CN101980721B - 含有合成肽的抗原药物赋形剂和使用其的粘膜疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供利用新型的合成肽的抗原药物(AD)赋形剂和粘膜疫苗。所述抗原药物(AD)赋形剂是诱导分泌型IgA抗体产生的由以下的氨基酸序列形成的合成肽和脂质的复合体，所述粘膜疫苗是通过使诱导粘膜免疫IgA的量的抗原在该AD赋形剂中共存、接触、捕获或吸附而得到，所述氨基酸序列为：PVHLKRLm，其中，m为11～15或16～20，例如序列编号1的肽；或KnLm，其中，n为4～8，m为11～20，例如序列编号2或3的肽。

Description

含有合成肽的抗原药物赋形剂和使用其的粘膜疫苗

技术领域

本发明涉及可以经鼻、经粘膜及经皮给药的抗原药物(AD)赋形剂、和使用了该AD赋形剂的经鼻·粘膜疫苗。

背景技术

在专利文献1及2中，详细记载了与以往的钝化疫苗、类毒素等中的缺陷、粘膜疫苗及免疫佐剂的开发有关的现状等。

如这些专利文献1、2记载所述，已经广泛且深刻地认识到用在作为病毒的自然感染途径的粘膜中诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗来代替向皮下、肌肉内等接种的以往疫苗的必要性。特别是作为21世纪的下一代疫苗，全世界都期待诱导IgA抗体产生、局部免疫或粘膜免疫的所谓粘膜疫苗的开发和实用化，但尚未实现。

本申请发明人等对于这样的课题，发明了由作为肺表面活性蛋白B及/或肺表面活性蛋白C与脂质的复合体的抗原药物(AD)赋形剂，以及由该AD赋形剂和抗原形成的粘膜疫苗，并提出了专利申请(专利文献1)。进而，本申请发明人等发现通过调节AD赋形剂量(V)和抗原量(A)的重量比V/A，可以转换IgA抗体的选择性产生和IgA/IgG两抗体产生，并提出了以此为作用机制的粘膜疫苗的专利申请(专利文献2)。另外，这些专利文献1、2也公开了肺表面活性蛋白B及C的片段(肽)的有效性。

需要说明的是，作为与肺表面活性蛋白有关的合成肽，已知有专利文献3～8。

【专利文献1】国际公开WO2005/097182号公报

【专利文献2】国际公开WO2007/018152号公报

【专利文献3】日本特公第3009690号公报

【专利文献4】日本特开2004-305006号公报

【专利文献5】日本特表2006-504635号公报

【专利文献6】国际公开WO95/15980号公报

【专利文献7】日本特表2003-523348号公报

【专利文献8】国际公开WO02/32451号公报

发明内容

本申请发明人等对肺表面活性蛋白片段的各种变异体研究了抗体产生增强作用，结果发现，无论是否是大小比专利文献1、2公开的部分肽小的肽，都具有抗体产生的强诱导或增强作用，特别是具有分泌型IgA抗体的单独产生、还有分泌型IgA和血中IgG两抗体产生的出色且有效的诱导作用。

本申请发明的课题在于，提供利用了这样的新合成肽的抗原药物(AD)赋形剂和粘膜疫苗。

用于解决上述的课题的第一发明，是作为由以下的氨基酸序列构成的合成肽与脂质的复合体的抗原药物(AD)赋形剂，所述氨基酸序列为：

PVHLKRLm(其中，m为11～15或16～20)、或

KnLm(其中，n为4～8，m为11～20)。

在该药物抗原(AD)赋形剂中，合成肽优选为由序列编号1～3的任一种氨基酸序列构成的肽。

该AD赋形剂中的脂质，优选卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸及油酸的至少1种，进而优选二棕榈酰卵磷脂、磷脂酰甘油及棕榈酸的3种脂质混合物。

