CN1942205A

CN1942205A - 可经粘膜和经皮给予的抗原药物媒介物、使用该媒介物的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗和dds

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Publication number: CN1942205A
Application number: CNA2005800120996A
Authority: CN
Inventors: 木户博; 水野大
Original assignee: University of Tokushima NUC
Current assignee: University of Tokushima NUC
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2007-04-04
Anticipated expiration: 2025-03-22
Also published as: JP4843792B2; CN1942205B; US20070141073A1; WO2005097182A1; RU2396090C2; CA2579710A1; EP1738765A1; US8268321B2; KR20070017348A; BRPI0508792A; CA2579710C; EP1738765B1; KR100992492B1; EP1738765A4; RU2006138182A; JPWO2005097182A1

Abstract

本发明涉及优先而且有选择地产生抗原特异的分泌型IgA抗体、发挥诱导局部免疫或粘膜免疫功能的抗原药物媒介物(AD媒介物)、以及使用该AD媒介物的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗、变态反应的预防和治疗剂。以及使用上述媒介物的经粘膜和经皮DDS。

Description

可经粘膜和经皮给予的抗原药物媒介物、使用该媒介物的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗和DDS

技术领域

本发明涉及到可经粘膜和经皮给予的抗原药物媒介物，更详细讲，涉及到以在所期望的抗原和药物中使用该媒介物为特征的使抗原特异的分泌型免疫球蛋白A优先而且有效地、特别是有选择地产生的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗、变态反应的预防和治疗、以及药物释放系统(Drug Delivery System)。

背景技术

已知在以往的灭活疫苗和类毒素等中存在如下缺点：

(1)在自然感染部位缺乏感染预防

与疫苗接种部位是皮下、肌肉内等部位相反，细菌和病毒等自然感染部位却是例如鼻腔、呼吸道、肠道等粘膜，与上述接种部位不同。有望通过切合自然感染的实际状态的接种部位防御感染、特别是通过经由粘膜给予疫苗在粘膜实现防御感染。

(2)低的粘膜免疫性

在接种疫苗者中，血中主要产生免疫球蛋白G(以下略记为“IgG”或“IgG抗体”)，诱导体液免疫。然而，担负粘膜免疫的免疫球蛋白A(以下略记为“IgA”或“IgA抗体”)几乎不产生，不能期待粘膜免疫的建立。而IgA抗体的必要性和有效性如下：IgA抗体担负经由飞沫和空气对鼻腔、呼吸道等呼吸器官感染的防御，以及在经口对肠道感染的门户的粘膜中的感染防御、即粘膜免疫，在临床免疫上起着极其重要的作用。另外IgG抗体对抗原的特异性高、感染防御谱窄，对于抗原变异的病原体的感染防御几乎无效，与IgG抗体相反，IgA抗体由于具有交叉免疫性、即交叉中和活性，比IgG感染防御谱的幅度宽，还能防御变异抗原的感染。

(3)追加接种的必要性和重复费用

由于仅初次免疫的一次接种产生的IgG抗体低，不能期望有确实的效果，所以根据一次接种后的IgG抗体保存状况，有必要通过一次以上的追加接种、即所谓的促升接种提高血中IgG抗体效价。因此，在反复消耗经费和劳力后，在具有促升接种机会的高龄者、成人和学童中看到了效果，但在容易失去这样机会的低年龄、特别是2岁以下的婴幼儿中偶尔看到没有效果的个案。

关于以上现象，如果换句话说，现有的灭活疫苗和类毒素等在被接种者中主要诱导血中IgG抗体的产生，具有提高体液免疫的作用效果，其有效性已被确认。然而，由于IgA抗体产生或粘膜免疫的诱导能力低，所以在充分防御自然感染的功能和效果上存在局限。根据这样的现状，为了消除现有疫苗的缺点，目前从各种各样的侧面进行了很多尝试。例如，疫苗抗原质的或量的改良、取代灭活疫苗试做活疫苗、新的接种部位和粘膜疫苗等开发、引起体液免疫的高进和持续的佐剂的筛选、粘膜免疫佐剂的开发中特定的试行等等。然而安全而有效的粘膜疫苗的开发还没有完成。

以下，就粘膜疫苗的开发进行说明。

(1)增加疫苗抗原的量

增加皮下或肌肉内接种的疫苗抗原的量，进行使分泌到粘膜的IgG和IgA抗体量增加的尝试。例如，尝试在现有的灭活流感疫苗中添加混合该病毒膜蛋白神经氨酸苷酶，使抗体产量增加，或添加混合作为佐剂的MF59的方法等。然而，尝试中出现了产生疼痛、副反应增强等不妥当的现象。

(2)经鼻给予型疫苗

为了使用认为最有效的IgA抗体防御感染，尝试了经鼻直接接种液体状的断裂抗原的方法，但需要指出的是IgA产量低。因此为了提高IgA抗体产生能力，进行了在断裂抗原中添加混合作为佐剂的大肠菌易热活毒素或霍乱毒素，提高粘膜免疫应答，即IgA抗体产生能力的尝试，但由于现状是作为佐剂的毒素的安全性没有保证，所以中止了治疗检验，没有达到实用化。

(3)使用可鼻腔内接种的低温驯化株的活疫苗

虽然将增殖的最适温度是25℃，而在39℃几乎不增殖的低温驯化流感病毒株接种在鼻腔内的方法已经实用化，但低温驯化亲本株的减毒的机理并不清楚，不能否定毒性恢复的危险性。另外，由于疫苗的有效成分为活的病毒，所以向细胞内的侵入力强，对于初期免疫非常好，但由于轻度的流感症状时有发生，发现存在着对于一旦感染流感就容易重症化的高危病人和高龄者等不能使用等缺点。

(4)其它疫苗

虽然以痘苗病毒作为病毒载体的载体疫苗和通过逆向遗传学做成减毒活疫苗、以及作为有效成分使用DNA或cDNA本身的DNA疫苗等的开发正在进行实验，但还没有达到实用化。

以下就免疫佐剂的开发进行说明。

(1)免疫佐剂

免疫佐剂是具有强化和抑制免疫应答等调节活性的物质的总称，大致分为以抗原在被接种体内缓释和贮留等为目的的与给予方式有关的物质和用于谋求使免疫应答高进和抑制等两类物质。这两类物质中，前者作为以给予方式为目的的佐剂，例如使用磷酸铝、明矾等的疫苗和类毒素已实用化。然而，后者以谋求强化·高进免疫应答为目的的佐剂的实用化还是未知数。例如，来自细菌的BCG活菌、BCG-CWS、内毒素、葡聚糖等、合成的MDP、左旋咪唑、聚I-聚C、乌苯美司等以及细胞因子类的干扰素、TNF、CSF等虽已众所周知，但由于关节炎、类风湿性关节炎、高γ球蛋白血症、贫血等的佐剂病因效果不理想等理由，认为对于这些制剂等的实用化必须要有安全性和有效性的保证。另外，为了谋求进一步强化体液免疫的诱导，作为佐剂使用来自高等动物的肺表面活性剂·蛋白质的技术(专利文献1)虽已众所周知，但其实用化还是未知数。

(2)粘膜免疫用佐剂的开发

已开发了例如百日咳毒素B寡聚物(专利文献2)、霍乱毒素(专利文献3)、大肠菌的易热性肠毒素B亚基LTB(专利文献4)、淀粉粒子(专利文献5)、肠毒素B链蛋白质CTB(专利文献6)、Vero细胞毒素1的B亚基(专利文献7)、寡核苷酸(专利文献8)、白介素12(非专利文献1)等各种各样的佐剂，但还没有达到实用化。

如上所述，对于由接种到皮下和肌肉内等的现有疫苗转换为在作为病毒的自然感染部位(root)的粘膜中诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗的必要性已被广泛而且深刻地认识到了。特别是作为21世纪的次世代疫苗，全世界都期待着诱导IgA抗体产生、局部免疫或粘膜免疫的所谓粘膜疫苗的开发和实用化，但还没有实现。认为其的理由在于为了将诱导IgA抗体产生、局部免疫乃至粘膜免疫的功能赋予疫苗的安全而且有效的佐剂还没有特定和确立。

