WO2022168889A1 - 微粒子粉末剤型粘膜ワクチン - Google Patents

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WO2022168889A1
WO2022168889A1 PCT/JP2022/004130 JP2022004130W WO2022168889A1 WO 2022168889 A1 WO2022168889 A1 WO 2022168889A1 JP 2022004130 W JP2022004130 W JP 2022004130W WO 2022168889 A1 WO2022168889 A1 WO 2022168889A1
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vaccine
glucan
protein
antigen
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博 木戸
宏一 鈴木
聡子 堺
貴士 木本
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応用酵素医学研究所株式会社
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a microparticle powder-type mucosal vaccine, more specifically, an antigen protein, a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence of KnLm, a mixed lipid, ⁇ -1,3-glucan or inulin, and an amino acid.
  • the present invention relates to a microparticulate powder formulation mucosal vaccine containing an adjuvant containing the same, and a method for producing the same.
  • the main entry points for droplet infection and contact infection are the nasal cavity and the oral cavity. Since many minor salivary glands are believed to exist in the mucosa, administration of an effective vaccine to the nasal cavity and pharynx is also one of the infection prevention measures.
  • the inventors have so far developed an artificial synthetic lung surfactant that has the function of transporting antigens to antigen-presenting cells, based on the composition of the lung surfactant that coats the mucosal surface of the lungs and trachea, which acts as a surfactant.
  • an artificial synthetic lung surfactant that has the function of transporting antigens to antigen-presenting cells, based on the composition of the lung surfactant that coats the mucosal surface of the lungs and trachea, which acts as a surfactant.
  • a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence of KnLm as an artificial synthetic lung surfactant
  • CVP carboxyvinyl polymer
  • Such a transmucosal vaccine has antigen-specific IgG induction in serum, respiratory tract mucosa (nasal washings) antigen-specific secretory IgA induction (see, for example, Patent Document 4 and Non-Patent Document 1), and cell-mediated immunity induction. It has been confirmed that it exhibits an action (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • the nasal mucosa has cilia and is covered with a mucus layer filled with mucus. It is quickly sent out to the throat along with small dust and bacteria in the air that enters the nasal cavity due to its strong excretion action, so it has hardly been put to practical use.
  • the object of the present invention is to provide a means for increasing the effects of vaccine administration, such as immune induction, by allowing the vaccine components to remain in the nasal cavity and pharynx when the vaccine is administered to the nasal cavity.
  • the present inventors decided to re-verify the formulations used for (trans)mucosal vaccines.
  • a powdery vaccine by freeze-drying a conventional liquid vaccine containing an antigen protein, a synthetic peptide consisting of a KnLm amino acid sequence, a mixed lipid, and CVP, but it was not possible to form microparticles. , a lump or string-like composition was formed, and no introduction or dispersion into the nasal cavity was observed.
  • compositions containing an antigen protein, a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence of KnLm, and a mixed lipid An attempt was made to administer a dry powder formulation obtained by freeze-drying AD vehicle) into the nasal cavity of mice, but with this composition alone, the efficiency of scattering along the airflow to the nasal cavity was poor, and it did not reach the mucous membrane of the nasal cavity. .
  • glycine which is a neutral amino acid with a small molecular weight, is used as a dispersant among amino acids that are generally known to be used as excipients having scattering and dispersing action in dry powder formulations. and AD vehicle complex, and when the composition, which was freeze-dried and powdered, was administered to the nasal cavity of mice, it reached the nasal mucosa and was able to spread properly in the nasal cavity.
  • concentrations of s-IgA in the lavage fluid after washing the nasal cavity and IgG in the serum of the administered mice were higher than expected, suggesting that the addition of glycine may enhance the effect of inducing antibody production. Therefore, I decided to investigate further.
  • the AD vehicle, various ⁇ -1,3-glucans or inulins, and combinations of various amino acids were continuously measured for s-IgA and IgG levels by changing the combinations in various ways.
  • a mixed lipid, ⁇ -1,3-glucan or inulin, and an amino acid it was confirmed that the synergistic effect remarkably enhanced the antibody production-inducing effect, leading to the completion of the present invention. rice field.
  • a microparticle powder-type mucosal vaccine comprising an antigen protein and an adjuvant containing the following (A) to (D).
  • a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is an integer of 4-8 and m is an integer of 11-20) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,
  • the microparticle powder-type mucosal vaccine according to the above [1].
  • [5] Mixed lipids from lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid
  • the microparticle powder-type mucosal vaccine according to any one of [1] to [4] above, which contains one or more selected.
  • Formulation mucosal vaccine Any one of [1] to [6] above, wherein the ⁇ -1,3-glucan is one or more selected from curdlan, laminaran, zymosan, and yeast ⁇ -glucan. microparticle powder-type mucosal vaccine.
  • the present invention is specified by the following matters.
  • a method for producing a freeze-dried microparticulate powder mucosal vaccine comprising The manufacturing method characterized by comprising the following steps (a) to (e).
  • the antigen protein alone contains an amount of the antigen protein that does not produce effective immunity-inducing and infection-protecting effects, and includes a synthetic peptide, a mixed lipid, ⁇ -1,3-glucan or inulin, and an amino acid.
  • the vaccine of the present invention When the vaccine of the present invention is administered to the nasal cavity, for example, the production of antigen-specific s-IgA antibodies in the mucous membranes of the whole body, including the nasal mucosa, and antigen-specific IgG antibodies in the serum is significantly increased, resulting in a significant increase in the production of antigen-specific IgG antibodies against infectious diseases. Excellent infection protection effect and antibody production induction effect can be obtained.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of a study on the addition of curdlan contained in microparticle powder-type mucosal vaccines.
  • Fig. 2 is a graph showing the measurement results of the particle size of the microparticle powder-type mucosal vaccine by scanning electron microscopy.
  • 20 shows images of the nasal cavity, pharynx, trachea, bronchi, and lungs of a subject mouse to which a fine particle powder formulation composition was administered through the nose or mouth 20 minutes after administration.
  • the vaccine of the present invention includes an antigen protein; and (A) a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20), (B) a mixed lipid, and (C) An adjuvant containing ⁇ -1,3-glucan and (D) an amino acid.
  • A a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20),
  • B a mixed lipid, and
  • C An adjuvant containing ⁇ -1,3-glucan and (D) an amino acid.
  • the synthetic peptide consisting of the above KnLm amino acid sequence includes n K (lysine: Lys (K)) residues on the N-terminal side and m L (leucine: Leu (L)) residues on the C-terminal side. It is not particularly limited as long as it is a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence composed continuously, wherein n is 4 to 8 and m is 11 to 20. Specifically, the following peptides are exemplified. can do. Here, amino acid residues are indicated by single-letter symbols.
  • the synthetic peptide is preferably added to the vaccine as a K6L16 peptide-containing solution dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, or trifluoroacetic acid that does not affect the synthetic peptide structure. It can be used as a K6L16 peptide-containing solution dissolved in methanol so as to obtain the concentration.
  • Lipids contained in the mixed lipid include lipids containing two or more types of lipids.
  • the two or more types of lipids include one or more types of phospholipids and one or more types of Combinations with lipids, combinations of two or more types of phospholipids, and combinations of two or more types of lipids other than phospholipids can be mentioned.
  • a combination with lipids other than lipids is preferred, and a combination of two phospholipids and one lipid other than phospholipids is more preferred.
  • phospholipids contained in natural pulmonary surfactant derived from mammals are preferable, and specific examples include phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, sphingomyelin, and the like.
  • phosphatidylcholine dipalmitoylphosphatidylcholine
  • phosphatidylserine phosphatidylglycerol
  • phosphatidylinositol phosphatidylethanolamine
  • phosphatidic acid phosphatidic acid
  • sphingomyelin phosphatidic acid
  • the mixing ratio of dipalmitoylphosphatidylcholine: phosphatidylglycerol is 10:1 to 1:10, 5:1 to 1:5, 4: 1 to 1:1 and 3.5:1 to 2.5:1 can be exemplified.
  • Lipids other than the above phospholipids include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaene. Acids and the like can be mentioned, but palmitic acid is preferred.
  • the ratio of the content of phospholipids to the content (mass) of lipids other than phospholipids is 100: 1 to lipids other than phospholipids. 30, preferably 100:5 to 15, more preferably 100:8 to 12, still more preferably 100:9 to 11, particularly preferably 100:9.5 to 10.5.
  • a composition consisting of the mixed lipid and a synthetic peptide consisting of the KnLm amino acid sequence, or a composition containing the mixed lipid and a synthetic peptide consisting of the KnLm amino acid sequence is called an "AD vehicle".
  • the ratio of the mass of the mixed lipid and the synthetic peptide in the AD vehicle, that is, the mixed lipid: synthetic peptide can be 100: 0.1 to 50, preferably 100: 0.5 to 10, and 100: 1 to 5 is more preferred, and 100:1.5-3 is even more preferred.
  • the antigen protein(s) is not particularly limited as long as it is a protein that can be used as a vaccine antigen.
  • Those expected to prevent or cure diseases include proteins derived from common pathogens, as well as inactivated antigen proteins, purified antigen proteins, partially purified antigen proteins, recombinant antigen proteins, detoxified toxin proteins, and allergens. etc., and antigen proteins including whole (mature) proteins, preproteins, preproproteins, functional or immunodominant antigenic peptides thereof, and the like can also be used.
  • pathogens examples include viruses, bacteria, parasites, and the like.
  • viruses examples include varicella virus, measles virus, poliovirus, rotavirus, influenza virus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, novel coronavirus (COVID-19), Ebola hemorrhagic fever virus, West Nile virus. viruses, hantavirus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus, HIV virus and the like.
  • SARS severe acute respiratory infection syndrome
  • COVID-19 novel coronavirus
  • Ebola hemorrhagic fever virus West Nile virus.
  • viruses hantavirus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus, HIV virus and the like.
  • bacteria examples include Bordetella pertussis, Meningococcus, Influenza type b, Streptococcus pneumoniae, and Vibrio cholerae.
  • fungi examples include Trichophyton, Candida, and Aspergillus. Examples include malaria pathogens, sleeping sickness pathogens, and the like.
  • antigenic proteins when the pathogen is influenza virus include antigenic glycoproteins present on the surface of viruses such as hemagglutinin (haemagglutinin: HA) antigenic protein, neuraminidase antigenic protein, and M protein. , internal nucleoproteins, and the like.
  • the content (mass) of the antigen protein in the vaccine of the present invention taking the case of using the hemagglutinin as an antigen protein, as the content of the hemagglutinin (HA) antigen protein, Single radial immunodiffusion (SRD), Fahey, J. et al. al., J. Immunol., 94, 84-90 (1965), the same HA stock solution is used when displaying the HA content quantitatively measured by the method and after measuring the HA content once by the SRD method.
  • the protein amount indicating the total amount of the hemagglutinin antigen protein and other antigen proteins, which is easier to measure than the SRD quantification is used.
  • the mass of HA antigen protein in the HA antigen protein solution using influenza virus hemagglutinin means the mass of total protein including HA antigen protein and antigenic proteins other than HA antigen protein. In this case, in the present invention, it is expressed as the mass of HA antigen protein (the amount of HA antigen protein) or concentration.
  • antigenic proteins other than HA antigen protein include M protein, neuramylase, nucleoprotein and the like.
  • the HA antigen protein in the vaccine of the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the dry mass of (A) can be exemplified by 0.01 ⁇ g to 3 ⁇ g/20 g mouse weight, preferably 0.05 ⁇ g to 2 ⁇ g/20 g mouse weight, more preferably 1.2 ⁇ g to 1.8 ⁇ g/20 g mouse weight. can be mentioned. Since young mature mice are often used in normal immune response tests, the mouse is 7 to 8 weeks old and weighs about 20 g.
  • the mass of the HA antigen molecule itself in the HA antigen protein is 5 to 90% by mass, preferably 10 to 80% by mass, preferably 20 to 70% by mass, and 30 to 60% by mass. preferable.
  • the method for producing the above-mentioned antigen protein (antigen peptide) is not particularly limited as long as it is a known method, but a production method capable of securing a sufficient amount of the antigen protein for vaccine production is preferable, and a method of producing by genetic recombination technology. and a method of producing by chemical synthesis.
  • the mass ratio of the mixed lipid to the antigen protein is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be exhibited, but the mixed lipid can be 0.1 to 20 times the antigen protein, and can be 1 to 18 times. is preferred, 5 to 15 times is more preferred, 8 to 12 times is more preferred, and 9 to 11 times is even more preferred.