第二发明是通过使诱导粘膜免疫IgA的量的抗原在上述的抗原药物(AD)赋形剂中共存、接触、捕获或吸附而得到的粘膜疫苗。

该粘膜疫苗中的抗原优选为源自传染病病原体的钝化抗原或无毒化毒素。

第三发明是通过使过敏原、过敏原表位、或源自过敏原的抗原在上述的抗原药物(AD)赋形剂中共存、接触、捕获或吸附而得到的变态反应预防剂或治疗剂。

第四发明是以将上述的粘膜疫苗给药至少2次为特征的感染症的预防或治疗方法。

第五发明是以将上述的变态反应预防或治疗剂给药至少2次为特征的变态反应的预防或治疗方法。

在第四发明及第五发明的方法中，优选进行3次的疫苗给药。

本发明提供的AD赋形剂的效果的特征在于，出色并有效地诱导分泌型IgA抗体的单独产生、及分泌型IgA和血中IgG两抗体的产生。通过该AD赋形剂的应用、通用，使得针对各种各样的感染症的粘膜疫苗、变态反应的预防和治疗剂、及药剂的经粘膜·经皮给药得以实现和普及。经鼻或粘膜疫苗是依照自然感染的实际情况的免疫手段，所以与以往的疫苗相比，发挥出显著出色的感染保护效果。另外，AD赋形剂诱导的鼻腔粘膜IgA及IgG使医疗、保健、卫生有很大的提高，而且对于世界医疗、保健、卫生领域的从业者来说成为期望的福音。而且，提供对于以往及未来的含有疫苗、类毒素等的生物制剂、进而是各种各样的药物而言广泛赋予可以进行比注射更简便的经粘膜给药及经皮给药的功能和性能的手段。

具体实施方式

本申请发明的AD赋形剂(Antigen and Drug Vehicle)，是被设计(design)成可以进行抗原、药物等的经粘膜给药及经皮给药的、脂质和合成肽的复合体。

(1)合成肽

是由PVHLKRLm(其中，m为11～15或16～20)或KnLm(其中，n为4～8、m为11～20)的氨基酸序列构成的肽。即，PVHLKRLm是在PVHLKRL的C末端侧连接有m个L(Leu)残基，KnLm是N末端侧的n个K(Lys)残基和C末端侧的m个L残基连接。需要说明的是，PVHLKRLm中的m＝16是被专利文献2的序列编号27公开的公知的的肽，所以被本申请发明除外在外。

这样的合成肽例如是以下的任意肽。需要说明的是，括弧内是肽的简称。另外，氨基酸残基用1个文字符号示出。

序列编号1(SP-CL11)：PVHLKRLLLLLLLLLLL

序列编号2(K6L16)：KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL

序列编号3(K6L11)：KKKKKKLLLLLLLLLLL

需要说明的是，序列编号1(SP-CL11)是在肺表面活性蛋白C(SP-C)的氨基酸序列中的第7～12氨基酸序列(PVHLKR)附加有11个L(Leu)残基。序列编号2(K6L16)由N末端侧的6个K(Lys)残基和C末端侧的16个L残基构成。序列编号3(K6L11)由N末端侧的6个K(Lys)残基和C末端侧的11个L残基构成。

(2)脂质

作为磷脂，优选使用肺表面活性剂所含的磷脂，例如使用卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。除此之外，可以使用磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、鞘磷脂等。另外，作为脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈烯酸、油酸等。进而可以使用肺的膨胀活跃的鲸、海豚等的水生动物来源的脂质。

(3)AD赋形剂的组成

合成肽为约0.2～约12.0干燥重量％，脂质为约88～约99.8干燥重量％。

(4)AD赋形剂的制备例

例如，将溶解于甲醇的合成肽4mg、溶解于氯仿-甲醇混液的脂质96mg混合，在用蒸发器减压干固之后，用10％乙醇悬浮，冻结干燥。使该干燥物在5mL的等渗液例如生理盐水、磷酸缓冲液(PBS)中均匀悬浮。将得到的悬浮液供于用作AD赋形剂(100mg/5mL)液。该赋形剂每次都在使用时制备。另外，悬浮可以使用超声波、均化器、混合器、振荡仪等。