专利文献1：特表2002-521460号公报

专利文献2：特开平3-135923号公报

专利文献3：特表平10-500102号公报

专利文献4：特表2001-523729号公报

专利文献5：特表2002-50452号公报

专利文献6：特开2003-116385号公报

专利文献7：特开2003-50452号公报

专利文献8：PCT公表WO 00/20039号小册子

非专利文献1：Infection and Immunity、第71卷、4780-4788页、2003年

非专利文献2：Journal of neonatal Nursing、第10卷、2-11页、2004年

非专利文献3：Biology of the Neonate、第74卷(suppl 1)、9-14页、1998年

非专利文献4：American Journal of Respiratory Cell andMolecular Biology、第24卷、452-458页、2001年

发明内容

本申请书课题如下。即赋予现有的灭活疫苗和类毒素等诱导IgA抗体产生、局部免疫或粘膜免疫的功能。为此目的的安全而且有效的技术的开发。从现有体液免疫疫苗向安全而且有效的粘膜免疫疫苗的变换。还有变态反应的予防和治疗、以及经由粘膜和皮肤给予而且输送药物的经粘膜·经皮药物释放系统(以下略记为“DDS”)的确立。

作为上述课题的解决手段，本发明提供可经粘膜给予和经皮给予的抗原药物媒介物、以将该媒介物在所期望的抗原和药物中使用为特征的、优先而且有效、特别是有选择地使抗原特异的分泌型免疫球蛋白A产生的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗、变态反应的予防和治疗剂、以及经粘膜·经皮DDS。

由于本发明提供的抗原药物媒介物的适用·通用，导致针对各种各样感染症的粘膜疫苗、变态反应的予防和治疗剂以及经粘膜·经皮DDS的实现和普及。粘膜疫苗由于是切合自然感染的实际状态的免疫手段，与现有疫苗相比，可发挥显著优越的防御感染效果。另外，抗原药物媒介物诱导的鼻腔粘膜IgA导致该处的变应原的失活，有可能减少致敏。另外对于各种各样的药剂适用该DDS可以强化而且促进通过药物经粘膜给予和经皮给予产生的予防·治疗效果。其结果使得本发明在使全人类的医疗·保健·卫生极大提高的同时，给世界的医疗·保健·卫生领域的从事者带来待望的福音。总之，可赋予现有和未来的包括疫苗和类毒素等在内的生物学制剂、以及各种各样的药物附加广泛、与注射相比更简便的可经粘膜给予和经皮给予的功能和性能的手段。

附图简单说明

图1表示各种经鼻给予流感疫苗的鼻腔(a)、肺泡(b)、皮下注射给予流感疫苗的鼻腔(c)、肺泡(d)的抑制流感病毒感染的效果。*表示通过t检定给出的单独给予疫苗(无AD媒介物或佐剂)组之间的有意义水平(p＜0.01)。(实施例1)

图2表示经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗引起的鼻腔清洗液中产生的抗流感抗体IgA和IgG量。白棒表示IgA量、黑棒表示IgG量。(实施例2)

图3表示佐剂对经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗引起的肺清洗液中抗流感特异抗体IgA和IgG产生的影响。(实施例3)

图4表示PSF-2、CTB对经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗引起的血中抗流感抗体特异抗体产生的影响。(实施例4)

图5表示PSF-2、CTB对经鼻给予流感疫苗引起的鼻腔(a)、肺泡(b)粘膜中的TGF-β1分泌水平的影响。(实施例6)

图6表示PSF-2、CTB对经鼻给予流感疫苗引起的鼻腔(a)、肺泡(b)以及血液中(c)中的抗流感特异抗体产生的影响。(实施例7)

图7表示SPF-2、CTB对经鼻给予流感疫苗引起的鼻、肺和脾脏的淋巴细胞分泌的各种细胞因子的影响。(实施例8)

图8表示PSF-3对经鼻给予流感疫苗引起的鼻腔(a)、肺泡(b)以及血液中(c)抗流感特异抗体产生的影响。(实施例9)

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行详细说明。

1.用语和抗原药物媒介物构成成分的说明

(1)抗原药物媒介物

该媒介物(Antigen and Drug Vehicle，以下略记为“AD媒介物”或“ADV”)是被设计成抗原或药物等能够经粘膜给予和经皮给予的脂质和蛋白质的复合物(Complex)。AD媒介物包含以下的(a)～(c)。

(a)肺表面活性剂蛋白B或其片段(不只包括通过蛋白质水解酶作用得到的天然片段，也包括通过基因工程和肽合成得到的人工片段、构成这样的片段的一个以上的氨基酸被置换和/缺失的突变片段等等)。

(b)肺表面活性剂蛋白C或其片段(不只包括通过蛋白质水解酶作用得到的天然片段，也包括通过基因工程和肽合成得到的人工片段、构成这样的片段的一个以上的氨基酸被置换和/缺失的突变片段等等)。

(c)磷脂和脂肪酸等脂质。其形状结构是在表面含有棘状或穗状的多肽链的膜状(片状或卷状的脂质膜)，使多个多肽链的疏水区末端嵌入到脂质膜插成了穗状的形状，与以往的脂质小泡(脂质体)不同。

如果使所期望的抗原或药物等与本发明的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、吸附或结合(搭载)，这样的抗原或药物有可能经粘膜给予和经皮给予。换言之，该媒介物是抗原和药物有可能经粘膜给予和经皮给予的该抗原和药物的交通工具。

另外，有关AD媒介物的构成成分、在该媒介物的制备·制造中使用的蛋白质、多肽或肽和脂质，即肺表面活性剂蛋白质B和C、它们的片段、这样片段肽中的至少一个氨基酸被置换和/缺失的突变片段等等，以及磷脂、脂肪酸等脂质的详细说明如后面所述。

(2)肺表面活性剂

肺表面活性剂在呼吸窘迫综合征(RDS：Respiratory DistressSyndrome)的治疗中从1990年代中期开始实用化，现在来自人、牛、猪等的各式各样的制剂已广泛销售、实用化(非专利文献2)。另外，与RDS治疗有关的含有活性结构域的合成肽制剂也有销售，而且SP-B和SP-C类似物的设计开发和合成也在进行中(非专利文献3)。肺表面活性剂的组成和构成如下：是由约90％的脂质(磷脂酰胆碱67.3％、磷脂酰甘油19.3％、磷脂酰丝氨酸3.2％、其它游离脂肪酸等)和约10％的蛋白质(表面活性剂蛋白质A、B、C和D；以下分别略记为“SP-A”、“SP-B”、“SP-C”和“SP-D”)构成的复合物。分子量：SP-A为28-36kDa、B为15kDa、C为3.5kDa、D为43kDa。SP-A和D为亲水性(水溶性)而且是类凝集素(膜结合性)。SP-B和C疏水性(脂溶性)而且是脂质结合性，对磷脂膜具有嵌入能力和表面活性作用。来自人、牛、猪等的肺表面活性剂蛋白基因众所周知，例如、GenBank/NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov./)中的人SP-B基因DNA的全长碱基序列的编号是J02761、人SP-C(和SP-C1)的编号是J03890。以下给出了由该NCBI得到的人SP-B和C的编码区(CDR)和该编码区编码的氨基酸序列。

1号序列：人SP-B基因DNA的CDR碱基序列；

2号序列：由1号序列破译的人SP-B全长氨基酸序列；

3号序列：人SP-C基因DNA的CDR碱基序列；

4号序列：由3号序列破译的人SP-C全长氨基酸序列；

5号序列：占据在人SP-C基因DNA上的SP-C1的CDR碱基序列；和

6号序列：由5号序列破译的人SP-C1全长氨基酸序列。

(3)本发明中使用的蛋白质或肽

在本发明涉及到的抗原药物媒介物的制备·制造中，可以使用来自人、牛、猪、鲸、海豚等哺乳类，以及来自金枪鱼、鲨鱼、海鳐鱼、鰤等鱼类的SP-B和SP-C的组合、以及SP-B和SP-C1的组合等各个组合。例如可以使用含有上述的2、4和6号序列分别给出的全长氨基酸序列的来自人的蛋白质、SP-B和SP-C的组合、以及SP-B和SP-C1的组合等各个组合。另外也可以使用例如基于Kyte-Doolittle的疏水性值的SP-B和SP-C的疏水性(脂溶性)区域和包括该区域在内的片段、这样的片段肽中的至少1个氨基酸被置换和/或缺失的突变片段等等。例如、可以使用以下给出的含有7～20号序列记载的氨基酸序列的天然肽或通过基因工程或化学合成得到的肽、包含这些肽在内的比它们更长的长链肽、以及这样的肽中的至少1个氨基酸被置换和/或缺失的突变体或合成类似物等等。另外氨基酸编号是以占据各序列N末端的Met作为第1位氨基酸，由此按照向C末端方向(由给出序列的左向右方向)的顺序附加的序数表示。