  • the ⁇ -1,3-glucan in the present invention is a polysaccharide containing glucose polymer linked by ⁇ -1,3-glycosidic bond and having glucose as a main constituent sugar. and is not particularly limited as long as it is a ⁇ -1,3-glucan that can play a role in the present invention, and a card that is a water-insoluble polysaccharide having a linear ⁇ -1,3-glucan structure
  • Curdlan known as a storage polysaccharide contained in seaweed and mushrooms, is a polysaccharide consisting of a ⁇ -1,3-linked and ⁇ -1,6-linked glucose backbone.
  • Laminaran a water-soluble glucose polymer with a ratio of .,6 bonds of about 3:1, a suspension of polysaccharides derived from the cell walls of budding yeast such as yeast, mannan Zymosan and Yeast ⁇ -Glucan, which contain a polysaccharide composed mainly of ⁇ -1,3-glucan as an active ingredient, can be mentioned.
  • the above inulin is a kind of dietary fiber having a structure in which about 2 to 60 fructose are linked to one glucose.
  • the amount of ⁇ -1,3-glucan or inulin to be added in the vaccine of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount that can effectively exhibit adjuvant action in the present invention. 5 to 50 times, preferably 10 to 30 times, or 10 to 1000 times, preferably 25 to 500 times, more preferably 50 to 200 times, more preferably 75 to 150 times the mass of the antigen protein. A double amount can be exemplified.
  • the amino acid in the vaccine of the present invention can be used as an excipient so that the administered mucosal vaccine in the form of microparticle powder of the present invention can easily reach the mucosa of the nasal cavity and the like on air currents, and can also be used as an anti-infective antibody.
  • Any amino acid that does not cause a decrease in the induction effect can increase the amount of s-IgA production in the mucosa, and can enhance the antibody production induction effect such as significantly increasing the amount of IgG production in serum.
  • ⁇ -amino acids that are major structural units of proteins in living organisms are preferable because of their availability, such as glycine (Gly), alanine (Ala), isoleucine (Ile), and leucine.
  • One or two or more amino acids are preferred, one or two or more amino acids selected from glycine, alanine, serine, threonine, leucine, isoleucine and phenylalanine are more preferred, and one or two or more amino acids selected from glycine, alanine, leucine and phenylalanine are preferred.
  • Amino acids are more preferred, glycine or phenylalanine are more preferred, and one or more amino acids selected from glycine, serine, leucine, phenylalanine, and methionine are more preferred, and one or more selected from glycine, serine, leucine, and phenylalanine.
  • glycine, alanine, leucine and/or phenylalanine are preferred, glycine and phenylalanine are most preferred, and phenylalanine is particularly preferred.
  • cysteine it may be desirable to exclude cysteine, and it may be desirable to exclude amino acids having SH groups in their side chains, such as methionine and cysteine.
  • the amount of amino acid to be added in the vaccine of the present invention is not particularly limited as long as the above effect of the present invention is exhibited.
  • 10 to 3000 times the mass of the antigen protein preferably 100 to 1500 times the mass, more preferably 150 to 750 times the mass, and still more preferably 200 to 400 times the mass.
  • the number of administrations of the vaccine of the present invention is not particularly limited as long as the vaccine of the present invention is effective, and may be once (primary immunization only) or multiple times of 2 or more times.
  • Primary immunization and secondary immunization) or three times (primary immunization, secondary immunization and tertiary immunization) can be preferably mentioned, and after 1 week to 1 month from the first administration, preferably after 10 days to 3 weeks , More preferably, the second administration is performed after 2 weeks, and the third administration is preferably 1 week to 1 month after the second administration, and more preferably 10 days to 3 weeks. More preferably after a week has passed.
  • the microparticulate powder-type mucosal vaccine of the present invention contains antigen proteins in an amount that does not produce effective immunity-inducing and infection-protecting effects, and comprises synthetic peptides, mixed lipids, ⁇ -1,3-glucan or inulin. and an amino acid to enhance the production of antigen-specific s-IgA in the mucous membrane, or to enhance the production of antigen-specific IgG in the blood for effective immune induction and infection protection effects. It can also be said that it is a use invention with a limited use, which is used for
  • the significant increase in the antibody production-inducing effect is, for example, the production of s-IgA in nasal lavage fluid of mice by 4 times or more, preferably, compared to the administration of an antigen protein, an AD vehicle, and an amino acid. is 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 15 times or more, and / or the production of IgG in serum is 1.5 times or more, preferably 2.5 times or more, more It is preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more, and still more preferably 10 times or more.
  • the amount of antibody that induces effective immunity induction means that the virus infection inhibitory effect HI value is at least the international evaluation standard for influenza vaccines (HI ⁇ 40). It can be exemplified that
  • a method for producing the microparticle powder-type mucosal vaccine of the present invention (1) an antigenic protein; (2) a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20); (3) mixed lipids; (4) amino acids; (5) ⁇ -1,3-glucan or inulin;
  • a method for producing a freeze-dried microparticle powder mucosal vaccine comprising (a) preparing an AD-vehicle suspension by suspending the synthetic peptide and mixed lipids in water; (b) adding an antigen protein to the AD-vehicle suspension and repeating heating and stirring one or more times to form an antigen protein-AD vehicle complex; (c) adding ⁇ -1,3-glucan to the antigen protein-AD vehicle complex and then stirring to prepare a uniform glucan-added antigen protein-AD vehicle complex; (d) adding an amino acid to the glucan-added antigen protein-AD vehicle complex and stirring to prepare a uniform crude vaccine solution; (e
  • step (b) step of freeze-drying the antigen protein-AD vehicle complex prepared in step (b) to prepare an antigen protein-AD vehicle lyophilisate; And, before the above step (c), (b'') A step of suspending the antigen protein-AD vehicle lyophilizate prepared in step (b') in water or physiological saline to prepare an antigen protein-AD vehicle complex (homogeneous suspension); may be provided.
  • a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20) and a mixed lipid are suspended in water.
  • the liquid is not particularly limited as long as it is prepared by turbidity, and the mass ratio of the mixed lipid and the synthetic peptide in the AD-vehicle suspension, that is, the mixed lipid:synthetic peptide is 100: 0.1 ⁇ 50, preferably 100:0.5-10, more preferably 100:1-5, even more preferably 100:1.5-3.
  • the antigen protein-AD vehicle complex prepared in the above step (b) is obtained by heating and stirring the AD-vehicle suspension prepared in the above step (a) once or twice or more. , complexes formed by hydrophobic interactions and the like.
  • the stirring includes adding the antigen protein in a water bath and shaking and stirring for 5 to 20 minutes, preferably 8 to 12 minutes.
  • the heating is generally 20 to 60°C. , Preferably, heating in a water bath at 40 to 50 ° C. can be mentioned, but it is desirable to select the temperature to be heated according to the heat stability of the antigen protein. 43°C is preferred, and 41-42°C is more preferred.
  • glucan (or inulin)-added antigen protein-AD vehicle complex prepared in the step (c) above a homogeneous mixture obtained by adding ⁇ -1,3-glucan to the antigen protein-AD vehicle complex and then stirring It is preferable to add ⁇ -1,3-glucan or inulin after the antigen protein-AD vehicle complex is formed. If ⁇ -1,3-glucan or inulin is added before the antigen protein-AD vehicle complex is formed, the adjuvant effect of the AD vehicle may be lost. In order to prepare a uniform glucan-added antigen protein-AD vehicle complex, it is preferable to use a homogenizer, mixer, shaker, stirrer, or the like.
  • the crude vaccine solution prepared in the above step (d) is particularly a homogeneous crude vaccine solution obtained by adding one or more amino acids to the glucan-added antigen protein-AD vehicle complex and then stirring.
  • the amino acid is preferably added after the antigen protein-AD vehicle complex is formed by the antigen protein and the AD vehicle without limitation. If the amino acid is added prior to formation of the antigen protein-AD vehicle complex, the adjuvant effect of the AD vehicle may be lost.
  • the fine particle powder formulation mucosal vaccine prepared in the above step (e) is not particularly limited as long as it is a vaccine obtained by freeze-drying a vaccine crude liquid to form a fine particle powder formulation. It can be performed using a known freeze-dryer, and is not particularly limited according to the method of freeze-drying the crude vaccine solution to form a fine particle powder. After freezing the crude vaccine solution for 5 hours or more, the frozen sample was placed in the freeze dryer and dried for 10 minutes under the conditions of vacuum degree of 4.0 to 6.0 pa, trap temperature of -47 to -50 ° C., and ambient temperature of room temperature. It is preferable to form a fine particle powder formulation by freeze-drying for at least one hour. The above freeze-drying can be performed using an apparatus capable of freeze-drying under the above conditions.
  • the antigen protein-AD vehicle lyophilisate prepared in the step (b') is not particularly limited as long as it is a solid obtained by lyophilizing the antigen protein-AD vehicle complex.
  • the pre-freezing process temperature of can be -80°C to -50°C, and the freeze-dried product is preferably stored at -20°C to -30°C.
  • the antigen protein-AD vehicle complex uniform suspension in the above step (b'') is obtained by suspending the antigen protein-AD vehicle lyophilisate prepared in the step (b') in water or physiological saline. Suspensions prepared by adjusting to a predetermined concentration suitable for vaccine formulation can be mentioned.
  • the antigen protein-AD vehicle complex is formed can be confirmed by, for example, using a calorimeter to detect the hydrophobic interaction signal between the antigen protein and the AD vehicle molecule.
  • the calorimeter can measure the reaction heat generated when the antigen protein interacts with the AD vehicle at a constant temperature, and by measuring the reaction heat, the interaction between molecules can be confirmed.
  • the amount of antigen protein recovered in the AD vehicle fraction precipitated by centrifugation can be calculated from the amount of antigen protein in the supernatant before and after centrifugation. .
  • the present invention it is preferable to confirm that 70% or more of the antigen protein is recovered in the AD vehicle fraction, and to use it after judging that it is a preparation in which a complex is formed.
  • a method for calculating the binding rate by centrifugation (binding rate calculation method) for calculating the ratio of formation of the antigen protein-AD vehicle complex is exemplified below.
  • HA solution A
  • [HA + AD vehicle] solution B
  • C solution sample after centrifugation
  • D solution sample after centrifugation
  • the protein concentration of each sample is measured using a BCA protein assay kit, and the "bound HA protein amount co-precipitated with the AD vehicle" collected in the precipitated fraction by centrifugation is measured to form a complex.
  • the coupling rate between HA and AD vehicles can be calculated.
  • the formula for calculating the binding rate is shown below.
  • a method for administering the above-mentioned vaccine known methods can be used.
  • the Eppendorf tube is filled with the required amount, and the step (e) is carried out to obtain an "eppendorf tube filled with vaccine crude liquid fine particle powder dosage form".
  • the tip of the Eppendorf tube is opened, pressed against the entrance of the nose of the test animal, and the Eppendorf tube is vigorously pushed with a finger, and fine particle powder is delivered to the nasal cavity by spraying with air currents. can do.
  • Methods of administration to humans include methods of administration using known means suitable for intranasal administration of dry powder formulations for nasal sprays, unit dose spray devices, and the like.
  • administration to the nasal cavity can also be performed by nasal inhalation, tracheal or bronchial inhalation, and transpulmonary inhalation.
  • the particle size of the fine particle powder when the nasal cavity is the main destination is preferably 5.0 ⁇ m to 80 ⁇ m, more preferably 6.5 ⁇ m to 50 ⁇ m, and even more preferably 6.5 ⁇ m to 40 ⁇ m.
  • the particle size of the fine particle powder when the trachea or bronchial inhalation is the main destination is preferably 3.0 ⁇ m to 5.0 ⁇ m, and the particle size of the fine particle powder when the alveoli is the main destination is 0.5 ⁇ m to 3 ⁇ m is preferred. If it is 0.5 ⁇ m or less, there is a possibility that it is likely to be discharged outside the body by exhalation.
  • mucous membranes in the present invention include mucous membranes covering the nasal cavity; tracheal mucosa; bronchial mucosa; alveolar mucosa; The presence or absence of production of antigen-specific secretory IgA (s-IgA) antibody secreted in the mucous membrane and the amount of production can be determined by measuring the amount of s-IgA) antibody in secretions secreted in the mucous membrane.
  • s-IgA antigen-specific secretory IgA
  • nasal washings in the nasal cavity As a method for measuring the amount of antibody in the above-mentioned secretions, nasal washings in the nasal cavity, vaginal washings in the vaginal mucosa, small bowel washings in the small intestine, feces in the large intestine, tracheal washings in the tracheal mucosa, bronchial washings in the bronchi, alveoli
  • nasal washings in the nasal cavity vaginal washings in the vaginal mucosa
  • small bowel washings in the small intestine feces in the large intestine
  • tracheal washings in the tracheal mucosa bronchial washings in the bronchi
  • alveoli A method of measuring the amount of each antibody in alveolar lavage fluid, etc. in
  • Antigen-specific s-IgA (secretary immunoglobulin A) antibody which is induced in the mucosa after administration of the vaccine of the present invention and is often found in secretions secreted in the mucosa, is a pathogen on the mucosal surface. It has anti-infective activity that binds to and toxins and negates their function.
