所述步骤(S1)中，选定以下一种或多种病毒和/或细菌以及致敏原：(1)幽门杆菌和幽门球菌，(2)引起腹泻的大肠杆菌和沙门氏菌，(3)感冒和流感、禽流感病毒，(4)引起龋齿和牙周病的病毒和/或细菌，(5)引起哮喘和过敏的尘螨以及若干种致敏花粉浸出液或萃取剂，(6)引起咽喉炎的金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、溶血性链球菌，(7)引起鼻炎的细菌、真菌和病毒；

在所述步骤(S3)中，制备以下一种或多种抗原：(1)幽门杆菌和幽门球菌复合抗原，(2)腹泻抗原，(3)感冒和流感、禽流感抗原，(4)龋齿和牙周病抗原，(5)致敏抗原，(6)咽喉炎抗原，(7)鼻炎抗原。

7、根据权利要求6所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，为制备流感、禽流感抗原，

在所述步骤(S1)中，选定A型流感病毒H3N2株、H1N1株、H2N2株、禽流感病毒H5N1和H9N2，B型流感病毒B-Vactoria株；

在所述步骤(S2)中，将步骤(S1)中所述病毒株采用常规鸡胚尿囊法，分别在鸡胚尿囊中培养；收取含有病毒的尿囊液，然后以鸡红细胞法粗提；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化，得到所需病毒；

在所述步骤(S3)中，即可不进行裂解处理，也可对步骤(S1)中所述病毒进行裂解处理：分别取所述提纯的各种病毒分别加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即分别得到上述各种病毒裂解液；经SDS-PAGE检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。

8、根据权利要求7所述的制备免疫奶或奶粉的方法，其特征在于，

在所述步骤(S4)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌免疫蛋，抗腹泻免疫蛋，抗感冒和流感、禽流感免疫蛋，抗龋齿和牙周病免疫蛋，抗过敏免疫蛋，抗咽喉炎免疫蛋，抗鼻炎免疫蛋这七种免疫蛋中的一种或多种；

在所述步骤(S5)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物、抗腹泻特异性IgY粗提物、抗感冒和流感特异性复合IgY粗提物、抗龋齿和牙周病特异性IgY粗提物、抗过敏特异性IgY粗提物、抗咽喉炎特异性IgY粗提物、抗鼻炎特异性复合IgY粗提物这七种特异性IgY粗提物中的一种或多种；

在所述步骤(S6)中，制得抗幽门杆菌和幽门球菌特异性复合IgY成品、抗腹泻特异性IgY成品、抗感冒和流感特异性复合IgY成品、抗龋齿和牙周病特异性IgY成品、抗过敏特异性IgY成品、抗咽喉炎特异性IgY成品、抗鼻炎特异性复合IgY成品这七种特异性IgY成品中的一种或多种。

9、根据权利要求1-8中任一项所述的制备免疫奶粉的方法，其特征在于，在所述步骤(S7)中，取通过前述步骤所制得特异性IgY成品干粉的中的一种或多种，用干粉混合机充分搅拌后得到IgY复合抗体干粉；再把这种IgY复合抗体粉以适当比例添加到婴儿免疫奶粉或成人免疫奶粉中，采取等量放大匀化法用干粉搅拌机充分混和匀化，即制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶粉或普通免疫奶粉。

10、根据权利要求1-8中任一项所述的制备免疫或奶粉的方法，其特征在于，在所述步骤(S7)中，取通过前述步骤所制得特异性IgY成品液体的中的一种或多种，制成特异性IgY混合液体；然后按一定比例与鲜奶汁混合，置入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶或普通免疫奶；再用60-85℃温度进行喷雾干燥，即可制成含相应抗体免疫球蛋白的婴儿免疫奶粉或普通免疫奶粉。