JP2000504746A

JP2000504746A - 粘液ターゲティング物質、および抗原を随時含むイスコムまたはイスコム―マトリックス

Info

Publication number: JP2000504746A
Application number: JP9530070A
Authority: JP
Inventors: ブロルモレイン; ロブグレン，ベングトソン，カリン; エクストロム，ジル
Original assignee: ブロルモレイン; ロブグレン，ベングトソン，カリン; エクストロム，ジル
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-04-18
Also published as: US20020131982A1; EP0889736A1; DK0889736T3; DE69726712T2; CA2247522A1; DE69726712D1; ES2210495T3; WO1997030728A1; NZ331403A; AU719084B2; EP0889736B1; SE9600647D0; US6607732B2; AU2238597A; ATE255905T1; CA2247522C

Abstract

(57)【要約】本発明は、ワクチンの製造、および経口経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の免疫刺激組成物の製造に使用するための、イスコム（iscom）および／またはイスコム−マトリックスと粘液ターゲティング分子を含んでなる、免疫原性複合体に関する。この免疫原性複合体は、少なくとも１つのグリコシド、少なくとも１つの脂質、および、ａ）局所的に粘膜に投与された時、リンパ組織をターゲティングし免疫応答を誘発する物質から選択される、少なくとも１つの粘液ターゲティング分子；およびｂ）おそらく、粘膜を通過して容易にリンパ組織に到達できない、薬学的免疫作用性または免疫物質から選択される１つのパッセンジャー抗原を含む。

Description

【発明の詳細な説明】粘液ターゲティング物質、および抗原を随時含むイスコムまたはイスコム−マトリックス本発明は、ワクチンの製造、および経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の免疫刺激組成物の製造に使用するための、イスコム（iscom）および／またはイスコムマトリックスと粘液ターゲティング分子の型の、免疫原性複合体に関する。免疫化のための方法が、長年の間使用されている。しかし、粘膜病を防止するための予防接種はうまくいっていない。これまでの知見では、粘膜表面を介する非複製抗原の抗原提示は、免疫応答刺激の非効率的な方法であり、この経路により有効で防御的な免疫応答を作成するには、新規の方策が必要であることが示されている（「粘膜感染の制御のための新規予防接種法」、アラン・ジェイ・ハズバンド（Alan J．Husband）、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１１巻、第２号、１０７〜１１２頁）。生きている弱毒化微生物を用いる予防接種は、粘膜病に対する唯一の可能な防御方法である。粘膜ターゲティング分子または抗原、を含有するイスコム、およびこれと混合したイスコム−マトリックスは、粘膜に投与された時、高力価の抗体を産生する。さらに、粘膜からの投与により容易に免疫することのない抗原（いわゆるパッセンジャー抗原）とともにそのような粘膜ターゲティング分子を含有するイスコムは、投与部位から離れたいくつかの別の粘膜でさえ、免疫応答を引き起こす。粘膜ターゲティング分子は、粘膜投与後にリンパ系をターゲティングする能力を有する。これは、免疫応答を誘発するのにパッセンジャー抗原を助ける抗原でもよいし、しばしば自分自身に対する免疫応答も誘発するであろう。抗原の複雑な混合物において、あるものは、パッセンジャー分子ならびに自身の標的分子になる能力を示す。２つまたはそれ以上の成分の混合物を使用する方策はまた、自身またはパッセンジャー抗原に対する以後の免疫応答を調節する可能性がある。この調節作用、ならびにＣＴＢに対するＩｇＡ応答に及ぼす増強作用により最もよく例示される、粘膜中のＩｇＡへの粘膜抗体応答の変換を増強するイスコムの能力、は、ＩｇＧ２ａにより例示される標的分子を有するイスコム製剤において特に顕著である。他の抗原に単に添加され別の物質として混合されたイスコム− マトリックスは、類似の性質を有するが、しばしばそれほど顕著ではない。背景イスコム（免疫刺激複合体）およびイスコム−マトリックスのような、脂質含有およびキラヤ（quillaja）サポニン含有構造は、薬学的および／または免疫学的活性を有する物質または分子複合体の有効な担体であることが報告されている。例えば、ＷＯ−Ａ１−９０／０３１８４号を参照されたい。多くの場合に、異なる抗原を取り込んだ構造で実験動物を非経口的に免疫すると、遊離型の対応する抗原で免疫した後に得られる免疫応答より、問題の抗原に対してより高い免疫応答を与えることが証明されている。イスコムは、非経口投与を使用して小分子および大分子（抗原）の免疫原性を増強するのに有効な担体であることが記録されている。ＥＰ０１０９９４２号のようにタンパク質のような抗原を取り込んだイスコム、およびＥＰ０１８０５６４号のように小さい抗原やオリゴヌクレオチドのような小分子の担体であるイスコムは、大分子および小分子に対する免疫応答を有効に引き起こす。イスコム中のオバルブミン（ＯＶＡ）のようなタンパク質抗原は、経口免疫後でさえ免疫応答（抗体生成、ＭＨＣクラス−２限定下でＴ−ヘルパー細胞、およびＨＭＣクラス１−限定下で細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む）を誘発することができるが、数回の免疫化（および、非現実的な高用量）が必要であることも証明されている（ビー・モレイン（Morein，B.）、ケー・レブグレン（Loevgren， K.）、ビー・レンバーグ（Roennberg，B）、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３，４６１−７５，１９９５）。一方、高用量（遊離型すなわちイスコムに取り込まれていない型で投与１回あたり数百μｇのオバルブミン）を投与しても、免疫応答がないかまたは小さな免疫応答しかない。遊離のオバルブミンは、以後の非経口投与免疫化に対して、寛容および抑制を示す。イスコム−マトリックス（およびイスコム）は、抗体性および細胞性免疫応答を引き起こす、充分記録された内蔵アジュバント活性を有する。クラス１およびクラス２ＭＨＣ限定下での細胞性免疫応答は、イスコムにより引き起こされる。非経口免疫化に比較して、イスコムの経口投与および経鼻投与後の免疫応答は低い（モワット（Mowat）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７２，３１７−３２２（１９９１）；モワット（Mowat）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８０，５２７−３２２（１９９３））。さらに、経鼻および経口免疫化の適用において、イスコムに取り込まれるある抗原（例えば、狂犬病ウイルスのｇ−タンパク質またはＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０）は、ＥＬＩＳＡで測定される血清抗体応答の形では、測定可能な免疫応答を引き起こさなかった。おそらくこれは、非経口的または経鼻的に投与された粒子のほんの少数が粘膜層を通過することができ、小腸上皮バリアーまたはパイエル板のＭ細胞により吸収されることができ、そこで免疫系と局所的に接触するためと考えられる。粘膜バリアーおよび標的抗原提示細胞（ＡＰＣ）、リンパ組織および／または小腸の上皮層（例えば、パイエル板（ＰＰ）または粘膜固有層（ＬＰ））、または咽頭の扁桃領域または他の粘膜被覆表面のリンパ組織を、抗原が通過できないことにより引き起こされる、限定された吸収および不充分な抗原通過を含む問題。粘膜の免疫応答は、一般に粘膜投与が局所的に行われた時にのみ発生する。イスコムは、他の抗原提示構造と同様に、粘液を通過する能力が限定されており、上皮に結合しこれに吸収される能力、またはＰＰ中のＭ細胞に到達しこれに吸収され、次に抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送られ、リンパ球集団を刺激する能力が種々の程度に限定されている。鼻粘膜内に投与された場合でも、現状の技術を使用する場合、ＡＰＣによるターゲティングと抗原摂取、および免疫応答の誘発は不充分である。ＣＴとＬＴは粘液ターゲティング分子として使用されているが、これらは毒性が高いため、ヒトや動物への使用は好ましくない。これらの毒素のＢ −サブユニットは毒性はないが、同様にほとんど効果もなく、従って、現実的には予防的または臨床的用途に適していない。