  • antigen-specific IgG antibodies found in the blood after administration of the vaccine of the present invention transmit antigen information to the splenic lymphoid tissue via the mucosal lymphoid tissue at the site of vaccination, are memorized, and are produced in the splenic lymphoid tissue.
  • the vaccine of the present invention can be formulated by known means, and pharmacologically acceptable bases and/or additives can be added as appropriate.
  • Examples of the pharmacologically acceptable bases and/or additives include lubricants, binders, solvents, tonicity agents, buffers, soothing agents, stabilizers, and the like. Additives such as preservatives, pH adjusters, cooling agents, antioxidants, wetting agents, corrigents and the like may also be added as necessary.
  • the vaccine of the present invention is an inhalation-type or aerosol-type uniform fine particle powder dosage form that exerts an infection-protecting effect against respiratory tract infections that pass through the nasal cavity to the pharynx.
  • Example 1 [Antibody-induced experimental animals] Induction of anti-influenza virus-specific s-IgA (Nasal wash s-IgA) in nasal wash and anti-influenza virus-specific IgG antibody (Serum IgG) in serum in microparticle powder-type mucosal vaccine using mice action was evaluated. All subsequent animal experiments were conducted in the infected animal house (P2 level) of the Experimental Animal Center, Faculty of Medicine, Tokushima University, in accordance with the guidelines of the Animal Care and Use Committee, Faculty of Medicine, Tokushima University.
  • mice BALB/c mice (7-8 weeks old, female, average weight 20 g) were purchased from Charles River Japan, Inc. and used.
  • microparticle powder dosage form vaccine In order to verify the effectiveness of a vaccine using hemagglutinin (HA) of influenza virus as an antigen protein, various microparticle powder vaccines were prepared for administration to the nasal cavity of mice.
  • HA hemagglutinin
  • Synthetic peptide K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL) (SEQ ID NO: 1) (manufactured by GenScript) with a purity of 95% or more was dissolved in methanol to a concentration of 5.0 mg/mL to prepare a K6L16 peptide-containing solution.
  • Influenza virus hemagglutinin (HA) was used as the antigen protein.
  • Daiichi Sankyo Co., Ltd. prepared a vaccine antigen solution from the vaccine strain provided by the National Institute of Infectious Diseases, and prepared an HA antigen protein solution from the A/Singapore/GP1908/2015 (H1N1) strain provided to Tokushima University for a fee. did.
  • the antigen protein-AD vehicle complex is lyophilized, stored at ⁇ 30° C. as an antigen protein-AD vehicle lyophilisate, thawed and suspended in pure water for use, and the antigen protein-AD vehicle complex is suspended. used as a liquid.
  • the amount of the HA antigen molecule itself in the antigen protein was approximately 36% of the amount of the antigen protein in the lot used.
  • Freeze drying Freeze drying was performed using a desktop freeze-dryer (Labconco FZ-4.5 vacuum freeze-dryer, Asahi Life Science Co., Ltd.). After pre-freezing the crude vaccine solution at -80°C for 5 hours or more, the frozen sample was placed in a freeze dryer under the conditions of a vacuum degree of 5.0 pa, a trap temperature of -50 to -47°C, and an ambient temperature of room temperature. Freeze-drying was performed over 10 hours.
  • administering method to mice [Administration method of fine particle powder type mucosal vaccine]
  • the fine particle powder formulation mucosal vaccine was administered to each nostril of each subject mouse anesthetized with ketalal (62.6 mg/Kg mouse weight) and theratal (12.4 mg/Kg mouse body weight). Administration was performed by applying an Eppendorf tube filled with vaccine and pushing it out with a finger to entrain the dry powder in the air stream.
  • Each group consists of 4-6 mice. Two weeks after the first immunization, specimens of the same composition were intranasally administered to each group in the same amount as secondary immunization and tertiary immunization. Two weeks after the final immunization, nasal washes and blood samples were collected.
  • mice Two weeks after the tertiary immunization, nasal washings and serum were prepared from mice according to the method described in J Immunol. 2006; 176: 1122-1130, and antigen-specific s-IgA and IgG were measured. rice field. That is, each mouse to which the vaccine was administered was subjected to laparotomy under pentobarbital anesthesia, the trachea was incised, an atom vein catheter was inserted into the nasal cavity from the incised trachea, and 1 mL of 0.1% BSA (bovine serum albumin) was added.
  • BSA bovine serum albumin
  • Physiological saline solution was injected, the fluid coming out of the nose was collected, and the collected fluid was used as a mouse nasal wash sample. Furthermore, blood was collected from the heart of each mouse, and serum samples were prepared by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes.
  • the plate was then rinsed three times with a washing solution (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0).
  • a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCl and 200 ⁇ L of 1% BSA was added to each well, and a blocking reaction was performed at room temperature for 1 hour.
  • glycine-added antigen protein-AD vehicle complex (HA + ADvehicle + Gly) + cellulose (Comparative Example 2), HA + ADvehicle + Gly + sodium alginate (Comparative Example 3), HA + ADvehicle + Gly + inulin (Example 1), HA + ADvehicle + Gly + curdlan (Example 2), HA + ADvehicle + Gly + laminaran (Example 3), HA + ADvehicle + Gly + zymosan (Example 4), HA + ADvehicle + Gly + yeast ⁇ -glucan ( Each microparticle powder type mucosal vaccine of Example 5) was prepared and administered to each test mouse, and the amount of s-IgA in nasal washing and IgG in serum was measured. The amount of each polysaccharide added was 100 times the HA antigen protein concentration ([HA]). Table 1 shows the results.
  • each solution is centrifuged (TOMY, MX-305) at 4° C. at 20400 ⁇ g for 15 minutes, and 0.05 mL of each supernatant after centrifugation is collected and centrifuged. Subsequent samples (Liquid C) and (Liquid D) were used. The protein concentration of each sample was determined using the BCA protein assay kit (Thermo Scientific, 23227).
  • the binding rate was calculated by measuring the amount of bound HA protein that co-precipitated with the AD beak recovered in the precipitated fraction by centrifugation.
  • the formula for calculating the binding rate is shown below.
  • Example 1 When a vaccine in which inulin, a fructose polymer, was added to HA + ADvehicle + Gly (Comparative Example 1) (Example 1), compared to HA + ADvehicle + Gly, s-IgA production in nasal lavage fluid The amount increased 4.3 times, and the amount of IgG produced in serum increased 1.7 times, confirming that the antibody production-inducing effect was remarkably enhanced.
  • Example 4 When a vaccine added with zymosan was administered to HA + ADvehicle + Gly (Example 4), compared to HA + ADvehicle + Gly (Comparative Example 1), the amount of s-IgA produced in the nasal wash was about It was confirmed that the antibody production-inducing effect was remarkably enhanced, 3.3-fold, and the amount of IgG produced in the serum was approximately 1.9-fold.
  • Example 5 When a vaccine containing yeast ⁇ -glucan was administered to HA + ADvehicle + Gly (Example 5), compared to HA + ADvehicle + Gly (Comparative Example 1), s-IgA production in nasal washes The amount was about 3.6-fold, and the amount of IgG produced in serum was about 18.9-fold, confirming that the antibody production-inducing effect was remarkably enhanced.
  • curdlan which are polysaccharides mainly composed of inulin and glucose containing glucose polymers linked by ⁇ -1,3-glycosidic bonds. It was confirmed that the antibody production-inducing effect was remarkably enhanced when ⁇ -1,3-glucan(s) such as ⁇ -1,3-glucans were added. It was confirmed that cellulose in which glucose is polymerized through ⁇ -1,4-glycosidic bonds does not contribute to the antibody production-inducing effect.
  • glycine was added to hemagglutinin (HA), which is an antigen protein, but no ADvehicle was added, and antibody production was induced after freeze-drying and administered to the nasal cavity of mice (Comparative Example 11). I confirmed the effect.
  • the mass administered per mouse was 1.5 ⁇ g of HA, 450 ⁇ g of Gly, and 150 ⁇ g of each polysaccharide. The results are shown in Table 2 below.
  • an AD vehicle, an amino acid, and ⁇ -1,3-glucan or inulin are essential components of a combination that bring about a synergistic effect as an adjuvant that enhances the effect of inducing antibody production.
  • the AD vehicle complex, glycine, and curdlan produce a synergistic effect due to the combination of the antigen-specific s-IgA antibody in the nasal mucosa and other systemic mucosa and the antigen-specific IgG antibody in the serum. It was confirmed to increase the production of production.
  • Vaccines were prepared by adding 75, 150, 300 and 450 ⁇ g of curdlan per mouse, and the antibody induction effect was examined. The results are shown in Table 3 below.
  • HA-specific s-IgA induction and IgG induction no significant difference was observed in any amino acid except cysteine, and any amino acid other than cysteine was associated with the AD vehicle, ⁇ -1,3-glucan, etc. It was determined that it can be used as an adjuvant component by combining with saccharides.
  • HI value It has been reported that vaccines containing high-molecular weight protein antigens may show a decrease in antibody titer, which is an indicator of their ability to protect against infection, due to conformational changes associated with freeze-drying. Therefore, it was decided to measure the hemagglutinin inhibition (HI) value, which is an indicator of the ability to protect against infection, of the produced vaccine.
  • the HI titer was measured using Denka Seiken's "Class III Immunological Test Series Influenza Virus Kit/Influenza HI Reagent 'Seiken'", and the influenza virus HI antibody titer in the serum was measured.
  • the vaccine of Example 2 in which curdlan and glycine were added to the antigen protein-AD vehicle complex, had an HI value twice as high as that of HA+poly(I:C) used as a positive control. Therefore, it was confirmed that the vaccine of the present invention not only satisfies HI ⁇ 40, which is evaluated as an international evaluation standard, but can also maintain a high antibody titer even by freeze-drying.
  • the AD vehicle of the present invention can form a complex with the antigen protein through weak hydrophobic interaction, thus avoiding a decrease in the HI value of the HA antigen due to the freeze-drying process. It is thought that this is because it brings about a protective effect that can be obtained.
  • the s-IgA antibody titer of each lavage fluid of the specific anti-influenza A/California/7/2009 (H1N1) pdm09 contained in the was measured.
  • the above data are shown in terms of the total amount of each wash per animal, but the total amount of sample collected was 1 mL for nasal wash, 1 mL for vaginal wash, 2 mL for lung wash, 2 mL for small intestinal mucosal fluid, and 500 ⁇ L for large intestine. Met. Table 6 shows the results.
  • the mouse of Example 2 showed higher antibody production per mouse than the mouse of Comparative Example 7.
  • the amount of antibody produced in the vaginal lavage fluid was comparable to that in the nasal lavage fluid, and the production of s-IgA in the small intestinal mucosal fluid and large intestine stool was significantly increased. did. Therefore, it was confirmed that the microparticle powder type mucosal vaccine of the present invention can produce s-IgA, which has an infection-protective effect, in systemic mucosal tissues even by local administration.
  • the vaccine of the present invention is extremely useful in the medical field.
  • efficacy can be confirmed by experiments with mice using human-derived virus strains that have been acclimatized to infect mice.
  • the HED conversion method of estimating the dose at which the equivalent action is expressed in the maximum blood concentration (Cmax) and the method of referring to the area under the time curve (AUC) data the dose of the vaccine, After estimating the dosage to humans, experimental data can be further accumulated to determine the dosage to humans.

