KR100992492B1

KR100992492B1 - 국소 점막 면역 유도 촉진용 항원약물 비히클, 이것을 사용하는 점막 백신, 알레르기의 예방제 또는 치료제, 약물전달 시스템, 및 점막면역의 유도방법

Info

Publication number: KR100992492B1
Application number: KR1020067020581A
Authority: KR
Inventors: 히로시 키도; 다이 미즈노
Original assignee: 토쿠시마 대학
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2010-11-08
Also published as: EP1738765A1; WO2005097182A1; EP1738765A4; BRPI0508792A; JPWO2005097182A1; EP1738765B1; US8268321B2; KR20070017348A; CA2579710A1; RU2396090C2; CN1942205B; CA2579710C; US20070141073A1; JP4843792B2; RU2006138182A; CN1942205A

Abstract

본 발명은 항원 특이적 분비형 IgA 항체의 우선적 또한 선택적인 생산, 국소면역 혹은 점막면역을 유도하는 기능을 발휘하는 항원약물 비히클(AD 비히클), 및 상기 AD 비히클을 사용하는 점막면역의 유도방법, 점막 백신, 알레르기의 예방 혹은 치료제에 관한 것이다. 또한, 상기 비히클을 사용하는 경점막·경피 DDS에 관한 것이다.

Description

국소 점막 면역 유도 촉진용 항원약물 비히클, 이것을 사용하는 점막 백신, 알레르기의 예방제 또는 치료제, 약물전달 시스템, 및 점막면역의 유도방법{ANTIGEN-DRUG VEHICLE FOR PROMOTING INDUCTION OF LOCAL MUCOSAL IMMUNITY, MUCOSAL VACCINE, DRUG FOR PREVENTION OR TREATMENT OF ALLERGY, DRUG DELIVERY SYSTEM, AND METHOD OF INDUCING MUCOSAL IMMUNITY USING THE SAME}

본 발명은 경점막투여 및 경피투여를 가능하게 하는 항원약물 비히클에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 상기 비히클을 원하는 항원이나 약물에 사용하는 것을 특징으로 하는, 항원 특이적 분비형 면역 글로블린A를 우선적 또한 효과적, 특히 선택적으로 생산시키는 점막면역의 유도방법, 점막 백신, 알레르기의 예방·치료, 및 약물전달 시스템에 관한 것이다.

종래의 불활화 백신이나 톡소이드 등에는 다음의 결점이 알려져 있다:

(1)자연 감염 루트에서의 부족한 감염방어

백신 접종 루트가 피하, 근육내 등인 것에 대하여, 세균이나 바이러스 등의 자연 감염 루트는 예를 들면 비강, 기관, 장관 등의 점막이며, 상기 접종 루트와는 다르다. 자연 감염의 실태에 입각한 접종 루트에 의한 감염방어, 특히 점막경유의 백신투여에 의한 점막에서의 감염방어의 실현이 기대된다.

(2)낮은 점막면역성

백신 피접종자에 있어서는 주로 면역 글로블린G(이하 「IgG」 또는 「IgG 항체」라고 약기함)가 혈중에 생산되어 체액성 면역이 유도된다. 그러나 점막면역을 담당하는 면역 글로블린A(이하 「IgA」 또는 「IgA 항체」라고 약기함)는 거의 생산되지 않아 점막면역의 성립은 기대할 수 없다. 또, IgA 항체의 필요성과 유효성은 다음과 같다 : IgA 항체는 비말(飛沫)이나 공기에 의한 비강, 기관 등의 호흡기로의 감염, 또 경구에 의한 장관으로의 감염의 문호인 점막에서의 감염방어, 즉 점막면역을 담당하고 있어 임상면역상, 매우 중요한 역할을 하고 있다. 또, IgG 항체가 항원에 대한 특이성이 높고, 감염방어 스펙트럼이 좁아서, 항원변이된 병원체의 감염방어에는 거의 무효인 것에 대하여, IgA 항체는 교차 면역성, 즉 교차 중화 활성이 있으므로 그만큼 감염방어 스펙트럼의 폭이 넓어 변이항원에 대한 감염도 방어한다.

(3)추가접종의 필요성과 겹치는 비용

초회면역의 1회 접종만으로는 생산되는 IgG 항체가 낮아 확실한 효과를 기대할 수 없으므로, 그 후의 IgG 항체 보유상황에 기초하여 1회이상의 추가접종, 소위 부스터 접종에 의해 혈중 IgG 항체가를 더욱 높일 필요가 있다. 그 때문에 경비나 노력의 반복을 필요로 하는 점에서, 또 부스터 접종의 기회가 많은 고령자, 성인 및 취학아동에게는 효과가 확인되지만, 그 기회가 적은 저연령, 특히 2세이하의 유아에게는 효과가 없는 경우가 산견된다.

이상에 대하여 바꿔 말하면, 종래의 불활화 백신이나 톡소이드 등은 피접종자에게 있어서 주로 혈중 IgG 항체의 생산을 유도하고, 체액성 면역을 높이는 작용효과를 초래하여 그 유효성은 확인되고 있다. 그러나 IgA 항체생산 내지는 점막면역의 유도능이 낮으므로 자연 감염을 방어하는데 충분한 기능과 효과에는 한계가 있다. 이러한 현상황으로부터, 종래 백신의 결점을 해소하기 위해 현재까지 다종다양한 측면에서 많은 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 백신 항원의 질적 또는 양적 개량, 불활화 백신을 대신하는 생백신의 시험제조, 새로운 접종 루트나 점막 백신 등의 개발, 체액성 면역의 고진(高進)과 그 지속을 초래하는 아쥬반트의 스크리닝, 점막면역 아쥬반트의 개발에 특정한 시행 등등이다. 그러나 아직 안전 또한 유효한 점막 백신의 개발은 달성되어 있지 않다.

이하, 점막 백신의 개발에 대하여 설명한다.

(1)백신 항원의 증량

피하 또는 근육내 접종하는 백신 항원을 증량하고, 점막에 분비되는 IgG 및 IgA 항체량을 증가시키는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면 종래의 불활화 인플루엔자 백신에 상기 바이러스 막단백의 뉴라미니다제를 첨가 혼합하여 항체생산량을 증가시키거나, 아쥬반트로서 MF59를 첨가 혼합하는 방법 등이 시도되고 있다. 그러나 이것에는 통증을 발생시켜 부반응이 강해지는 등의 문제가 보여진다.

(2)경비투여형 백신

가장 유효하다고 생각되는 IgA 항체에 의한 감염방어를 위해 액상의 스플릿 항원을 경비에 직접 접종하는 방법이 시험되었지만, IgA 생산량이 낮은 것이 지적되고 있다. 그래서 IgA 항체생산능을 높이기 위해 스플릿 항원에 아쥬반트로서 대장균 이열성 독소나 콜레라 독소를 첨가 혼합하고, 점막면역 응답, 즉 IgA 항체생산능을 높이는 시도가 이루어지고 있지만, 아쥬반트로서의 독소의 안전성이 보증되고 있지 않는 현상황에서 치검(治檢)이 중지되어 실용화에는 도달되어 있지 않다.

(3)비강내 접종이 가능한 저온순화주를 사용하는 생백신

증식의 최적온도가 25℃이며, 39℃에서는 거의 증식하지 않는 저온순화 인플루엔자 바이러스주를 비강 내에 접종하는 방법이 실용화되어 있지만, 저온순화 친주(親株)의 약독의 메커니즘이 명확하지 않아 독성 복귀의 위험성을 부정할 수 없다. 또, 백신의 유효성분이 살아있는 바이러스 때문에 세포 내로의 침입력이 높아 면역의 초기화에는 뛰어나지만, 경도의 인플루엔자 증상이 산발하므로 인플루엔자에 감염되면 중증화되기 쉬운 고위험의 사람이나 고령자 등에게는 사용할 수 없는 등의 결점이 보여진다.

(4)기타 백신

백시니아 바이러스를 바이러스 벡터로 한 벡터 백신이나, 리버스 지네틱스에 의한 약독 생백신, DNA나 cDNA 그 자체를 유효성분으로서 사용하는 DNA 백신 등의 개발이 실험적으로 진행되고는 있지만 실용화에는 도달되어 있지 않다.

또한, 이하 면역 아쥬반트의 개발에 대하여 설명한다.

(1)면역 아쥬반트

면역 아쥬반트는 면역응답의 강화나 억제 등의 조절 활성을 갖는 물질의 총칭이며, 피접종체 내에서의 항원의 서방(徐放)이나 저류 등을 목적으로 한 투여형태에 따른 물질과, 면역응답의 고진이나 억제 등을 도모하기 위한 물질로 2가지로 대별된다. 이들 중, 전자인, 투여형태를 위한 아쥬반트로서는 예를 들면 인산알루미늄, 백반 등을 사용하는 백신이나 톡소이드가 이미 실용화되어 있다. 그러나 후자인, 면역응답의 강화·고진을 도모하기 위한 아쥬반트의 실용화는 아직 알려져 있지 않다. 예를 들면 세균유래의 BCG 생균, BCG-CWS, 엔도톡신, 글루칸 등, 합성된 MDP, 레바미솔, 폴리I-폴리C, 베스타틴 등, 또 사이토카인류의 인터페론, TNF, CSF 등이 공지이지만, 관절염, 만성 관절 류머티즘, 고γ글로불린 혈증, 빈혈 등의 아쥬반트병, 효과가 불충분함 등등의 이유에 의해 이것 등의 실용화에는 안전성과 유효성의 보증이 필요하다고 사료된다. 또, 널리 체액성 면역의 유도강화를 도모하기 위해 고등동물유래의 폐계면활성제·단백질을 아쥬반트로서 사용하는 기술(특허문헌1)이 공지이지만, 그 실용화는 아직 알려져 있지 않다.

(2)점막면역용 아쥬반트의 개발

예를 들면, 백일해 독소 B 올리고머(특허문헌2), 콜레라 독소(특허문헌3), 대장균의 이열성 엔테로톡신 B 서브유닛 LTB(특허문헌4), 전분입자(특허문헌5), 콜레라톡신 B쇄 단백질 CTB(특허문헌6), 베로독소1의 B 서브유닛(특허문헌7), 올리고뉴클레오티드(특허문헌8), 인터류킨12(비특허문헌1) 등등 다종다양으로 개발되어는 있지만, 아직 실용화에는 도달되어 있지 있다.

이상과 같이, 피하나 근육내 등으로 접종하는 종래 백신으로부터 바이러스의 자연 감염 루트인 점막에 있어서 IgA 항체의 생산을 유도하는 점막 백신으로의 변환의 필요성은 널리 또한 깊이 인식되어 있다. 특히, 21세기에 있어서의 차세대 백신으로서는 IgA 항체의 생산, 국소면역 혹은 점막면역을 유도하는, 소위 점막 백신의 개발과 실용화가 전세계에서 기대되고는 있지만, 아직 달성되어 있지 않다. 그 이유는 IgA 항체생산, 국소면역 내지는 점막면역을 유도하는 기능을 백신에 부여하기 위한 안전 또한 유효한 아쥬반트가 특정·확립되어 있지 않은 것에 있다고 사료된다.

[특허문헌1:일본 특허공표 2002-521460호 공보]

[특허문헌2:일본 특허공개 평3-135923호 공보]

[특허문헌3:일본 특허공표 평10-500102호 공보]

[특허문헌4:일본 특허공표 2001-523729호 공보]

[특허문헌5:일본 특허공표 2002-50452호 공보]

[특허문헌6:일본 특허공개 2003-116385호 공보]

[특허문헌7:일본 특허공개 2003-50452호 공보]

[특허문헌8:PCT 공개공표 WO 00/20039호 팜플렛]

[비특허문헌1:Infection and Immunity, 제71권, 4780-4788페이지, 2003년]

[비특허문헌2:Journal of neonatal Nursing, 제10권, 2-11페이지, 2004년]

[비특허문헌3:Biology of the Neonate, 제74권(suppl 1), 9-14페이지, 1998년]

[비특허문헌4:American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 제24권, 452-458 페이지, 2001년]

본 출원은 이하를 과제로 한다. 즉, 종래의 불활화 백신이나 톡소이드 등에 IgA 항체의 생산, 국소면역 혹은 점막면역을 유도하는 기능을 부여한다. 그것을 위한 안전 또한 유효한 기술의 개발. 종래의 체액성 면역 백신으로부터 안전 또한 유효한 점막면역 백신으로의 변환. 또, 알레르기의 예방과 치료, 또한 점막이나 피부를 경유해서 약물을 투여 또한 수송하는 경점막·경피 약물전달 시스템(이하 「DDS」라고 약기함)의 확립.