従って、経口投与または経鼻投与で使用するのための抗原のより優れた提示系が必要である。粘膜経由の投与において有効な、より優れた抗原提示系に対するニ−ズがある重要な理由は、この種の投与は、膜において局所的免疫応答を引き起こすためである。例えば腸管での免疫化が、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を介して遠くの粘膜表面で免疫応答を引き起こすか、または呼吸器管での免疫化が気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）を介して他の粘膜表面の免疫応答を引き起こすような、共通のリンパ系が存在することはよく知られているが、これらの応答は一般に小さく、離れた粘膜のターゲティングを促進する粘液ターゲティング分子もしくは抗原提示系は、特に規定されていない。気道、腸管または生殖器官のような場所では、粘膜を介して多くの感染症が発生し、粘膜には最初の免疫防御バリアーが存在する。さらに、注射による非経口投与に比較して経口および経鼻投与は、医療的熟練者を必要としないという利点がある。発明の要約本発明は、ワクチンの製造、および経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の免疫刺激組成物の製造に使用するための、イスコム（iscom）および／またはイスコム−マトリックスと粘液ターゲティング分子の型の、免疫原性複合体に関する。少なくとも１つのグリコシド、その１つがコレステロールである少なくとも１つの脂質、ａ）リンパ組織をターゲティングしこうして局所粘膜において免疫応答を誘発する物質から選択される、少なくとも１つの粘液ターゲティング分子、およびおそらくｂ）粘膜を通過して容易にリンパ組織に到達できない、薬学的免疫作用性もしくは増強性または免疫原性物質から選択される少なくとも１つのパッセンジャー抗原、を含有するイスコムおよびイスコム−マトリックスから選択される免疫増強複合体を使用することにより、ワクチンや、経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の免疫刺激物質を製造することができることが証明されている。これは、血清中のパッセンジャー抗原に対する抗体、投与部位の局所膜および他の部位（特に、呼吸器官、小腸および生殖器官）の膜の分泌物中での局所ＩｇＡ免疫応答を提供するであろう。詳細な説明本発明の１つの面は、粘液ターゲティング分子に対するワクチンまたは免疫調節組成物を製造するための、少なくとも１つの粘液ターゲティング分子を含有する、イスコム複合体の使用に関する。イスコムはまた、粘液ターゲティング分子、またはターゲティング分子およびパッセンジャー抗原に対する免疫応答を生み出すための分子とともに、少なくとも１つのパッセンジャー抗原を含有してもよい。本発明はまた、粘液ターゲティング分子に対するワクチンまたは免疫調節組成物を製造するための、少なくとも１つの粘液ターゲティング分子と混合されるイスコム−マトリックスの使用に関する。イスコム−マトリックスはまた、粘液ターゲティング分子、またはターゲティング分子およびパッセンジャー抗原に対する免疫応答を生み出すための分子とともに、少なくとも１つのパッセンジャー抗原と混合してもよい。イスコムは、少なくとも１つのグリコシド、少なくとも１つの脂質、および少なくとも１つのタイプの抗原性物質（特に、タンパク質およびペプチド）を含有する。これらの複合体は、投与された抗原の免疫原性を増強し、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号、ＥＰ０２４２３８０Ｂ１号、およびＥＰ０１８０５６４Ｂ１号に記載のように、１つまたはそれ以上の免疫調節（アジュバント活性）物質を含有してもよい。いくつかの抗原は、イスコム粒子中で物理的組み込みを必要としないため、別の物質中でパッセンジャー抗原と混合したイスコム−マトリックスを使用する局所的粘膜投与からも大きな利点が得られる。そのような抗原は単純ヘルペスウイルス２ウイルスのｇＢ２により例示され、これは粘膜投与により免疫応答を誘発するが、この免疫応答は、マトリックスとイスコムにより大きく増強される。マトリックスは、アジュバント活性物質である少なくとも１つのグリコシドと、少なくとも１つの脂質を含有する。マトリックスは、抗原性物質とともに投与に対して免疫刺激作用を有する（ＥＰ０４３６６２０Ｂ１を参照）。マトリックスは、種々の免疫活性、免疫増強成分を含有してもよい（ＥＰを参照）。本発明によれば、複合体は、イスコム複合体に組み込まれたかまたは既製のイスコム複合体に結合した、粘液ターゲティング分子および／またはパッセンジャー分子とのイスコム複合体から構成されてよい。これらはまた、粘液ターゲティング抗原およびパッセンジャー抗原が化学的に結合できるかまたは疎水性相互作用により結合することができるイスコム−マトリックスから構成されてよく、これらを、抗原式と混合した別の物質であるイスコムまたはイスコム−マトリックスとしている。本発明によれば、これらの複合体は、ワクチンの製造、および経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸モードの投与もしくは他のタイプの局所的粘膜投与用の免疫刺激物質の製造のために、使用することができる。これらは、生殖器、小腸、上呼吸器官、および肺などの、これらが投与されたものとは別の粘膜での免疫応答、ならびに循環抗体を誘発する。本発明によれば、これらの複合体はまた、免疫応答を調節して、種々の粘膜分泌物中の強い特異的ＩｇＡを包含し、血清中のＩｇＧ２ａ応答の上昇を包含し、インターフェロンガンマおよびＴヘルパー１応答の参加を示している。本発明によれば、イスコムはイスコム−マトリックスのように、非経口投与により引き起こされる免疫調節とは異なる抗体性免疫応答および細胞性免疫応答を調節することができる。局所的粘膜投与はまた、他の抗原または抗原決定基に対する免疫応答も引き起こす。この点から、非経口投与免疫化では認識できない（例えば、炭水化物構造）免疫応答を誘発する新しい可能性が発生する。これらを、免疫治療ための、または例えば免疫治療による脱感作によるアレルギーの治療のためのワクチンの製造において使用することも興味深い。これらはまた、ＣＴＢまたはＬＴＢにより誘発される抗原に対する寛容または局所的投与により引き起こされる他の寛容条件を破壊するのにも有用である。粘液ターゲティング分子およびパッセンジャー抗原は、細菌、ウイルスまたは寄生体、特にＥＰ０１０９９４２Ｂ１号に記載のようなもののような微生物から得られる。粘液ターゲティング分子は、リンパ組織をターゲティングして、種々の粘膜表面での局所的粘膜投与において免疫応答、ならびに全身性免疫応答、を誘発する分子である。特に、タンパク質、ペプチド、炭水化物のような抗原物質が企図される。炭水化物は、多糖、糖脂質または糖ペプチドでもよい。粘液ターゲティング分子は、細菌またはウイルス起源、例えば細菌性コレラ毒素およびそのサブユニットＢ（ＣＴＢ）、または大腸菌（E．coli）の熱不安定性毒素およびそのサブユニットＢ（ＬＴＢ）でもよい。他の例は、粘膜を通過し気道に感染するウイルスのエンベロープタンパク質や、細菌のタンパク質（例えば、インフルエンザウイルス、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、マイコプラズマの膜タンパク質、およびアデノウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、およびピコルナウイルス科のエンテロウイルスやアストロウイルスのヘキソンやペントンのような細菌の綿毛がある。使用可能な抗原の他の例は、小腸に感染するウイルスや細菌、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、コロナウイルス、のエンベロープタンパク質、および大腸菌（E．coli）（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｋ９８１−Ｂ）、赤痢菌（Shigella）、クラミジアの綿毛、およびマイコプラズマの膜タンパク質がある。