7号序列：2号序列的第214～225位的氨基酸序列(SP-B片段)；

8号序列：2号序列的第257～266位的氨基酸序列(SP-B片段)；

9号序列：4号和6号序列的第29～58位的氨基酸序列(SP-C片段)；

10号序列：2号序列的第1～20位的氨基酸序列(SP-B片段)；

11号序列：2号序列的第102～110位的氨基酸序列(SP-B片段)；

12号序列：2号序列的第119～127位的氨基酸序列(SP-B片段)；

13号序列：2号序列的第136～142位的氨基酸序列(SP-B片段)；

14号序列：2号序列的第171～185位的氨基酸序列(SP-B片段)；

15号序列：2号序列的第201～279位的氨基酸序列(SP-B片段)；

16号序列：2号序列的第253～278位的氨基酸序列(SP-B片段)；

17号序列：2号序列的第300～307位的氨基酸序列(SP-B片段)；

18号序列：2号序列的第317～330位的氨基酸序列(SP-B片段)；

19号序列：2号序列的第344～351位的氨基酸序列(SP-B片段)；

20号序列：2号序列的第358～381位的氨基酸序列(SP-B片段)；

21号序列：4和6号序列的第24～58位的氨基酸序列(SP-C片段)。

另外根据本发明，可以将含有2、7、8、10～20号序列给出的氨基酸序列的SP-B与从这些片段选出的至少1种，和含有4、6、9和21号序列所述的氨基酸序列的SP-C(和SP-C1)与从这些片段选出的至少1种组合使用。

(4)本发明中使用的脂质

作为磷脂，希望使用含有肺表面活性剂的磷脂、例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等。另外可以使用二棕榈酰甘油磷酸胆碱、二酰基甘油磷酸甘油、磷脂酰甘油(心磷脂)、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、鞘磷脂等。而作为脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈酸油酸、油酸等。另外还可以使用来自肺膨胀活跃的鲸鱼、金枪鱼、海豚等水栖动物的脂质。

(5)RDS治疗用的市售的肺表面活性剂制剂

根据本发明，作为AD媒介物可以使用作为RDS治疗剂的安全性和有效性被有关当局认可，而且含有疏水性或脂溶性的SP-B和SP-C以及磷脂的市售的肺表面活性剂，例如商品名Surfacten、Infasurf、Curosurf、Humansurf、Exosurf、Alveofact等。另外除了SP-B和SP-C以外，如果是含有亲水性或水溶性的SP-A和SP-D的市售制剂，例如用1-丁醇对该制剂等的水溶性蛋白质SP-A和SP-D进行提取，一直将它们等除到检测界限以下后供使用。另外如果考虑到在AD媒介物的配制中的使用浓度的调整，与液状制剂相比，优选使用干燥制剂。

2.成为本发明基础的新的见识

本发明是处于上述的背景技术的极其严酷的漩涡中，通过不断进行了10余年的尝试的第一发明人的卓越的观察力和解析力、以及丰富的学识经验和崭新的立意形成的发明，基于如下令人惊奇的发现。

(1)现有的佐剂引起炎症后增强抗原提示能力，与此相反发现使病毒抗原与从本来作为肺和消化管粘膜分泌的表面活性剂的肺表面活性剂的4种蛋白质有效成分SP-A、B、C和D除去了A和D的SP-B和SP-C的组合与磷脂的复合物，或含有磷脂等的脂溶性区域(有效区域)的SP-B和SP-C两片段的合成肽的组合与脂质膜的复合物(上述的AD媒介物)共存或接触或捕捉或吸附，可以不惹起炎症地活化鼻腔粘膜的抗原提示细胞，病毒抗原被有效地整合到该细胞内，同时在粘膜和血液中可以不引起IgG产生的诱导而有效、且优先、就中、有选择地诱导粘膜的抗病毒IgA产生。

(2)另外发现通过向现在作为安全的灭活疫苗抗原使用的流感病毒·断裂抗原中添加混合SP-B和SP-C的组合与磷脂的复合物、或含有磷脂的脂溶性区域(有效区域)的SP-B和SP-C两片段的合成肽的组合与脂膜的复合物(AD媒介物)，不仅保持断裂抗原的高的安全性，而且如果使用单独断裂抗原，比活疫苗差的抗原提示细胞的活化处于被充分增强补充的状态，可以实现分泌型IgA产生的有选择诱导。

3.上述发现之前的研究过程

(1)首席发明人一直不断进行着要阐明流感发症机制和治疗、予防法的锐意研究。在研究过程中，阐明了对流感病毒膜蛋白质的血细胞凝集素(HA)进行有限分解，使病毒的膜融合活性和感染能力表现的呼吸道的HA加工蛋白水解酶的类胰蛋白酶クララ被肺表面活性剂吸附之后被钝化，结果阻止了病毒的增殖循环。

(2)继续研究的结果发现肺表面活性剂除了上述的作用以外，可有选择地活化粘膜的抗原提示细胞，活化对病毒抗原的免疫能力，虽然引起分泌型IgA的诱导，但不引起IgG的诱导。另外作为肺表面活性剂中的粘膜免疫增强有效成分，表明SP-B、SP-C与脂质成分都很重要，进行了这些蛋白成分的有效区域的特定和验证了粘膜免疫增强的有效性。

(3)另外像上述那样，从呼吸道粘膜的生体防御物质和防御病毒感染的观点进一步研究，证明体内分泌的肺表面活性剂作为来自生体内的粘膜免疫佐剂，参与有选择的IgA产生的诱导。

(4)着眼于上述的肺表面活性剂是本来生体内的生理的作用物质，(a)具有吸附特定的生体物质的性质(Kido H.，et al.FEBS Lett.Pulmonary surfactant is a potentialendogenous inhibitor ofproteolytic activation of Sendai virus and influenza Avirus，322(29)，115-119，1992)、(b)从肺胞II型细胞和クララ细胞分泌后，有选择地整合到巨噬细胞后被代谢(諏访部彰、J.Jpn.Med.Soc.Biol.Interface；肺胞蛋白症中表面活性剂代谢异常、33，10-13，2002)、以及(c)整合到它的类缘关系细胞、例如抗原提示细胞(树突状细胞)后被代谢，不断进行研究。

研究结果表明在肺表面活性剂的蛋白成分中，只是SP-B、SP-C和脂质成分行使作为有选择地诱导IgA产生的粘膜疫苗的“AD媒介物”的功能，而SP-B的有效成分区域或粘膜免疫诱导活性结构域是含有如下氨基酸序列的肽：

SP-B 214-225：Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro LysGly(7号序列)；和

SP-B 257-266：Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu(8号序列)。

同时阐明了SP-C的有效成分区域或粘膜免疫诱导活性结构域是含有如下氨基酸序列的肽：

SP-C 29-58：Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val ValVal Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu MetGly Leu(9号序列)。

(5)另外阐明了作为有选择的IgA诱导的机制，肺表面活性剂的有效成分除了诱导抗原提示树突上细胞的MHC Class II、CD40、B7-2的表达增加，有效实行对T-淋巴细胞的抗原提示以外，还诱导粘膜局部的细胞因子TGF-β1，促进向IgA产生B-淋巴细胞的类转变。

4.根据以上的发现和其事情原委完成的本发明的目的如下

(1)第1个目的是粘膜免疫方法的确立。通过提供“AD媒介物”和其活用，在实现作为粘膜免疫的有效物质的抗原特异的IgA产生的有选择诱导的同时，确立了安全而且有效的(无副作用)粘膜免疫的诱导和诱导的方法。