본 발명은 상기 과제의 해결수단으로서 경점막투여 및 경피투여를 가능하게 하는 항원약물 비히클, 상기 비히클을 원하는 항원이나 약물에 사용하는 것을 특징으로 하는, 항원 특이적 분비형 면역 글로블린A를 우선적 또한 효과적, 특히 선택적으로 생산시키는 점막면역의 유도방법, 점막 백신, 알레르기의 예방과 치료제, 및 경점막·경피 DDS를 제공한다.

본 발명이 제공하는 항원약물 비히클의 적용·범용에 의해 다종다양한 감염증에 대한 점막 백신, 알레르기의 예방과 치료제, 및 경점막·경피 DDS의 실현과 보급도 초래한다. 점막 백신은 자연 감염의 실태에 입각한 면역수단이므로, 종래 백신에 비해 현저하게 뛰어난 감염방어 효과를 발휘한다. 또, 항원약물 비히클이 유도하는 비강점막 IgA는 그곳에서의 알레르겐의 실활(失活)을 초래하여 감감작을 가능하게 한다. 또한, 다종다양한 약제로의 상기 DDS의 적용은 약물의 경점막투여 및 경피투여에 의한 예방·치료효과를 강화 또한 촉진시킨다. 그 결과, 본 발명은 인류 전체의 의료·보건·위생을 많이 향상시킴과 아울러, 세계의 의료·보건·위생분야의 종사자에게는 대망의 복음으로 된다. 아울러, 종래 및 미래의 백신이나 톡소이드 등을 함유하는 생물학적 제재, 더욱 다종다양한 약물에 널리, 주사에 비해 간편한 경점막투여 및 경피투여가 가능한 기능과 성능을 부가하는 수단을 부여한다.

도 1은, 각종 경비 인플루엔자 백신투여에 있어서의 비강(a), 폐포(b), 피하주사 인플루엔자 백신투여에 있어서의 비강(c), 폐포(d)에 있어서의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과. *는 t검정에 의한 백신 단독(AD 비히클 또는 아쥬반트 없음) 투여군과의 사이의 유의수준(p<0.01)을 나타낸다.(실시예1)

도 2는, 경비투여(a), 피하주사(b) 인플루엔자 백신에 의한 비강세정액의 항인플루엔자 항체생산 IgA와 IgG량. 흰색 막대는 IgA량을, 검은색 막대는 IgG량을 각각 나타낸다.(실시예2)

도 3은, 경비(a), 피하주사(b) 인플루엔자 백신투여에 의한 폐세정액에 있어서의 항인플루엔자 특이항체 IgA 및 IgG 생산에 대한 아쥬반트의 영향을 나타낸다.(실시예3)

도 4는, 경비(a), 피하주사(b) 인플루엔자 백신투여에 의한 혈중 항인플루엔자 특이 항체생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향을 나타낸다.(실시예4)

도 5는, 경비 인플루엔자 백신투여에 의한 비강(a), 폐포(b) 점막에 있어서의 TGF-β1 분비레벨에 대한 PSF-2, CTB의 영향을 나타낸다.(실시예6)

도 6은, 경비투여 인플루엔자 백신에 의한 비강(a), 폐포(b) 및 혈액 중(c)의 항인플루엔자 특이 항체생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향을 나타낸다.(실시예7).

도 7은, 경비 인플루엔자 백신투여에 의한 코, 폐 및 비장의 림프구로부터 분비되는 각종 사이토카인에 대한 SPF-2, CTB의 영향을 나타낸다.(실시예8).

도 8은, 경비투여 인플루엔자 백신에 의한 비강(a), 폐포(b) 및 혈액 중(c)의 항인플루엔자 특이 항체생산에 대한 PSF-3의 영향을 나타낸다.(실시예9)

이하, 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다.

1.용어 및 항원약물 비히클 구성성분의 설명

(1)항원약물 비히클

상기 비히클(Antigen and Drug Vehicle, 이하, 「AD 비히클」또는 「ADV」라고 약기함)은 항원이나 약물 등의 경점막투여 및 경피투여가 가능하게 되도록 설계(디자인)된 지질과 단백질의 복합체(콤플렉스)이다. AD 비히클은 다음의 (a)~(c)로 이루어진다.

(a)폐계면활성제 단백질B 또는 그 단편(단백질 분해효소에 의해 얻어지는 천연단편 뿐만 아니라, 유전공학이나 펩티드 합성에 의해 얻어지는 인공단편, 이러한 단편을 구성하는 아미노산의 1개이상이 치환 및/또는 결실(缺失)된 변이단편 등등도 포함함).

(b)폐계면활성제 단백질C 또는 그 단편(단백질 분해효소에 의해 얻어지는 천연단편 뿐만 아니라, 유전공학이나 펩티드 합성에 의해 얻어지는 인공단편, 이러한 단편을 구성하는 아미노산의 1개이상이 치환 및/또는 결실된 변이단편 등등도 포함함).

(c)인지질이나 지방산 등의 지질. 그 형상구조는 표면에 가시나무(棘)형상 혹은 스파이크형상의 폴리펩티드쇄를 보유한 막형상(시트형상 또는 롤링형상의 지질막)이며, 복수의 폴리펩티드쇄의 소수영역 말단을 지질막에 끼워넣어 스파이크형 상으로 식쇄한 형태로 되어 있어 종래의 지질소포(리포솜)와는 다르다.

본 발명에 따른 항원약물 비히클에 원하는 항원이나 약물 등을 공존, 접촉, 포착, 흡착 또는 결합시키면(실으면), 이러한 항원이나 약물 등의 경점막투여 및 경피투여가 가능하게 된다. 바꾸어 말하면, 상기 비히클은 항원이나 약물 등의 경점막투여 및 경피투여를 가능하게 하는, 이들의 운반물이다.

또한, AD 비히클의 구성성분, 상기 비히클의 조제·제조에 사용하는 단백질, 폴리펩티드 혹은 펩티드와 지질, 즉 폐계면활성제 단백질B 및 C, 이것 등의 단편, 이러한 단편 펩티드 중 적어도 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 변이단편 등등, 및 인지질, 지방산 등의 지질의 상세에 대해서는 후술된다.

(2)폐계면활성제

폐계면활성제는 호흡궁박증후군(RDS:Respiratory Distress Syndrome)의 치료에 1990년대 중반부터 실용화되어, 이미 현재 인간, 소, 돼지 등에 유래의 다양한 제제가 널리 시판되어 상용화되어 있다(비특허문헌2). 또, RDS 치료에 따른 활성 도메인을 포함하는 합성 펩티드 제제도 시판되고, 또 SP-B나 SP-C 아날로그의 디자인 개발이나 합성도 진행되고 있다(비특허문헌3). 폐계면활성제의 조성과 구성은 다음과 같다 : 약 90%의 지질(포스파티시셀콜린 67.3%, 포스파티딜글리세롤 19.3%, 포스파티딜세린 3.2%, 그 외의 유리지방산 등)과 약 10%의 단백질(폐계면활성제 단백질A, B, C 및 D ; 이하 「SP-A」, 「SP-B」, 「SP-C」 및 「SP-D」라고 각각 약기함)로 이루어지는 복합체이다. 분자량은 SP-A가 28-36kDa, B가 15kDa, C가 3.5kDa, 및 D가 43kDa이다. SP-A와 D는 친수성(수용성) 또한 렉틴(막 어소시에이티드)과 비슷하다. SP-B와 C는 소수성(지용성) 또한 지질결합성이고, 인지질막으로의 침입능 및 계면활성작용을 갖는다. 인간, 소, 돼지 등에 유래의 폐계면활성제 단백질 유전자는 공지이며 예를 들면 GenBank/NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov./)에 있어서의 인간 SP-B 유전자 DNA의 완전 길이 염기서열의 액세션 번호는 JO2761, 인간 SP-C(및 SP-C1)의 그것은 JO3890이다. 이하, 이 NCBI로부터 얻은 인간 SP-B 및 C의 코딩영역(CDR)과 그것이 코드하는 아미노산 서열을 기재한다.

서열번호1:인간 SP-B 유전자 DNA의 CDR 염기서열;

서열번호2:서열번호1로부터 해독된 인간 SP-B 완전 길이 아미노산 서열;

서열번호3:인간 SP-C 유전자 DNA의 CDR 염기서열;

서열번호4:서열번호3로부터 해독된 인간 SP-C 완전 길이 아미노산 서열;

서열번호5:인간 SP-C 유전자 DNA상에 차지하는 SP-C1의 CDR 염기서열;및

서열번호6:서열번호5로부터 해독된 인간 SP-C1 완전 길이 아미노산 서열.

(3)본 발명에서 사용하는 단백질 혹은 펩티드

본 발명에 따른 항원약물 비히클의 조제·제조에는 인간, 소, 돼지, 고래, 돌고래 등의 포유류에 유래, 또 다랑어, 상어, 가오리, 방어 등의 어류에 유래의 SP-B와 SP-C의 조합, 및 SP-B와 SP-C1의 조합을 각각 사용할 수 있다. 예를 들면 상기의 서열번호2, 4 및 6에 각각 기재된 완전 길이 아미노산 서열로 이루어지는 인간유래 단백질, SP-B와 SP-C의 조합, 및 SP-B와 SP-C1의 조합을 각각 사용할 수 있다. 또, 예를 들면 Kyte-Doolittle의 소수성 값에 기초하는 SP-B 및 SP-C의 소수성(지용성) 영역 및 상기 영역을 포함하는 단편, 이러한 단편 펩티드 중 적어도 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 변이단편 등등도 사용할 수 있다. 예를 들면 이하에 나타내는 서열번호7~20에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 천연 펩티드 혹은 유전자공학이나 화학합성에 의해 얻어지는 펩티드, 이것 등의 펩티드를 함유하는 이것보다 장쇄의 펩티드, 및 이러한 펩티드 중 적어도 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 변이체나 합성 아날로그 등등을 사용할 수 있다. 또, 아미노산 번호는 각 서열의 N말단을 차지하는 Met를 제1번 아미노산으로 하고, 이것으로부터 C말단방향(기재된 서열의 왼쪽으로부터 오른쪽방향)으로 순서대로 붙여진 서수(序數)로 표시되어 있다.

서열번호7:서열번호2의 제214~225번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호8:서열번호2의 제257~266번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호9:서열번호4 및 6의 제29~58번의 아미노산 서열(SP-C단편);

서열번호10:서열번호2의 제1~20번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호11:서열번호2의 제102~110번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호12:서열번호2의 제119~127번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호13:서열번호2의 제136~142번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호14:서열번호2의 제171~185번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호15:서열번호2의 제201~279번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호16:서열번호2의 제253~278번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호17:서열번호2의 제300~307번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호18:서열번호2의 제317~330번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호19:서열번호2의 제344~351번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호20:서열번호2의 제358~381번의 아미노산 서열(SP-B단편);

서열번호21:서열번호4 및 6의 제24~58번의 아미노산 서열(SP-C단편).

또한, 본 발명에 의하면 서열번호2, 7, 8, 10~20에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 SP-B와 그 단편군으로부터 선택되는 적어도 1종과, 서열번호4, 6, 9 및 21에 기재된 아미노산 서열로 이루어지면 SP-C(및 SP-C1)와 그 단편군으로부터 선택되는 적어도 1종을 조합해서 사용할 수 있다.