Abstract

ワクチンの鼻腔等への投与に際し、ワクチン成分が鼻腔や咽頭部にとどまり、ワクチン投与による免疫誘導等の効果を高めるための手段を提供するものである。 抗原タンパク質に、合成ペプチド、混合脂質、β－１，３－グルカン又はイヌリン、及び、アミノ酸を添加することにより、相乗的な効果によって、抗体産生誘導効果が顕著に増強されることを確認した。

Description

微粒子粉末剤型粘膜ワクチン
　本発明は、微粒子粉末剤型粘膜ワクチンに関し、より詳細には、抗原タンパク質、及び、ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、混合脂質と、β－１，３－グルカン又はイヌリンと、アミノ酸とを含むアジュバントを包含する微粒子粉末剤型粘膜ワクチン、並びにその製造方法に関する。
　現在、世界で広く使用されている皮下や筋肉内接種型ワクチンは、血液の抗病原体ＩｇＧ抗体の誘導に優れ、感染重症化の防止に効果を示す。しかし、病原体の侵入する全身の粘膜で感染を防御する役割を担う抗病原体特異的分泌型ＩｇＡ（ｓ－ＩｇＡ）抗体の誘導効果がほとんどないことから、感染予防効果は期待できないとされている（例えば、特許文献１及び２参照）。感染力が強いとされるインフルエンザウイルス、コロナウイルス等の場合、感染予防効果の充実が必要とされる。喫緊の課題であるＣＯＶＩＤ－１９については、飛沫感染と接触感染の侵入部位は鼻腔と口腔が主であり、いわゆる新型コロナウイルスの受容体であるＡＣＥ２が唾液腺に豊富に存在し、鼻粘膜や口腔粘膜には、小唾液腺が多数存在しているとされるため、鼻腔や咽頭部へ効果的なワクチンを投与することも感染防止対策の一つとなる。
　発明者らは、これまで、界面活性剤として作用する肺や気管の粘膜表面を覆っている肺サーファクタントの組成を基本として、抗原提示細胞に抗原を運搬する機能を付与した人工合成肺サーファクタントを開発してきた。例えば、人工合成肺サーファクタントとして、ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを用い、脂質とさらに増粘剤のカルボキシビニルポリマー（ＣＶＰ）を加えることにより、安全で有効とされる経粘膜投与型インフルエンザワクチンを報告してきた（例えば、特許文献３及び４参照）。
　かかる経粘膜投与型ワクチンは、血清中の抗原特異的ＩｇＧ誘導作用、気道粘膜（鼻腔洗浄液）抗原特異的分泌型ＩｇＡ誘導作用（例えば、特許文献４及び非特許文献１参照）、細胞性免疫誘導作用（例えば、非特許文献２参照）を示すことが確認されている。
　しかし、例えば鼻粘膜には、繊毛が生えており、さらに粘液が充満する粘液層で覆われているため、従来の液状の経粘膜ワクチンが鼻粘膜に投与されると粘液に付着したとしても、鼻腔に入った空気中の小さなホコリや細菌とともに、強い排出作用により速やかに喉へと送り出されるので、実用化にはほとんど至っていない。
国際公開ＷＯ２００５／０９７１８２号パンフレット 国際公開ＷＯ２００７／０１８１５２号パンフレット 国際公開ＷＯ２００９／１２３１１９号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１１／１０８５２１号パンフレット
Vaccine 2019;37: 612-22. PLoS One 2018; 13:e0191133.
　本発明の課題は、ワクチンの鼻腔等への投与に際し、ワクチン成分が鼻腔や咽頭部にとどまり、ワクチン投与による免疫誘導等の効果を高めるための手段を提供することにある。
　本発明者らは、（経）粘膜ワクチンに使用してきた剤型について、改めて検証することとした。その結果、従来の液状の粘膜ワクチンに代えて、微粒子粉末型の粘膜ワクチンを作製することを思いついた。まず、抗原タンパク質と、ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドと混合脂質とＣＶＰを含む、従来の液状ワクチンを凍結乾燥して粉状のワクチンを作製しようとしたが、微粒子を形成することができず、塊や紐状の組成物が形成され、鼻腔への投入、分散が認められなかった。そこで、従来の液状ワクチンから粘性が高く、凍結乾燥で紐状になる原因と考えられるポリマーのＣＶＰを除き、抗原タンパク質、及び、ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドと混合脂質とを含む組成物（ＡＤビークル）を凍結乾燥して粉末化した乾燥粉末製剤についてマウスの鼻腔へ投与を試みたが、この組成だけでは鼻腔への気流に乗って飛散する効率が悪く鼻腔の粘膜にまで到達しなかった。
　そこで、一般的に乾燥粉末製剤において飛散・分散作用を有する賦形剤として使用されていることが知られていたアミノ酸のうち、分子量が小さい中性アミノ酸であるグリシンを分散剤として、上記抗原タンパク質及びＡＤビークル複合体に添加し、凍結乾燥して粉末化した組成物をマウスの鼻腔へ投与したところ、鼻腔の粘膜に到達し、鼻腔内に適切にいきわたらせることができた。投与されたマウスについて、鼻腔を洗浄した洗浄液中のｓ－ＩｇＡと血清中のＩｇＧの濃度を測定すると予想されたよりも高く、グリシンの添加により抗体産生誘導効果が増強される可能性があると思われたので、さらに検討を進めることにした。
　まず、上記抗原タンパク質及びＡＤビークル複合体に、従来から乾燥粉末製剤において賦形剤や増量剤として使用されている種々の多糖類を、グリシンとともに添加した後、凍結乾燥して粉末化した組成物をマウスの鼻腔へ投与することとした。
　β－１，４グルカンに分類されるグルコース重合体であるセルロース、及び、ウロン酸重合体であるアルギン酸ナトリウムを、多糖類として選択した場合には、粘膜においても血清中においても抗体産生を誘導する効果が認められなかった。しかし、カードラン等のβ－１，３－グルカンを含むグルコース重合体、又はイヌリンを、上記抗原タンパク質及びＡＤビークル複合体にグリシンとともに添加し、凍結乾燥して粉末化した組成物をマウスの鼻腔へ投与したところ、鼻腔の洗浄液中のｓ－ＩｇＡと血清中のＩｇＧの値とが、増加することを見い出した。そこで、ＡＤビークル、各種β－１，３－グルカン又はイヌリン、及び、各種アミノ酸の組合せについて、組合せを様々に変更してｓ－ＩｇＡとＩｇＧの値について測定を続け、抗原タンパク質に、合成ペプチド、混合脂質、β－１，３－グルカン又はイヌリン、及び、アミノ酸を添加することにより、相乗的な効果によって、抗体産生誘導効果が顕著に増強されることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の事項により特定されるものである。
［１］抗原タンパク質と、以下の（A）～（D）を含むアジュバントとを包含する、微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
（A）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチド；
（B）混合脂質；
（C）β－１，３－グルカン又はイヌリン；
（D）アミノ酸；
［２］ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドが、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、上記［１］記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［３］混合脂質が１又は２以上のリン脂質を含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［４］１又は２以上のリン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸から選ばれることを特徴とする、上記［３］記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［５］混合脂質が、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、γ－リノレン酸、アラキドン酸、α－リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする、上記［１］～［４］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［６］抗原タンパク質が、病原体に由来するタンパク質、不活化抗原タンパク質、リコンビナント抗原タンパク質、又は無毒化毒素タンパク質であることを特徴とする、上記［１］～［５］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［７］β－１、３－グルカンが、カードラン、ラミナラン、ザイモサン、イーストβグルカンから選ばれる１又は２種類以上であることを特徴とする、上記［１］～［６］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［８］β－１、３－グルカンが、カードランであることを特徴とする、上記［１］～［６］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［９］アミノ酸が、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニンから選ばれた１又は２種類以上のアミノ酸であることを特徴とする上記［１］～［８］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［１０］粘膜において抗原特異的ｓ－ＩｇＡの産生を増強し、又は、血中において抗原特異的ＩｇＧの産生を増強するために用いられることを特徴とする上記［１］～［９］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
［１１］鼻腔から咽頭部を経由する気道感染症に対して、感染防御効果を発揮する吸入型又は噴霧型の均一な微粒子粉末であることを特徴とする上記［１］～［１０］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
　また、本発明は以下の事項により特定されるものである。
［１２］（１）抗原タンパク質；
（２）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチド；
（３）混合脂質；
（４）β－１，３－グルカン又はイヌリン；
（５）アミノ酸；
を含む凍結乾燥された微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法であって、
以下の工程（ａ）～（ｅ）を備えることを特徴とする前記製造方法。
（ａ）前記合成ペプチドと、混合脂質とを水に懸濁することにより、ＡＤ－ビークル懸濁液を調製する工程；
（ｂ）ＡＤ－ビークル懸濁液に抗原タンパク質を添加し、加温と攪拌とを１回又は２回以上行い、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を形成する工程；
（ｃ）抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、β－１，３－グルカン又はイヌリンを添加後攪拌することによる、グルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を調製する工程；
（ｄ）グルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、アミノ酸を添加後攪拌することによるワクチン液を調製する工程；
（ｅ）ワクチン液を凍結乾燥して微粒子粉末剤型化する工程；
［１３］混合脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びパルミチン酸の３種脂質混合脂質であることを特徴とする上記［１２］記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
［１４］抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を形成する（ｂ）工程において、加温の温度設定範囲が２５～７５℃であることを特徴とする上記［１２］又は［１３］記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
［１５］抗原タンパク質単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせることのない量の抗原タンパク質を含み、合成ペプチドと、混合脂質と、β－１，３－グルカン又はイヌリンと、アミノ酸とを組み合わせることにより、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせるために用いられる、上記［１２］～［１４］のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
　本発明のワクチンを例えば鼻腔に投与すると、鼻腔の粘膜をはじめとする全身の粘膜における抗原特異的ｓ－ＩｇＡ抗体と、血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗体の産生が顕著に増大し、感染症に対する優れた感染防御効果や抗体産生誘導効果を得ることができる。
微粒子粉末剤型粘膜ワクチンに含まれるカードランを添加する場合の検討結果を示す図である。 微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの走査電子顕微鏡による粒子径の測定結果を示すグラフである。 微粒子粉末剤型組成物を鼻口から投与した被検マウスの、投与から２０分経過後の鼻腔、咽頭部、気管、気管支、肺部の画像である。
　本発明のワクチンとしては、抗原タンパク質；及び、（A）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、（B）混合脂質と、（C）β－１，３－グルカンと、（D）アミノ酸とを含む、アジュバント；を包含する、微粒子粉末剤型粘膜ワクチンであれば特に制限されないが、本発明においてアジュバントとは、抗原タンパク質（ペプチド）と共に投与することにより、とりわけ、抗原タンパク質単独では、効果的に粘膜において抗原特異的ｓ－ＩｇＡを産生し、血中において抗原特異的ＩｇＧを産生することのない量の抗原タンパク質を含む場合に、上記抗原に対する抗体の産生を誘導し、各種抗体の産生量を増やすことができる成分及び／又は相乗的に抗体の産生量を増やすことができる成分の組合せをいう。
　上記ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドとしては、Ｎ末側のｎ個のＫ（リジン：Ｌｙｓ（Ｋ））残基とＣ末側のｍ個のＬ（ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ））残基が連続して構成されるアミノ酸配列であって、上記ｎは４－８、上記ｍは１１－２０のアミノ酸配列からなる合成ペプチドであれば特に制限されないが、具体的には、以下のペプチドを例示することができる。なお、ここではアミノ酸残基は１文字記号で示している。
配列番号１：（Ｋ６Ｌ１６）：ＫＫＫＫＫＫＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
配列番号２：（Ｋ６Ｌ１１）：ＫＫＫＫＫＫＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
　上記合成ペプチドは、公知の化学合成法に従って調製することができる、純度９５％以上のものを使用することが好ましい。
　上記合成ペプチドは、合成ペプチド構造に影響を与えないメタノール、エタノール、トリフルオロ酢酸等の有機溶媒に溶解してＫ６Ｌ１６ペプチド含有液としてワクチンに添加されることが好ましく、例えば、３ｍｇ～７ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにメタノールに溶解したＫ６Ｌ１６ペプチド含有液として使用することができる。
　上記混合脂質に含まれる脂質としては、２種類以上の脂質を含む脂質を挙げることができ、２種類以上の脂質としては、１又は２種類以上のリン脂質と１又は２以上のリン脂質以外の脂質との組合せや、２種類以上のリン脂質の組合せや、２種類以上のリン脂質以外の脂質の組合せを挙げることができるが、１又は２種類以上のリン脂質と１又は２種類以上のリン脂質以外の脂質との組合せが好ましく、２種類のリン脂質と１種類のリン脂質以外の脂質との組合せがより好ましい。