(2)第2个目的在于通过合成肽的使用提高了涉及到AD媒介物的安全性·有效性·均质性的品质。提供SP-B的粘膜免疫诱导活性结构域(含上述SP-B 214-225和SP-B 257-266的各氨基酸序列)的合成肽、和SP-C的粘膜免疫活性導活性结构域(含上述SP-C 29-58的氨基酸序列)的合成肽、这些肽等的合成类似物、以及作为一部分含有这些肽等的氨基酸序列的长链的合成肽等等和肺表面活性剂脂质成分之间制备的复合物(AD媒介物)，使AD媒介物的品质提高。

(3)第3个目的在于现有疫苗由皮下接种向经粘膜给予的转换。将AD媒介物用在呼吸道感染病毒的灭活疫苗、例如流感、SARS、麻疹、风疹、流行性腮腺炎等灭活疫苗、以及肠道感染病毒的灭活疫苗、例如轮状病毒、脊髓灰质炎病毒等灭活疫苗中，将这些皮下接种疫苗变换为粘膜疫苗。

(4)第4个目的是提供在针对呼吸道、肠道以外的经由粘膜病毒感染的灭活疫苗、例如爱滋病、B型肝炎、C型肝炎等灭活疫苗中可利用AD媒介物的方法。

(5)第5个目的是对于DNA疫苗、活疫苗、变应反应的予防和治疗等也提供可利用AD媒介物的方法。

(6)第6个目的是在作为粘膜以外的可诱导IgA的免疫部位的经皮接种(涂布和贴付等)中提供可利用AD媒介物的方法。

(7)第7个目的在于不仅对DDS和制药，对于农业、渔业等也打开AD媒介物的用途和应用的道路。

再者，本发明提出的AD媒介物与现有免疫学中使用的佐剂在如下那样的性能和作用方面不同。即、现有佐剂通常被接种在皮下或肌肉内，引起局部炎症反应，将抗原提示细胞和B-、T-淋巴细胞拉到跟前，将发挥它们能力的异物作为有效成分。另外为了维持长时间的炎症反应，可以并用惹起抗原的缓释和贮留的矿物油和金属盐。而现有的作为粘膜疫苗·佐剂已知的如上所述，大肠菌易热生毒素和霍乱毒素等异物，有产生危害作用和副作用的危险性。而与此相反，本发明涉及到的AD媒介物不引起局部的炎症反应。而且由于是来自生体成分，以及肺表面活性剂中的活性成分或它的活性结构域在被限定的同时，使用这些结构域和含有该结构域区域的低分子肽，可实现有效果的粘膜疫苗。因此是极其安全，而且是非侵袭的。

5.根据本发明可提供以下(1)～(5)

(1)抗原药物媒介物，该媒介物是包含肺表面活性剂蛋白B或从来自该蛋白B的多个片段选出的至少一个片段、肺表面活性剂蛋白C或从来自该蛋白C的多个片段选出的至少一个片段、以及至少一种脂质的复合物。

更详细地讲，AD媒介物是含如下的I组(肺表面活性剂蛋白B和来自或起因于该蛋白B的天然和合成多肽组)、II组(肺表面活性剂蛋白C和来自或起因于该蛋白C的天然和合成多肽组)和III组(磷脂、脂肪酸等脂质组)各组至少各选出1种，合计至少3种物质的复合物。

[I组]肺表面活性剂蛋白B、和2号序列给出的含如下氨基酸序列的多肽(氨基酸编号，将N末端的Met作为第1位氨基酸，由此依次向C末端方向编号)：作为活性结构域含有第1-381位(2号序列)、第214-225位(7号序列)、第257-266位(8号序列)、第1-20位(10号序列)、第102-110位(11号序列)、第119-127位(12号序列)、第136-142位(13号序列)、第171-185位(14号序列)、第201-279位(15号序列)、第253-278位(16号序列)、第300-307位(17号序列)、第317-330位(18号序列)、第344-351位(19号序列)、第358-381位(20号序列)，上述氨基酸序列中的至少1个序列的多肽、上述各氨基酸序列中的至少1个氨基酸被置换和/或缺失的多肽、这些多肽等的合成类似物、这些多肽等被糖或糖链修饰的修饰物等等。

[II组]肺表面活性剂蛋白C、和4号序列给出的含如下氨基酸序列的多肽(氨基酸编号，将N末端的Met作为第1位氨基酸，由此依次向C末端方向编号)：含第1-197位(4号序列)、第29-58位(9号序列)、第24-58位(12号序列)、6号序列的第1-191位的氨基酸序列的多肽、作为活性结构域含有上述氨基酸序列中的至少1个序列的多肽、上述的各氨基酸序列中的至少一个氨基酸被置换和/或缺失的多肽、这些多肽等的合成类似物、这些多肽等被糖或糖链修饰的修饰物等等。

[III组]磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰甘油磷酸胆碱、二酰基甘油磷酸甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸等脂质，月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等的脂肪酸等等的脂质。

另外该抗原药物媒介物的一个其构成和形状的优选方式是：上述III组是片状或卷曲状的脂膜，上述I组和II组的各个组多数链以将疏水区域末端嵌入到该脂质膜的状态被插成穗状形状。

(2)一种粘膜疫苗，其特征是可以通过使抗原与上述(1)的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附得到，诱导粘膜免疫。

(3)变态反应的予防和治疗剂，其特征是可以通过使变应原与上述(1)的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附得到，诱导粘膜免疫。其作用效果在于例如吸引飞来的杉树花粉、壁虱等变应原被鼻腔或鼻咽头粘膜IgA失活或减轻致敏。

(4)通过使起到药效量的药物与上述(1)的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉或吸附得到的经粘膜和/或经皮DDS。

(5)粘膜免疫的诱导方法，其特征是将通过使抗原与上述(1)的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉或吸附得到的粘膜疫苗给予鼻或上呼吸道。

另外在上述的发明(2)、(3)和(5)中，粘膜免疫的诱导作为优选的方式其特点是通过促进粘膜局部的IgA抗体产生，以及促进粘膜局部中的TGF-β1和Th2型细胞因子产生。

6.以下就本发明的实施方式进行说明。

(1)AD媒介物的组成

上述的I组(来自或起因于肺表面活性剂蛋白B和该蛋白B的天然和合成多肽组)、II组(来自或起因于肺表面活性剂蛋白C和该蛋白C的天然和合成多肽组)和III组(磷脂、脂肪酸等脂质组)等3组的干重％如下：I组约0.1～约6.0重量％、II组约0.1～约6.0重量％、和III组约88～约99.8重量％。在抗原药物媒介物的制备中，在重量％中按照I组％+II组+III组％＝100％那样进行调整。

(2)AD媒介物的制备

以下例举了制备步骤。例如，分别秤取I组2mg、II组2mg、和III组96mg(对于重量％，I组％+II组+III组％＝100％)，然后使它们均一地悬浮于5ml的等渗液、例如生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)中。得到的悬浮液用作抗原药物媒介物(100mg/5ml)液。该媒介物在每次使用时进行配制。而为了悬浮可以使用超音波、匀浆机、混合器、振荡器等。由于超音波过度处理容易引起溶液的变性(粘性的增加)，希望使用混合器、例如旋涡混合器(例如商品名Vortex mixer)。

而III组的脂质96mg的组成细目，例如可以采用磷脂酰胆碱71mg、磷脂酰甘油21mg、和磷脂酰丝氨酸4mg的混合等(脂质量合计96mg)。另外，对于使用确实除去了SP-A和D，含有SP-B和C的市售RDS治疗用的肺表面活性剂制剂的场合，可以将按照制剂使用书配制的悬浮液直接作为抗原药物媒介物液使用。

(3)粘膜疫苗的制备

抗原药物媒介物量(V)相对于疫苗中的抗原量(A)的干重比A/V按照达到约0.2～约5那样向疫苗原液添加抗原药物媒介物液进行混合、配制。例如、抗原含量相对于1μg/ml的疫苗原液1,000ml，如果采用重量比A/V＝1，那么上述(2)制备的抗原药物媒介物(100mg/5ml)液的添加混合量是50μl。而为了进行均一混合，可以使用匀浆机、混合器、振荡器、搅拌器等。