需要说明的是，关于脂质96mg的详细内容，例如可以采用卵磷脂64.5mg、磷脂酰甘油22.7mg、及棕榈酸8.8mg的混合等。

(5)粘膜疫苗的制备

按照使AD赋形剂量(V)相对于疫苗中的抗原量(A)的干燥重量比V/A为所希望的值的方式，向疫苗原液中添加混合AD赋形剂液进行制备。例如，关于抗原含量，采用相对于50mg/mL的疫苗原液50μL而重量比V/A＝1时，上述(4)中制备的AD赋形剂(50mg/mL)液的添加混合量为50μL。另外，均匀混合中可以使用均化器、混合器、振荡仪、搅拌器等。

抗原是指疫苗用的高度纯化的纯度为约90％以上的细菌来源抗原、病毒抗原、类毒素等，进而指杉树花粉、扁虱等来源的纯度为约90％以上的过敏原、蛋白质、糖蛋白、高分子的糖质、核酸等。关于抗原质量的A值，可以使用实测值，或可以使用源自抗原的纯度、比活性、分子量、抗原抗体反应等的计算值。

本发明的粘膜疫苗中的抗原的干燥重量(A)为约0.1～约50μg/kg，优选为约0.3～约30μg/Kg。就这样的抗原量而言，用于优先选择性诱导IgA抗体产生的V/A，优选为约0.1～约1.0。另外，用于诱导IgA及IgG两抗体产生的V/A，可以采用约1.0～约100、优选为约5～约20的范围。

另外，就如上所述的V/A而言，抗原的约60％以上与AD赋形剂结合，由此得到的粘膜免疫疫苗可以有效诱导IgA抗体产生及/或IgG抗体产生。

进而，就本申请发明中的预防或治疗方法而言，进行至少2次的疫苗给药(初次免疫和2次免疫)。进而优选进行3次的疫苗给药(初次免疫、2次免疫、3次免疫)。通过这样的多次免疫处置，可以显著增加IgA及IgG的抗体效价。需要说明的是，2次或3次的疫苗给药以1周～3周、优选为约2周的间隔进行。

以下，示出实施例进一步详细且具体地说明本申请发明，但本申请发明不限于以下的例子。

【实施例1】

使用小鼠，对粘膜疫苗的抗体产生增强作用进行试验。

(1)合成肽的制备

利用公知的方法来化学合成以下的肽。

SP-CL11：PVHLKRLLLLLLLLLLL(序列编号1)

K6L16：KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL(序列编号2)

K6L11：KKKKKKLLLLLLLLLLL(序列编号3)

SP-C(1～35)：FGIPCCPVHLKRLLIVVVVVVLIVVVIVGALLMGL(序列编号4)

RK-SP-CL：PVHLRKLLLLLLLLLLLLLLLL(序列编号5)

SP-C(1～35)(序列编号4)相当于人肺表面活性蛋白C的第1～35个氨基酸序列，与专利文献1的序列编号21相同。RK-SP-CL(序列编号5)是SP-CL11(序列编号1)的C末端侧L残基数进而多4个，另外，SP-CL11的第5～6番氨基酸序列的KR转化为RK。

(2)AD赋形剂的制备

将上述(1)中制备的合成肽分别添加到3种脂质混合物(二棕榈酰卵磷脂：DPPC、磷脂酰甘油：PG、棕榈酸：PA)中，作成板状的磷脂膜，制备AD赋形剂：SSF-2(含有SP-C(1～35))、SSF-3(含有SP-CL11)、SSF-4(含有K6L16)、SSF-5(含有RK-SP-CL)及SSF-6(含有K6L11)。3种脂质混合物的组成为PA、PG、PA(75∶25∶10、w/w/w)。另外，各肽添加与脂质混合物的0.6％摩尔相当的量。