　上記リン脂質としては、哺乳類由来天然肺サーファクタントが含有するリン脂質が好ましく、具体的には、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン等を挙げることができ、かかるリン脂質は１種類を単独で、又は２種類以上の混合物として使用することができるが、２種類以上のリン脂質としては、ジパルミトイルホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールとの組合せを好ましく挙げることができる。
　上記混合脂質に含まれるリン脂質がジパルミトイルホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールである場合の配合比率としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロールが、１０：１～１：１０、５：１～１：５、４：１～１：１、３．５：１～２．５：１を例示することができる。
　上記リン脂質以外の脂質としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、γ－リノレン酸、アラキドン酸、α－リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を挙げることができるが、パルミチン酸が好ましい。
　上記混合脂質がリン脂質とリン脂質以外の脂質を含む場合の、リン脂質の含量とリン脂質以外の脂質の含量（質量）の比としては、リン脂質：リン脂質以外の脂質が１００：１～３０を挙げることができ、１００：５～１５が好ましく、１００：８～１２がより好ましく、１００：９～１１がさらに好ましく、１００：９．５～１０．５が特に好ましい。
　本発明においては、上記混合脂質とＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドからなる組成物、又は、上記混合脂質とＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを含む組成物を「ＡＤビークル（ADvehicle）」と呼ぶことがある。ＡＤビークルにおける混合脂質と合成ペプチドの質量の比率、すなわち、混合脂質：合成ペプチドとしては、１００：０．１～５０を挙げることができ、１００：０．５～１０が好ましく、１００：１～５がより好ましく、１００：１．５～３がさらに好ましい。
　上記抗原タンパク質（類）としては、ワクチンの抗原として用いることができるタンパク質であれば特に制限されないが、抗原タンパク質に対する免疫（抗体）を体内に惹起することにより、上記抗原タンパク質が由来する病原体が引き起こす疾病の予防又は治癒が期待できるものを挙げることができ、一般的な病原体に由来するタンパク質のほか、不活化抗原タンパク質、精製抗原タンパク質、部分精製抗原タンパク質、リコンビナント抗原タンパク質、無毒化毒素タンパク質、アレルゲン等を例示することができ、また、全（成熟）タンパク質のほか、プレタンパク質、プレプロタンパク質、これらの機能的又は免疫優性の抗原ペプチド等を含めた抗原タンパク質類とすることもできる。
　上記病原体としては、ウイルス、細菌、寄生虫等を例示することができる。
　上記ウイルスとしては、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、新型コロナウイルス（Coronavirus：ＣＯＶＩＤ－１９）、エボラ出血熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス等を挙げることができる。
　上記細菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌等を挙げることができ、上記真菌としては、白癬菌、カンジダ、アスペルギルスを挙げることができ、上記寄生虫としては、マラリア病原体、眠り病病原体等を挙げることができる。
　上記病原体がインフルエンザウイルスである場合の、抗原タンパク質の具体例としては、ヘマグルチニン（赤血球凝集素：ＨＡ）抗原タンパク質や、ノイラミニダーゼ抗原タンパク質、Ｍプロテイン等のウイルスの表面上に存在する抗原性糖タンパク質と、内部のヌクレオプロテイン等を例示することができる。
　本発明のワクチンにおける抗原タンパク質の含量（質量）は、上記ヘマグルチニンを抗原タンパク質として用いる場合を例にとると、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原タンパク質の含量として、Single radial immunodiffusion(SRD), Fahey,J.et al., J.Immunol., 94,84-90(1965)の方法でＨＡ量を定量測定したＨＡ含量を表示する場合と、一度ＳＲＤ法でＨＡ含量を測定した後では、同じＨＡ原液を用いる限り、表記はＳＲＤ定量より測定の容易な、ヘマグルチニン抗原タンパク質と、他の抗原タンパク質の総量を示すタンパク質量によって表記する場合を挙げることができる。すなわち後者の場合、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）を使用したＨＡ抗原タンパク質液におけるＨＡ抗原タンパク質の質量としては、ＨＡ抗原タンパク質と、ＨＡ抗原タンパク質以外の抗原性タンパク質とを含む総タンパク質の質量を意味することもでき、その場合、本発明においてはＨＡ抗原タンパク質の質量（ＨＡ抗原タンパク質量）や濃度と表現する。ＨＡ抗原タンパク質以外の抗原性タンパク質としては、Ｍタンパク質、ノイラミラーゼ、ヌクレオプロテイン等を挙げることができる。
　本発明のワクチンにおけるＨＡ抗原タンパク質としては、本発明の効果を奏する限りにおいて特に制限されないが、抗体産生誘導を行う程度に免疫応答を増強させることができない量で済むという点で、ＨＡ抗原タンパク質量（Ａ）の乾燥質量として、０．０１μｇ～３μｇ／２０ｇマウス体重を例示することができ、０．０５μｇ～２μｇ／２０ｇマウス体重が好ましく、１．２μｇ～１．８μｇ／２０ｇマウス体重をより好ましく挙げることができる。なお通常の免疫応答試験には若年齢成熟マウスを使用することが多いため、７－８週齢で、マウス体重約２０ｇを使用することから、ここでは２０ｇマウス体重として表記している。
　なお、上記ＨＡ抗原タンパク質におけるＨＡ抗原分子それ自体の質量としては、５～９０質量％を挙げることができ、１０～８０質量％が好ましく、２０～７０質量％が好ましく、３０～６０質量％が好ましい。
　上記抗原タンパク質（抗原ペプチド）の作製方法としては、公知の方法であれば特に制限されないが、ワクチン製造のために抗原タンパク質量を十分に確保できる作製方法が好ましく、遺伝子組換技術により作製する方法や化学合成により作製する方法を挙げることができる。
　抗原タンパク質に対する上記混合脂質の質量比としては、本発明の効果を奏することができる限りにおいて特に制限されないが、混合脂質が抗原タンパク質の０．１～２０倍を挙げることができ、１～１８倍が好ましく、５～１５倍がより好ましく、８～１２倍がさらに好ましく、９～１１倍がさらにより好ましい。
　本発明におけるβ－１，３－グルカン（β－１，３－Ｇｌｕｃａｎ）としては、β－１，３－グリコシド結合にて連結されたグルコース重合体を含む、グルコースを主要な構成糖とする多糖であって、上記の本発明における役割を果たすことができるβ－１，３－グルカンであれば特に制限されず、直鎖β－１，３－グルカン構造を有する水不溶性の多糖類であるカードラン（Ｃｕｒｄｌａｎ）、海藻やキノコに含まれる貯蔵多糖として知られ、β－１，３結合及びβ－１，６結合のグルコース主鎖からなる多糖であり、β－１，３結合とβ－１，６結合の比は約３：１であって、水に可溶であるグルコース重合体であるラミナラン（Ｌａｍｉｎａｒａｎ）、イースト菌等の出芽酵母の細胞壁由来の多糖類の懸濁液であって、マンナンを含み、β－１，３－グルカンが主成分の多糖を活性成分とするザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）、イーストβ－グルカン（Ｙｅａｓｔ β－Ｇｌｕｃａｎ）を挙げることができる。
　上記イヌリンとは、１つのグルコースにフルクトースが２～６０個程度連なった構造を有する食物繊維の一種である。
　本発明のワクチンにおけるβ－１，３－グルカン、又はイヌリンの添加量としては、本発明において、アジュバント作用を有効に発揮できる量であれば特に制限されないが、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体の質量の５～５０倍量、好ましくは１０～３０倍量や、抗原タンパク質の質量の１０～１０００倍量、好ましくは２５～５００倍量、より好ましくは５０～２００倍量、さらに好ましくは７５～１５０倍量を例示することができる。
　本発明のワクチンにおけるアミノ酸としては、投与された本発明の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンが気流に乗って鼻腔等の粘膜に到達し易くするために賦形剤として用いることができるとともに、感染防御抗体誘導効果の低下を起こさず、かつ、粘膜においてｓ－ＩｇＡ産生量を増加させることができ、血清中のＩｇＧ産生量を顕著に増加させる等の抗体産生誘導効果を増強することができるアミノ酸であれば特に限定されないが、入手の容易性等から、生体のタンパク質の主要な構成単位となっている２０種のα－アミノ酸が好ましく、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）等の非極性側鎖を有する中性アミノ酸；アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）等の極性の中性側鎖を有する中性アミノ酸；アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）等の酸性側鎖を有する酸性アミノ酸；アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）等の塩基性側鎖を有する塩基性アミノ酸などを例示することができるが、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸が好ましく、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸がより好ましく、グリシン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸がより好ましく、グリシン又はフェニルアラニンがさらに好ましく、また、グリシン、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸がより好ましく、グリシン、セリン、ロイシン、フェニルアラニンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸がより好ましく、グリシン、アラニン、ロイシン、及び／又はフェニルアラニンが好ましく、グリシンやフェニルアラニンが最も好ましく、フェニルアラニンが特に好ましい。あるいは、システインを除くことが望ましく、メチオニンやシステイン等のＳＨ基を側鎖に有するアミノ酸を除くことが望ましい場合もある。
　本発明のワクチンにおけるアミノ酸の添加量としては、上記本発明の効果を奏する限りにおいて特に制限されないが、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体の質量の１５～３５倍量、好ましくは２５～３０倍量、又は、抗原タンパク質の質量の１０～３０００倍量、好ましくは１００～１５００倍量、より好ましくは１５０～７５０倍量、さらに好ましくは２００～４００倍量を例示することができる。
　本発明のワクチンの投与回数としては、本発明のワクチンが効果を奏するものであれば特に制限されないが、１回（初回免疫のみ）又は２回以上の複数回を挙げることができ、２回（初回免疫と二次免疫）又は３回（初回免疫と二次免疫と三次免疫）を好ましく挙げることができ、１回目の投与から１週間～１月経過後、好ましくは１０日～３週間経過後、より好ましくは２週間経過後に２回目の投与を行うことが好ましく、３回目の投与も２回目の投与から１週間～１月経過後が好ましく、１０日～３週間経過後がより好ましく、２週間経過後がさらに好ましい。
　本発明の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンは、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせることのない量の抗原タンパク質を含み、合成ペプチドと、混合脂質と、β－１，３－グルカン又はイヌリンと、アミノ酸とを組み合わせることにより、粘膜において抗原特異的ｓ－ＩｇＡの産生を増強し、又は、血中において抗原特異的ＩｇＧの産生を増強する効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせるために用いられる、使用用途が限定された用途発明でもあるともいえる。
　本発明において、顕著に抗体産生誘導効果が増加するとしては、例えば、抗原タンパク質とＡＤビークルと、アミノ酸を投与した場合と比較してマウスの鼻腔洗浄液におけるｓ－ＩｇＡの産生が４倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１５倍以上を挙げることができ、及び／又は、血清中のＩｇＧの産生が１．５倍以上、好ましくは２．５倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上を挙げることができる。
　或いは、本発明のワクチンにおいて、効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗体の誘導量とは、ウイルス感染阻止効果ＨＩの値が、インフルエンザワクチンにおいての国際的評価基準以上の数値（ＨＩ≧４０）であることを例示することができる。
　本発明の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法としては、
（１）抗原タンパク質；
（２）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０）のアミノ酸配列からなる合成ペプチド；
（３）混合脂質；
（４）アミノ酸；
（５）β－１，３－グルカン又はイヌリン；
を含む凍結乾燥されている微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法であって、
（ａ）前記合成ペプチドと、混合脂質とを水に懸濁することにより、ＡＤ－ビークル懸濁液を調製する工程；
（ｂ）ＡＤ－ビークル懸濁液に抗原タンパク質を添加し、加温と攪拌とを１回以上反復して抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を形成する工程；
（ｃ）抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、β－１，３－グルカンを添加後攪拌して、均一なグルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を調製する工程；
（ｄ）グルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、アミノ酸を添加し、攪拌して均一なワクチン粗液を調製する工程；
（ｅ）ワクチン粗液を凍結乾燥して微粒子粉末剤型化することにより微粒子粉末剤型粘膜ワクチンを調製する工程；を備える、微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法を例示することができる。
　さらに、上記（ｂ）工程の後に、
（ｂ’）（ｂ）行程で調製された抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を、凍結乾燥することにより、抗原タンパク質－ＡＤビークル凍結乾燥体を調製する工程；
及び、上記（ｃ）工程の前に、
（ｂ”）（ｂ’）工程で調製された抗原タンパク質－ＡＤビークル凍結乾燥体を、水又は生理食塩水に懸濁して抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体（均一懸濁液）を調製する工程；を備えていてもよい。