(4)经粘膜·经皮DDS的制备

与上述(3)同样，通过取代抗原使用药物可以制备。

实施例

以下给出实施例，就本发明的构成和效果进行具体说明。但本发明并不限定于这些具体例子、说明和记载。

本实施例中使用的材料、试验手续等如下。

(1)肺表面活性剂

用作“抗原药物媒介物(AD媒介物)”的肺表面活性剂可以使用从牛的肺根据Howgood等人的方法(Howgood S，et al.，：Effectsof a surfactant-associated protein and calcium ions on thestructure and surface activity of lung surfactant lipids.Biochemistry 24，184-190，1985)调整的标准品(PSF-1)，或大多数使用对该标准品用1-丁醇提取，除去水溶性蛋白成分SP-A、SP-D，或减少到检测界限以下的标准品(Haagsman HP，et al.，：Themajor lung surfactant protein，SP28-36，is a calcium-dependent，carbohydrate binding protein，J.Biol.Chem.262，13977-13880，1987)(PSF-2)，而且还含有作为总体40重量％以上的主要由磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰胆碱构成的磷脂，类似于肺表面活性剂脂质还含有10-20％磷脂酰甘油，2～5％磷脂酰丝氨酸、含有0～3.5％脂溶性蛋白质SP-B、SP-C的有效区域的合成肽中任一方、或两方的肽合起来为0～3.5％的标准品。另外对于在该标准品中含有兼备SP-B、SP-C有效区域的两方的肽的标准品(PSF-3)、SP-B有效区域的合成肽的标准品(PSF-4)、SP-C有效区域的合成肽的标准品(PSF-5)也进行了研究。或者也可以使用相当于PSF-1、PSF-2的众所周知的标准品、例如商品名サ一ファクテン、ィンサァ一フ(Infasurf)、キュ一ロサ一フ(Curosurf)、ヒュ一マンサ一フ(Humansurf)、エキソサ一フ(Exosurf)、ァルビオファクト(Alveofact)等。

(2)动物

使用从日本エスエルシ一株式会社(日本·静冈)购入的6周龄、雌性BALB/c小鼠和10周龄Hartley豚鼠。所有的动物实验都是在德岛大学医学部实验动物中心的感染动物房(P2水平)进行，按照德岛大学医学部动物实验委员会的指导方针进行。

(3)断裂型流感疫苗的制作

使用来自接种了流感病毒A Aichi/68/2/H3N2株的发育鸡蛋的浮游液(1×10⁸Plaque forming unit(PFU))(由川崎医科大学·微生物学教室大内正信教授提供)，通过以下操作做成断裂型流感疫苗。向经0.004M PBS(タカラバィオ株式会社日本·东京·滋贺)透析过夜的病毒浮游液添加液量的0.05％的β丙内酯(和光纯药株式会社日本·大阪)，使得最终浓度达到8nM，于冰浴中温育18小时。然后通过于37℃下温育1.5小时，进行β丙内酯的水解。然后按照终浓度达到0.1％那样加Tween 20(和光纯药株式会社)，再加与Tween等量的二乙醚(和光纯药株式会社)，于4℃下倒置混合2小时。通过将该液在2000rpm下离心分离5分钟，回收水相。然后使用AutomaticEnvironmental SpeedVac System(SAVANT INSTRUMENTS，INC.美国·纽约)从水相中除去二乙醚。再用Millex 0.45μm膜(MILLIPORE美国·马萨诸塞)进行过滤，作为灭活断裂型流感疫苗使用。

(4)免疫法

将用上述的制造法制作的断裂型流感疫苗与作为“AD媒介物”的上述肺表面活性剂(PSF-1)、1-丁醇提取肺表面活性剂(PSF-2)、SP-B，SP-C有效区域的合成肽和肺表面活性剂脂质(PSF-3、4、5)、众所周知的肺表面活性剂商品、或作为免疫佐剂的肠毒素B亚基(CTB、SIGMA美国·密苏里)混合后使用。将肺表面活性剂或上述的相当标准品按照给予疫苗所需要的浓度在用时悬浮于PBS，于室温下通过5分钟的超音波处理做成均一的悬浮液。向该悬浮液中按照相对于肺表面活性剂或上述的相当标准品的干重0.1μg加断裂型流感疫苗0.1μg，用旋涡混合器混合后，于室温下静置1小时后使用。CTB也同样在用时进行调整，按照相对于断裂型流感疫苗0.1μg达到0.1μg那样混合(Watanabe I，et al.，：Characterization of protectiveimmune responses induced by nasal influenza Vaccine containingmutant cholera toxin as a safe Adjuvant(CT112K).Vaccine 2002；20：3443-55)。

至于疫苗的经鼻给予，将上述的调整品用PBS稀释成相当干重量0.1μg/1μl的Phosphate buffered saline(PBS)溶液，将该稀释液按照每只每一鼻孔1μl投到两鼻孔中，将合计2μl稀释液点到用乙醚麻醉的小鼠的两侧鼻腔。在用于比较进行的现有型皮下注射中，将断裂型流感疫苗用PBS稀释成0.1μg/50μl溶液，将该稀释液注射到小鼠颈部皮下。对照组给予与疫苗液同量的PBS。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫，制备2次免疫后第2周的小鼠的鼻腔·肺胞清洗液和血清，用于病毒特异的IgA、IgG的测定和病毒感染实验。

(5)小鼠鼻腔·肺胞清洗液和血清的制备

将给予疫苗小鼠在戊巴比妥麻醉下开腹开胸，切开呼吸道，向肺插入微型静脉导管节付3Fr(ァトムメディカル株式会社日本·东京)后，注入生理盐水1ml，对该液进行回收。该操作反复进行3次，将采集的液共计3ml用作肺胞清洗液。采集肺清洗液后，由切开的呼吸道向鼻腔方向插入微型静脉导管，注入1ml的生理盐水，采集从鼻流出的液。将该液用作鼻清洗液。另外从心脏採血，通过于5,000rpm下离心分离10分钟，制备血清。

(6)蛋白定量

使用BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE美国·伊利诺依)测定鼻清洗液、肺清洗液和血清的蛋白含量(Smith PK.et al.，：Measurementof protein using bicinchoninic acid.Anal.Biochem.，150，76-85，1985)。562nm的吸光度使用SPECTRAmax PLUS 384(MolecularDevices Corporation美国·加利福尼亚)进行测定。

(7)病毒感染实验和感染效价的评价

在感染中使用与断裂型流感疫苗的制备中使用的病毒株同样的流感病毒株A Aichi/68/2/H3N2株。2次免疫结束后第2周用乙醚对小鼠进行麻醉后，将来自流感病毒发育鸡蛋的浮游液滴到小鼠两侧鼻腔，合计7×10⁴PFU/3μl，使其感染。感染3日后按照上述要领制备鼻腔、肺胞清洗液，用于病毒感染效价的评价。使用A549细胞(由川崎医科大学·微生物学教室大内正信教授提供)进行病毒感染效价的评价。A549细胞在5％牛胎儿血清/DMEM(Gibco美国·纽约)的条件下进行培养。将A549细胞按照100％铺满6孔培养板(グレィナ一ドィッ·シュトウットガルト社)那样进行传代，24小时后换成无血清培养基。向各孔滴下流感感染小鼠的鼻腔·肺胞清洗液，每孔500μl，于CO2培养箱在37℃下培养12小时至16小时。然后向培养板中加从豚鼠采集的红细胞1％PBS液，于室温下静置5分钟。然后用1mMCa²⁺/Mg²⁺PBS清洗培养板，将使红细胞凝集的细胞作为病毒感染细胞计数，进行病毒感染效价的评价(Tashiro M.，Homma M.：Pneumotropism of Sendai virus in relation to protease-mediatedactivation in mouse lungs.Infect.Immun.39，879-888，1983)。