(4)본 발명에서 사용하는 지질

인지질로서는 폐계면활성제가 함유하는 인지질, 예를 들면 포스파티딜콜린(레시틴), 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 등의 사용이 바람직하다. 그 외, 디팔미토일글리세로포스포콜린, 디아실글리세로포스포글리세롤, 포스파티딜글리세롤(카르디올리핀), 디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산, 스핑고미엘린 등을 사용할 수 있다. 또, 지방산으로서는 라우릴산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 팔미트올레인산, 올레인산 등을 사용할 수 있다. 또한, 폐의 팽창이 활발한 고래, 다랑어, 돌고래 등의 수서동물에 유래의 지질을 사용할 수 있다.

(5)RDS 치료용의 시판의 폐계면활성제 제제

본 발명에 의하면, RDS 치료제로서의 안전성과 유효성이 관계당국에 의해 인가되고, 또 소수성 혹은 지용성 SP-B 및 SP-C 및 인지질을 함유하는 시판의 폐계면활성제, 예를 들면 상품명 서팩텐(Surfactent), Infasurf, Curosurf, Humansurf, Exosurf, Alveofact 등을 AD 비히클로서 사용할 수 있다. 또, SP-B와 SP-C 이외에 친수성 혹은 수용성 SP-A 및 SP-D를 함유하는 시판 제제에서는, 예를 들면 1-부탄올에서 이것 등의 수용성 단백질 SP-A와 SP-D를 추출하고, 이것 등을 검출한계이하로까지 제거한 후, 사용에 제공한다. 또한, AD 비히클의 조제에 있어서의 사용농도의 조정을 고려하면, 액상 제재에 비해 건조 제제의 사용이 바람직하다.

2.본 발명의 기초가 되는 신규 발견

본 발명은 상술한 배경기술의 매우 엄격한 와중에 있어서, 10여년에나 미치는 시행착오를 거듭한 필두 발명자의 탁월한 관찰력과 해석력, 그리고 깊은 학식경험과 참신한 착상에 의한 것이며, 다음의 우수한 발견에 기초한다.

(1)종래의 아쥬반트가 염증을 야기해서 항원제시능을 증강하는 것에 대하여, 본래 폐나 소화관 점막이 분비의 계면활성물질인 폐계면활성제의 4종의 단백질 유효성분, SP-A, B, C 및 D로부터 A와 D를 제거한 SP-B 및 SP-C의 조합과 인지질의 복합체, 혹은 이것 등의 지용성 영역(유효영역)을 포함하는 SP-B와 SP-C 양 단편의 합성 펩티드의 조합과 지질막의 복합체(상술한 AD 비히클)에 바이러스 항원을 공존 또는 접촉 또는 포착 또는 흡착시키면, 염증을 야기하는 일 없이 비강 점막의 항원제시세포가 활성화되고, 바이러스 항원이 상기 세포 내에 효율적으로 도입됨과 아울러, 점막이나 혈액 중에서의 IgG 생산의 유도를 일으키는 일 없이 점막의 항바이러스 IgA 생산이 효과적 또한 우선적으로, 특히 선택적으로 유도되는 것을 발견했다.

(2)또한, 종래부터 안전한 불활화 백신 항원으로서 사용되고 있는 인플루엔자 바이러스·스플릿 항원에, SP-B와 SP-C의 조합과 인지질의 복합체, 혹은 이것 등의 지용성 영역(유효영역)을 포함하는 SP-B와 SP-C 양 단편의 합성 펩티드의 조합과 지질막의 복합체(AD 비히클)를 첨가 혼합함으로써 스플릿 항원의 높은 안전성을 유지하면서, 또한 스플릿 항원 단독으로는 생백신에 비해 뒤떨어지는 항원제시세포의 활성화가 충분하게 증강되어 보충된 상태에서 분비형 IgA 생산의 선택적 유도가 실현되는 것을 발견했다.

3.상기의 발견에 이르는 경위

(1)필두 발명자는 인플루엔자 발병기서와 치료, 예방법을 해명하기 위해 예의 연구를 거듭해 왔다. 그 과정에서, 인플루엔자 바이러스 막단백질의 헤마글루티닌(HA)을 한정 분해해서 바이러스의 막융합활성과 감염능을 발현시키는 기도의 HA 프로세싱 프로테아제의 트립타제클라라를 폐계면활성제가 흡착해서 불활성화하고, 결과적으로 바이러스의 증식 사이클을 저지하는 것을 해명했다.

(2)계속되는 연구의 결과, 폐계면활성제에는 상기의 작용 이외에 선택적으로 점막의 항원제시세포를 활성화해서 바이러스 항원에 대한 면역능을 활성화하여, 분비형 IgA의 유도를 야기하지만, IgG의 유도는 일으키지 않는 것을 발견했다. 또 폐계면활성제 중의 점막면역 증강 유효성분으로서 SP-B, SP-C가 지질성분과 함께 중요함을 명확하게 하고, 이들 단백성분의 유효영역의 특정과 점막면역 증강의 유효성을 검증했다.

(3)또한, 상술한 바와 같이 기도점막의 생체방어 물질과 바이러스감염 방어의 관점에서 연구를 진행하고, 체내에 분비되어 있는 폐계면활성제가 생체내유래의 점막면역 아쥬반트로서 선택적 IgA 생산의 유도에 관여하고 있는 것을 증명했다.

(4)상기의 폐계면활성제가 본래 생체내의 생리적 작용물질이고, (a)특정의 생체물질을 흡착하는 성질이 있는 것(Kido H.,et al.FEBS Lett.Pulmonary surfactant is a potential endogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza Avirus,322(29),115-119,1992), (b)폐포Ⅱ형 세포나 클라라 세포로부터 분비된 후, 선택적으로 매크로파지에 도입되어 대사되는 것(스와베 아키라, J.Jpn.Med.Soc.Bio1.Interface ; 폐포단백증에 있어서의 계면활성제 대사이상, 33,10-13,2002), 또 (c)그 유연세포, 예를 들면 항원제시세포(수상세포)에 도입되어 대사되는 것에 주목하여 연구를 거듭했다.

그 결과, 폐계면활성제의 단백성분 중에서 SP-B, SP-C 및 지질성분만으로, 선택적으로 IgA 생산을 유도하는 점막 백신의 「AD 비히클」로서 기능하는 것, 또 SP-B의 유효성분 영역 혹은 점막면역 유도 활성 도메인이 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드임을 명확하게 했다:

SP-B 214-225 : Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly(서열번호7);및

SP-B 257-266 : Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Le-u(서열번호8).

아울러, SP-C의 유효성분 영역 혹은 점막면역 유도 활성 도메인이 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드임을 명확하게 했다:

SP-C 29-58 : Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu(서열번호9).

(5)또한, 선택적 IgA 유도의 기서로서, 폐계면활성제의 유효성분은 항원제시 수상세포의 MHC Class II, CD40, B7-2의 발현증가를 유도해서 T-림프구로의 항원제시를 효과적으로 실행하는 것 외에, 점막국소의 사이토카인 TGF-β1을 유도해서 IgA 생산 B-림프구로의 클래스 스위치를 촉진하고 있는 것을 명확하게 했다.

4.이상의 발견과 그 경위에 기초하여 완성된 본 발명의 목적은 다음과 같다

(1)제1의 목적은 점막면역 방법의 확립이다. 「AD 비히클」의 제공과 그 활용에 의해 점막면역의 유효물질인 항원 특이적 IgA 생산의 선택적 유도를 실현함과 아울러, 안전 또한 유효한(부작용이 없는) 점막면역의 유도와 그 방법을 확립한다.

(2)제2의 목적은 합성 펩티드의 사용에 의한 AD 비히클의 안전성·유효성·균질성에 따른 품질의 향상에 있다. SP-B의 점막면역 유도 활성 도메인(상술 SP-B 214-225 및 SP-B 257-266의 각 아미노산 서열로 이루어짐)의 합성 펩티드, 및 SP-C의 점막면역 유도 활성 도메인(상기 SP-C 29-58의 아미노산 서열로 이루어짐)의 합성 펩티드, 이것 등의 합성 아날로그, 또한 이것 등의 아미노산 서열을 부분으로서 포함하는 장쇄의 합성 펩티드 등등과, 폐계면활성제 지질성분과의 사이에서 조제되는 복합체(AD 비히클)를 제공하여 AD 비히클의 품질을 향상시킨다.

(3)제3의 목적은 종래 백신의 피하접종으로부터 경점막투여로의 전환에 있다. AD 비히클을 기도감염 바이러스의 불활화 백신, 예를 들면 인플루엔자, SARS, 홍역, 풍진, 유행성 이하선염 등의 불활화 백신, 또한 장관감염 바이러스의 불활화 백신, 예를 들면 로타, 폴리오 등의 불활화 백신에 이용하고, 이것 등의 피하접종 백신을 점막 백신으로 변환한다.

(4)제4의 목적은 기도, 장관 이외의 점막경유 바이러스 감염에 대한 불활화 백신, 예를 들면 에이즈, B형간염, C형간염 등의 불활화 백신에 있어서 AD 비히클을 이용할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

(5)제5의 목적은 DNA 백신, 생백신, 알레르기의 예방이나 치료 등에 대해서도 AD 비히클을 이용할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

(6)제6의 목적은 점막 이외의 IgA를 유도 가능한 면역 루트로 해서, 경피접종(도포나 접착 등)에 있어서 AD 비히클을 이용할 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다.

(7)제7의 목적은 DDS나 제약 뿐만 아니라, 농업, 어업 등등으로의 AD 비히클의 용도와 응용의 길을 여는 것에 있다.

또한, 본 발명이 제안하는 AD 비히클은 종래 면역학에서 사용되고 있는 아쥬반트와는 다음과 같이 성능과 작용을 달리한다. 즉, 종래 아쥬반트는 통상 피하 혹은 근육내 접종되어 국소의 염증반응을 일으키고, 항원제시세포나 B-, T-림프구를 끌어당겨 그 능력을 발휘하는 이물을 유효성분으로 하고 있다. 또, 장시간에 걸치는 염증반응을 유지하기 위해 항원의 서방이나 저류를 야기하는 광유나 금속염이 병용되고 있다. 또, 종래의 점막 백신·아쥬반트로서 알려져 있는 것은 상술한 바와 같이, 대장균 이열성 독소나 콜레라 독소 등의 이물이며, 위해작용이나 부작용이 생길 위험성이 있다. 이에 대하여 본 발명에 따른 AD 비히클은 국소의 염증반응을 일으키지 않는다. 또한, 생체성분유래인 점에서, 또 폐계면활성제 중의 활성 성분 혹은 그 활성 도메인이 한정되어 있음과 아울러, 이러한 도메인이나 상기 도메인 영역을 포함하는 저분자 펩티드를 사용하여 효과적인 점막 백신을 실현하고 있다. 따라서 매우 안전하고 또 비침습적이다.

5. 본 발명에 의하면, 다음 (1)~(5)가 각각 제공된다

(1)폐계면활성제 단백질B 또는 상기 단백질B에 유래의 복수의 단편으로부터 선택되는 적어도 1개의 단편, 폐계면활성제 단백질C 또는 상기 단백질C에 유래의 복수의 단편으로부터 선택되는 적어도 1개의 단편, 및 적어도 1종의 지질로 이루어지는 복합체인 항원약물 비히클.

더욱 상세하게는, AD 비히클은 다음의 I군(폐계면활성제 단백질B 및 상기 단백질B에 유래 혹은 기인하는 천연 및 합성 폴리펩티드군), Ⅱ군(폐계면활성제 단백질C 및 상기 단백질C에 유래 혹은 기인하는 천연 및 합성 폴리펩티드군) 및 Ⅲ군(인지질, 지방산 등의 지질군)의 각 군으로부터 적어도 1종씩 선택되는, 합계, 적어도 3종의 물질로 이루어지는 복합체이다.