このような微生物は、麻疹（measles）ウイルス、ドイツ風疹（German measle s）ウイルス、および水痘（chicken pox）ウイルス；マイコプラズマ・ニューモニー（Mycoplasma pneumoniae）、マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）、クラミジア・ニューモニー（Chlamydia pneumoniae）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitides）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae ）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、サルモネラ・ティフィ（Salmonell a typhi）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacter ium diphtheriae）、マイコバクテリウム・ツベルキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgd orferi）、プラスモジウム・ビバックス（Plasmodium vivax）、プラスモジウム・ファルシパリウム（Plasmodium falciparium）、トキソプラズマ・ゴンジー（ Toxoplasma gondii）、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、ガルジア・ラムビイア（Gardia l ambiia）、およびエンタメーバ・ヒストリティカ（Entamoeba histolytica）；および、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）とヒストプラスマ、カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、ニューモコッカス・ニューモニア（Pneu mococcus pneumonia）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenz ae）でもよい。パッセンジャー抗原は、薬理学的抗原物質よりなる群から、または免疫化に関係はあるがあまり有効に粘膜を通過できない抗原物質のいずれかから選択されてよい。そのような物質には、例えば、種々のヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１および２、ウシヘルペスウイルス１）、ピコルナウイルスのｇＢおよびｇＤ、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０およびｇｐ１６０またはＨＩＶ−２ならびに他のレトロウイルス、ヘパドナウイルス（例えば、ポックスウイルス）、アデノウイルス、カルジウイルス、トガウイルス、フラバウイルス、イルジオウイルス、ビルナウイルス、パルボウイルス、ポポバウイルス、ピコルナウイルス、カルシウイルス、アストロウイルス、アレナウイルス、ブニャウイルス、オルトミキソウイルス、パラミキソウイルスからの対応するエンベロープタンパク質、狂犬病ウイルスもしくはサルモネラ、大腸菌（E．coli）、赤痢菌（Shigella）のような細菌、クラミジア、リケッチャ、バルトネラもしくはマイコプラズマ（ Mycoplasma）からのＧ−タンパク質がある。これらはまた、クローニング後にその能力を喪失するかもしくは喪失しない、または粘膜に適用された時リンパ組織に対して粘液ターゲティングであるため、粘液ターゲティング分子とともにもしくはマトリックスとともにイスコム中に取り込まれることにより、免疫応答を誘発する能力を増加させる、種々の組換え生成物または合成抗原であってもよい。複合体がイスコムである場合は、これらはヨーロッパ特許ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号に記載のように調製される。ここでは、抗原または抗原決定基を含有するウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生体および動物細胞が混合され、特に、疎水性または両新媒性領域を有するタンパク質またはペプチドまたは単離された分子が、１つまたはそれ以上の可溶化剤と混合され、次に抗原または決定基は、可溶化剤の存在下で可溶化剤から分離されるか、または可溶化剤から分離されて、少なくとも決定的に重要なミセル濃度のコレステロール、リン脂質、および疎水性または親水性ドメインを有する１つまたはそれ以上のグリコシドに移され、次にタンパク質複合体が生成し、次に単離し精製される。パッセンジャー抗原および／または粘液ターゲティング分子を含有する完全な微生物から出発することができ、この場合、多少とも純粋に精製されたかまたは合成もしくはハイブリッド−ＤＮＡ法を用いて調製された、粘液ターゲティング分子またはパッセンジャー抗原が加えられる。この添加物は、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号（特に、４〜８頁）に説明されているように、任意の部分的な段階で添加される。好適な方法は、添加物を、脂質やグリコシドの添加前に加えることである。さらに、多少とも純粋に精製されたかまたは化学合成もしくはＥＰ０１０９９４２Ｂ１号の４〜８頁に記載のハイブリッド−ＤＮＡ法を用いて調製された、粘液ターゲティング分子またはパッセンジャー抗原からなるベースを使用してもよい。この場合、本出願人のヨーロッパ特許ＥＰ０２４２３８０Ｂ１号に記載のように、複合体が単離および洗浄される前に脂質を添加することが好ましい。使用される脂質は、特に本出願人の特許ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号の特に３頁およびＥＰ０４３６６２０Ｂ１号の７頁７〜２４行に記載の種類である。コレステロールのようなステロール、ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルコリンＧＭ１のようなリン脂質が、特に使用された。脂質はまた、細胞形成成分に結合する脂質含有物質（例えば、コレラ毒素の受容体、ガングリオシドＧＭ１、およびフコース化血液型抗原のような）を含有してもよい。細胞結合成分は、粘液ターゲティング分子として機能することができ、脂質含有物質を含有する複合体と単純に混合して、脂質含有物質に結合させることができる。粘液ターゲティング抗原またはパッセンジャー抗原からまずイスコム粒子を調製し、次に現状の結合法、好ましくは本出願人のヨーロッパ特許ＥＰ０１８０５６４Ｂ１号およびＥＰ０４３６６２０Ｂ１号に記載のような化学的結合法、を使用して、パッセンジャー抗原および粘液ターゲティング抗原に加えることができる。ベースはまた、可溶化剤中で少なくとも１つのステロールを可溶化し、グリコシドまたはサポニンおよび他の脂質を加え、次に、必要であれば、すなわち最終生成物中で許容されないなら可溶化剤を除去して、調製されるマトリックスでもよい。マトリックスは通常、個々の部分が溶解不可能な水溶液に移される。可溶化剤は、例えばゲルろ過、限外ろ過、透析または電気泳動により除去できる。次に、例えば密度勾配による遠心分離またはゲル遠心分離により、マトリックスを、過剰のステロールおよびサポニンから精製してもよい。可溶化剤は、ＥＰ０４３６６２９Ｂ１号の５頁２４〜４５行に記載の任意のものでよい。他の成分および調製法もまた、この明細書に記載されている。パッセンジャーおよび粘液ターゲティング分子は、現状の結合法（上記参照）を使用してマトリックスに結合することができる。アジュバント分子および／またはパッセンジャー抗原を、イスコム分子と混合（ここでパッセンジャー抗原またはアジュバント分子は、組み込まれる）するか、またはイスコムおよび／またはマトリックス複合体（ここにパッセンジャー抗原または粘液ターゲティング分子が結合している）と混合することもできる。また、粘液ターゲティング分子とパッセンジャー抗原の両方を、別々の物質中のイスコム複合体またはマトリックスと混合（この場合、イスコム複合体は異なる抗原分子を含有する）することもできる。この調製に使用されるグリコシドは、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号の４頁の最後の段落に記載のものでもよい。好適な方法は、トリテルペンサポニン類、特にキルＡ（Quil A）またはその規定された成分、特に本出願人のヨーロッパ特許ＥＰ０４３６６２０Ｂ１号号の４頁１９〜４６行に記載のようなサポニンを使用することである。これらは、ＱＨＡ、ＱＨＢ、またはキルＡの他の成分（例えば、７０３）でもよい。グリコシドはアジュバントである。または、ケンシル（Kensil ）、ケルステン（Kersten）またはダルスガード（Dalsgaard）（シー・アール・ケンシル（Kensil，C.R.）、ユー・パテル（Patel，U.）、エム・レニック（Len nick，M．）、ディー・マルシアニ（Marciani，D．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，４３１−４３７，１９９１；ジー・ジー・エー・ケルステン（Kersten G. G.A.）、エー・スピエクストラ（Spiekstra，A．）、イー・シー・ベウベリ（Be uvery，E.C.）およびディー・ジェイ・エー・コメリン（Commelin，D.J.A．）、ＢＢＡ１０６２，１６５−１７１，１９９１；または特許ＷＯ９５／０９１７９号、ダルスガード（Dalsgaard））に記載されている成分。