(8)抗流感特异的IgA和IgG的纯化

为了作为ELISA分析中定量的基准使用，象以下那样对特异的抗流感IgA和IgG进行纯化。通过使用重组大肠菌表达ProteinG琼脂糖4B柱(ZYMED LABORTORIES INC，美国·旧金山)的亲和层析，从给予流感疫苗和病毒感染小鼠的肺清洗液纯化IgG级分。使抗小鼠IgA山羊IgG(SIGMA)结合在BrCN活化琼脂糖4B柱(Amersham Bioscience美国·新泽西)上，通过使用该柱的亲和层析从ProteinG的穿过级分纯化IgA级分。为了从这些IgG、IgA级分纯化病毒特异的抗体，使免疫中使用的灭活断裂型流感疫苗结合在BrCN活化琼脂糖柱上，通过使用该柱的抗原亲和层析，分别从IgA、IgG级分纯化对应的抗流感特异的IgA和IgG。作为配体的断裂型流感蛋白质在柱中的偶联使用0.1MNaHCO₃/0.5M NaCl缓冲液(pH 8.5)进行结合反应，使用0.1M酢酸/0.5M NaCl缓冲液(pH 8.5)除去游离的配体后，用PBS(pH 7.5)中和。各亲和层析使用PBS(pH 7.5)进行亲和结合反应和除去游离的抗体后，通过甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.8)进行特异抗体的洗脱。洗脱的级分立刻用0.5M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)中和，经MilliQ水透析后进行冷冻干燥，用时溶解于PBS后使用。

(9)抗流感抗体的定量

通过ELISA分析对鼻腔、肺胞清洗液和血清中的抗流感IgA、IgG含量进行定量。ELISA分析根据BETHYL LABORATORIES社(美国·德克萨斯)的Mouse ELISA定量试剂盒的方法进行。向96孔Nunc免疫板(Nalgen Nunc International美国·纽约)各孔加疫苗1μg、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美国·密苏里)1μg/ml PBS溶液100μl，于4℃下过夜进行固层化反应。然后使用清洗液(50mM Tris，0.14MNaCl，0.05％Tween 20，pH 8.0)洗3次，除去疫苗液。向各孔加含有0.15M NaCl、1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)200μl，于室温下进行1小时封闭反应。用清洗液将各孔清洗3次后，加100μl适量稀释于样品结合缓冲液(50mM Tris，0.15M NaCl，1％BSA，0.05％Tween 20，pH 8.0)的鼻清洗液·肺清洗液或血清，于室温下反应2小时。使用山羊抗鼠IgA或IgG-辣根过氧化物酶(IgG-horse rADish peroxidase)(HRP)(BETHYL LABORATORIES INC.)作为二次抗体，用TMB微孔过氧化物酶底物系统(Kirkegaard & PerryLaboratories，Inc.美国·马里兰)进行发色反应。通过向各孔添加100μl、2M H₂SO₄(和光纯药株式会社)停止反应，使用SPECTRAmaxPLUS 384测定450nm的吸光度。作为用于定量的标准，使用就由上述肺清洗液纯化的抗流感IgA和IgG 10ng同样操作得到的吸光度。

(10)树突状细胞的制备和流式细胞测量法

根据Gonzalez-Juarrero M的方法(Gonzalez-Juarrero M，OrmeIM.：Characterization of murine lung dendritic cells infectedwith Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun 2001；69：1127-33)由从初次免疫后第2天的各组小鼠(1组4只)採取的鼻、肺、脾脏制备树突状细胞。而从鼻制备树突状细胞以及它的胶原酶处理根据Asanuma H等方法(Asanuma H，et al.，：Characterizationof mouse nasal lymphocytes isolated by enzymatic extractionwith collagenase.J Immunol Methods 1995；187：41-51)进行。用1mM EDTA/PBS清洗从各组织制备的树突状细胞，每10⁶细胞加FITCconjugated Anti-IA/IE(MHC class II)和PE conjugated Anti CD40或FITC conjugated Anti-CD80(B7-1)和PE conjugated Anti CD86(B7-2)(BD Bioscience美国·新泽西)各1μg/ml，做成50μl 1mM EDTA/PBS悬浮液于冰上反应30分钟。用1ml的1mM EDTA/PBS清洗2次除去游离的抗体，再悬浮于1ml的1mM EDTA/PBS中。使用该悬浮液通过BD FACS Callibur(BD Bioscience)进行细胞表面修饰因子的检测。

(11)TGF-β1的定量

通过ELISA分析对鼻腔、肺胞清洗液中的TGF-β1的分泌量进行定量。ELISA分析使用TGF-β1 ELISA试剂盒(BIOSOURCEINTERNATIONAL美国·加利福尼亚)，按照试剂盒附带的使用法进行。

(12)各种细胞因子的定量

对鼻腔、肺胞清洗液中和由脾脏的淋巴细胞分别分泌的细胞因子(白介素4：IL-4、IL-5、IL-6、IL-13)的量使用各自的市售ELISA试剂盒进行定量。

(13)含SP-B和SP-C的合成肽与磷脂的PSF-3的制备

按照众所周知的方法化学合成SP-B 253-278(16号序列)和SP-C24-58(21号序列)各个肽。将这些肽加到磷脂膜(二棕榈酰磷脂酰胆碱(75)、磷脂酰甘油(25)、棕榈酸(10))后做成板状的磷脂膜，制备AD媒介物PSF-3。

实施例1

经鼻流感疫苗和皮下注射流感疫苗的抑制病毒增殖作用的比较

将作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与作为“AD媒介物”的1-丁醇提取(SP-A、SP-D除去)表面活性剂(以下PSF-2)0.1μg、或与CTB 0.1μg一起做成PBS溶液给予BALB/c小鼠两鼻各1μl。作为皮下注射疫苗，将与经鼻疫苗同量的疫苗单独、或加作为AD媒介物的PSF-2、或加作为佐剂的CTB，总体做成50μl PBS溶液，注射到BALB/c小鼠颈部皮下。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。2次免疫2周后将6.6×10⁴PFU的流感病毒做成3μl PBS溶液经鼻感染。感染3日后屠杀小鼠，制备鼻腔和肺胞清洗液，使用这些清洗液进行病毒感染效价的评价(n＝15～20；平均±SE；*，通过t检定得到的有意义水准对于给予疫苗组p＜0.01)。

就像图1(a)和(b)表示的那样，经鼻给予流感疫苗时，鼻腔和肺清洗液中流感病毒的增殖虽然也被单独给予疫苗抑制，但PSF-2、CTB有意义增强疫苗的效果，直至完全抑制流感的增殖，确实达到了疫苗的效果。虽然图中没有表示，但即使取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3也可获得几乎同等程度的效果。虽然对于PSF-4、-5也可确认同样的现象，但效果减弱。

另外，虽然图中没有表示，即使将PSF-2、CTB分别单独在初次免疫时和2次免疫时经鼻给予，也完全看不到抑制病毒增殖的效果，判定PSF-2、CTB的效果为增强疫苗作用的效果。

另外皮下注射流感疫苗的场合，就像图1(c)和(d)表示的那样，鼻腔、肺清洗液中的流感病毒的滴度(PFU)即使单独疫苗也有意义减少，虽然可确认疫苗的效果，但没有看到PSF-2、CTB的增强疫苗作用的效果。即对于皮下给予的场合，几乎看不到PSF-2、CTB的增强免疫效果，推定即使有也是很微量的。另外，在该实验中，虽然没有图示，但即使在初次免疫时和2次免疫时分别单独将PSF-2、CTB注射到皮下，也完全没有看到抑制病毒增殖的效果。虽然图中没有表示，但即使取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3、PSF-4、PSF-5也没有看到增强疫苗作用的效果。

实施例2

PSF-2、CTB对通过经鼻(a)、皮下注射(b)给予流感疫苗后的鼻腔清洗液中的抗流感特异抗体(IgA、IgG)产生的影响

使用图1所述的方法，将作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与作为AD媒介物的0.1μg PSF-2、或与作为佐剂的0.1μg CTB一起做成PBS溶液，各给予BALB/c小鼠两鼻1μl，合计2μl。作为皮下疫苗，将与经鼻疫苗同量的疫苗、PSF-2、CTB做成50μl PBS溶液注射到BALB/c小鼠颈部皮下。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。2次免疫2周后将6.6×10⁴PFU的流感病毒做成3μl PBS溶液经鼻感染。感染3日后屠杀小鼠，制备鼻腔清洗液，使用这些清洗液进行病毒感染效价的评价。(n＝15～20；平均±SE；*，通过t检定得到的有意义水准对于给予疫苗组p＜0.01)。