[I군]폐계면활성제 단백질B, 및 서열번호2에 기재된 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(아미노산 번호는, N말단의 Met를 제1번 아미노산으로 하고, 이것으로부터 C말단방향으로 순차 붙여져 있음) : 제1-381번(서열번호2), 제214-225번(서열번호7), 제257-266번(서열번호8), 제1-20번(서열번호10), 제102-110번(서열번호11), 제119-127번(서열번호12), 제136-142번(서열번호13), 제171-185번(서열번호14), 제201-279번(서열번호15), 제253-278번(서열번호16), 제300-307번(서열번호17), 제317-330번(서열번호18), 제344-351번(서열번호19), 제358-381번(서열번호20), 상기의 아미노산 서열 중 적어도 1개의 서열을 활성 도메인으로서 보유하는 폴리펩티드, 상기의 각 아미노산 서열 중 적어도 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 폴리펩티드, 이것 등의 합성 아날로그, 이것 등의 당 또는 당쇄에 의한 수식체 등등.

[Ⅱ군]폐계면활성제 단백질C, 및 서열번호4에 기재된 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(아미노산 번호는 N말단의 Met를 제1번 아미노산으로 하고, 이것으로부터 C말단방향으로 순차 붙여져 있음):제1-197번(서열번호4), 제29-58번(서열번호9), 제24-58번(서열번호21), 서열번호6의 제1-191번의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 상기의 아미노산 서열 중 적어도 1개의 서열을 활성 도메인으로서 보유하는 폴리펩티드, 상기의 각 아미노산 서열 중 적어도 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 폴리펩티드, 이것 등의 합성 아날로그, 이것 등의 당 또는 당쇄에 의한 수식체 등등.

[Ⅲ군]포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 디팔미토일글리세로포스포콜린, 디아실글리세로포스포글리세롤, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산 등의 인지질, 라우릴산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 올레인산 등의 지방산 등등의 지질.

또한 이 항원약물 비히클은 상기 Ⅲ군이 시트형상 또는 롤형상의 지질막이며, 상기 I군 및 Ⅱ군의 각각 복수쇄가 소수영역 말단을 상기 지질막에 끼워넣은 상태에서 스파이크형상으로 식쇄되어 있는 것을 그 구성 및 형상 중 하나의 바람직 한 형태로 하고 있다.

(2)상기 (1)의 항원약물 비히클에 항원을 공존, 접촉, 포착, 또는 흡착시킴으로써 얻어지고, 점막면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 점막 백신.

(3)상기 (1)의 항원약물 비히클에 알레르겐을 공존, 접촉, 포착, 또는 흡착시킴으로써 얻어지고, 점막면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 알레르기의 예방 및 치료제. 그 작용효과는, 예를 들면 비래(飛來) 흡인된 삼목 화분, 진드기 등의 알레르겐의 비강 혹은 비인두점막 IgA에 의한 실활 혹은 감감작에 있다.

(4)상기 (1)의 항원약물 비히클에 약효를 나타내는 양의 약물을 공존, 접촉, 포착 또는 흡착시킴으로써 얻어지는 경점막 및/또는 경피 DDS.

(5)상기 (1)의 항원약물 비히클에 항원을 공존, 접촉, 포착 또는 흡착시킴으로써 얻어지는 점막 백신을 코 또는 상부 기도에 투여하는 것을 특징으로 하는 점막면역의 유도방법.

또한, 상기의 발명 (2), (3) 및 (5)에 있어서는 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 IgA 항체의 생산촉진에 의해, 또한 점막국소에 있어서의 TGF-β1 및 Th2 타입 사이토카인의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 바람직한 형태로 하고 있다.

6.이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 설명한다.

(1)AD 비히클의 조성

상술한 I군(폐계면활성제 단백질B 및 상기 단백질B에 유래 혹은 기인하는 천연 및 합성 폴리펩티드군), Ⅱ군(폐계면활성제 단백질C 및 상기 단백질C에 유래 혹 은 기인하는 천연 및 합성 폴리펩티드군) 및 Ⅲ군(인지질, 지방산 등의 지질군)의 3군의 건조중량%는 다음과 같다 : I군은 약 0.1~약 6.0중량%, Ⅱ군은 약 0.1~ 약 6.0중량%, 및 Ⅲ군은 약 88~약 99.8중량%이다. 항원약물 비히클의 조제에서는 중량%에 있어서 I군%+Ⅱ군%+Ⅲ군%=100%가 되도록 조정한다.

(2)AD 비히클의 조제

이하에 조제순서를 예시한다. 예를 들면 I군을 2㎎, Ⅱ군을 2㎎, 및 Ⅲ군을 96㎎ 각각 저울로 채취하여(중량%에서 I군%+Ⅱ군%+Ⅲ군%=100%), 이것 등을 5ml의 등장액, 예를 들면 생리적 식염수나 인산 완충액(PBS) 속에 균일하게 현탁시킨다. 얻어진 현탁액은 항원약물 비히클(100㎎/5ml)액으로서 사용에 제공한다. 상기 비히클은 사용시에 그때마다 조제한다. 또, 현탁에는 초음파, 호모지나이저, 믹서, 진탕기 등을 사용할 수 있다. 초음파는 과잉처리에 의한 액의 변성(점성의 증가)을 초래하기 쉬우므로, 믹서 예를 들면 박스 믹서(예를 들면 상품명 Vortex mixer)의 사용이 바람직하다.

또한, Ⅲ군의 지질 96㎎의 내역에 대해서는, 예를 들면 포스파티딜콜린 71㎎, 포스파티딜글리세롤 21㎎, 및 포스파티딜세린 4㎎의 혼합 등을 채용할 수 있다(지질량의 합계는 96㎎). 또, SP-A와 D가 제거되고, SP-B와 C의 함유가 확실한 시판의 RDS 치료용 폐계면활성제 제제를 사용할 경우에는, 그 사용서에 따라 조제된 현탁액을 그대로 항원약물 비히클액으로서 사용에 제공할 수 있다.

(3)점막 백신의 조제

백신 중의 항원량(A)에 대한 항원약물 비히클량(V)의 건조중량비(A/V)가 약 0.2~약 5로 되도록, 백신 원액에 항원약물 비히클액을 첨가 혼합하여 조제한다. 예를 들면 항원함유량이 1㎍/ml인 백신 원액 1,000ml에 대하여 중량비(A/V=1)를 채용하면, 상기 (2)에서 조제한 항원약물 비히클(100㎎/5ml)액의 첨가 혼합량은 50μl이다. 또, 균일하게 혼합하기 위해서는 호모지나이저, 믹서, 진탕기, 교반기 등을 사용할 수 있다.

(4)경점막·경피 DDS의 조제

상기 (3)과 마찬가지로 해서 항원 대신에 약물을 사용함으로써 조제할 수 있다.

<실시예>

이하, 실시예를 나타내고, 본 발명의 구성과 효과에 대하여 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이것 등의 구체예, 설명 및 기재에만 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 실시예에서 사용한 재료, 시험절차 등은 이하와 같다.

(1)폐계면활성제

「항원약물 비히클(AD 비히클)」로서 사용한 폐계면활성제는 소의 폐로부터 Howgood들의 방법(Howgood S,et al., : Effects of a surfactant-associated protein and calcium ions on the structure and surface activity of lung surfactant lipids. Biochemistry 24,184-190,1985)으로 조정한 표품(PSF-1)이나, 혹은 대부분은 이 표품을 1-부탄올에서 추출하여 수용성 단백성분 SP-A, SP-D를 제거, 혹은 검출한계이하로까지 줄인 표품(Haagsman HP,et al., : The major lung surfactant protein, SP28-36,is a calcium-dependent, carbohydrate binding protein, J.Bio1.Chem.262,13977-13880,1987)(PSF-2), 또한 주로 포스파티딜콜린이나 디팔미토일포스파티딜콜린으로 이루어지는 인지질을 전체로서 40중량%이상 함유하며, 또 폐계면활성제 지질에 유사하여 포스파티딜글리세롤을 10~20%, 포스파티딜세린이 2~5% 함유되고, 지용성 단백질의 SP-B, SP-C의 유효영역의 합성 펩티드의 어느 한쪽이나, 혹은 양쪽의 펩티드를 합해서, 0~3.5% 함유하는 표품이 사용된다. 이 표품 중에서 SP-B, SP-C의 유효영역의 양쪽의 펩티드를 겸비하는 표품(PSF-3), SP-B의 유효영역의 합성 펩티드를 갖는 표품(PSF-4), SP-C의 유효영역의 합성 펩티드를 갖는 표품(PSF-5)에 대해서도 검토했다. 혹은 PSF-1, PSF-2에 상당하는 공지의 표품, 예를 들면 상품명 서팩턴트, 인파서프(Infasurf), 큐로서프(Curosurf), 휴먼서프(Humansurf), 엑소서프(Exosurf), 알베오팩트(Alveofact) 등도 사용된다.

(2)동물

6주령, 암컷 BALB/c 마우스 및, 10주령 Hartley 모르모트를 니폰 에스엘씨 가부시키가이샤(일본·시즈오카)로부터 구입하여 사용했다. 모든 동물실험은 토쿠시마대학 의학부 실험동물센터의 감염동물사(P2 레벨)에서 행해지고, 토쿠시마대학 의학부 동물실험위원회의 가이드라인에 따라 행해졌다.

(3)스플릿형 인플루엔자 백신의 조제

인플루엔자 바이러스 A Aichi/68/2/H3N2주를 접종한 발육 계란유래 부유액(1×10⁸ Plaque forming unit(PFU))(카와사키 의과대학·미생물학교실 오오우치 마사노부 교수로부터 공여됨)을 이용하여 이하의 조작으로 스플릿형 인플루엔자 백신의 조제를 행했다. 0.004M PBS(다카라 바이오 가부시키가이샤 일본·토쿄·시가)로 하룻밤 투석된 바이러스 부유액에 β프로피오락톤(와코쥰야쿠 가부시키가이샤 일본·오사카)을 액량의 0.05%, 최종농도 8nM이 되도록 첨가하고, 빙욕(氷浴) 속에서 18시간 인큐베이트했다. 그 후, 37℃에서 1.5시간 인큐베이트함으로써 β프로피오락톤의 가수분해를 행했다. 그 후, 마지막 농도 0.1%로 되도록 Tween20(와코쥰야쿠 가부시키가이샤)을 첨가하고, 또한 Tween과 등량의 디에틸에테르(와코쥰야쿠 가부시키가이샤)를 첨가하여 4℃에서 2시간 전도 혼합했다. 이 액을 2000rpm, 5분간 원심분리함으로써 수층을 회수했다. 또 Automatic Environmental SpeedVac System(SAVANT INSTRUMENTS,INC.미국·뉴욕)을 이용하여 수층으로부터 디에틸에테르의 제거를 행했다. 이것을 Millex 0.45㎛ 필터(MILLIPORE 미국·매사추세츠)로 여과하여 불활화 스플릿형 인플루엔자 백신으로서 사용했다.

(4)면역법

상기의 제조법으로 조제한 스플릿형 인플루엔자 백신에 「AD 비히클」로서 상기의 폐계면활성제(PSF-1), 1-부탄올추출 폐계면활성제(PSF-2), SP-B, SP-C의 유효영역의 합성 펩티드와 폐계면활성제 지질(PSF-3, 4, 5), 공지의 폐계면활성제 상품, 혹은 면역 아쥬반트로서 콜레라톡신 B 서브유닛(CTB, SIGMA 미국·미주리)을 혼합해서 사용했다. 폐계면활성제 혹은 상기의 상당 표품을 백신투여에 필요한 농도로 용시(用時) PBS에 현탁하고, 실온 5분간의 초음파처리에 의해 균일한 현탁액으로 했다. 이것에 폐계면활성제 혹은 상기의 상당 표품의 건조중량으로 0.1㎍에 대하여 스플릿형 인플루엔자 백신을 0.1㎍ 첨가하고, 보르텍스 믹서에서 혼합한 후, 실온에서 1시간 정치해서 사용했다. CTB도 마찬가지로 용시로 조정하고, 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍에 대하여 0.1㎍으로 되도록 혼합했다(Watanabe I, et al., : Characterization of protective immune responses induced by nasal influenza vaccine containing mutant cholera toxin as a safe Adjuvant(C T112K). 백신 2002 ; 20 : 3443-55).