ＥＰ０４３６６２０Ｂ１号に記載のように、イスコムまたはマトリックス中にグリコシド以外の他のアジュバントまたは免疫調節成分を取り込むこともできる。このようなアジュバントの例は、コックス（Cox）ら、ＣＲＳ，１９９２に提供されている。好適な方法は、ＭＤＰ、ＭＴＰおよびアブリジン（avridi n）を使用する方法である。粘液ターゲティング分子またはパッセンジャー抗原に疎水性基または両新媒性基が欠如している場合は、抗原がイスコム粒子に結合できるようにこれらを加えることができる。そのような基の例は、ＥＰ０２４２３８０Ｂ１号の９頁、およびＥＰ０４３６６２０Ｂ１号の６頁３３行〜７頁６行に記載されており、結合法が記載されている。これらは、下記の例２に記載のように脂質でもよい。使用されるコレステロール、脂質および抗原の相対量は、前記特許ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号、ＥＰ０１８０５６４Ｂ１号、ＥＰ０２４２３８０Ｂ１号、およびＥＰ０４３６６２０Ｂ１号に記載されている。細菌性粘液ターゲティング分子については、最も好ましいのはコレラ毒素、Ｂ（ＣＴＢ）のようなそのサブユニット、および大腸菌（E．coli）中の熱不安定性毒素でＢ（ＬＴＢ）のようなそのサブユニットである。コレラはすべての下痢疾患の中で最も危険であり、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）細菌０の１型により引き起こされる。これらの細菌はヒトの小腸でコロニーを形成し、そこでコレラ毒素として知られている外毒素タンパク質を分泌する。同様の疾患が、いわゆる「腸毒性」球菌（ＥＴ）により引き起こされるが、これらの症状は通常より軽度であり、コレラ毒素（ＣＴ）に似た熱不安定性毒素（ＬＴ）により引き起こされる。これらの毒素はよく似ているため、同じ受容体に結合する。ＣＴとＬＴの構造は、構造と機能についてよく解明されている。これらは、コレラ毒素受容体に結合する部分を含有するオリゴマータンパク質、すなわちＢ− サブユニットであり、これはまた、各々がモル質量約１１，６００のサブ物質であり、５成分環の型を有する。Ａサブユニットは、２つのジスルフィド結合断片からなる約２８，０００のモル質量を有するタンパク質分解性の分割されたポリペプチドである。大きいＡ１−断片は、毒素−酵素活性を有し、小さいＡ２−断片は、Ａ１−断片をＢ５環に結合させる。ＣＴは、小腸のいわゆるブラシ縁膜の表面に存在するあるクラスの受容体に強い親和性で結合し、かつほとんどの哺乳動物細胞中の原形質膜に結合する。この受容体は、ガングリオシドＧＭ１からなる。さらに、ＬＴは不特定の糖タンパク質にも結合する（ホルムグレン（Holmgr en）ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ、３８，４２４−４３３（１９８２））。これらのタンパク質はまた、イスコムに取り込まれるかまたはイスコムもしくはマトリックスに結合し、ＬＴへの結合分子として作用する。ガングリオシドＧＭ１、および脂質タイプまたは疎水性の粘液ターゲティング分子の他の受容体は、イスコム粒子の脂質含有領域に含めてもよい。これらは、マトリックス中の脂質組成の一部でもよい。受容体がイスコム粒子またはイスコム−マトリックス粒子中に取り込まれる時、これは、粒子内に取り込まれた受容体に結合する対応するリガンドと混合することができる。担体またはパッセンジャー抗原の受容体がガングリオシドの場合は、この抗原は、単純な混合法によりそのような受容体に結合させることができる。この方法は、下記の例１で説明される。同様に、他の受容体はそのアンタゴニストに結合する。コレラ毒素は、毒性を示すＡサブユニットと、糖脂質（ＧＭ１）を介してこの毒素を細胞の原形質膜に結合させるＢサブ物質とを含有する。毒性を低下させるために、通常コレラ毒素中のＢサブユニット（ＣＴＢ）のみを、免疫応答を引き起こすためのワクチン抗原として使用する。Ｂサブユニットは毒性がなく、局所的経鼻および非経口投与免疫化（例えば、皮下または筋肉内免疫化）において、ＣＴに比較して比較的弱い免疫応答を引き起こす。すなわち、Ｂサブ物質は、弱いアジュバント活性を有する。ＣＴＢはまた、組換えＤＮＡ産物として入手できる。（ｒＣＴＢ）（ＥＰ３６８８１９号）。ＣＴＢとＬＴＢの抗原活性、または粘膜中で粘液をターゲティングするこれらの活性、および自身と閉じこめられた抗原をリンパ系臓器および細胞に局在化して免疫応答を引き起こす活性を大幅に低下させない限りは、わずかの数のアミノ基またはカルボキシ基しか活性化されないため、抗原をＣＴＢやＬＴＢに共有結合させて、有用な物理的または経済的収率を得ることは困難である。担体分子上の化学的結合のために充分な数の基が利用できても、そのような作製体から有用な物理的および経済的収率を得るのが困難であることは公知である（レーブグレン（Loevgren）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７３，２３７−２４３）。イスコムにおいて粘液ターゲティング分子を使用することは、多くの利点を有する。特に、種々の疾患に対する経口、経鼻または直腸ワクチンの調製について、このことが言える。このようなワクチンは、担体作製体を、リンパ系臓器および腸管内の細胞、および他の粘膜に、ＧＡＬＴＭＡＬＴ、ＮＡＬＴ（腸管、粘膜および鼻−咽頭関連リンパ組織）（例えば、呼吸器官）を介して、または局所投与により直接局在化するために、抗原と、ＣＴＢまたはＬＴＢが補足されたアジュバント成分とを有する担体作製体を含有することができる。イスコムは粘液ターゲティング分子より大きいため、結合または他の方法（例えば、疎水性相互作用または静電結合）により、選択されたパッセンジャー抗原および選択されたアジュバント成分を取り込む余地がある。マトリックスの製造において、ステロール、他の脂質、およびグリコシドの一般的な比率は、０．２〜１０：０．２〜１０：１〜１００、好ましくは１：１：５である。脂質含有受容体を使用すると、他の脂質を完全に置換することができ、その結果ステロール、他の脂質、およびグリコシドの一般的な比率が上記のようになる。他の可能性は、脂質含有受容体および他の脂質（好ましくは、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンと受容体）の両方を使用することであり、その結果比率は、ステロール；他の脂質；受容体；グリコシドが０．２〜１０：０．２〜１０：０．１〜１：５〜１０、好ましくは１：１：０．２５：５になる。受容体分子の数は、希望する分子の数に依存する。原理的に、成分は任意の比率で加えられる。最終生成物は、上記の種々の成分の間の重量比を有し、過剰には入らないことが証明されている。他の脂質が過剰に使用されるなら、複合体は「脂っこく」かつもろくなり、簡単にくずれる。他の脂質が少なすぎる場合、複合体が形成されず、その代わりに輸状（環状）のサブユニットが形成される。これは、電子顕微鏡で測定できる。電子顕微鏡で生成物を調べることにより、イスコムまたはマトリックスが得られているかどうかを測定できる。ＥＰ０１０９９４２Ｂ１号の図３および本出願の図３にみられるように、典型的なマトリックスまたはイスコムは、特徴的に開いた球形構造であり、環状のサブユニットからなる。イスコムは、対応するミセルより小さい沈降定数を有し、しばしば対応するモノマー型のタンパク質またはペプチドより大きい沈降定数を有する。マトリックスおよびイスコムは、約１２〜２２Ｓ、特に２０Ｓの沈降定数を有する。標的または粘液ターゲティング抗原を結合するために脂質含有受容体を使用する利点は、グリコシド、ステロール、おそらくは他の脂質および脂質含有受容体とともに、次に粘液ターゲティング分子を単に混合するだけで、マトリックスが調製できることである。この方法は、上記成分と粘液ターゲティングタンパク質抗原を含有する既製のイスコムを調製するより、または既製のマトリックスに抗原を結合するのに化学的結合法を用いるより、より効果的で安価で簡便である。化学的結合法を使用して抗原がイスコムに組み込まれるかまたはマトリックスに結合される時、抗原決定基を構成するアミノ基またはカルボキシル基は修飾される。抗原をイスコムに共有結合するかまたは疎水性のテイルに結合してイスコムへの組み込みを促進するために、抗原が活性化される時、または化学的方法でマトリックスまたはイスコムに結合される（２つの抗原が使用される時）時、抗原決定基は変性される。これは、抗原を脂質含有受容体に結合させる方法に比較すると、修飾されない抗原の量は、大幅に低下することを意味する。これは例えば、脂質含有受容体を使用する方法に比較して、約５倍多量の抗原が必要であることを意味する。脂質含有受容体を使用するなら、方法ははるかに安価である。取り込みの程度が低下するのに平行して、グリコシドおよびアジュバント含量が上昇し、これは、達成される免疫応答中の抗原の量の少なさを部分的に補償する。同時に、アジュバント含量の増加のために、毒性が上昇することもある。しかし原理的に、抗原の受容体結合が使用されるなら、免疫応答はより高くなる。