其结果如图2(a)和(b)所示。由于经鼻给予的断裂型流感疫苗，抗流感特异IgA有选择地在鼻腔产生，在清洗液中增加，PSF-2、CTB都可同程度、显著地使该特异的IgA量增加。另外皮下注射的场合也可看到通过断裂型流感疫苗单独引起的鼻腔清洗液中特异的IgA量的增加，但与鼻腔给予相比，其程度低。而疫苗皮下注射的场合，在IgA、IgG产生中都没有看到PSF-2、CTB的增强免疫效果。虽然图中没有表示，但即使取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3也可获得与PSF-2同等程度的效果。虽然对于PSF-4、-5也可确认同样的现象，但效果减弱。

实施例3

PSF-2、CTB对通过经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗的肺清洗液中抗流感特异抗体(IgA、IgG)产生的影响

作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与作为AD媒介物的0.1μg PSF-2、或与作为佐剂的0.1μg CTB一起做成PBS溶液，各给予BALB/c小鼠两鼻1μl，合计2μl。作为皮下疫苗，将与经鼻疫苗同量的疫苗、PSF-2、CTB做成50μl PBS溶液给予BALB/c小鼠颈部皮下。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。2次免疫2周后将6.6×10⁴PFU的流感病毒做成3μl PBS溶液经鼻感染。感染3日后屠杀小鼠，制备肺胞清洗液，使用这些清洗液研究抗原药物媒介物对抗流感特异抗体IgA、IgG产生的影响。(n＝15～20；平均±SE；*，通过t检定得到的有意义水准对于给予疫苗组p＜0.01)。

就像图3(a)和(b)表示的那样，与疫苗的鼻腔给予的场合同样，PSF-2、CTB对产生在肺清洗液中的抗流感特异抗体的促进产生效果显著，两者间没有大的差别。该增强免疫效果对于IgA特异，而对IgG没有看到效果。皮下注射的场合，虽然看到肺清洗中的IgA增加，但PSF-2、CTB的增强免疫效果与鼻腔清洗液中的场合同样没有看到。另外虽然图中没有表示，即使将PSF-2、CTB分别单独在初次免疫时和2次免疫时经鼻给予、皮下给予，也没有看到肺清洗中的病毒特异的IgA、IgG的增加，判定PSF-2、CTB的效果为增强疫苗作用的效果。虽然图中没有表示，但即使取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3也可获得几乎同等程度的效果。虽然对于PSF-4、-5也可确认同样的现象，但效果减弱。

实施例4

PSF-2、CTB对通过经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗导致血液中的抗流感特异抗体(IgA、IgG)产生的影响

将作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与作为AD媒介物的0.1μg PSF-2、或与作为佐剂的0.1μg CTB一起做成PBS溶液，各给予BALB/c小鼠两鼻各1μl，合计2μl。作为皮下注射疫苗，将与经鼻疫苗同量的疫苗、PSF-2、CTB做成50μl PBS溶液注射到BALB/c小鼠颈部皮下。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。2次免疫2周后屠杀小鼠，进行心脏采血，由血制备血清，使用血清对抗流感特异抗体表达量进行定量。(n＝15～20；平均±SE)。

就像图4(a)和(b)表示的那样，血液中抗流感抗体IgA(白棒)、IgG(黑棒)的产生量对于经鼻给予疫苗的场合，虽然看到IgA、IgG有轻度增加，但PSF-2、CTB并没有使IgA、IgG增加，也没有看到增强免疫效果。另外，皮下注射的场合，看到由于给予断裂型流感疫苗引起IgG显著增加和IgA的明显增加，但这种场合下PSF-2、CTB并没有引起抗体产量的增加，没有看到增强免疫效果。特别是皮下注射的场合，IgG特异地在血液中增加。即使取代PSF-2使用PSF-1也可获得几乎同样的效果(图中没有表示)。

而在初次免疫时和2次免疫时分别单独经鼻给予、皮下给予PSF-2、CTB也没有看到血液中的病毒特异的IgA、IgG的增加，判定PSF-2、CTB的效果为增强疫苗作用的效果(图中没有表示)。

实施例5

PSF-2、CTB对通过经鼻给予(a)、皮下注射(b)流感疫苗引起的鼻、肺、脾脏的树突状细胞的抗原提示能力的影响

将作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与0.1μg的PSF-2、或与0.1μg的CTB一做成1μl PBS溶液，各给予BALB/c小鼠两鼻1μl，合计2μl。作为皮下疫苗，将与经鼻疫苗同量的疫苗，PSF-2、CTB做成50μl PBS溶液给予BALB/c小鼠颈部皮下。2日后屠杀小鼠，由鼻、肺、脾脏制备树突状细胞，通过流式细胞测量法测定MHC class II、CD40、B7-1(CD80)、B7-2(CD80)的细胞表面表达水平。

其结果看到使用CTB可增加挑战疫苗的鼻的树突状细胞(抗原提示细胞)的膜表面的抗原提示相关分子、CD40、B7-2的表达，在分子水平确认了佐剂效果。PSF-2的场合，除了鼻的树突状细胞的CD40、B7-2，还看到MHC II分子表达的增加、显然树突状细胞中的至少3个分子与该增强免疫效果有关。

然而就肺和脾脏树突状细胞的CD40、B7-2、MHC II分子来说，没能看到明显的变化。另外即使取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3也可获得几乎同等程度的效果。虽然对于PSF-4、-5也可确认同样的现象，但其效果减弱了。

实施例6

SPF-2、CTB对通过经鼻给予流感疫苗引起的鼻腔(a)、肺胞(b)粘膜中TGF-β1分泌水平的影响

将作为经鼻疫苗的0.1μg断裂型流感疫苗单独，或与0.1μg的SPF-2、0.1μg的CTB一做成1μl PBS溶液，各给予BALB/c小鼠两鼻1μl，合计2μl。将作为皮下疫苗与经鼻疫苗同量的疫苗，PSF-2、CTB做成50μl PBS溶液给予BALB/c小鼠颈部皮下。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。2次免疫2周后屠杀小鼠，制备鼻腔清洗液，使用这些清洗液进行TGF-β1分泌量的定量。(n＝15～20；平均±SE；*，通过t检定得到的有意义水准对于给予疫苗组p＜0.01)。

已知为了使B细胞分化为产生IgA的细胞(类转换)，产生细胞局部存在的局处的TGF-β1浓度很重要(Stavnezer，J.：Regulationof antibody production and class switching by TGF-beta.J.Immunol.155(4)，1647-1651，1995)。因此对在上述的条件下的鼻腔(a)、肺胞(b)粘膜局部的TGF-β1浓度进行了研究。

给予断裂型流感疫苗的鼻腔、肺胞粘膜局部的TGF-β1浓度在SPF-2、CTB存在下都有意义增加。增加的程度在SPF-2、CTB间没有有意义差别。其结果如图5(a)和(b)所示。判明来自生体内的SPF-2与外来毒素CTB同等程度地使催促促进分泌IgA的B细胞分化的TGF-β1的浓度增加。虽然没有图示，但取代PSF-2使用PSF-1、PSF-3也可以得到大致程度的效果。对于PSF-4、-5也可确认同样的现象，但效果减弱了。另外，即使在初次免疫时和2次免疫时分别单独经鼻给予、皮下注射给予PSF-2、CTB，也没有看到TGF-β1浓度的增加，判定PSF-2、CTB的效果为疫苗作用的增强效果(图中没有表示)。

实施例7

PSF-2、CTB对于通过经鼻给予流感疫苗引起鼻腔(a)、肺胞(b)和血液中(c)的抗流感特异抗体(IgA、IgG)产生的影响

将作为经鼻疫苗的0.2μg的断裂型流感疫苗单独，或与作为AD媒介物的0.2μg PSF-2、或与作为佐剂的0.2μgCTB一做成PBS溶液给予BALB/c小鼠两鼻各1μl，合计2μl。4周后通过与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组分别给予同容量的PBS。各组都于2次免疫2周后屠杀小鼠，制备鼻腔清洗液、肺胞清洗液和通过心脏採血制备血清，使用这些样品进行抗流感抗体表达量的定量(n＝15～30，平均±SE、+，p＜0.01vs.疫苗单独给予)。

就像图6(a)和(b)表示的那样，就鼻腔清洗液和肺胞清洗液来说，虽然在给予PSF-2和疫苗的场合下血液中抗流感抗体IgA(蓝圆形)表现出显著增加，但就像图6(c)表示的那样，血液中没有看到IgG(红圆形)增加。