백신의 경비투여에 있어서는, 상기의 조정품을 건조중량 상당량으로서 0.1㎍/1μl Phosphate buffered saline(PBS) 용액이 되도록 PBS에서 희석하고, 이것을 1마리당 한쪽 1μl씩을 양측에 투여해서 합계 2μl를 에테르로 마취된 마우스의 양측 비강에 점비투여했다. 비교를 위해 행한 종래형 피하주사에 있어서는, 스플릿형 인플루엔자 백신을 0.1㎍/50μl 용액이 되도록 PBS에서 희석하여 이것을 마우스 경부피하에 투여했다. 대조군에는 백신액과 동량의 PBS를 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행하고, 2차면역 후 2주간째의 마우스의 비강·폐포세정액 및 혈청을 조제해서 바이러스 특이적인 IgA, IgG의 측정과 바이러스 감염실험에 사용했다.

(5)마우스 비강·폐포세정액 및 혈청의 조제

백신투여 마우스를 펜토바르비탈 마취하에서 개복 개흉하고, 기관을 절개하여 아톰 정맥 카테터절이 있는 3Fr(아톰 메디칼 가부시키가이샤 일본·도쿄)을 폐로 삽입한 후, 생리식염수 1ml를 주입하고, 이 액을 회수했다. 이것을 3회 반복해서 채취한 액, 합계 3ml를 폐포세정액으로서 사용했다. 폐세정액 채취 후, 절개된 기관으로부터 비강방향으로 아톰 정맥 카테터를 삽입하고, 1ml의 생리식염수를 주 입하여 코로부터 나온 액을 채취했다. 이 액을 비세정액으로서 사용했다. 또, 심장으로부터 채혈을 행하여 5,000rpm, 10분간의 원심분리에 의해 혈청을 조제했다.

(6)단백정량

비세정액, 폐세정액, 및 혈청의 단백함유량을 BCA Protein Assay Reagent Kit(PIERCE 미국·일리노이)를 이용하여 측정했다(Smith PK.et al., : Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal.Biochem.,150,76-85,1985). 562㎚의 흡광도는 SPECTRAmax PLUS 384(Molecular Devices Corporation 미국·캘리포니아)를 이용하여 측정했다.

(7)바이러스 감염실험 및 감염가의 평가

스플릿형 인플루엔자 백신의 조제에 사용한 바이러스주와 같은 인플루엔자 바이러스주, A Aichi/68/2/H3N2주를 감염에 사용했다. 2차 면역종료 후 2주간째의 마우스를 에테르로 마취한 후, 인플루엔자 바이러스 발육 계란유래 부유액을 양측 비강에 합계 7×10⁴ PFU/3μl를 적하해서 감염시켰다. 감염 3일 후에 비강, 폐포세정액을 상기의 요령으로 조제하여 바이러스 감염가의 평가에 사용했다. 바이러스 감염가의 평가를 A549 세포(카와사키 의과대학·미생물학교실 오오우치 마사노부 교수로부터 공여됨)를 사용하여 행했다. A549 세포는 5% 소태아혈청/DMEM(Gibco 미국·뉴욕)의 조건하에서 배양을 행했다. A549 세포를 6웰 배양 플레이트(그레이너 독일·슈투트가르트사)에 100% 컨플루언트되도록 계대하고, 24시간 후에 무혈청배지로 교환했다. 각 웰에 인플루엔자 감염 마우스의 비강·폐포세정액을 500μl씩 적하하고, CO₂ 인큐베이터에서 12시간~16시간 37℃에서 배양을 행했다. 이것에 모르모트로부터 채혈한 적혈구 1% PBS액을 첨가하여 5분간 실온하에서 정치했다. 이것을 1mM Ca²⁺/Mg²⁺ PBS를 이용하여 세정하고, 적혈구를 응집시킨 세포를 바이러스 감염세포로서 카운트하여 바이러스 감염가의 평가를 행했다(Tashiro M.,Homma M. : Pneumotropism of Sendai virus in relation to protease-mediated activation in mouse lungs.Infect.Immun.39,879-888,1983).

(8)항인플루엔자 특이적 IgA 및 IgG의 정제

ELISA assay에 있어서의 정량의 기준으로서 사용하기 위해, 특이적 항인플루엔자 IgA 및 IgG의 정제를 이하와 같이 해서 행했다. 재조합 대장균발현 단백질G 세파로스 4B 칼럼(ZYMED LABORTORIES INC,미국·샌프란시스코)을 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 인플루엔자 백신투여 및 바이러스 감염 마우스의 폐세정액으로부터 IgG 획분을 정제했다. 항마우스 IgA 염소 IgG(SIGMA)를 BrCN 활성화 세파로스 4B 칼럼(Amersham Bioscience 미국·뉴저지)에 결합하고, 단백질G의 통과하는 획분으로부터 이것을 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 IgA 획분을 정제했다. 이들 IgG, IgA 획분으로부터 바이러스 특이적 항체를 정제하기 위해, 면역에 사용한 불활화 스플릿형 인플루엔자 백신을 BrCN 활성화 세파로스 칼럼에 결합하고, IgA, IgG 획분으로부터 이것을 사용한 항원 어피니티 크로마토그래피에 의해 각각 항인플루엔자 특이적 IgA 및 IgG를 정제했다. 리간드로서의 스플릿형 인플루엔자 단백질의 칼럼으로의 커플링은 0.1M NaHCO₃/0.5M NaCl 완충액(pH 8.5) 을 이용하여 결합반응을 행하고, 유리 리간드를 0.1M 초산/0.5M NaCl 완충액(pH 8.5)을 이용하여 제거한 후, PBS(pH 7.5)에 의해 중화를 행했다. 각 어피니티 크로마토그래피는 PBS(pH 7.5)에 의해 어피니티 결합반응 및 유리 항체의 제거를 행한 후, glycine-HCl 완충액(pH 2.8)에 의해 특이항체의 용출을 행했다. 용출된 획분은 즉시 0.5M Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 의해 중화를 행하고, MilliQ수에서 투석 후 동결 건조하여 용시 PBS에 용해해서 사용했다.

(9)항인플루엔자 항체의 정량

비강, 폐포세정액 및 혈청 중의 항인플루엔자 IgA, IgG 함유량을 ELISA assay에 의해 정량했다. ELISA assay는 BETHYL LABORATORIES사(미국·텍사스)의 Mouse ELISA quantitation kit의 방법에 따라 행했다. 96 웰 Nunc 이뮤노플레이트(Nalgen Nunc International 미국·뉴욕) 각 웰에 백신 1㎍, 소혈청알부민(BSA,SIGMA 미국·미주리) 1㎍/ml PBS 용액 100μl를 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 고층화반응을 행했다. 그 후 세정액(50mM Tris, 0.14M NaCl, 0.05% Tween20, pH 8.0)으로 3회 헹궈 백신액을 제거했다. 각 웰에 0.15M NaCl, 1% BSA를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 200μl를 첨가하여 실온에서 1시간 블로킹 반응을 행했다. 각 웰을 세정액으로 3회 헹군 후, 샘플결합 완충액(50mM Tris, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20, pH 8.0)에서 적당량으로 희석한 비세정액·폐세정액 혹은 혈청을 100μl 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다.

Goat anti-mouse IgA 또는 IgG-horse rADish peroxidase(HRP)(BETHYL LABORATORIES INC.)를 2차항체로서 사용하고, TMB Microwell Peroxidase Substrate System(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.미국·메릴랜드)을 이용하여 발색반응을 행했다. 각 웰에 100μl, 2M H₂SO₄(와코쥰야쿠 가부시키가이샤)를 첨가함으로써 반응을 정지하고, 450㎚의 흡광도를 SPECTRAmax PLUS 384로 측정했다. 정량을 위한 스탠다드로서, 상기 폐세정액으로부터 정제한 항인플루엔자 IgA 및 IgG 10ng에 대해서 마찬가지로 하여 얻어진 흡광도를 사용했다.

(10)수장세포의 조제 및 플로우 사이토메트리

초회면역 후 2일째의 각 군의 마우스(1군 4마리)로부터 채취한 코, 폐, 비장으로부터 수장세포의 조제를 Gonzalez-Juarrero M의 방법(Gonzalez-Juarrero M,0rme IM. : Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 2001 ; 69 : 1127-33)에 의한 조제를 행했다. 또, 코로부터 수장세포의 조제, 및 그 콜라게나제 처리는 Asanuma H 등의 방법(Asanuma H,et al., : Characterization of mouse nasal lymphocytes isolated by enzymatic extraction with collagenase. J Immunol Methods 1995 ; 187 : 41-51)에 따라 행했다. 각 조직으로부터 조제된 수장세포를 1mM EDTA/PBS에서 세정하고, 10⁶ 세포당 FITC conjugated Anti-IA/IE(MHC class Ⅱ) 및 PE conjugated Anti CD40 혹은 FITC conjugated Anti-CD80(B7-1) 및 PE conjugated Anti CD86(B7-2)(BD 바이오사이언스 미국·뉴저지) 각 1㎍/ml를 첨가하여 50μl 1mM EDTA/PBS 현탁액으로 해서 빙상에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 1mM EDTA/PBS로 2회 세정을 행하여 유리 항체를 제거하고, 1ml의 1mM EDTA/PBS에 재현탁했다. 이것을 이용하여 BD FACS Callibur(BD 바이오사이언스)에 의해 세포 표면 수식 인자의 검출을 행했다.

(11)TGF-β1의 정량

비강, 폐포세정액 중의 TGF-β1의 분비량을 ELISA assay에 의해 정량했다. ELISA assay는 TGF-β1 ELISA kit(BIOSOURCE INTERNATIONAL 미국·캘리포니아)를 이용하여 키트에 첨부된 사용법에 따라 행했다.

(12)각종 사이토카인의 정량

비강, 폐포세정액 중, 및 비장의 림프구로부터 각각 분비되는 사이토카인(인터류킨4 : IL-4, IL-5, IL-6, IL-13)의 양을 각각의 시판 ELISA 키트에 의해 정량 했다.

(13)SP-B 및 SP-C의 합성 펩티드와 인지질로 이루어지는 PSF-3의 조제

SP-B 253-278(서열번호16)과 SP-C 24-58(서열번호21)의 각각의 펩티드를 공지의 방법에 의해 화학 합성했다. 이들 펩티드를 인지질막(디팔미토일포스파티딜콜린(75), 포스파티딜글리세롤(25), 팔미틴산(10))에 첨가해서 판형상의 인지질막을 조제하고, AD 비히클 PSF-3을 조제했다.

<실시예1>

(경비 인플루엔자 백신과 피하주사 인플루엔자 백신의 바이러스 증식억제 작용의 비교)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 「AD 비히클」로서 1-부탄올 추출(SP-A, SP-D 제거) 계면활성제(이하 PSF-2) 0.1㎍, 혹은 CTB 0.1㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 1μl씩 투여를 행했다. 피 하주사 백신으로서는 경비 백신과 동량의 백신 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-2, 또는 아쥬반트로서 CTB를 첨가하여, 전체에서 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 2차면역 2주간 경과 후에 6.6×10⁴ PFU의 인플루엔자 바이러스를 3μl PBS 용액으로서 경비 감염시켰다. 감염 3일 후에 마우스를 도살하고, 비강 및 폐포세정액을 조제하여 이들을 이용해서 바이러스 감염가의 평가를 행했다(n=15~20 ; 평균 ±SE ; *, t검정에 의한 유의수준은 백신투여군에 대하여 p<0.01).

도 1(a)와 (b)에 나타내는 바와 같이 경비 인플루엔자 백신투여의 경우, 비강과 폐세정액 중의 인플루엔자 바이러스의 증식은 백신 단독투여에 의해서도 억제되지만, PSF-2, CTB는 그 효과를 유의하게 증강해서 거의 완전할 때까지 인플루엔자의 증식을 억제하여 백신의 효과를 확실하게 했다. 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3을 사용해도 같은 정도의 효과가 얻어지고 있다. PSF-4 , -5에 대해서도 같은 현상은 확인되었지만, 효과는 감약되어 있다.