イスコムまたはマトリックスに粘液ターゲティング分子およびパッセンジャー抗原を結合させたい時には、他の利点もある。脂質含有受容体からイスコムまたはマトリックスを作成するなら、パッセンジャー抗原をイスコムに組み込んで、これを化学的結合法によりマトリックスに結合させるためのより多くのスペースがある。脂質含有受容体の使用は、パッセンジャー抗原の結合には影響しない。この方法では、最適の比率を得ることがより容易である。イスコムに組み込まれるかまたは化学的方法を使用してイスコムまたはマトリックスに結合されるパッセンジャー抗原および粘液ターゲティング分子の量を制御することが、より簡単である。一方、同じ方法で粘液ターゲティング分子および抗原を使用してイスコムを作成するなら、これらは競合して結合し、両方の成分の取り込みを全体に制御することが困難になる。特に、５つの結合部位サブユニットを有するコレラＣＴＢサブユニットに関して、ＧＭ１−受容体の重量の１３倍まで結合することができる。これでもまだ、粘膜中の受容体に結合することができるＣＴＢ中に結合物質は残り、分子として作用する。皮下投与において、ステロール、他の脂質、タンパク質およびグリコシドの重量比は、０．２〜１０：０．２〜１０：２〜１０：１〜１００、好ましくは１：１：１：５〜１０である。経口または経鼻投与においては、グリコシドの量は、上記比率より高く、すなわち１〜２００、好ましくは５〜２０である。まずマトリックスが製造し化学的結合法を使用して抗原に結合する時と、次にイスコム粒子を作成する時の両方で、適切な量が存在する。上記の特許文献のすべておよび先行文献ＳＥ９６００６４７−３は、参考のため本明細書に組み込まれる。イスコム、マトリックスおよび抗原の量は、薬学的に活性があるように選択され、当業者はこれを推定することができる。ヒトでは少なくとも１μｇ、特に１〜２００μｇの抗原が使用でき、この場合経済的側面が上限を設定する。動物では抗原の投与量は、抗原と個体の大きさとに依存して、少なくとも０．１μｇである。イスコムまたはイスコム−マトリックスは、可溶化剤（例えば、水または塩化ナトリウム）を含有する組成物中で調製できる。組成物はまた、複合体の作成において使用される洗浄剤（これがヒトまたは獣医学的慣行から許容されるなら）を含有してもよい。さらに、この組成物は、ヒトまたは獣医学的慣行で許容される他の添加剤や充填剤を含有してもよい。このような組成物は、例えばイスコム複合体および不活性の充填剤（例えば、塩化ナトリウム）を含有してもよい。これはまた、抗原と混合したマトリックスから構成されていてもよい。ワクチンは、不活性な充填剤を含有する組成物中のマトリックスとの物質、および不活性な充填剤を含有する組成物中の抗原との物質とを含有する投与法について利用できる。ＥＸＰＯＶＡＩ例１イスコムへのＧＭ１とｒＣＴＢの取り込みコレラ毒素（ＣＴ）は、特に局所的免疫化により有効なアジュバントである（ジェイ・ホルムグレン（Holmgren，J.）、シー・チェルシンスキー（Czercinsky C．）、ジェイ−ビー・サン（Sun，J-B）、およびエー−エム・スベネルホルム（Svennerholm A-M）、「ワクチン開発の考え方（Concepts in Vaccine Develop ment）」中、エス・エイチ・イー・カウフマン（S.H.E.Kaufmann）編、１９９６）。文献によれば、局所的免疫化によるその標的探索性のために、Ｂサブユニット（ＣＴＢ）でさえ、アジュバントとして記録されているが、この活性は、小腸のリンパ細胞への抗原のガイド機能に限定されている。ＣＴＢがイスコム−マトリックスに結合しているかまたはイスコム中に取り込まれるなら、局所的および非経口投与免疫化により免疫応答を強化し効率的である製剤が得られる。コレラに対するワクチンに関連して、および特に局所的のみならず非経口投与免疫化による他の抗原のためのアジュバントの選択により、この作用は興味深い。組換えコレラ毒素、サブユニットＢ（ｒＣＴＢ）（ＥＰ０３６８８１９号）は、異なる調製物中で、以下のものと混合される：ＭＥＧＡ−１０（バッケム（Bachem）Ｐ１０００デカノイル−ｎ−メチルグルカミド）、２０重量％水；ホスファチジルコリン（ＰＣ）（シグマ（Sigma）Ｐ−５７６３）、２０重量％ＭＥＧＡ−１０水で１０mg/mlに希釈；コレステロール（Ｃ）（シグマ（Sigma）Ｃ８６６７）、２０％ＭＥＧＡ−１０水で１０mg/mlに希釈；ＧＭ１（シグマ（Sigma）Ｇ７６４１）、２０％ＭＥＧＡ−１０水で１０mg/mlに希釈；ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（シグマ（Sigma）Ｐ２７６８）、２０％ＭＥＧＡ−１０水で１０mg/mlに希釈；キルＡ（スピコシド（Spikoside）、イスコテック（Iscotec）、ルレア（Lulea ）、１００μg/ml水；ｒＣＴＢ、０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．２ＭＮａＣｌ、０．００１ＭＮａ₂ＥＤＴＡ、０．００３ＭＮａＮ₃を有する緩衝液中５mg/ml；ホスファチジルコリンは、微量の放射活性コレステロール（³Ｈ−コレステロール、アマシャム（Amersham））で１：１（１０mlの２０％ＭＥＧＡ−１０中各脂質１００mg）の比率で補足したコレステロール、および１．０mlのリン酸緩衝化生理的ＮａＣｌ−食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）中１mg〜７．５μgのＧＭ１の変動する量（１μｇ、１．７μｇ、２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ）のＧＭ１と混合した。６つの異なるホスファチジルコリン／コレステロール−ＧＭ１−溶液の１mlに、キルＡを最終濃度０．２％になるように加えた。この混合物をソノレックス（ Sonorex）ＴＫ５２で２×１５分超音波処理し、室温（ＲＴ）に１時間放置した。次に混合物を、まずＲＴで２４時間そして次に低温室（４℃）で２４時間、ＰＢＳで透析した。電子顕微鏡（ＥＭ）により、マトリックスの存在を確認した。６つの異なるマトリックス（ＧＭ１含量が異なる）に１００μｇのｒＣＴＢを加えた。混合物をＲＴで２時間放置した。ｒＣＴＢが結合したマトリックス（すなわち、イスコム）を、ＰＢＳ中の１０〜５０％ショ糖勾配で、ＴＳＴ４１．１４ −ロータ（コントロン（Kontron））で３９，０００rpmで１０℃で１８時間超遠心分離して精製した。勾配を１６〜１８画分に集めた。画分を、ブラッドフォード（Bradford）のタンパク質測定法（ブラッドフォード（Bradford）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，（１９７６）２４８−２５４）を使用してｒＣＴＢに関して分析し、５９５nmで比色法で測定し、脂質については³Ｈ−コレステロールの検出により測定し、ならびにＥＭでマトリックスまたはイスコム構造の存在について観察した。図１は、それぞれｒＣＴＢ：ＧＭ１の比率１３：１（図１Ａ）と１００：１（図１Ｂ）の画分中の、脂質（■）とｒＣＴＢ（□）の量を示す。結果ＧＭ１マトリックスに完全に取り込まれた、すなわちｒＣＴＢ−イスコムを形成するための、タンパク質の相対的最大量（重量）は、取り込まれたＧＭ１の量より１３倍高かった（図１）。３つの異なる実験で、我々は同じ比率を観察した。多量のｒＣＴＢを加えると、勾配のより高い部分の過剰のｒＣＴＢは、³Ｈ− コレステロールに結合せず、これはこのｒＣＴＢが取り込まれていないことを示す。ｒＣＴＢは、イスコムを形成して凝集を引き起こす、ＧＭ１への５つの可能な結合部位を有するため、少量のｒＣＴＢを加えると、凝集が見つかった。ｒＣＴＢに結合したマトリックス、すなわちイスコムは、画分７〜９に存在する（図１Ｂ）。図３は、異なるイスコム調製物のＥＭを示す。ホスファチジルコリンの代わりに、それぞれマトリックスとイスコムにホスファチジルエタノールアミンを用いて同様の結果が得られている（結果は示していない）。結論ｒＣＴＢは、糖脂質ＧＭ１を含有するマトリックスに有効に結合することができる。マトリックスの調製時に適量のＧＭ１を加えることは、ｒＣＴＢイスコムの調製ための有効な方法である。例２パッセンジャー抗原（ＰＡ）の免疫学的標的装置としてのＣＴＢおよびイスコム背景コレラ毒素のＢ−サブユニット（ＣＴＢ）は、「パッセンジャー抗原」または、例えば経鼻的もしくは経口的に粘液に局所的にＢ−サブユニットと一緒に投与される抗原の「標的探索タンパク質」としての役割を活発に果たすことができることは、充分記録されている（ジェイ・ホルムグレン（Holmgren，J.）、エヌ・リッケ（Lycke，N．）、チェルキンクシー（Czerkinksy）、Ｖａｃｃｉｎｅ１１，１１７９−８４，１９９３）。Ｂ−サブユニットは、組換えＤＮＡ−生成物（ｒＣＴＢ）としてうまく産生され、従って、粘膜を介して投与されるワクチン抗原の標的探索タンパク質として魅力的である。