另外给予CTB和疫苗的场合下，IgG和IgA在鼻腔清洗液和肺胞清洗液增加(图6(a)、(b))、在血液中也显著增加(图6(c))。

如上所述，对于CTB的场合，就像现有报告那样，除了对经鼻接种的抗原反应之后建立局部免疫以外，也产生全身性的免疫反应(Systemic Immune Response)。另外对于使用PSF-2的场合，只建立了局部粘膜免疫。

J.Freek van Iwaarden等(非专利文献4)报道了如果从肺人工除去巨噬细胞，通过SP-B和脂质虽然可以诱导全身性的免疫反应，但对于没有除去巨噬细胞的场合，不能诱导免疫。另外，在上述文献中，为了诱导全身性免疫反应所需要的SP-B+脂质量是250-300μl，与上述实施例的PSF-2给予量(0.2μl)相差很大。而且对于局部粘膜免疫一点都没谈到。

实施例8

SPF-2、CTB对通过经鼻给予流感疫苗引起从鼻、肺和脾脏的淋巴细胞分泌的各种细胞因子的影响

将作为经鼻疫苗的0.2μg断裂型流感疫苗与SPF-2 0.2μg、或CTB 0.2μg一起做成1μl PBS溶液，给予BALB/c小鼠的上呼吸道，合计2μl。2次免疫2周后屠杀小鼠，对来自鼻腔、肺胞和脾脏淋巴细胞的TGF-β1和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-13)的分泌量进行定量(n＝15～20；平均±SE；+++，P＝0.06；++，P＝0.05；+，P＝0.01vs.疫苗单独给予)。

就像图7(a)～(e)表示的那样、在与PSF-2一起进行疫苗免疫后的粘膜局部(鼻、肺)虽然看到TGF-β1、IL-5和IL-6分泌有意义增加，但就IL-4和IL-13来说没有看到有意义增加。另外在脾脏中无论那一个细胞因子都没有观察到有意义增加。

由以上的结果可以确认PSF-2在粘膜局部使促进产生IgA的B细胞分化、诱导的Th2型细胞因子增加。

实施例9

PSF-3对通过经鼻给予流感疫苗引起鼻腔(a)、肺胞(b)和血液中(c)的抗流感特异抗体(IgA、IgG)产生的影响

将作为经鼻疫苗的0.2μg断裂型流感疫苗单独，或与作为AD媒介物的0.2μg PSF-3(号序列16所述的SP-B片段253～278肽与21号序列所述的SP-C片段24～58肽的等重量混合物)、或0.2μg脂质成分一起做成PBS溶液给予BALB/c小鼠两鼻各1μl，合计2μl。4周后采用与初次免疫同样的方法进行2次免疫。对于对照组各给予同容量的PBS。各组都在2次免疫2周后屠杀小鼠，制备鼻腔清洗液、肺胞清洗液和通过心脏采血制备血清，使用这些样品进行抗流感抗体表达量的定量(n＝15～30，平均±SE、+，p＜0.01vs.疫苗单独给予)。

就像图8(a)和(b)表示的那样，就鼻腔清洗液和肺胞清洗液来说，在给予PSF-3和疫苗的场合下虽然血液中抗流感抗体IgA(蓝圆形)表现出显著的增加，但没有看到IgG(红圆形)有意义增加。另外在血清中(c)无论IgG(红圆形)还是IgA(蓝圆形)都没有看到有意义增强。

产业上利用的可能性

本发明涉及到的“AD媒介物”由于在发挥将抗原·药物·营养剂等所有的物质由鼻·呼吸道·肠道等粘膜或皮肤向细胞内输送的功能的同时，优先而且有选择地诱导该处的IgA产生，所以粘膜疫苗、变态反应的予防和治疗、经粘膜和经皮DDS、药物和营养素等有用物质的经粘膜给予和经皮给予成为可能。而且，其临床使用和安全性在国内和诸外国已被认可。

因此，期待着通过生物学的制剂和DDS等在医药品·制药、通过功能性食品和健康食品等在饮食品·粮食工业、通过农产物的育成·栽培·疾病对策·驱除昆虫等在农业·农药、通过鱼病疫苗·投药等在栽培渔业、通过防蚁·防虫等在建筑业和环境保护等极其广泛产业中的用途和活用。

序列表

<110>The University of Tokushima

<120>可经粘膜和经皮给予的抗原药物媒介物、使用该媒介物的粘膜

免疫的诱导方法、粘膜疫苗和DDS

<130>05F021PCT

<150>JP2004-111249

<151>2004-04-05

<150>2004-125036

<151>2004-04-21

<160>21

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1146

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

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<223>

<400>1

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Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr

1 5 10 15

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Leu Cys Gly Pro Gly Thr Ala Ala Trp Thr Thr Ser Ser Leu Ala Cys

20 25 30

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Ala Gln Gly Pro Glu Phe Trp Cys Gln Ser Leu Glu Gln Ala Leu Gln

35 40 45

tgc aga gcc cta ggg cat tgc cta cag gaa gtc tgg gga cat gtg gga 192

Cys Arg Ala Leu Gly His Cys Leu Gln Glu Val Trp Gly His Val Gly

50 55 60

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Ala Asp Asp Leu Cys Gln Glu Cys Glu Asp Ile Val His Ile Leu Asn

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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245 250 255

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260 265 270

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<212>PRT

<213>人

<400>19

Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro

1 5

<210>20

<211>24

<212>PRT

<213>人

<400>20

Thr Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr Met Ser Ser Pro Leu

1 5 10 15

Gln Cys Ile His Ser Pro Asp Leu

20

<210>21

<211>35

<212>PRT

<213>人

<400>21

Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val

1 5 10 15

Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu

20 25 30

Met Gly Leu

35

Claims

1.抗原药物媒介物，该媒介物是包含肺表面活性剂蛋白B或从来自该蛋白B的多个片段选出的至少一个片段、肺表面活性剂蛋白C或从来自该蛋白C的多个片段选出的至少一个片段、以及至少一种脂质的复合物。

2.权利要求1所述的抗原药物媒介物，其中至少一种脂质选自磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰甘油磷酸胆碱、二酰基甘油磷酸甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸以及油酸。

3.权利要求1所述的抗原药物媒介物，其中来自蛋白B的片段是含有序列号2、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的肽。

4.权利要求1所述的抗原药物媒介物，其中来自蛋白C的片段是含有序列号4、序列号9、21、或序列号6的氨基酸序列的肽。

5.权利要求1至4任一项所述的抗原药物媒介物，脂质是片状或卷曲状的膜，由肺表面活性剂蛋白B或从来自该蛋白B的多个片段选出的至少一个片段、以及肺表面活性剂蛋白C或从来自该蛋白C的多个片段选出的至少一个片段的各个多条链以疏水区域末端嵌入到该脂质膜的状态使之被插成穗状。

6.一种粘膜疫苗，其特征是可以通过使抗原与权利要求1至5任一项所述的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附得到，诱导粘膜免疫。

7.权利要求6所述的粘膜疫苗，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进IgA抗体在粘膜局部产生。

8.权利要求6或7所述的粘膜疫苗，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进TGF-β1和Th2型细胞因子在粘膜局部产生。

9.变态反应的预防剂或治疗剂，其特征是可以通过使变应原与权利要求1至5任一项所述的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附得到，诱导粘膜免疫。

10.权利要求9所述的变态反应的预防剂或治疗剂，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进IgA抗体在粘膜局部产生。

11.权利要求9或10所述的变态反应的预防剂或治疗剂，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进TGF-β1和Th2型细胞因子在粘膜局部产生。

12.通过使起到药效的量的药物与权利要求1至5任一项所述的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附得到的经粘膜和/或经皮DDS。

13.粘膜免疫的诱导方法，其特征是将通过使抗原与权利要求1至5任一项所述的抗原药物媒介物共存、接触、捕捉、或吸附的粘膜疫苗给予到鼻腔或上呼吸道。

14.权利要求13所述的粘膜免疫的诱导方法，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进IgA抗体在粘膜局部产生。

15.权利要求13或14所述的粘膜免疫的诱导方法，其中粘膜免疫的诱导的特征是促进TGF-β1和Th2型细胞因子在粘膜局部产生。