또한, 도면에는 나타내고 있지 않지만 PSF-2, CTB를 각각 단독으로 초회면역시와 2차면역시에 경비 투여해도 바이러스 증식의 억제효과는 전혀 확인되지 않고, PSF-2, CTB의 효과는 백신작용의 증강효과로 판정되었다.

한편, 피하주사 인플루엔자 백신의 경우, 도 1(c)와 (d)에 나타내는 바와 같이 비강, 폐세정액 중의 인플루엔자 바이러스의 타이터(titer)(PFU)는 백신 단독으로도 유의하게 감소해서 백신의 효과는 확인되었지만, PSF-2 , CTB의 백신작용의 증강효과는 확인되지 않았다. 즉 피하투여의 경우에는 PSF-2, CTB의 면역증강 효과는 거의 확인되지 않거나, 있어도 매우 약간이라고 추정되었다. 또, 이 실험에 있어서는 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 , CTB를 각각 단독으로 초회면역시와 2차면역시에 피하투여해도 바이러스 증식의 억제효과는 전혀 확인되지 않았다. 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3, PSF-4, PSF-5를 사용해도 백신작용의 증강효과는 확인되지 않았다.

<실시예2>

(경비(a), 피하주사(b)에 의한 인플루엔자 백신투여 후의 비강세정액 중에 있어서의 항인플루엔자 특이항체(IgA, IgO) 생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향)

도 1에 기재한 방법에서, 경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-2 0.1㎍, 혹은 아쥬반트로서 CTB 0.1㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 1μl씩 합계 2μl 투여를 행했다. 피하 백신로서는 경비 백신과 동량의 백신, PSF-2, CTB를 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 2차면역 2주간 경과 후에 6.6×10⁴ PFU의 인플루엔자 바이러스를 3μl PBS 용액으로 해서 경비 감염시켰다. 감염 3일 후에 마우스를 도살하고, 비강세정액을 조제하여 이들을 이용해서 바이러스 감염가의 평가를 행했다(n=15~20 ; 평균 ±SE ; *, t검정에 의한 유의수준은 백신투여군에 대하여 p<0.01).

그 결과를 도 2(a)와 (b)에 나타낸다. 경비투여한 스플릿형 인플루엔자 백신에 의해, 항인플루엔자 특이 IgA가 선택적으로 비강에서 생산되어서 세정액 중에 증가되지만, 이 특이적 IgA량을 PSF-2, CTB는 모두 같은 정도, 저명하게 증가시켰다. 한편 피하주사한 경우도 스플릿형 인플루엔자 백신단독에 의한 비강세정액 중의 특이적 IgA량의 증가는 확인되었지만, 비강투여에 비해 그 정도는 낮았다. 또 백신의 피하주사의 경우, PSF-2, CTB의 면역증강 효과는 IgA, IgG 생산에 있어서 모두 확인되지 않았다. 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3을 사용해도 PSF-2와 같은 정도의 효과가 얻어져 있다. PSF-4, -5에 대해서도 같은 현상은 확인되었지만, 그 효과는 감약되어 있다.

<실시예3>

(경비투여(a), 피하주사(b1) 인플루엔자 백신에 의한 폐세정액 중의 항인플루엔자 특이항체(IgA, IgO) 생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-2 0.1㎍, 혹은 아쥬반트로서 CTB 0.1㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 1μl씩 합계 2μl 투여를 행했다. 피하 백신으로서는 경비 백신과 동량의 백신, PSF-2, CTB를 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 2차면역 2주간 경과 후에 6.6×10⁴ PFU의 인플루엔자 바이러스를 3μl PBS 용액으로 해서 경비 감염시켰다. 감염 3일 후에 마우스를 도살하고, 폐포세정액을 조제하여 이들을 이용해서 항인플루엔자 특이항체 IgA, IgG 생산에 대한 항원약물 비히클의 영향을 검토했다.(n=15~20 ; 평균 ±SE ; *, t검정에 의한 유의수준은 백신투여군에 대하여 p<0.01).

도 3(a)와 (b)에 나타내는 바와 같이 백신의 비강투여의 경우와 마찬가지로, 폐세정액 중에 생산되는 항인플루엔자 특이항체에 대한 PSF-2, CTB의 생산촉진 효과는 저명하고, 양자간에 큰 차는 없었다. 이 면역증강 효과는 IgA에 특이적이고, IgG에 대하여 효과는 확인되지 않았다. 피하주사의 경우, 폐세정 중의 IgA의 증가가 확인되었지만, PSF-2, CTB의 면역증강 효과는 비강세정액 중의 경우와 마찬가지로 확인되지 않았다. 또, 도면에는 나타내고 있지 않지만 PSF-2, CTB를 각각 단독으로 초회면역시와 2차면역시에 경비투여, 피하투여해도 폐세정 중의 바이러스 특이적 IgA, IgG의 증가는 확인되지 않고, PSF-2, CTB의 효과는 백신작용의 증강효과로 판정되었다. 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3을 사용해도 같은 정도의 효과가 얻어져 있다. PSF-4, -5에 대해서도 같은 현상은 확인되었지만, 그 효과는 감약되어 있다.

<실시예4>

(경비투여(a), 피하주사(b) 인플루엔자 백신에 의한 혈액 중의 항인플루엔자 특이항체(IgA, IgO) 생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-2 0.1㎍, 혹은 아쥬반트로서 CTB 0.1㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마 우스 양쪽 코에 1μl씩 합계 2μl 투여를 행했다. 피하주사 백신으로서는 경비 백신과 동량의 백신, PSF-2, CTB를 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 2차면역 2주간 후에 마우스를 도살하고, 심장채혈을 행하여 이것으로부터 혈청을 조제하여 이들을 이용해서 항인플루엔자 항체발현량의 정량을 행했다(n=15~20, 평균 ±SE).

도 4(a)와 (b)에 나타내는 바와 같이 혈액 중 항인플루엔자 항체 IgA(흰색 막대), IgG(검은색 막대)의 생산량은 경비 백신투여의 경우 경도한 IgA, IgG의 증가가 확인되지만, PSF-2, CTB에 의한 IgA, IgG의 증가는 없고, 면역증강 효과는 확인되지 않았다. 한편, 피하주사의 경우, 스플릿형 인플루엔자 백신투여에 의한 현저한 IgG의 증가와 IgA의 명확한 증가가 확인되었지만, 여기서도 PSF-2, CTB에 의한 항체생산량의 증가는 없고, 면역증강 효과는 확인되지 않았다. 특히 피하주사의 경우, IgG가 특이적으로 혈액 중에서 증가되어 있었다. PSF-2 대신에 PSF-1을 사용해도 거의 같은 결과가 얻어져 있다(도시생략).

또한, PSF-2, CTB를 각각 단독으로 초회면역시와 2차면역시에 경비투여, 피하투여해도 혈액 중의 바이러스 특이적 IgA, IgG의 증가는 확인되지 않고, PSF-2, CTB의 효과는 백신작용의 증강효과로 판정되었다(도시생략).

<실시예5>

(경비투여(a), 피하주사(b) 인플루엔자 백신에 의한 코, 폐, 비장의 수장세포의 항원제시능에 대한 PSF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 PSF-2 0.1㎍, CTB 0.1㎍과 함께, 1μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 합계 2μl 투여를 행했다. 피하 백신으로서 경비 백신과 동량의 스플릿형 인플루엔자 백신, PSF-2, CTB를 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 2일 후에 마우스를 도살하여 코, 폐, 비장으로부터 수장세포를 조제하고, 플로우 사이토메트리에 의해 MHC classⅡ, CD40, B7-1(CD80), B7-2(CD80)의 세포표면 발현 레벨을 측정했다.

그 결과, CTB에 의해 백신을 챌린지(challenge)한 코의 수장세포(항원제시세포)의 막표면의 항원제시관련 분자, CD40, B7-2의 발현증가가 확인되고, 아쥬반트 효과가 분자의 레벨로 확인되었다. PSF-2의 경우, 코의 수장세포의 CD40, B7-2에 첨가해서 MHC Ⅱ분자의 발현증가도 확인되고, 그 면역증강 효과에 수장세포 중 적어도 3개의 분자가 관여하고 있는 것이 명확하게 되었다.

그러나 폐와 비장의 수장세포의 CD40, B7-2, MHC Ⅱ 분자에서는 명확한 변화는 확인할 수 없었다. 또, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3을 사용해도 거의 비슷한 정도의 효과가 얻어졌다. PSF-4, -5에 대해서도 같은 현상은 확인되었지만, 그 효과는 감약되어 있었다.

<실시예6>

(경비 인플루엔자 백신투여에 의한 비강(a), 폐포(b) 점막에 있어서의 TGF-β1 분비 레벨에 대한 SPF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.1㎍을 단독, 혹은 SPF-2 0.1 ㎍, CTB 0.1㎍과 함께, 1μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 합계 2μl 투여를 행했다. 피하 백신으로서 경비 백신과 동량의 백신, PSF-2, CTB를 50μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 경부피하에 투여했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 2차면역 2주간 후에 마우스를 도살하고, 비강세정액을 조제하여 이들을 이용해서 TGF-β1 분비량의 정량을 행했다(n=15~20 ; 평균 ±SE ; *, t검정에 의한 유의수준은 백신투여군에 대하여 p<0.01).

B세포가 IgA 생산세포로 분화(클래스 스위치)되기 위해서는, 생산세포가 국재하고 있는 국소의 TGF-β1 농도가 중요함이 알려져 있다(Stavnezer,J. : Regulation of antibody production and class switching by TGF-beta. J.Immunol.155(4),1647-1651,1995). 그래서 상기의 조건하에서의 비강(a), 폐포(b) 점막국소의 TGF-β1 농도를 검토했다.

스플릿형 인플루엔자 백신을 투여한 비강, 폐포점막 국소의 TGF-β1 농도는 모두 SPF-2, CTB 존재하에 유의하게 증가했다. 증가의 정도는 SPF-2, CTB 사이에서 유의한 차는 없었다. 그 결과를 도 5(a)와 (b)에 나타낸다. 생체내유래의 SPF-2는 외래독소의 CTB와 같은 정도, IgA 분비 B세포분화의 촉진을 재촉하는 TGF-β1의 농도를 증가시키고 있는 것이 판명되었다. 도면에는 나타내고 있지 않지만, PSF-2 대신에 PSF-1, PSF-3을 사용해도 거의 같은 정도의 효과가 얻어지고 있다. PSF-4, -5에 대해서도 같은 현상은 확인되었지만, 효과는 감약되어 있다. 또, PSF-2, CTB를 각각 단독으로 초회면역시와 2차면역시에 경비투여, 피하주사 투여해도 TGF-β1의 농도의 증가는 확인되지 않고, PSF-2, CTB의 효과는 백신작용의 증강효과로 판정되었다(도시생략).

<실시예7>

(경비투여 인플루엔자 백신에 의한 비강(a), 폐포(b) 및 혈액 중(c)의 항인플루엔자 특이항체(IgA, IgG) 생산에 대한 PSF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.2㎍을 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-2 0.2㎍, 혹은 아쥬반트로서 CTB 0.2㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 1μl씩 합계 2μl 투여를 행했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 각 군 모두, 2차면역 2주간 후에 마우스를 도살하고, 비강세정액, 폐포세정액 및 심장채혈에 의한 혈청을 조제하여 이들을 이용해서 항인플루엔자 항체발현량의 정량을 행했다(n=15~30, 평균 ±SE, +, p<0.01 vs.백신 단독투여).

도 6(a)와 (b)에 나타내는 바와 같이, 비강세정액 및 폐포세정액에서는 PSF-2와 백신을 투여한 경우에 혈액 중 항인플루엔자 항체 IgA(청색 원)가 현저한 증가를 나타냈지만, 도 6(c)에 나타내는 바와 같이 혈액 중에서는 IgG(적색 원)의 증가는 확인되지 않았다.

한편, CTB와 백신을 투여한 경우, IgA와 IgG가 비강세정액 및 폐포세정액에서 증가하고(도 6(a), (b)), 또한 혈액 중에서도 현저하게 증가했다(도 6(c)).