本例の目的は、ｒＣＴＢを有するかまたは有さないイスコムは、粘膜への経鼻適用（ｉ．ｎ．）により、取り込まれた抗原であるＰＡ（パッセンジャー抗原）または同時に投与された抗原（ＣＡ）の、免疫刺激作用を増強させることを証明することである。この実験は、イスコム作製体およびイスコムマトリックスを有する作製体が、免疫防御に好ましいタイプの免疫応答を引き起こすことにより、免疫調節作用を有することを証明するために行なった。これらの実験において、ＯＶＡ、ｒＣＴＢまたはこれらの組合せに対する具体的な免疫応答を評価した。イソタイプＩｇＡとＩｇＧの粘液中、および異なるＩｇＧサブクラスの血清中の、免疫応答の分布を調べた。材料オバルブミン画分Ｖ（ＯＶＡ）（シグマ（Sigma）Ａ２５１２、セントルイス、アメリカ合衆国）ホスファチジルエタノールアミン−ジオレオイル（ＰＥ）２０重量％ＭＥＧＡ− １０（シグマ（Sigma）Ｐ−０８９０、セントルイス、アメリカ合衆国）中１０m g/ml¹⁴ Ｃ標識ＰＥ（アマシャム（Amersham）、バッキンガムシャー（Buckinghamshir e）、英国）コレステロール（Ｃ）２０重量％ＭＥＧＡ（シグマ（Sigma）Ｃ８６６７、Ｐ０８９０、セントルイス、アメリカ合衆国）中１０mg/ml ホスファチジルコリン（ＰＣ）（シグマ（Sigma）Ｃ８６６７）２０重量％ＭＥＧＡ−１０水中で１０mg/ml ＭＥＧＡ１０バッケム（Bachem）Ｐ１０００、バーゼル、スイス、デカノイル− ｎ−メチルグルカミド（２０重量％水）スルホ−ＮＨＳＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＨＭＳ）（ピアス（PI ERCE）No２４５１０、ロックフォード（Rockford）、アメリカ合衆国）ＥＤＣ１エチル−３（−ジメチルアミノプロピルカルボデミド−ＨＣｌ（ピアス（PIERCE）No２２９８０、ロックフォード（Rockford）、アメリカ合衆国）キラヤサポニンｉＨ₂Ｏ１００mg/ml（スピコシド（Spikoside）、アドヴェット（Advet）ＡＢ、ルレア（Lulea）、スエーデン）ｒＣＴＢコレラ毒素からの組換えＢ−サブユニットは、ジャン・ホルムグレン（Jan Holmgren）（免疫部（Department of Immunology）、ゲーテボルグ（Goet eborg）、スエーデン）から供与された。ＰＢＳｐＨ７．２イスコム−マトリックスは、アドヴェット（Advet）、ルレア（Lulea）、スエーデンから得た。動物ＮＭＲＩ−マウス、メス１８〜２０ｇ）ナショナル・ベテリナリー・インスチチュート（National Veterinary Institute）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン。方法イスコムの調製ＯＶＡは、製造業者（ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ合衆国）に記載のものを我々（カリン−レブグレン−ベングツソン（Karin- Loevgren-Bengtsson）が修飾して、脂質テイル−ホスファチジルエタノール（ＰＥ）−ジオレオイルとともに供給された。要約すると：ＯＶＡ１mg、ＰＥ１ mg、ＮＨＳ１mg、ＥＤＣ２０mgを、３７℃で２時間攪拌しながら総量７７５ μｌのＨ₂Ｏ中でインキュベートした。上記溶液に、Ｃ１mg、キラヤ５mgを加えた。ＣＴＢの結合を促進するために、ＯＶＡ１mg当たり４０μｇのＧＭ１を調製物に加えた。ＭＥＧＡ−１０の最終濃度は、総量１．１ml中２％に達した。この溶液をＲＴで２時間攪拌しながらインキュベートし、次にＰＢＳに対してＲＴで４８時間透析した。イスコムの形態は、電子顕微鏡で確認した。ＧＭＩを含むかまたは含まない調製物にｒＣＴＢを加えた。ＧＭ１の取り込みにより、例１のように、イスコム中にｒＣＴＢを取り込んだ（例１を参照）。他の調製物においては、ｒＣＴＢの結合をさけるためにＧＭ１を省いた。ＯＶＡまたはｒＣＴＢまたはその両方を含有するイスコム粒子を、ＰＢＳ中１０〜５０％ショ糖勾配でＴＳＴ４１．１４−ロータ（コントロン（Kontron）で３９０００rpmで１０℃で１８時間超遠心分離して精製した。ブラッドフォード（Bradford）のタンパク質測定法（ブラッドフォード（Bradfo rd）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，１９７６，２４８−２５４）を使用してｒＣＴＢに関して分析し、５９５nmで比色法で測定し、脂質については³ Ｈ−コレステロールの検出により測定し、そして電子顕微鏡でマトリックス− またはイスコム構造の存在について観察した。異なるイスコム−成分の性状解析図４Ａは、タンパク質測定法で測定し、１０〜５０％ショ糖勾配遠心分離で解析した遊離のｒＣＴＢ（□）、すなわちイスコム沈殿物に取り込まれず、ｒＣＴＢはゆっくり沈降し、勾配の上の方（すなわち、画分１２〜１４）で回収されることを示す。図４Ｂは、ショ糖勾配の超遠心分離によるイスコムに従うコレステロールの脂質放射活性（ＣＰＭ）（■）、およびブラッドフォード（Bradford）に従って測定した脂質化タンパク質ＯＶＡ（本文を参照）（□）を示す。ＯＶＡを有するイスコムは、画分６〜８で検出される。勾配は、２０〜５０％ショ糖勾配でＴＳＴ４１．１４−ロータで３９０００rpmで１８時間遠心分離した。一部の組み込まれなかったタンパク質画分１１、１２、および１３。ブラッドフォード（Bradfo rd）は、５９５nmの吸光度として測定した。図４Ｃは、ＧＭ１を有するイスコム中のｒＣＴＢの取り込みを示す。イスコムへのｒＣＴＢの取り込みは、タンパク質測定（ブラッドフォード（Bradford））により測定した（□）。イスコムの沈降は、勾配中のイスコムに従う放射能標識コレステロール（ＣＰＭ）（■）により示す。タンパク質（すなわちｒＣＴＢ）、コレステロール、およびイスコム構造（後者は電子顕微鏡で証明される）は、画分６〜９に見いだされる。ＧＭ１脂質を有するＯＶＡ−イスコムを作成することにより、ｒＣＴＢは図４Ｄに示すようにＯＶＡ−イスコムに加えられ取り込まれる。脂質化ＯＶＡとｒＣＴＢの両方の取り込みは、ブラッドフォード（Bradford）のタンパク質測定法（□）により証明される。イスコムの沈降は、画分４〜６に見いだされる標識コレステロールの放射活性（ＣＰＭ）（■）により証明され、イスコム構造はＥＭにより測定された。図４Ｅは、もしＧＭ１−脂質の欠如したＯＶＡ−イスコムにｒＣＴＢを加えると、タンパク質すなわちｒＣＴＢが、勾配の上の方（すなわち、画分１１〜１３）に見いだされるという事実により、イスコム中に取り込まれることを示す。イスコムに取り込まれたＯＶＡは画分５〜８に重層される。免疫化実験ナショナル・ベテリナリー・インスチチュート（National Veterinary Instit ute）（ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）からのＮＭＲＩ−マウスの２０ｇのメスを使用した。以下の群（下記）は、各調製物１０μｇで経鼻的に免疫化したか、または２μｇずつ６週間置きに２回皮下（ｓ．ｃ．）に免疫化した。群１．ｉ．ｎ．キラヤ（ＱＡ）のないＯＶＡ１０μｇ２．ｉ．ｎ．ＯＶＡ−イスコム１０μｇ３．ｉ．ｎ．ＯＶＡ−イスコム１０μｇと遊離のｒＣＴＢ１０μｇ４．ｉ．ｎ．同じイスコム中でＯＶＡとｒＣＴＢ１０μｇ５．ｓ．ｃ．ＯＶＡ−イスコム２μｇ６．ｉ．ｎ．遊離型のＯＶＡとｒＣＴＢを各１０μｇ７．ｉ．ｎ．遊離型のＯＶＡとマトリックス（１０μｇ）８．ｉ．ｎ．ＰＢＳすなわち抗原のない群ビーカー中でメタファンを吸入させてマウスを麻酔した。ｉ．ｎ．投与のために、各調製物２０μｌを投与した。ｓ．ｃ．免疫化する時は、投与量は、ＰＢＳ中２００μｌ／マウスで与えた。最初の免疫化の２週間後、血清をＯＶＡとｒＣＴＢに対して試験した。４週間後、マウスに追加免疫を行い、さらに２週間後に血液試料を採取した。肺を取り出す前に、血管を２０mlのＰＢＳ−０．１％ヘパリンを用いて、心臓の右心室を経由して肺の中へ、そして血流の残りの部分を洗浄した。見かけ上マウスから地がなくなったようであった。肺、上気道、生殖器および小腸を切開し、ペーパータオルで乾燥させ、あらかじめ秤量したＰＢＳ−ヘパリンとともに試験管に入れた。臓器を秤量し、ＰＢＳで洗浄し、次に乾燥して、エッペンドルフ試験管に入れて−２０℃で保存した。抗体応答を試験する前に、フリーザーから臓器を取り出し、ＰＢＳ中の２％のスピコシド（spikoside）を１：１で加え、肺を小片に切り、エッペンドルフ試験管を冷蔵庫で一晩保存した。翌日、臓器片をエッペンドルフ遠心分離機で１３０００rpmで１５分間遠心分離した。上清を、ＯＶＡとｒＣＴＢに対してそれぞれＩｇＡとＩｇＧについて解析した。血清をＥＬＩＳＡでＯＶＡとｒＣＴＢに対して試験し、ＩｇＡ、ＩｇＧサブクラスのＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ、総ＩｇＧの抗体応答を解析した。