　上記（ａ）工程において調製されるＡＤ－ビークル懸濁液としては、ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、混合脂質とを水に懸濁することにより調製される液であれば特に制限されず、ＡＤ－ビークル懸濁液における、混合脂質と合成ペプチドの質量の比率、すなわち、混合脂質：合成ペプチドとしては、１００：０．１～５０を挙げることができ、１００：０．５～１０が好ましく、１００：１～５がより好ましく、１００：１．５～３がさらに好ましい。上記混合脂質と合成ペプチドは、さらにクロロホルム、メタノール等の有機溶媒に溶解（混合脂質：有機溶媒＝１００：１～５０、好ましくは１００：２～２５、より好ましくは１００：５～１５、さらに好ましくは１００：８～１２）して、減圧乾固又は凍結乾燥により有機溶剤を除いた後で水に懸濁する際に便宜であり、この場合、ＫｎＬｍのアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質溶液とを含むＡＤ－ビークル懸濁液となる。
　上記（ｂ）工程において調製される抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体としては、上記（ａ）工程において調製されたＡＤ－ビークル懸濁液について加温と攪拌とを１回又は２回以上行うことにより、疎水性相互作用等により形成される複合体を挙げることができる。上記攪拌としては、水浴中で抗原タンパク質を添加し、５～２０分間、好ましくは８～１２分間振盪攪拌混和することを挙げることができ、上記加温としては、一般的には２０～６０℃、好ましくは４０～５０℃の水浴中における加温を挙げることができるが、抗原タンパク質の熱安定性により加温する温度を考慮に入れて選択することが望ましく、インフルエンザワクチン抗原の場合は３５～４３℃が好ましく、４１～４２℃がより好ましい。
　上記（ｃ）工程において調製されるグルカン（又はイヌリン）添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体としては、β－１，３－グルカンを抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に添加後攪拌することにより得られる均一なグルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を挙げることができ、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体が形成された後にβ－１，３－グルカン又はイヌリンを添加することが好ましい。抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体が形成される前にβ－１，３－グルカン又はイヌリンを添加した場合には、ＡＤビークルのアジュバントとしての効果が消滅するおそれがある。均一なグルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を調製するためには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることが好ましい。
　上記（ｄ）工程において調製されるワクチン粗液としては、１又は２以上のアミノ酸をグルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に添加後攪拌することにより得られる、均一なワクチン粗液であれば特に制限されず、抗原タンパク質とＡＤビークルとによる抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体が形成された後にアミノ酸を添加することが好ましい。抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体の形成前にアミノ酸を添加した場合には、ＡＤビークルのアジュバント効果が消滅するおそれがある。均一なグルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を調製するためには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることが好ましい。したがって、上記（ｂ）工程の後に（ｄ）工程を行い、（ｄ）工程の後に上記（ｃ）工程を行って、ワクチン粗液を調製することも可能である。
　上記（ｅ）工程において調製される微粒子粉末剤型粘膜ワクチンとしては、ワクチン粗液を凍結乾燥して微粒子粉末剤型化することにより得られたワクチンであれば特に制限されず、凍結乾燥は、公知の凍結乾燥機を用いて行うことができ、上記ワクチン粗液を凍結乾燥して微粒子粉末剤型化できる方法によれば特に制限されないが、例えば、予備凍結プロセスで－５０～－８０℃にてワクチン粗液を５時間以上冷凍した後、凍結乾燥機に凍結試料を挿入し、真空度４．０～６．０ｐａ、トラップ温度－４７～－５０℃、周囲温度は室温の条件で、１０時間以上凍結乾燥を実施することで、微粒子粉末剤型化することが好ましい。なお、上記の凍結乾燥は、上記条件において凍結乾燥をすることができる装置により行うことができる。
　上記（ｂ’）工程において調製される抗原タンパク質－ＡＤビークル凍結乾燥体としては、上記抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を、凍結乾燥することにより得られる固体であれば特に制限されず、上記凍結乾燥の予備凍結プロセス温度としては、－８０℃～－５０℃を挙げることができ、かかる凍結乾燥体は－２０℃～－３０℃で保存されることが好ましい。
　また、上記（ｂ”）工程において抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体均一懸濁液としては、（ｂ’）工程において調製された抗原タンパク質－ＡＤビークル凍結乾燥体を、水又は生理食塩水に懸濁してワクチンの処方に適した所定濃度に調整することにより調製された懸濁液を挙げることができる。
　上記抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体が形成されているか否かの確認は、例えば、カロリーメーターを用いて抗原タンパク質とＡＤビークル分子間の疎水性相互作用シグナルを検出することにより確認することができる。カロリーメーターは温度一定化において、抗原タンパクとＡＤビークルが相互作用するときに生じる反応熱を測定することが可能であり、その反応熱を測定することで分子間の相互作用を確認することができる。さらに、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体形成量の定量測定は、遠心分離法により沈殿するＡＤビークル分画に回収される抗原タンパク質量を、遠心前後の上清の抗原タンパク質量から計算することができる。本発明においては、抗原タンパク質の７０％以上がＡＤビークル分画に回収されることを確認して複合体が形成された標品と判定して用いることが好ましい。以下に上記抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体形成が形成されている割合を計算するための、遠心分離法による結合率を算出するための方法（結合率算出方法）を例示する。
　上記結合率算出方法の例としては、ＨＡ（Ａ液）と、［ＨＡ＋ＡＤビークル］（Ｂ液）を作製し、それぞれを振盪攪拌混和し、各溶液を遠心し、遠心後の各上清標品を分取し、それぞれを遠心処理後の試料（Ｃ液）及び（Ｄ液）とする。各試料のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて測定し、遠心処理によって沈殿分画に回収される「ＡＤビークルと共沈する結合ＨＡタンパク質量」を測定することにより、複合体を形成する、ＨＡとＡＤビークルとの結合率を算出することができる。結合率の計算式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記ワクチンの投与方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば、マウス等の試験動物の鼻腔に投与する場合には、工程（ｄ）によって得られたワクチン粗液を、先端を閉じたエッペンドルフチューブに必要量を充填して、工程（ｅ）を実施して「ワクチン粗液微粒子粉末剤型を充填したエッペンドルフチューブ」を得ることができる。接種前にエッペンドルフチューブの先端を開放して、試験動物の鼻の入口に押し当てて、エッペンドルフチューブを手指で勢いよく押し、気流に乗せて噴霧投与することにより微粒子粉末を鼻腔に送り込む方法を例示することができる。ヒトに対する投与方法としては、経鼻噴霧用乾燥粉末製剤の鼻腔内投与に適切な公知の手段や単位投薬噴霧デバイス等を用いて投与する方法を挙げることができる。
　また、上記鼻腔への投与により、経鼻吸入、気管又は気管支吸入、及び経肺吸入による投与を行うこともできるが、その場合、微粒子の好ましい粒径により目的とする到達場所を設定することができる。鼻腔を主な到達場所とする場合の微粒子粉末の粒径としては、５．０μｍ～８０μｍが好ましく、６．５μｍ～５０μｍがより好ましく、６．５μｍ～４０μｍがさらに好ましい。気管又は気管支吸入を主な到達場所とする場合の微粒子粉末の粒径としては、３．０μｍ～５．０μｍが好ましく、肺胞を主な到達場所とする場合の微粒子粉末の粒径としては、０．５μｍ～３μｍが好ましい。０．５μｍ以下は呼気により体外に放出されやすくなるおそれがある。
　本発明における粘膜としては、鼻腔を覆っている粘膜；気管粘膜；気管支粘膜；肺胞の粘膜のほか、膣粘膜、小腸の粘膜、大腸の粘膜等全身に位置する粘膜を例示することができ、粘膜において分泌された抗原特異的分泌型ＩｇＡ（ｓ－ＩｇＡ）抗体の産生の有無や産生量の測定は、粘膜において分泌された分泌物中のｓ－ＩｇＡ）抗体量を測定することによって行うことができ、上記分泌物中の抗体量を測定する方法としては、鼻腔における鼻腔洗浄液、膣粘膜における膣洗浄液、小腸における小腸洗浄液、大腸における便、気管粘膜における気管洗浄液、気管支における気管支洗浄液、肺胞における肺胞洗浄液等においてそれぞれの抗体量を測定する方法を挙げることができる。
　本発明のワクチンの投与後に粘膜において産生誘導され、粘膜において分泌される分泌物中に多く見いだされる抗原特異的ｓ－ＩｇＡ（分泌型免疫グロブリンＡ［secretary immunoglobulin A］）抗体は、粘膜表面で病原体や毒素に結合し、それらの機能を無効化する感染防御的な作用を有する。また、本発明のワクチンの投与後に血中において見いだされる抗原特異的ＩｇＧ抗体は、ワクチン接種部位の粘膜リンパ組織を介して抗原情報が脾臓のリンパ組織に伝達、記憶され、脾臓リンパ組織で産生され血液中に放出された抗体で、血液中に侵入した病原体に結合して無効化することにより、感染重症化を抑制する。この抗原情報は脾臓リンパ組織で減衰しながらも比較的長期間記憶と産生が維持され、再感染時には記憶抗原情報により迅速に抗体産生が立ち上がり、抗原を捕捉することができる。
　本発明のワクチンは、公知の手段によって製剤化されることができるが、薬理学的に許容される基剤及び／又は添加物を適宜添加することもできる。 
　上記薬理学的に許容される基剤及び／又は添加物としては、例えば滑沢剤 、結合剤、溶剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、安定化剤等を挙げることができる。また必要に応じて保存剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、抗酸化剤、湿潤化剤、矯臭剤等の添加物を含むことができる。
　本発明のワクチンは、一態様において鼻腔から咽頭部を経由する気道感染症に対して、感染防御効果を発揮する吸入型又は噴霧型の均一な微粒子粉末の剤型を有するワクチンである。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
［抗体誘導実験動物］
　マウスを用いて、微粒子粉末剤型粘膜ワクチンにおける、鼻腔洗浄液中の抗インフルエンザウイルス特異的ｓ－ＩｇＡ（Ｎａｓａｌ ｗａｓｈ ｓ－ＩｇＡ）と、血清中の抗インフルエンザウイルス特異的ＩｇＧ抗体（Ｓｅｒｕｍ ＩｇＧ）の誘導作用を評価した。これ以降の動物実験はすべて徳島大学医学部実験動物センターの感染動物舎（Ｐ２レベル）で行われ、徳島大学医学部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
　上記マウスとしては、ＢＡＬＢ／ｃマウス（７－８週齢、雌、平均体重２０ｇ）を日本チャールズリバー株式会社から購入して用いた。
［微粒子粉末剤型ワクチンの作製］
　インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）を抗原タンパク質として、ワクチンとしての効果を検証するため、マウスの鼻腔に投与するための各種微粒子粉末剤型ワクチンを調製した。
（混合脂質の溶液の調製）
　ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）からなるリン脂質が、１０ｍｇ／ｍＬの終濃度になるように、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、パルミチン酸（ＰＡ）を７５：２５：１０（ｗ／ｗ／ｗ）の割合でクロロホルム：メタノール（２：１（ｖ／ｖ））混合液に懸濁し、混合脂質溶液を調製した。
（Ｋ６Ｌ１６ペプチド含有液の調製）
　純度９５％以上の合成ペプチドＫ６Ｌ１６(KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL)（配列番号１） (GenScript社製)を、５．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにメタノールに溶解し、Ｋ６Ｌ１６ペプチド含有液を調製した。
（ＡＤ－ビークルの調製）
　上記混合脂質溶液とＫ６Ｌ１６ペプチド含有液とを、混合脂質溶液：Ｋ６Ｌ１６ペプチド含有液＝１００：２の混合比（質量比）となるように混合し、かかる混合脂質－Ｋ６Ｌ１６混合物４ｍｇを、ロータリーエバポレーターを用いて約４０℃で乾固した後、１０％エタノール１ｍＬに再懸濁し、約４５℃の水浴中で１５分間程度振盪混和し、脂質溶液－Ｋ６Ｌ１６混合物の均一懸濁液（ＡＤ－ビークルの懸濁液）を調製した。かかるＡＤ－ビークル懸濁液を凍結乾燥機により凍結乾燥したものを、凍結乾燥ＡＤ－ビークルとして－３０℃にて保存した。
（抗原タンパク質の調製）
　抗原タンパク質としては、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）を使用した。国立感染症研究所供与ワクチン株より第一三共株式会社がワクチン抗原液を調製し、これを徳島大学に有償提供されたＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）株からＨＡ抗原タンパク質液を調製した。
（抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体の形成）
　前記凍結乾燥ＡＤ－ビークルを室温に戻して超純水に懸濁して再度ＡＤ－ビークル懸濁液とし、かかるＡＤ－ビークル懸濁液に上記ＨＡ抗原タンパク質液を、ＨＡ抗原タンパク質量（Ａ）に対する混合脂質中のリン脂質の質量（Ｖ）の比であるＶ／Ａが１０ (すなわちＨＡ抗原タンパク質量（Ａ）：混合脂質中のリン脂質の質量（Ｖ）＝１：１０)となるように添加し、ボルテックスミキサーで均一になるまで懸濁して懸濁液を調製後、かかる懸濁液を４２℃の水浴中で１０分間振盪混和して、抗原タンパク質とＡＤビークルとを結合させ、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体（ＨＡ＋ＡＤビークル）を形成させた。かかる抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を凍結乾燥し、抗原タンパク質－ＡＤビークル凍結乾燥体として－３０℃にて保存し、使用時には解凍して純水に懸濁し抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体の懸濁液として用いた。なお、これ以降インフルエンザワクチンのＨＡ抗原タンパク質量（Ａ）と混合脂質中のリン脂質の質量（Ｖ）とについて、Ｖ／Ａ＝１０に固定した。なお、抗原タンパク質中のＨＡ抗原分子それ自体の量は、使用したロットでは、抗原タンパク質量の約３６％であった。