이상과 같이, CTB의 경우에는 종래부터의 보고와 같이 경비접종한 항원에 반응해서 국소면역을 성립시키는 것 이외에 전신성 면역반응(Systemic Immune Response)을 발생시켰다. 한편, PSF-2를 사용한 경우에는 국소점막 면역만을 성립시켰다.

또한, J.Freek van Iwaarden 등(비특허문헌4)은 폐로부터 매크로파지를 인공적으로 제거하면, SP-B와 지질에 의해 전신성의 면역반응을 유도할 수 있지만, 매크로파지를 제거하지 않을 경우에는 면역을 유도할 수 없음을 보고하고 있다. 또, 상기 문헌에 있어서는 전신성 면역반응을 유도하기 위해 필요한 SP-B+지질량은 250~300μl이며, 상기 실시예의 PSF-2 투여량(0.2μl)과는 크게 차가 나 있다. 또, 국소 점막면역에 대해서는 일절 언급되어 있지 않다.

<실시예8>

(경비 인플루엔자 백신투여에 의한 코, 폐 및 비장의 림프구로부터 분비되는 각종 사이토카인에 대한 SPF-2, CTB의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.2㎍을 SPF-2 0.2㎍, 또는 CTB 0.2㎍과 함께, 1μl PBS 용액으로서 BALB/c 마우스의 상부 기도에 합계 2μl 투여했다. 2차면역 2주간 후에 마우스를 도살하고, 비강, 폐포 및 비장 림프구로부터의 TGF-β1 및 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-6, IL-13)의 분비량의 정량을 행했다(n=15~20 ; 평균 ±SE ; +++, P=0.06 ; ++, P=0.05 ; +, P=0.01 vs. 백신 단독투여).

도 7(a)~(e)에 나타내는 바와 같이, PSF-2와 함께 백신 면역한 후의 점막국소(코, 폐)에서는 TGF-β1, IL-5 및 IL-6의 유의한 분비증가가 확인되었지만, IL-4 및 IL-13에서는 유의한 증가는 확인되지 않았다. 한편, 비장에서는 어느 사이토카인의 유의한 증가도 관찰되지 않았다.

이상의 결과로부터, PSF-2는 IgA를 생산하는 B세포의 분화, 유도를 촉진하는 Th2 타입의 사이토카인을 점막국소에서 증가시키는 것이 확인되었다.

<실시예9>

(경비투여 인플루엔자 백신에 의한 비강(a), 폐포(b) 및 혈액 중(c)의 항인플루엔자 특이항체(IgA, IgG) 생산에 대한 PSF-3의 영향)

경비 백신으로서 스플릿형 인플루엔자 백신 0.2㎍을 단독, 혹은 AD 비히클로서 PSF-3(서열번호16에 기재된 SP-B 단편 253~278 펩티드와 서열번호21에 기재된SP-C 단편 24~58 펩티드의 등중량 혼합물) 0.2㎍, 또는 지질성분 0.2㎍과 함께, PBS 용액으로서 BALB/c 마우스 양쪽 코에 1μl씩 합계 2μl 투여를 행했다. 4주간 후에 초회면역과 같은 방법에 의해 2차면역을 행했다. 대조군에는 각각 동 용량의 PBS를 투여했다. 각 군 모두, 2차면역 2주간 후에 마우스를 도살하고, 비강세정액, 폐포세정액 및 심장채혈에 의한 혈청을 조제하여 이들을 이용해서 항인플루엔자 항체발현량의 정량을 행했다(n=15~30, 평균 ±SE, +, p<0.01 vs. 백신 단독투여).

도 8(a)와 (b)에 나타내는 바와 같이, 비강세정액 및 폐포세정액에서는 PSF-3과 백신을 투여한 경우에 혈액 중 항인플루엔자 항체 IgA(청색 원)가 현저한 증가를 나타냈지만, IgG(적색 원)의 유의한 증가는 확인되지 않았다. 한편, 혈청 중(c)에서는 IgG(적색 원)) 및 IgA(청색 원) 모두 유의한 증강은 확인되지 않았다.

본 발명에 따른 「AD 비히클」은 항원·약물·영양제 등등의 모든 물질을, 코·기관·장관 등등의 점막 혹은 피부로부터 세포 내에 수송하는 기능을 발휘함과 아울러, 그곳에서의 IgA 생산을 우선적 또한 선택적으로 유도하므로 점막 백신, 알레르기의 예방과 치료, 경점막 및 경피 DDS, 약물이나 영양소 등의 유용물질의 경점막투여 및 경피투여를 가능하게 한다. 또, 그 임상사용 및 안전성은 국내 및 여러 외국에서 이미 인가되어 있다.