経鼻投与により、イスコム作製体は、イスコムまたはイスコム−マトリックスのないｒＣＴＢ製剤より高い免疫応答を引き起こすＯＶＡに対する血清抗体応答を、１回と２回のｉ．ｎ．およびｓ．ｃ．免疫化後に追跡した（図５を参照）。ｒＣＴＢ−ＯＶＡ−製剤は、１回または２回の免疫化後も、ＯＶＡに対する血清抗体応答を引き起こさない。図５Ａと表１は、マウスの１回の経鼻（ｉ．ｎ．）免疫化後に、ＥＬＩＳＡで解析したＯＶＡに対する血清抗体応答を示す。ｒＣＴＢアジュバントのないＯＶＡまたはアジュバントのあるＯＶＡに対しても、抗体応答は測定されなかった。ＯＶＡ−イスコム製剤およびイスコム−マトリックスを補足したＯＶＡで免疫化したすべてのマウスは、抗体の上昇により応答し、これは明確に測定できた。図５Ｂは、２回目の免疫化後に、イスコムまたはマトリックス製剤で免疫化したすべてのマウスは、ＯＶＡに対する血清抗体の高力価で応答した。別の物質として混合したｒＣＴＢを補足したＯＶＡで免疫化したマウスは、ＯＶＡのみで免疫化したマウスより、血清抗体力価は低かった。これは、ｒＣＴＢはＯＶＡに対する寛容を誘発し、その結果マウスはＯＶＡに対する血清抗体で応答しないことを示す。図５Ｃは、２回の免疫化後のマウス血清の希釈率増加におけるＥＬＩＳＡ値を示す。この図および図５Ｂに示すように、ＯＶＡを有するイスコム製剤は、寛容を破壊し、ｒＣＴＢは、「パッセンジャー抗原」または同時投与抗原としてＯＶＡに対する血清抗体応答を引き起こす。表１は、総ＩｇＧ応答およびＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラスの応答に関してＥＬＩＳＡで解析した、マウスの２回目のｉ．ｎ．免疫化の２週間後の、ＯＶＡに対する血清抗体応答（ｌｏｇ¹⁰力価）を示す。イスコムは、ＯＶＡ＋イスコムマトリックスに比較して、ＩｇＧ２ａ応答を強くアップレギュレートすることは特に興味深い。さらに、ＯＶＡ−イスコムおよびＯＶＡ／ｒＣＴＢイスコムおよびＯＶＡ−イスコム＋遊離のｒＣＴＢは、ｓ．ｃ．注入したＯＶＡイスコムより、ＩｇＧ２ａ−応答に比較して高いＩＧ１−応答を誘発する。これは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ数として測定できる。アジュバントの添加のないＯＶＡは、ＩｇＧ１サブクラスでのみ証明できる小さな抗体応答を引き起こした。遊離のｒＣＴＢを有するＯＶＡ−イスコムまたはｒＣＴＢとＯＶＡの両方を含有するイスコムのｉ．ｎ．投与は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ−サブクラスに局在化される、予想外に高い血清抗体応答を引き起こした。この免疫調節作用は、ＩｇＧ２ａの産生により証明される。これは、ＩＦＮ−γ応答の誘発を示す（アール・エル・コフマン（Coffmann，R.L.）、ビー・ダブリュー・ピー・セイモア（Seymour，B.W.P ．）、ディー・エー・レブマン（Lebman，D.A.）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１０２，５〜２８，１９８８）。ＯＶＡ−ｒＣＴＢは、血清抗体応答に関して寛容様の状態を引き起こした。しかし、この状態の寛容が、イスコム製剤およびイスコムマトリックスにより有効に除去されることは予想外であった。イスコム製剤は、マウスの粘膜において、ｒＣＴＢ製剤よりパッセンジャー抗原に対してより高い抗体応答を引き起こす（図６）肺分泌物中のＩｇＡ抗体応答ｉ．ｎ．投与したＯＶＡまたはＯＶＡ−イスコムマトリックスを有するすべてのイスコム製剤は、肺分泌物中で、ｒＣＴＢを補足した遊離のＯＶＡ、およびｓ．ｃ．投与したＯＶＡ−イスコム、またはｉ．ｎ．投与した遊離の単独ＯＶＡより、有意に高いＩｇＡ力価を引き起こした。図６Ａでは、マウスの肺の（２回のｉ．ｎ．）免疫化で、ＩｇＡ抗体応答を解析した。比較すると、イスコム製剤は、使用した低投与量（１０μｇ）のｒＣＴＢ−ＯＶＡ製剤よりも、ｉ．ｎ．投与後に大きなＩｇＡ抗体応答を引き起こす。図６Ｂは、上気道でのＩｇＡ抗体応答に関する、異なる群間の比較を示す。ＯＶＡ−イスコムおよびマトリックスを補足したＯＶＡは、ＯＶＡ−ｒＣＴＢ製剤より有意に高いＩｇＡ−力価を引き起こす。生殖器抽出物において、ｒＣＴＢを補足したＯＶＡ−イスコムは、ｒＣＴＢでアジュバントしたＯＶＡ（１０^1.4±０．２５）または対照マウス（１０^1.2）より有意に高いＩｇＡ抗−ＯＶＡ（１０²±０．３８）を引き起こした。ＯＶＡ− イスコムに取り込まれたｒＣＴＢでさえ、生殖器抽出物において、対照マウス（１０^1.2）より有意に高いＩｇＡ力価（１０^1.7）を引き起こした。対照マウスは、ＥＬＩＳＡのバックグランドを示す（図６Ｃ）。粘膜におけるＯＶＡに対するＩｇＧ抗体応答一般に、ＯＶＡを含有するｉ．ｎ．またはｓ．ｃ．投与したイスコムおよびマトリックス製剤は、肺および上気道の粘膜の抽出物における、ＯＶＡ＋ｒＣＴＢおよび非免疫化対照マウス（図７ＡとＢ）より、有意に高いＩｇＧ抗体力価を引き起こした。ｒＣＴＢは、ＩｇＡ抗体応答より顕著な、肺抽出物中のＯＶＡに対するＩｇＧ免疫応答に対して強力な寛容を誘発するようである。この寛容は、イスコムおよびイスコム製剤により明らかに排除される。また生殖器ＯＶＡ−イスコムの分泌物において、ＯＶＡ−ｒＣＴＢ−イスコムおよびＯＶＡを有するイスコム−マトリックス製剤は、ｒＣＴＢＯＶＡ製剤が誘発するより、有意ではるかに高いＩｇＧ抗体応答を誘発した。小腸分泌物において、ＯＶＡを有するイスコムは、遊離のｒＣＴＢを補足したＯＶＡまたはイスコム−マトリックスを補足したＯＶＡより高いＩｇＧ抗体力価を誘発した。結果を、図７Ｃと７Ｄに示す。結論イスコムとｒＣＴＢの比較イスコムは、「パッセンジャー抗原」およびＳＡに対するアジュバントおよび「標的探索物」（ここでは、ＯＶＡで表される）として、粘膜投与後に、ＯＶＡとｒＣＴＢの製剤より、予想外かつかなり有効である。これは、呼吸器官（例えば、肺）および投与部位から遠い粘膜（例えば、生殖器官および小腸）の分泌物中の局所的ＩｇＡ応答を包含する分泌性抗体応答の両方について真実である。また、肺、上気道、小腸および生殖器官などの粘膜臓器からの分泌物中のＩｇＧ抗体応答は、ｒＣＴＢとともに投与したＯＶＡによる増強に比較して、イスコム中のモデル抗原またはイスコムマトリックスと一緒のモデル抗原としてのＯＶＡの粘膜投与後に、かなり上昇する。イスコム中のまたはイスコム−マトリックスとともに同時投与されたパッセンジャー抗原の粘膜投与後に、血清抗体応答は、ｒＣＴＢがもたらす応答よりかなり増強していた。コレラ毒素のＢ−サブユニットとともにＡ−サブユニットが存在するなら（すなわちコレラ毒素全体）、分泌物中の抗体応答の増強に関して対応する作用が得られる。しかし、全コレラ毒素は毒性で病原性があり、アジュバントとして許容できない（ジェイ・ホルムグレン（Holmgren，J.）、シー・チェルシンスキー（ Czercinsky C．）、ジェイ−ビー・サン（Sun，J-B）、およびエー−エム・スベネルホルム（Svennerholm A-M）、「ワクチン開発の考え方（Concepts in Vacci ne Development）」中、エス・エィチ・イー・カウフマン（S.H.E.Kaufmann）編、１９９６）。同様に、全毒素ＬＴおよびＣＴＢに対するその同等物（すなわち、ＬＴＢ）は、ＬＴおよびＣＴＢと同じ問題を有する。ｒＣＴＢは、同時投与した抗原の粘液分泌物中のＩｇＧ−抗体応答をダウンレギュレーションした。パッセンジャー抗原に対するｒＣＴＢのダウンレギュレーションまたは寛容誘発作用は、予想外かつ顕著に、インキュベートおよびイスコム−マトリックス製剤により有効に排除された。イスコム、イスコム／標的探索分子またはイスコム−マトリックス製剤の免疫調節作用は、これも粘膜投与後のＩｇＧ２ａに対するアップレギュレーションされた血清抗体応答（これは、ＩＦＮ−γ免疫応答参加、すなわちＴＨ１応答の参加を示す）により証明される。マトリックスとｒＣＴＢの比較粘膜に一緒に投与したマトリックス＋抗原（ＯＶＡ）は、肺と生殖器官の分泌物中のＩｇＡ抗体応答について、粘膜に一緒にｉ．ｎ．投与したｒＣＴＢ＋抗原より有効である。また、肺、呼吸器官および生殖器官のような粘膜臓器からの分泌物中のＩｇＡ抗体応答は、ＯＶＡ−ｒＣＴＢ製剤が持たらすものに比較してかなり増強している。また、粘膜アジュバントとしてマトリックスと一緒のＯＶＡにより誘発される特異的血清抗体応答は、ｒＣＴＢで補足したＯＶＡ製剤により誘発されるものよりかなり大きい。マトリックスが、そのような強いアジュバント作用を粘膜で局所的に有するということは予想外であった。正しい条件下での吸着を必要とする水酸化アルミニウムと異なり、または工業的ワクチン製造における複雑な方法であるエマルジョン型の専門的調製を必要とする油アジュバントと異なり、マトリックスは、単にワクチン抗原に加えることによりアジュバントとして使用でき、簡単であるということは注目すべきである。