（凍結乾燥）
　凍結乾燥は、卓上型凍結乾燥機（ラブコンコＦＺ－４．５型真空凍結乾燥機、朝日ライフサイエンス株式会社）を用いた。－８０℃にてワクチン粗液を５時間以上予備凍結した後、凍結試料を凍結乾燥機に挿入し、真空度５．０ｐａ、トラップ温度－５０～－４７℃、周囲温度は室温の条件で、１０時間以上凍結乾燥を実施した。
（マウスへの投与方法）
［微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの投与方法］
　微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの投与は、ケタラール（６２．６ｍｇ／Ｋｇマウス体重）及びセラクタール（１２．４ｍｇ／Ｋｇマウス体重）で麻酔した各被検マウスの片鼻の入口に、微粒子粉末剤型粘膜ワクチンを充填したエッペンドルフチューブを当てて、指で押し出し、気流に乾燥粉末を乗せて投与を実施した。各群は４～６匹のマウスから成る。免疫は初回免疫後２週目に同様の組成からなる検体を、それぞれの群に２次免疫、３次免疫として同量経鼻投与した。最終免疫の後２週目に鼻腔洗浄液と血液検体を採取した。
［マウス鼻腔洗浄液サンプル及び血清サンプルの調製］
　３次免疫後２週間目のマウスから、J Immunol. 2006; 176: 1122-1130に記載の方法に準じて、鼻腔洗浄液及び血清を調製し、抗原特異的なｓ－ＩｇＡ、ＩｇＧの測定を行った。すなわち、ワクチンを投与した各マウスをペントバルビタール麻酔下で開腹開胸して気管を切開し、切開した気管から鼻腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入し、１ｍＬの０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）生理食塩水溶液を注入し、鼻から出てきた液を採取し、採取した液をマウス鼻洗浄液サンプルとして用いた。さらに、各マウスについて心臓より採血を行い、５０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により血清サンプルを調製した。
［抗原特異的抗体価の定量方法］
　抗原（病原体）特異的抗体価（量）の測定は、鼻腔洗浄液サンプル及び血清サンプル中の抗インフルエンザｓ－ＩｇＡ、ＩｇＧ含有量を、上記J Immunol. 2006; 176: 1122-1130の記載に従い、ＥＬＩＳＡアッセイにより定量することにより行った。ＥＬＩＳＡアッセイは９６ウェルのイムノプレート（Nalgene Nunc International社製、米国）の各ウェルにＨＡ抗原タンパク質として０．１μｇを加え、さらに１μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ, SIGMA社製）と、１００μＬのＰＢＳ溶液を加え、４℃にて一晩固層化反応を行った。その後洗浄液（５０ｍＭＴｒｉｓ，０．１４ＭのＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）でプレートを３回すすいだ。各ウェルに０．１５ＭのＮａＣｌ、２００μＬの１％ＢＳＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、室温で１時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で３回すすいだのち、サンプル結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ，０．１５ＭのＮａＣｌ，１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）にて適量に希釈した鼻洗浄液又は血清を１００μＬ加え、室温で２時間反応させた。Goat anti-mouse IgA又はIgG-horse Radish peroxidase（ＨＲＰ）（BETHYL LABORATORIES INC.）を二次抗体として用い、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 社製、米国）を用いて発色反応を行った。各ウェルに１００μＬ、２ＭのＨ２ＳＯ４（和光純薬株式会社）を添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ ３８４で測定した。定量のためのスタンダードとして、上記J Immunol. 2006; 176: 1122-1130の記載に従いアフィニティー精製した抗インフルエンザＩｇＡ及びＩｇＧそれぞれ１０ｎｇについて同様にして得られた吸光度の検量線を用いた。
［試験例］
（抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体微粒子粉末剤）
　抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を凍結乾燥して粉末化したものについてマウスの鼻腔へ投与を試みたところ、マウスの鼻腔に到達しなかった。分散剤の役割を果たす成分がないからであると推察した。
（アミノ酸の添加）
　上記抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体溶液に、アミノ酸の中でも一番小さい分子量を有するグリシンを、ＨＡ抗原タンパク質濃度（［ＨＡ］）の３００倍量となるよう添加し、ホモジナイザーで攪拌することにより、ワクチン液を調製し、凍結乾燥を行うことにより、微粒子粉末剤型粘膜ワクチン（HA + ADvehicle +Ｇｌｙ）（比較例１）を作製した。
（糖類の添加）
　公知の粉末型ワクチンにおいて、イヌリンが賦形剤として使用されている例があるため、糖類について、分散剤として適切なものがないかどうかを検討した。グルコースがβ－１，４－グルコシド結合した多糖類であるセルロース（０３４－２２２２１、富士フィルム和光純薬社製）、マンヌロン酸とグルロン酸という二種類のウロン酸が直鎖重合した構造を有するアルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）（１９４－１３３２１、富士フィルム和光純薬社製）、イヌリン（９００５－８０－５、富士フィルム和光純薬社製）、カードラン（０３０－０９９０３、富士フィルム和光純薬社製）、ラミナラン（ＰＳ１３１、ＤＥＸＴＲＡ社製）、ザイモサン（ＮＢＰ２－２６２３３、ＮＯＶＵＳ社製）、イーストβグルカン（ＯＧ３０８２９、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社製）を、それぞれＧｌｙを添加した抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体溶液に加え、ホモジナイザーで攪拌後に凍結乾燥を行った。すなわち、グリシンを添加した抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体（HA + ADvehicle ＋ Ｇｌｙ）＋セルロース（比較例２）、HA + ADvehicle + Ｇｌｙ＋アルギン酸ナトリウム（比較例３）、HA + ADvehicle + Ｇｌｙ＋イヌリン（実施例１）、HA + ADvehicle + Ｇｌｙ＋カードラン（実施例２）、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ＋ラミナラン（実施例３）、HA + ADvehicle + Ｇｌｙ＋ザイモサン（実施例４）、HA + ADvehicle + Ｇｌｙ＋イーストβ-グルカン（実施例５）からなる各微粒子粉末剤型粘膜ワクチンを調製して、各被検マウスに投与し、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩgＡ、及び血清中のＩｇＧ量を測定した。なお、各多糖類の添加量は、ＨＡ抗原タンパク質濃度（［ＨＡ］）の１００倍量とした。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果）
　抗原タンパク質（ＨＡ）（１．５μｇ）－ＡＤビークル複合体（HA + ADvehicle）にグリシンを添加した、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）は、HA +Ｇｌｙ（比較例１１）と比較すると、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は５倍近く、血清中のＩｇＧ産生量は約１．７倍程度となったが、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量、血清中のＩｇＧ産生量はともに十分高いとはいえなかった。HA + ADvehicle +Ｇｌｙに、セルロースを添加したワクチンを投与した場合（比較例２）は、ネガティブコントロールの生理食塩水を投与した場合（比較例０）よりも鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量が少なく、抗体産生誘導を抑制することが確認された。また、HA + ADvehicle +Ｇｌｙに、アルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）を添加した場合（比較例３）も、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量、血清中のＩｇＧ産生量ともに高いとはいえなかった。
　なお、上記検討において、これ以降、添加した抗原タンパク質（ＨＡ）の７０％以上が、ＡＤビークル抗原タンパク質（ＨＡ）と複合体を形成していたことについては、以下の方法によって確認した。
　カロリーメーター(Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製)を用いて抗原タンパク質とＡＤビークル分子間の疎水性相互作用シグナルを検出することにより確認した。結合率の算出では、０．４ｍｇＨＡ（タンパク質量）／ｍＬ（超純水）（Ａ液）と、［０．４ｍｇＨＡ（タンパク質量）＋４ｍｇＡＤビークル(リン脂質量)］／ｍＬ（超純水）（Ｂ液）の各１ｍＬ溶液を作製し、それぞれを４２℃にて１０分間振盪攪拌混和した。それぞれの混和した溶液からタンパク質量測定用として各０．０５ｍＬずつ分取し、分取したそれぞれを遠心処理前の（Ａ液）及び（Ｂ液）試料とした。次に各溶液を遠心機（ＴＯＭＹ、ＭＸ－３０５）で４℃にて、２０４００×ｇ、１５分間遠心し、遠心後の各上清標品を０．０５ｍＬずつ分取し、それぞれを遠心処理後の試料（Ｃ液）及び（Ｄ液）とした。各試料のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２７）を用いて測定した。
　遠心処理によって沈殿分画に回収されるＡＤビークと共沈する結合ＨＡ蛋白質量を測定して結合率を算出した。結合率の計算式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）に、フルクトース重合体であるイヌリンを添加したワクチンを投与した場合（実施例１）は、HA + ADvehicle +Ｇｌｙに比べて、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は４．３倍、血清中のＩｇＧ産生量は１．７倍となり、顕著に抗体産生誘導効果が増強されたことが確認された。
１）HA + ADvehicle +Ｇｌｙに、カードランを添加したワクチンを投与した場合（実施例２）は、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）に比べて、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は約９．９倍、血清中のＩｇＧ産生量は約１３倍となり、顕著に抗体産生誘導効果が増強されたことが確認された。
２）HA + ADvehicle +Ｇｌｙに、ラミナランを添加したワクチンを投与した場合（実施例３）は、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）に比べて、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は約３．６倍、血清中のＩｇＧ産生量は約１２．９倍となり、顕著に抗体産生誘導効果が増強されたことが確認された。
３）HA + ADvehicle+Ｇｌｙに、ザイモサンを添加したワクチンを投与した場合（実施例４）は、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）に比べて、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は約３．３倍、血清中のＩｇＧ産生量は約１．９倍となり、顕著に抗体産生誘導効果が増強されたことが確認された。
４）HA + ADvehicle +Ｇｌｙに、イーストβ-グルカンを添加したワクチンを投与した場合（実施例５）は、HA + ADvehicle +Ｇｌｙ（比較例１）に比べて、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ産生量は約３．６倍、血清中のＩｇＧ産生量は約１８．９倍となり、顕著に抗体産生誘導効果が増強されたことが確認された。
　したがって、多糖類の中でも、イヌリンと、β－１，３－グリコシド結合にて連結されたグルコース重合体を含むグルコースを主要な構成糖とする多糖である、カードラン、ラミナラン、ザイモサン、イーストβグルカン等のβ－１，３-グルカン（類）を添加した場合に、顕著に抗体産生誘導効果が増強されることが確認された。なお、β－１，４－グリコシド結合によりグルコースが重合しているセルロースは抗体産生誘導効果に寄与しないことが確認された。
［比較検討例］
　上記で検討した多糖類について、抗原タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）にグリシンを添加するが、ADvehicleを添加せずに、凍結乾燥後にマウスの鼻腔に投与した場合（比較例１１）との抗体産生誘導効果について確認した。マウス１匹当たりの投与質量は、ＨＡ１．５μｇ、Ｇｌｙ４５０μｇ、多糖類はそれぞれ１５０μｇとした。結果を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（結果）
　抗原タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）にＡＤビークルを添加せずに、グリシンを添加し、セルロース（比較例４）やアルギン酸ナトリウム（比較例５）を添加した場合、抗体産生誘導効果の増強の程度は非常に小さかった。また、イヌリン（比較例６）、カードラン（比較例７）、ラミナラン（比較例８）、ザイモサン（比較例９）、イーストβ－グルカン（比較例１０）を添加した場合についても、それぞれの比較例６－１０にＡＤビークルを添加した（実施例１－５）の場合と比べると、抗体産生誘導効果の増強の程度は小さかった。
　また、抗原タンパク質にアミノ酸だけを添加しても（比較例１１）、また、さらにイヌリン（比較例６）やβ－１,３－グルカンを添加しても（比較例７－１０）、抗体産生誘導効果の増強は確認できなかった。また、前記で確認した通り、抗原タンパク質（ＨＡ）（１．５μｇ）－ＡＤビークル複合体（HA + AD vehicle）にグリシンを添加した場合（比較例１）も抗体産生誘導効果の顕著な増強は確認できなかった。しかし、さらにＡＤビークルを添加した場合（実施例１－５）では、強い抗体産生誘導効果の増強が確認された。したがって、本発明において、ＡＤビークルと、アミノ酸と、β－１,３－グルカン又はイヌリンとは、抗体産生誘導効果を増強するアジュバントとして相乗効果をもたらす必須の組合せ成分であることが確認された。
（カードランの検討）