따라서, 생물학적 제재나 DDS 등에서의 의약품·제약, 기능성 식품이나 건강식품 등에서의 음식품·식량공업, 농산물의 육성·재배·질병대책·곤충구제 등에서의 농업·농약, 어병(魚病) 백신·투약 등에서의 양식어업, 방의(防蟻)·방충 등에서의 건축업이나 환경보전 등등, 매우 광범위한 산업에 있어서의 용도와 활용이 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokushima <120> “Antigen and Drug Vehicle”for mucosal or percutaneous administration, thereby a method for induction of mucosal immunity, mucosal vaccine and DDS <130> 05F021PCT <150> JP2004-111249 <151> 2004-04-05 <150> 2004-125036 <151> 2004-04-21 <160> 21 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1146 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <223> <400> 1 atg gct gag tca cac ctg ctg cag tgg ctg ctg ctg ctg ctg ccc acg 48 Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr 1 5 10 15 ctc tgt ggc cca ggc act gct gcc tgg acc acc tca tcc ttg gcc tgt 96 Leu Cys Gly Pro Gly Thr Ala Ala Trp Thr Thr Ser Ser Leu Ala Cys 20 25 30 gcc cag ggc cct gag ttc tgg tgc caa agc ctg gag caa gca ttg cag 144 Ala Gln Gly Pro Glu Phe Trp Cys Gln Ser Leu Glu Gln Ala Leu Gln 35 40 45 tgc aga gcc cta ggg cat tgc cta cag gaa gtc tgg gga cat gtg gga 192 Cys Arg Ala Leu Gly His Cys Leu Gln Glu Val Trp Gly His Val Gly 50 55 60 gcc gat gac cta tgc caa gag tgt gag gac atc gtc cac atc ctt aac 240 Ala Asp Asp Leu Cys Gln Glu Cys Glu Asp Ile Val His Ile Leu Asn 65 70 75 80 aag atg gcc aag gag gcc att ttc cag gac acg atg agg aag ttc ctg 288 Lys Met Ala Lys Glu Ala Ile Phe Gln Asp Thr Met Arg Lys Phe Leu 85 90 95 gag cag gag tgc aac gtc ctc ccc ttg aag ctg ctc atg ccc cag tgc 336 Glu Gln Glu Cys Asn Val Leu Pro Leu Lys Leu Leu Met Pro Gln Cys 100 105 110 aac caa gtg ctt gac gac tac ttc ccc ctg gtc atc gac tac ttc cag 384 Asn Gln Val Leu Asp Asp Tyr Phe Pro Leu Val Ile Asp Tyr Phe Gln 115 120 125 aac cag act gac tca aac ggc atc tgt atg cac ctg ggc ctg tgc aaa 432 Asn Gln Thr Asp Ser Asn Gly Ile Cys Met His Leu Gly Leu Cys Lys 130 135 140 tcc cgg cag cca gag cca gag cag gag cca ggg atg tca gac ccc ctg 480 Ser Arg Gln Pro Glu Pro Glu Gln Glu Pro Gly Met Ser Asp Pro Leu 145 150 155 160 ccc aaa cct ctg cgg gac cct ctg cca gac cct ctg ctg gac aag ctc 528 Pro Lys Pro Leu Arg Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Leu Asp Lys Leu 165 170 175 gtc ctc cct gtg ctg ccc ggg gcc ctc cag gcg agg cct ggg cct cac 576 Val Leu Pro Val Leu Pro Gly Ala Leu Gln Ala Arg Pro Gly Pro His 180 185 190 aca cag gat ctc tcc gag cag caa ttc ccc att cct ctc ccc tat tgc 624 Thr Gln Asp Leu Ser Glu Gln Gln Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys 195 200 205 tgg ctc tgc agg gct ctg atc aag cgg atc caa gcc atg att ccc aag 672 Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys 210 215 220 ggt gcg cta gct gtg gca gtg gcc cag gtg tgc cgc gtg gta cct ctg 720 Gly Ala Leu Ala Val Ala Val Ala Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu 225 230 235 240 gtg gcg ggc ggc atc tgc cag tgc ctg gct gag cgc tac tcc gtc atc 768 Val Ala Gly Gly Ile Cys Gln Cys Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile 245 250 255 ctg ctc gac acg ctg ctg ggc cgc atg ctg ccc cag ctg gtc tgc cgc 816 Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg 260 265 270 ctc gtc ctc cgg tgc tcc atg gat gac agc gct ggc cca agg tcg ccg 864 Leu Val Leu Arg Cys Ser Met Asp Asp Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro 275 280 285 aca gga gaa tgg ctg ccg cga gac tct gag tgc cac ctc tgc atg tcc 912 Thr Gly Glu Trp Leu Pro Arg Asp Ser Glu Cys His Leu Cys Met Ser 290 295 300 gtg acc acc cag gcc ggg aac agc agc gag cag gcc ata cca cag gca 960 Val Thr Thr Gln Ala Gly Asn Ser Ser Glu Gln Ala Ile Pro Gln Ala 305 310 315 320 atg ctc cag gcc tgt gtt ggc tcc tgg ctg gac agg gaa aag tgc aag 1008 Met Leu Gln Ala Cys Val Gly Ser Trp Leu Asp Arg Glu Lys Cys Lys 325 330 335 caa ttt gtg gag cag cac acg ccc cag ctg ctg acc ctg gtg ccc agg 1056 Gln Phe Val Glu Gln His Thr Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro Arg 340 345 350 ggc tgg gat gcc cac acc acc tgc cag gcc ctc ggg gtg tgt ggg acc 1104 Gly Trp Asp Ala His Thr Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr 355 360 365 atg tcc agc cct ctc cag tgt atc cac agc ccc gac ctt tga 1146 Met Ser Ser Pro Leu Gln Cys Ile His Ser Pro Asp Leu 370 375 380 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr 1 5 10 15 Leu Cys Gly Pro Gly Thr Ala Ala Trp Thr Thr Ser Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Ala Gln Gly Pro Glu Phe Trp Cys Gln Ser Leu Glu Gln Ala Leu Gln 35 40 45 Cys Arg Ala Leu Gly His Cys Leu Gln Glu Val Trp Gly His Val Gly 50 55 60 Ala Asp Asp Leu Cys Gln Glu Cys Glu Asp Ile Val His Ile Leu Asn 65 70 75 80 Lys Met Ala Lys Glu Ala Ile Phe Gln Asp Thr Met Arg Lys Phe Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Cys Asn Val Leu Pro Leu Lys Leu Leu Met Pro Gln Cys 100 105 110 Asn Gln Val Leu Asp Asp Tyr Phe Pro Leu Val Ile Asp Tyr Phe Gln 115 120 125 Asn Gln Thr Asp Ser Asn Gly Ile Cys Met His Leu Gly Leu Cys Lys 130 135 140 Ser Arg Gln Pro Glu Pro Glu Gln Glu Pro Gly Met Ser Asp Pro Leu 145 150 155 160 Pro Lys Pro Leu Arg Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Leu Asp Lys Leu 165 170 175 Val Leu Pro Val Leu Pro Gly Ala Leu Gln Ala Arg Pro Gly Pro His 180 185 190 Thr Gln Asp Leu Ser Glu Gln Gln Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys 195 200 205 Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys 210 215 220 Gly Ala Leu Ala Val Ala Val Ala Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu 225 230 235 240 Val Ala Gly Gly Ile Cys Gln Cys Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile 245 250 255 Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg 260 265 270 Leu Val Leu Arg Cys Ser Met Asp Asp Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro 275 280 285 Thr Gly Glu Trp Leu Pro Arg Asp Ser Glu Cys His Leu Cys Met Ser 290 295 300 Val Thr Thr Gln Ala Gly Asn Ser Ser Glu Gln Ala Ile Pro Gln Ala 305 310 315 320 Met Leu Gln Ala Cys Val Gly Ser Trp Leu Asp Arg Glu Lys Cys Lys 325 330 335 Gln Phe Val Glu Gln His Thr Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro Arg 340 345 350 Gly Trp Asp Ala His Thr Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr 355 360 365 Met Ser Ser Pro Leu Gln Cys Ile His Ser Pro Asp Leu 370 375 380 <210> 3 <211> 594 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(591) <223> <400> 3 atg gat gtg ggc agc aaa gag gtc ctg atg gag agc ccg ccg gac tac 48 Met Asp Val Gly Ser Lys Glu Val Leu Met Glu Ser Pro Pro Asp Tyr 1 5 10 15 tcc gca gct ccc cgg ggc cga ttt ggc att ccc tgc tgc cca gtg cac 96 Ser Ala Ala Pro Arg Gly Arg Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His 20 25 30 ctg aaa cgc ctt ctt atc gtg gtg gtg gtg gtg gtc ctc atc gtc gtg 144 Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val 35 40 45 gtg att gtg gga gcc ctg ctc atg ggt ctc cac atg agc cag aaa cac 192 Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His Met Ser Gln Lys His 50 55 60 acg gag atg gtt ctg gag atg agc att ggg gcg ccg gaa gcc cag caa 240 Thr Glu Met Val Leu Glu Met Ser Ile Gly Ala Pro Glu Ala Gln Gln 65 70 75 80 cgc ctg gcc ctg agt gag cac ctg gtt acc act gcc acc ttc tcc atc 288 Arg Leu Ala Leu Ser Glu His Leu Val Thr Thr Ala Thr Phe Ser Ile 85 90 95 ggc tcc act ggc ctc gtg gtg tat gac tac cag cag ctg ctg atc gcc 336 Gly Ser Thr Gly Leu Val Val Tyr Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Ile Ala 100 105 110 tac aag cca gcc cct ggc acc tgc tgc tac atc atg aag ata gct cca 384 Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Thr Cys Cys Tyr Ile Met Lys Ile Ala Pro 115 120 125 gag agc atc ccc agt ctt gag gct ctc act aga aaa gtc cac aac ttc 432 Glu Ser Ile Pro Ser Leu Glu Ala Leu Thr Arg Lys Val His Asn Phe 130 135 140 cag atg gaa tgc tct ctg cag gcc aag ccc gca gtg cct acg tct aag 480 Gln Met Glu Cys Ser Leu Gln Ala Lys Pro Ala Val Pro Thr Ser Lys 145 150 155 160 ctg ggc cag gca gag ggg cga gat gca ggc tca gca ccc tcc gga ggg 528 Leu Gly Gln Ala Glu Gly Arg Asp Ala Gly Ser Ala Pro Ser Gly Gly 165 170 175 gac ccg gcc ttc ctg ggc atg gcc gtg aac acc ctg tgt ggc gag gtg 576 Asp Pro Ala Phe Leu Gly Met Ala Val Asn Thr Leu Cys Gly Glu Val 180 185 190 ccg ctc tac tac atc tag 594 Pro Leu Tyr Tyr Ile 195 <210> 4 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Val Gly Ser Lys Glu Val Leu Met Glu Ser Pro Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Pro Arg Gly Arg Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His 20 25 30 Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val 35 40 45 Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His Met Ser Gln Lys His 50 55 60 Thr Glu Met Val Leu Glu Met Ser Ile Gly Ala Pro Glu Ala Gln Gln 65 70 75 80 Arg Leu Ala Leu Ser Glu His Leu Val Thr Thr Ala Thr Phe Ser Ile 85 90 95 Gly Ser Thr Gly Leu Val Val Tyr Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Ile Ala 100 105 110 Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Thr Cys Cys Tyr Ile Met Lys Ile Ala Pro 115 120 125 Glu Ser Ile Pro Ser Leu Glu Ala Leu Thr Arg Lys Val His Asn Phe 130 135 140 Gln Met Glu Cys Ser Leu Gln Ala Lys Pro Ala Val Pro Thr Ser Lys 145 150 155 160 Leu Gly Gln Ala Glu Gly Arg Asp Ala Gly Ser Ala Pro Ser Gly Gly 165 170 175 Asp Pro Ala Phe Leu Gly Met Ala Val Asn Thr Leu Cys Gly Glu Val 180 185 190 Pro Leu Tyr Tyr Ile 195 <210> 5 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(573) <223> <400> 5 atg gat gtg ggc agc aaa gag gtc ctg atg gag agc ccg ccg gac tac 48 Met Asp Val Gly Ser Lys Glu Val Leu Met Glu Ser Pro Pro Asp Tyr 1 5 10 15 tcc gca gct ccc cgg ggc cga ttt ggc att ccc tgc tgc cca gtg cac 96 Ser Ala Ala Pro Arg Gly Arg Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His 20 25 30 ctg aaa cgc ctt ctt atc gtg gtg gtg gtg gtg gtc ctc atc gtc gtg 144 Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val 35 40 45 gtg att gtg gga gcc ctg ctc atg ggt ctc cac atg agc cag aaa cac 192 Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His Met Ser Gln Lys His 50 55 60 acg gag atg gtt ctg gag atg agc att ggg gcg ccg gaa gcc cag caa 240 Thr Glu Met Val Leu Glu Met Ser Ile Gly Ala Pro Glu Ala Gln Gln 65 70 75 80 cgc ctg gcc ctg agt gag cac ctg gtt acc act gcc acc ttc tcc atc 288 Arg Leu Ala Leu Ser Glu His Leu Val Thr Thr Ala Thr Phe Ser Ile 85 90 95 ggc tcc act ggc ctc gtg gtg tat gac tac cag cag ctg ctg atc gcc 336 Gly Ser Thr Gly Leu Val Val Tyr Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Ile Ala 100 105 110 tac aag cca gcc cct ggc acc tgc tgc tac atc atg aag ata gct cca 384 Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Thr Cys Cys Tyr Ile Met Lys Ile Ala Pro 115 120 125 gag agc atc ccc agt ctt gag gct ctc act aga aaa gtc cac aac ttc 432 Glu Ser Ile Pro Ser Leu Glu Ala Leu Thr Arg Lys Val His Asn Phe 130 135 140 cag gcc aag ccc gca gtg cct acg tct aag ctg ggc cag gca gag ggg 480 Gln Ala Lys Pro Ala Val Pro Thr Ser Lys Leu Gly Gln Ala Glu Gly 145 150 155 160 cga gat gca ggc tca gca ccc tcc gga ggg gac ccg gcc ttc ctg ggc 528 Arg Asp Ala Gly Ser Ala Pro Ser Gly Gly Asp Pro Ala Phe Leu Gly 165 170 175 atg gcc gtg aac acc ctg tgt ggc gag gtg ccg ctc tac tac atc tag 576 Met Ala Val Asn Thr Leu Cys Gly Glu Val Pro Leu Tyr Tyr Ile 180 185 190 <210> 6 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Val Gly Ser Lys Glu Val Leu Met Glu Ser Pro Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Pro Arg Gly Arg Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His 20 25 30 Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val 35 40 45 Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His Met Ser Gln Lys His 50 55 60 Thr Glu Met Val Leu Glu Met Ser Ile Gly Ala Pro Glu Ala Gln Gln 65 70 75 80 Arg Leu Ala Leu Ser Glu His Leu Val Thr Thr Ala Thr Phe Ser Ile 85 90 95 Gly Ser Thr Gly Leu Val Val Tyr Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Ile Ala 100 105 110 Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Thr Cys Cys Tyr Ile Met Lys Ile Ala Pro 115 120 125 Glu Ser Ile Pro Ser Leu Glu Ala Leu Thr Arg Lys Val His Asn Phe 130 135 140 Gln Ala Lys Pro Ala Val Pro Thr Ser Lys Leu Gly Gln Ala Glu Gly 145 150 155 160 Arg Asp Ala Gly Ser Ala Pro Ser Gly Gly Asp Pro Ala Phe Leu Gly 165 170 175 Met Ala Val Asn Thr Leu Cys Gly Glu Val Pro Leu Tyr Tyr Ile 180 185 190 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val 1 5 10 15 Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu 20 25 30 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr 1 5 10 15 Leu Cys Gly Pro 20 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Leu Pro Leu Lys Leu Leu Met Pro 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Tyr Phe Pro Leu Val Ile Asp Tyr Phe 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ile Cys Met His Leu Gly Leu 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Leu Leu Asp Lys Leu Val Leu Pro Val Leu Pro Gly Ala Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly Ala Leu Ala Val Ala Val Ala 20 25 30 Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu Val Ala Gly Gly Ile Cys Gln Cys 35 40 45 Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg 50 55 60 Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser Met 65 70 75 <210> 16 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Ser Val Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 20 25 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Leu Cys Met Ser Val Thr Thr 1 5 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Pro Gln Ala Met Leu Gln Ala Cys Val Gly Ser Trp Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro 1 5 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Thr Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr Met Ser Ser Pro Leu 1 5 10 15 Gln Cys Ile His Ser Pro Asp Leu 20 <210> 21 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val 1 5 10 15 Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Met Gly Leu 35

Claims

폐계면활성제 단백질B 또는 서열번호2, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드로부터 선택되는 1개이상의 단편, 폐계면활성제 단백질C 또는 서열번호4, 6, 9, 또는 21의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드로부터 선택되는 1개이상의 단편, 및 1종이상의 지질로 이루어지는 복합체인 것을 특징으로 하는 국소 점막 면역 유도 촉진용 항원약물 비히클.
제1항에 있어서, 1종이상의 지질이 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 디팔미토일글리세로포스포콜린, 디아실글리세로포스포글리세롤, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산, 라우릴산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 및 올레인산로 이루어지는 지질군로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 국소 점막 면역 유도 촉진용 항원약물 비히클.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 지질이 시트형상 또는 롤형상의 막이며, 폐계면활성제 단백질B 또는 서열번호2, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드로부터 선택되는 1개이상의 단편, 폐계면활성제 단백질C 또는 서열번호4, 6, 9, 또는 21의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드로부터 선택되는 1개이상의 단편의 각각 복수쇄가, 소수영역 말단을 상기 지질막에 끼워넣은 상태에서 스파이크형상으로 식쇄되어 있는 것을 특징으로 하는 국소 점막 면역 유도 촉진용 항원약물 비히클.
제1항 또는 제2항에 기재된 항원약물 비히클에 항원을 공존, 접촉, 포착, 또는 흡착시킴으로써 얻어지고, 점막면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 점막 백신.
제6항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 IgA 항체의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 점막 백신.
제6항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 TGF-β1 및 Th2 타입 사이토카인의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 점막 백신.
제1항 또는 제2항에 기재된 항원약물 비히클에 알레르겐을 공존, 접촉, 포착, 또는 흡착시킴으로써 얻어지고, 점막면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 알레르기의 예방제 또는 치료제.
제9항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 IgA 항체의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 알레르기의 예방제 또는 치료제.
제9항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 TGF-β1 및 Th2 타입 사이토카인의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 알레르기의 예방제 또는 치료제.
제1항 또는 제2항에 기재된 항원약물 비히클에 약효를 나타내는 양의 약물을 공존, 접촉, 포착 또는 흡착시킴으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 경점막 및 경피 중 하나 이상을 통한 약물전달시스템.
제1항 또는 제2항에 기재된 항원약물 비히클에 항원을 공존, 접촉, 포착 또는 흡착시킨 점막 백신을 인간 이외의 동물의 비강 또는 상부 기도에 투여하는 것을 특징으로 하는 점막면역의 유도방법.
제13항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 IgA 항체의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 점막면역의 유도방법.
제13항에 있어서, 점막면역의 유도가 점막국소에 있어서의 TGF-β1 및 Th2 타입 사이토카인의 생산촉진에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 점막면역의 유도방법.