进而，制备仅由3种脂质混合物形成的粘膜疫苗(SSF-1)制备。

(3)裂解型流感疫苗的制作

使用接种了流感病毒A Aichi/68/2/H3N2株的发育鸡蛋来源的浮游液(1×10⁸Plaque forming unit：噬斑形成单位(PFU))(由川崎医科大学·微生物学教室大内正信教授提供)，按照以下的操作制作裂解型流感疫苗。向用0.004M PBS(Takara-bio株式会社日本·东京·滋贺)透析一晚的病毒浮游液添加β-丙内酯(和光纯药株式会社日本·大阪)，使其为液量的0.05％，最终浓度为8nM，在冰浴中孵化18小时。然后，在37℃下孵化1.5小时，由此进行β-丙内酯的水解。然后，添加Tween 20(和光纯药株式会社)使最终浓度为0.1％，进而，添加与Tween等量的乙醚(和光纯药株式会社)，在4℃下颠倒混合2小时。将该液以2000rpm离心分离5分钟，回收水层。进而，使用Automatic Environmental SpeedVac System(SAVANT INSTRUMENTS，INC.美国·纽约)从水层除去乙醚。将其用Millex 0.45μm过滤器(MILLIPORE美国·马萨诸塞)进行过滤，用作钝化裂解型流感疫苗(HA)。需要说明的是，也可以同样使用基于福尔马林的钝化裂解型流感疫苗来代替β-丙内酯。

(4)粘膜疫苗的制备

在上述(3)中制作的裂解型流感疫苗(HA)中混合在上述(2)中制备的AD赋形剂(SSF-1～SSF-6)，制备了粘膜疫苗(HA+SSF-1～HA+SSF-6)。即，将各AD赋形剂以疫苗给药所需的浓度在用时悬浮于PBS中，室温下通过5分钟的超音波处理制成均匀的悬浮液。向其中添加裂解型流感疫苗，该疫苗的添加量相对于以AD赋形剂的干燥重量计的0.1μg为0.1μg，用涡流混合器进行了混合之后，室温下静置1小时后使用。

(5)动物

从日本SLC株式会社(日本·静冈)购入6周龄、雌BALB/c小鼠后使用。所有的动物实验由德岛大学医学部实验动物中心的感染动物舍(P2水平)进行，按照德岛大学医学部动物实验委员会的操作规则来进行。

(6)免疫法

在疫苗的经鼻给药中，用PBS稀释上述(4)的粘膜疫苗，使得以干燥重量相当量计成为0.1μg/1μL磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline：PBS)溶液，将其对小鼠给药，每只单侧给药1μL，两侧给药，将总计2μL向用氯胺酮(ketalar)(62.6mg/Kg)及盐酸二苯甲胺噻嗪(Selactar)(12.4mg/Kg)麻醉的小鼠的两侧鼻腔点鼻给药。对照组给与疫苗液等量的PBS。另外，也进行病毒抗原的HA单独给药。4周后通过与初次免疫同样的方法进行2次免疫。进而，关于HA单独使用和HA+SSF-4，在2次免疫2周后进行3次免疫。

(7)小鼠鼻腔·肺泡清洗液及血清的制备

制备2次免疫后第2周的小鼠的鼻腔·肺泡清洗液及血清，测定病毒特异性的IgA、IgG。另外，对于HA单独使用和HA+SSF-4，在3次免疫2周后同样测定IgA、IgG。

在戊巴比妥麻醉下对疫苗给药小鼠进行开腹开胸，切开气管向肺插入ATOM静脉导管带节3Fr(ATOM(阿童木)医疗株式会社日本·东京)后，注入生理盐水1ml，回收该液。对其反复采液3次，将得到的液体计3mL用作肺泡清洗液。在采肺清洗液之后，从已切开的气管向鼻腔方向插入ATOM静脉导管，注入1mL的生理盐水，对从鼻腔出来的液体进行采液。将该液作为鼻清洗液。进而，对心脏采血，通过5000rpm、10分钟的离心分离来制备血清。