　これまでの検討について、カードランに着目してデータをまとめた図１からも明らかなとおり、抗原タンパク質（ＨＡ）（１．５μｇ）－ＡＤビークル複合体（HA + ADvehicle）に、グリシンを添加した比較例１と比べると、カードラン１５０μｇを添加した、抗原タンパク質（１．５μｇ）－ＡＤビークル複合体（HA + ADvehicle）に、グリシンを添加した実施例２において、抗体産生誘導効果の増強の程度が顕著に大きかった。抗原タンパク質（HA）とグリシン（比較例１１）では、ほとんど抗体産生はみられなかった。抗原タンパク質（HA）（１．５μｇ）に、グリシン及びカードランを添加した場合（比較例７）も抗体産生はそれほど増加しなかった。したがって、ＡＤビークル複合体とグリシンとカードランとは、その組合せによる相乗効果によって、鼻腔の粘膜をはじめとする全身の粘膜における抗原特異的ｓ－ＩｇＡ抗体と、血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗体の産生の産生を増大させることが確認された。
　次に、カードランの最適な添加濃度を検討することとした。マウス一匹当たり、７５、１５０、３００、４５０μｇのカードランを添加してワクチンを作製し、抗体誘導効果を検討した。結果を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（結果）
　表３から明らかなとおり、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡ濃度は、カードランの濃度に依存して増加傾向を示した。一方、血清中のＩｇＧの濃度は、カードラン添加量１５０μｇ（実施例２）でプラトーを示した。したがって、カードランの最適添加量は、ＨＡ抗原タンパク質濃度（［ＨＡ］）の１００倍量である１５０μｇ程度であると判断した。なお、グリシンとカードランを添加し、ＡＤビークルを添加しない場合（比較例１２）は、顕著な抗体産生増強効果は認められなかった。
（アミノ酸の検討）
　次にグリシン以外のアミノ酸について検討した。カードラン１５０μｇを添加した、抗原タンパク質（１．５μｇ）－ＡＤビークル複合体（HA + AD vehicle）に、グリシン（実施例２）、アラニン（実施例９）、セリン（実施例１０）、トレオニン（実施例１１）、ロイシン（実施例１２）、イソロイシン（実施例１３）、フェニルアラニン（実施例１４）、メチオニン（実施例１５）、システイン（比較例１３）をそれぞれ４５０μｇ添加してワクチンを作製し、抗体誘導効果を検討した。結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４から明らかなとおり、システインを除く各アミノ酸を添加した場合、グリシンと同様、鼻腔洗浄液中のｓ－ＩｇＡの値、及び血清中のＩｇＧの値が、顕著に上昇したことが確認された。すなわち、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン等のアミノ酸はＨＡ特異的ｓ－ＩｇＡ誘導においてグリシンと同等以上の抗体誘導を、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン等のアミノ酸は血清中のＨＡ特異的ＩｇＧ誘導においてグリシンと同等以上の抗体誘導を示した。ＨＡ特異的ｓ－ＩｇＡ誘導及びＩｇＧ誘導において、システインを除くいずれのアミノ酸においても特に際立った大きな差異は見られず、システインを除くいずれのアミノ酸も、ＡＤビークルと、β－１,３－グルカン等の糖類と組み合わせることによりアジュバント成分として使用できると判定した。
［ＨＩ価］
　高分子のタンパク質抗原を含むワクチンは、凍結乾燥に伴う立体構造変化により、感染防御能の指標となる抗体価の低下がみられることがあることが報告されている。そこで、作製されたワクチンについて感染防御能の指標となるヘマグルチニンインヒビション（ＨＩ）価を測定することとした。ＨＩ価の測定は、デンカ生研「クラスIII免疫検査用シリーズ インフルエンザウイルスキット・インフルエンザウイルスHI試薬「生研」」を使用し、血清中のインフルエンザウイルスＨＩ抗体価を測定した。実施にあたっては、樹状細胞を刺激するアジュバントとして多くの研究で用いられているｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１０μｇを抗原タンパク質１．５μｇに添加した試料をポジティブコントロールとして、生理食塩水をネガティブコントロールとして用い、ＨＡ＋ＡＤｖｅｈｉｃｌｅ、ＨＡ＋ＡＤｖｅｈｉｃｌｅ＋カードラン＋Ｇｌｙ（実施例２）について比較を行った。なお、ＨＡ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、生理食塩水の検体は、凍結乾燥粉末として鼻腔への薬剤噴霧投与が困難であったことから、投与可能な液剤として経鼻投与した。マウスは各群６匹ずつ検討した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（結果）
　抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体にカードランとグリシンとを添加した実施例２のワクチンは、ポジティブコントロールとして用いたＨＡ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）よりも、ＨＩ価が２倍高いことが確認された。したがって、本発明のワクチンは凍結乾燥を行うことによっても国際的評価基準として評価されるＨＩ≧４０を満たすばかりか、高い抗体価を維持できることが確認された。かかるすぐれた効果が得られる理由の一つとしては、本発明におけるＡＤビークルは、抗原タンパク質と弱い疎水性相互作用で複合体を形成できることから、凍結乾燥工程によるＨＡ抗原のＨＩ価の低下を回避できる保護作用をもたらすからであることが考えられる。
［全身粘膜組織のｓ－ＩｇＡ抗体誘導効果］
　本発明のワクチン投与後において、経鼻のみならず全身の各粘膜組織におけるｓ－ＩｇＡ抗体の産生量を比較検討した。抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体にカードランとグリシンとを添加した実施例２のワクチンを２週間隔で合計３回経鼻投与を実施した。ＡＤビークルを含まない比較例７を比較対象とした。最終免疫から、２週間後に鼻腔洗浄液(nasal fluids)、膣洗浄液(vaginal fluids)、小腸分泌液（(small)intestinal fluids）、大腸の便(feces)を採取して、夫々の洗浄液の遠心上清に含まれる特異的抗インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９の各洗浄液のｓ－ＩｇＡ抗体価を測定した。上記データは、１匹当たりの各洗浄液の全体量で示されているが、採取検体全体量は、鼻腔洗浄液は１ｍＬ、膣洗浄液は１ｍＬ、肺洗浄液は２ｍＬ、小腸粘膜液は２ｍＬ、大腸は５００μＬであった。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（結果）
　表６から明らかなとおり、実施例２のマウスが比較例７のマウスよりも１匹当たり高い抗体産生量を示した。また、実施例２の試料をマウスに投与した場合には、膣洗浄液において鼻腔洗浄液と同程度の抗体産生量を示し、さらに小腸粘膜液と大腸における便においてｓ－ＩｇＡの産生量が顕著に増加した。したがって、本発明の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンは、局所的な投与によっても、全身の粘膜組織において、感染防御的な作用を有するｓ－ＩｇＡを産生させることができることが確認された。
［微粒子粉末のサイズの確認］
　実施例２の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン１．５μｇを、ビニール袋内に噴霧飛散させ、導電性両面テープを貼った測定用ステージ上に飛散粉末を写し取った。飛散粉末が写し取られたステージを金蒸着装置内に入れて金蒸着を実施した。金蒸着終了後測定用ステージを取り出して、走査電子顕微鏡装置（ＪＣＭ５７００、日本電子株式会社製）に挿入し、得られたＳＥＭ画像から微粒子粉末の粒径を附属の計測装置にて読み取ってグラフ化した。測定は、画像面積３．５×１０－６ｍ２当たりに確認された微粒子粉末２４４個について行い、長径を粒子径として測定し、粒子径の個数分布表を作成した。結果を図２に示す。
（結果）
　図２から明らかなとおり、金蒸着法により固定化された実施例２の微粒子粉末の粒子径は、１０～２０μｍに該当する微粒子が一番多く、６．５～１０μｍに該当する微粒子が次に多く、２０～３０μｍに該当する微粒子がその次に多く、５～６．５μｍに該当する微粒子がまたその次に多く、全体の約８０％が５～４０μｍの範囲に該当した。
［ワクチン到達部位の確認］
　マウスの鼻腔に投与した微粒子粉末剤型ワクチンの到達部位の確認を行った。抗原としてヘマグルチニンではなく、Ａｌｅｘａ６４７蛍光色素でラベルしたオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いた他は、実施例２のワクチンと同一の組成を有する組成物（ＯＶＡ抗原１．５μｇ＋ＡＤビークル１５μｇ＋カードラン１５０μｇ＋Ｇｌｙ（４５０μｇ））を充填したエッペンドルフチューブを被検マウスの鼻口に押し当てて、押し出す気流に乗せて噴霧投与することにより経鼻投与した。経鼻投与から２０分後に、インビボイメージングシステム（IVIS spectrum、パーキンエルマー社製）により、被検マウスの鼻腔、咽頭部、気管、気管支、肺の画像を撮影した。画像を図３に示す。
（結果）
　図３から明らかなとおり、被検マウスの鼻腔、咽頭部において、投与した微粒子粉末が、被検マウスの鼻腔、咽頭部に分布していることが確認された。しかし、気管、気管支、及び肺には微粒子粉末は到達していなかった。この結果は、上記５μｍ以上の微粒子が到達する範囲と一致した。
　本発明のワクチンは、医療の分野において非常に有用である。なお、例えば、マウスに感染するよう馴化させたヒト由来のウイルス株等を用いるマウスの実験によって有効性が確認することができるため、当該技術分野においてはマウス等の試験動物の体表面積から、ヒトにおいて同等の作用が発現する用量を推定するＨＥＤ換算方法や、最高血中濃度（Ｃｍａｘ）や時間曲線下面積（ＡＵＣ）のデータを参照する方法等の公知の方法により、ワクチンの投与量について、ヒトへの投与量を推定したうえで、実験データをさらに蓄積させてヒトへの投与量を決定することを行うことができる。

Claims (15)

  1. 抗原タンパク質と、以下の（A）～（D）を含むアジュバントとを包含する、微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
    （A）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチド；
    （B）混合脂質；
    （C）β－１，３－グルカン又はイヌリン；
    （D）アミノ酸；
  2. ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドが、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  3. 混合脂質が１又は２以上のリン脂質を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  4. １又は２以上のリン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸から選ばれることを特徴とする、請求項３記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  5. 混合脂質が、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、γ－リノレン酸、アラキドン酸、α－リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  6. 抗原タンパク質が、病原体に由来するタンパク質、不活化抗原タンパク質、リコンビナント抗原タンパク質、又は無毒化毒素タンパク質であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  7. β－１、３－グルカンが、カードラン、ラミナラン、ザイモサン、イーストβグルカンから選ばれる１又は２種類以上であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  8. β－１、３－グルカンが、カードランであることを特徴とする、請求項１～６のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  9. アミノ酸が、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニンから選ばれた１又は２種類以上のアミノ酸であることを特徴とする請求項１～８のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  10. 粘膜において抗原特異的ｓ－ＩｇＡの産生を増強し、又は、血中において抗原特異的ＩｇＧの産生を増強するために用いられることを特徴とする請求項１～９のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  11. 鼻腔から咽頭部を経由する気道感染症に対して、感染防御効果を発揮する吸入型又は噴霧型の均一な微粒子粉末であることを特徴とする請求項１～１０のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチン。
  12. （１）抗原タンパク質；
    （２）ＫｎＬｍ（但し、ｎは４－８、ｍは１１－２０の整数を表す）のアミノ酸配列からなる合成ペプチド；
    （３）混合脂質；
    （４）β－１，３－グルカン又はイヌリン；
    （５）アミノ酸；
    を含む凍結乾燥された微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法であって、
    以下の工程（ａ）～（ｅ）を備えることを特徴とする前記製造方法。
    （ａ）前記合成ペプチドと、混合脂質とを水に懸濁することにより、ＡＤ－ビークル懸濁液を調製する工程；
    （ｂ）ＡＤ－ビークル懸濁液に抗原タンパク質を添加し、加温と攪拌とを１回又は２回以上行い、抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を形成する工程；
    （ｃ）抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、β－１，３－グルカン又はイヌリンを添加後攪拌することによる、グルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を調製する工程；
    （ｄ）グルカン添加抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体に、アミノ酸を添加後攪拌することによるワクチン液を調製する工程；
    （ｅ）ワクチン液を凍結乾燥して微粒子粉末剤型化する工程；
  13. 混合脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びパルミチン酸の３種脂質混合脂質であることを特徴とする請求項１２記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
  14. 抗原タンパク質－ＡＤビークル複合体を形成する（ｂ）工程において、加温の温度設定範囲が２５～７５℃であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
  15. 抗原タンパク質単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせることのない量の抗原タンパク質を含み、合成ペプチドと、混合脂質と、β－１，３－グルカン又はイヌリンと、アミノ酸とを組み合わせることにより、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせるために用いられる、請求項１２～１４のいずれか記載の微粒子粉末剤型粘膜ワクチンの製造方法。
     
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