(8)抗流感抗体的定量

通过ELISA分析对鼻腔、肺泡清洗液及血清中的抗流感IgA、IgG含量进行定量。ELISA分析按照BETHYL LABORATORIES公司(美国·得克萨斯)的Mouse ELISA quantitation kit(小鼠ELISA定量试剂盒)的方法进行。96孔Nunc immuno plate(免疫板)(Nalgen Nunc International美国·纽约)各孔进行疫苗1μg、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美国·密苏里)1μg/mLPBS溶液100μL的添加，4℃下进行一晚的固层化反应。然后用清洗液(50mM Tris，0.14M NaCl，0.05％Tween 20，pH8.0)冲洗3次，除去疫苗液。向各孔添加含有0.15M NaCl、1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)200μL，室温下进行1小时的封端反应。用清洗液对各孔冲洗3次之后，添加用样品结合缓冲液(50mM Tris，0.15M NaCl，1％BSA，0.05％Tween 20，pH8.0)适量稀释了的鼻清洗液·肺清洗液或血清100μL，室温下反应2小时。将羊抗小鼠(Goat anti-mouse)IgA或IgG-马rADish过氧化物酶(HRP)(BETHYL LABORATORIES INC.)用作二次抗体，使用TMB Microwell Peroxidase Substrate System(TMB微孔过氧化物酶底物系统)(Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.美国·马里兰)进行发色反应。向各孔中添加100μL、2MH₂SO₄(和光纯药株式会社)，由此停止反应，用SPECTRAmax PLUS 384测定450nm的吸光度。作为用于定量的标准，使用对从上述肺清洗液纯化的抗流感IgA及IgG 10ng进行同样操作而得到的吸光度。

(9)结果

将抗流感抗体的定量结果示于表1。与HA疫苗单独给药组相比，在将SSF-1～SSF-6分别与HA疫苗混合的粘膜疫苗(HA+SSF-1～HA+SSF-6)给药组中，抗流感IgA及/或IgG的产生量升高。特别是对于“含有SP-CL11的SSF-3”、“含有K6L16的SSF-4”及“含有K6L11的SSF-6”，确认了可以与天然的SP-C(1～35)相匹敌的强IgA及IgG抗体产生增强作用。另外，SSF-1和SSF-5的抗体产生增强作用大致相等，所以确认了SSF-3(SP-CL)的一部分氨基酸序列发生了改变的RK-SP-CL对抗体产生作用关联度小。

进而，HA+SSF-4的3次免疫后的抗体效价在鼻涕IgA及血清IgG的两者大大增加。根据该结果，确认了在利用本申请发明的粘膜疫苗的治疗中，优选至少2次、优选为3次的疫苗给药。

【表1】

注：HA(3)和HA+SSF-4(3)表示3次免疫后的结果。

【实施例2】

对小型猪模型中的粘膜疫苗的抗体产生增强作用进行了试验。

(1)方法的概略

小型猪使用5～10周龄(3～7kg)的Clawn系統(日本farm·鹿儿岛)。对于小型猪，在初次免疫2周前用下述的方法采鼻涕样品，用ELISA法确认抗流感抗体阴性的个体，用于接种试验。抗原使用以流感病毒ANewCaledonia株(H1N1)为原料作成的福尔马林钝化醚裂解疫苗(表中HA、以下文中称为疫苗：从阪大微生物病研究会(香川)获得)。每一头小型猪1的疫苗接种量换算成血球凝集素量为24μg。

AD赋形剂(含有SP-C(1～35)的SSF-2、含有SP-CL11的SSF-3及含有K6L16的SSF-4)采用与实施例1相同的方法作成，按照文献(Mizuno D，Ide-Kurihara M，Ichinomiya T，Kubo I，Kido H.Modifiedpulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgAproduction in response to the influenza virus antigen.J Immunol.2006；176：1122-30)的方法，作成以AD赋形剂10相对于疫苗总蛋白重量1的比例混合的200μl生理盐水悬浮液。将该悬浮液作为粘膜疫苗(分别为HA+SSF-2、HA+SSF-3、HA+SSF-4)，在用美托咪定(Medetomidine)(0.08mg/Kg)和咪达唑仑(Midazolam)(0.08mg/Kg)混合液镇静后氯胺酮(0.2mg/Kg)麻醉下，使用大鼠用经口探棒，注入到小型猪的两侧鼻腔内，每侧鼻注入100μL，对其进行经鼻疫苗接种。

在初次疫苗接种后第3周进行后续接种(2次免疫)，自初次给药时至第5周，每周进行鼻涕样品及基于颈静脉采血的血清的取样。疫苗接种周(0、3周)的样品取样在疫苗接种的2日前实施。关于鼻涕样品的取样，是用棉棒在小型猪两鼻腔内擦拭，在2mL的生理盐水中清洗该棉棒，回收鼻涕。在用于试验之前在-80℃下保存各样品。另外，对于HA单独使用、HA+SSF-2及HA+SSF-4，在2次免疫后第2周进行3次免疫，随后在3次免疫后第2周(初次免疫后第7周)进行取样。

部分改变实施例1的ELISA来测定各样品所含的抗流感IgA及IgG抗体效价。关于抗流感特异抗体的检测，将经鼻接种所使用的疫苗抗原在板上固相化，使用小型猪的鼻涕样品的4倍稀释液、以及将血清样品稀释10倍及自此2倍递增分阶段稀释的液体，实施抗体效价的测定。以作为对照组的生理盐水给药组的鼻涕样品的4倍稀释液、和血清样品的10倍稀释液的[450nm吸光度的平均值+2×标准差]为基准值，将示出超过其的吸光度的最大稀释倍率作为各样品中所含的IgA或IgG抗体效价。对于吸光度未超出基准值的样品，作为检测界限以下(N.D.)。

(2)结果

结果如表2所示。血中、鼻涕的抗体效价均在进行2次免疫1、2周后显著増加。如果用第5周的最终抗体效价进行比较，通过仅用疫苗抗原的经鼻接种诱导的抗流感抗体效价，在鼻涕IgA、血清IgG分别为28、66，与此相对，就各AD赋形剂混合粘膜疫苗接种组而言，IgA被诱导至448～784的抗体效价，IgG被诱导至832～1280的抗体效价。另外，检验的3种AD赋形剂SP-C(1～35)、K6L16、及SP-CL11的效果均为有效，在AD赋形剂之间没有统计学上的显著差异。

进而，有关HA+SSF-2及HA+SSF-4的3次免疫后(初次免疫后第7周)的抗体效价，鼻涕IgA抗体效价进一步増加，在HA+SSF-4的情况下，血清IgG抗体效价也大大増加。其结果，在仅实施2次免疫至第7周进行测定的情况(第7周*)下，鼻涕IgA及血清IgG的抗体效价大大降低，强烈示出3次免疫的有效性。其结果，也确认了在使用了本申请发明的粘膜疫苗的治疗中，优选至少2次、优选为3次的疫苗给药。

【表2】

注：7周*表示仅实施2次免疫(不进行3次免疫)至第7周测定的结果。

Claims (6)

1.一种抗原药物赋形剂，其是脂质与由序列编号2或3的氨基酸序列构成的合成肽的复合体。

2.根据权利要求1所述的抗原药物赋形剂，其中，

脂质是卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸及油酸的至少1种。

3.根据权利要求2所述的抗原药物赋形剂，其中，

脂质是二棕榈酰卵磷脂、磷脂酰甘油及棕榈酸的3种脂质混合物。

4.一种粘膜疫苗，其中，

通过使诱导粘膜免疫IgA的量的抗原在权利要求1～3中任一项所述的抗原药物赋形剂中共存、接触、捕获或吸附而得到。

5.根据权利要求4所述的粘膜疫苗，其中，

抗原是传染病病原体来源的钝化抗原或无毒化毒素。

6.一种变态反应预防剂或治疗剂，其中，

通过使过敏原、过敏原表位、或过敏原来源的抗原在权利要求1～3中任一项所述的抗原药物赋形剂中共存、接触、捕获或吸附而得到。