イスコムまたはイスコム−マトリックスが、粘膜投与により強力な免疫応答を誘発するのに使用できるということは、特に興味深い。ＣＴＢまたはＬＴＢは、この免疫応答をダウンレギュレーションするのに使用することができる。これらの組合せは、免疫応答を誘発し、必要であればこの抗体応答をダウンレギュレーションするのに使用することができる。精子抗原に特異的なメスの生殖器官における抗体応答をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションできる可能性は、避妊ワクチンにおいて興味がある。誘発された抗精子抗体は、精子に対して排除する必要がある。イスコムとイスコム−マトリックスの比較イスコムとマトリックスは、例えばＥＭで研究されるように形態、トリテルペノイド、脂質、または取り込まれたアジュバント分子の組成が似ている。しかし、イスコムは抗原が組み込まれているが、マトリックスは、組み込まれていない同時投与抗原に対するアジュバント活性を示す。この例では、ＯＶＡの投与ための粘膜アジュバント製剤としてのイスコム−マトリックスとイスコムの比較を行なった。この作用は、肺、上気道、生殖器官および小腸から抽出される分泌物で局所的に評価する。一般に、いくつかの例のイスコムは、マトリックスより有効な粘膜アジュバントである。イスコムは、例えば血清中で高いＩｇＧ２ａ抗体応答を誘発し、これはいくつかのウイルス疾患に対する防御にとって有効である。他の場合では、マトリックス−ＯＶＡ製剤は、ＯＶＡ−イスコム製剤と同じレベルの抗体応答を誘発する。ＯＶＡ−マトリックスよりもイスコム製剤でｉ．ｎ．免疫した後の方が、小腸の粘液中のＩｇＧ応答は強かった。抗原調製物にマトリックスを単に添加しさえすればよいということは、大きな利点である。ｒＣＴＢに対する血清抗体応答２回のｉ．ｎ．免疫化後の結果を表２に示す。イスコム調製物は、高いＩｇＧ２ａ応答を含む高い血清抗体応答を誘発した（群３：１０^4.9±０．５１；群４：１０^5.1±０．５４）。ｒＣＴＢはかなり低い抗体力価を引き起こした（１０³ ^.3 ±０．４）。すべてのｒＣＴＢ調製物は、非免疫化対照マウスより高い抗体力価を誘発した。異なる臓器の分泌物中のＣＴＢに対するＩｇＡ抗体応答ＯＶＡ／ｒＣＴＢ−イスコムまたはＯＶＡ−イスコムを補足した遊離のｒＣＴＢ（この場合、ｒＣＴＢに対するイスコム−マトリックスの形でアジュバント作用をした）は、２回のｉ．ｎ．免疫化後、すべての試験した粘液、すなわち肺、上気道、小腸および生殖器官で、アジュバント製剤無添加のｒＣＴＢよりかなり高いＩｇＡ抗体応答を誘発した（図８ＡとＢ）。ｒＣＴＢが、小腸の粘液において自身に対するＩｇＡ抗体応答を誘発しなかったことは興味深い。異なる臓器のｒＣＴＢ粘液に対するＩｇＧ抗体応答イスコム中のまたはイスコム−マトリックスを有するｒＣＴＢ製剤で、肺、上気道、生殖器官および小腸の分泌物中で、ｒＣＴＢに対する高いｇＧ抗体応答が検出された。イスコムまたはイスコム−マトリックス製剤のないｒＣＴＢで免疫化したマウスからのこれらの粘膜分泌物中のＩｇＧ抗体応答は、イスコムまたはイスコム−マトリックス製剤について低かったが、非免疫化対照からの分泌物については有意に高かった（図８ＣとＤ）。結論結果は、イスコム製剤は予想外かつ効率的に、呼吸器官からの分泌物中、および遠くの臓器からの分泌物、すなわち小腸や生殖器官からの分泌物中で、局所的にｉ．ｎ．免疫化後にｒＣＴＢに対する抗体応答を増強することを示す。ｒＣＴＢに対する血清抗体応答さえ、イスコム作製体または別に加えたアジュバントとしてのイスコム−マトリックスにより強く増強された。イスコムおよびイスコム−マトリックスの免疫調節作用は、ｒＣＴＢに対する抗体応答が、ＩｇＧ２ａサブクラス中で誘発された（これは、ＩＦＮ−γ産生が誘発されたことを示し、これはＴＨ１タイプの応答を示す）という事実により証明される。イスコムおよびイスコムマトリックスによる免疫調節の驚くべき例は、ｒＣＴＢの結果により証明され、これはそれ自身、他の分泌物中のＩｇＡ応答と反対に、小腸中の抗体応答をＩｇＡ−応答を包含するようには変換しない。しかし、イスコムにより提示されるかまたはイスコムマトリックスとともに同時投与されたＣＴＢは、抗体応答を、ＣＴＢに対して特異的なＩｇＡを包含するように変換した。例３インフルエンザウイルス抗原を有するイスコムによるｉ．ｎ．免疫化後の血清と肺分泌物中の特異的抗体応答の進展の速度論この例で我々は、インフルエンザウイルス抗原（すなわちイスコムに取り込まれるＰＲ８単離株からのエンベロープタンパク質）を有するイスコムによるｉ．ｎ．免疫化後の血清と肺分泌物中の特異的抗体応答の進展の速度論を示す。インフルエンザ−イスコムの調製インフルエンザウイルスからのエンベロープタンパク質の調製濃度２．６mg／mlのＨＩＮ１−インフルエンザウイルス単離株ＰＲ８（Ａ／ＰＲ／８／３４）の精製調製物を使用した。洗浄剤ＭＥＧＡ−１０を最終濃度２重量％で加え、溶液を３７℃で１５分間インキュベートし、次にＲＴで６０分間インキュベートした。ウイルスの破片から可溶化したエンベロープタンパク質を分離するために、ＰＢＳ中３０重量％のショ糖２．８mlの上にの２重量％のＭＥＧＡ−１０を含有するＰＢＳ中の１０％ショ糖０．６mlの上記溶液（１ml）を、ＴＳＴ５５．５コントロン（Kontron）ロータで４００００rpmで３０分遠心分離した。遊離のエンベロープタンパク質を、上層１．５mlに集めた。タンパク質の量は０．８５５μｇと測定された。可溶化したエンベロープタンパク質（５７０μg/ml）の血球凝集活性（ＨＡ）は、ニワトリ赤血球で≧１：４０９６と測定された。イスコムの調製５７０μｌエンベロープタンパク質／mlの量に０．５mgのコレステロール（Ｃ）を加え、２．５mgのキルＡ（スピコシド（Spikoside）、アドヴェット（Advet ）ＡＢ、ルレア（Lulea）、スベリゲ（Sverige））を加えた。溶液をＲＴで２時間インキュベートし、次に低温室で４８時間透析した。調製したイスコムの性状解析ＰＲ８−イスコム（図２Ｂ）を、２０〜５０％ショ糖勾配で超遠心分離により解析した。１．５mlを越える試料容量は分割し、２つの同じ勾配で分散させた。試料をＴＳＴ４１．１４コントロン（Kontron）ロータで３９，０００rpmで１８時問遠心分離した。すべての調製物において、画分５、６、７、および８に上層としてタンパク質が存在し、画分６が最大値を示した。これは、イスコム粒子について予測されることとよく一致する。放射活性Ｃ¹⁴コレステロールは、同じ画分に検出された。タンパク質レベルは、ブラッドフォード（Bradford）に従って測定した。ＥＭによりさらなる性状解析を行なった（図３）。またイスコムをその血球凝集能について観察した。ＰＲ８−イスコムは、雌鳥の赤血球を凝集させた。２回のｉ．ｎ．免疫化後４８日間の免疫応答の進展を試験するためのマウスでの免疫化実験各群５匹のマウスの７群を、３週問の間隔で７μｇのＰＲ８−イスコムでｉ．ｎ．免疫化し、図９に示すＥＬＩＳＡで血清および肺分泌物中の抗体応答を追跡した。血清中の抗体応答図９Ａは、１回の免疫化後に逆ＥＬＩＳＡ力価が約１０００に上昇することを示す。追加免疫の１週間後、４０倍高い総抗体力価が得られた。５０日目に、すなわち第２のｉ．ｎ．免疫化後３０日目に、力価は、同じ増加した抗体レベルであった。図９Ｂは、ＩｇＧ−サブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂの血清で高い抗体力価が観察されたことを示す。図９Ｃは、ＰＲ８に対するＩｇＡ血清応答は、血清中で比較的低かったことを示す。肺の分泌物中の抗体応答図９Ｄは、１回の免疫化後に、吸光度４５０nm、希釈率１／９０でＥＬＩＳＡによりＩｇＡタイプの低い抗体力価が測定されたことを示す。２回目の免疫化後に、ＰＲ８に対するＩｇＡ抗体力価の明らかな上昇によって、顕著な追加免疫効果が観察された。結論ただ１回のｉ．ｎ．免疫化後の低投与量ＰＲ８−イスコムは、血清および肺分泌物中で抗体応答を誘発する。２回のｉ．ｎ．免疫化後に、血清および肺分泌物の両方で大きな上昇が得られる。数回の免疫化と高用量を必要とする文献に記載の他の製剤に比較して、イスコム中の低用量の抗原でｉ．ｎ．免疫化後は、抗体応答は予想外に高い。これは、正しい組成のイスコムによるｉ．ｎ．免疫化に基づき、実際的な免疫化プログラムを作成することが可能であることを示差している。例４インフルエンザウイルスおよびパッセンジャー抗原（ＯＶＡ）からの標的探索分子を有するイスコム方法粘膜を介する局所的免疫化のための担体粒子としてのイスコムの調製オバルブミン（ＯＶＡ）は、粘膜を介して投与される時、低用量では自発的に免疫応答を誘発しないタンパク質である。さらに、ＯＶＡは、自発的にイスコムに取り込まれないタンパク質である。従ってこの実験では、脂質テイルをＯＶＡに結合させる。脂質化ＯＶＡおよびインフルエンザウイルスからのエンベロープタンパク質は、イスコムと一緒に取り込まれた。ウイルスエンベロープタンパク質（ターゲティングタンパク質）とＯＶＡ（パッセンジャー抗原）の両方を含有するこれらのイスコムは、マウスのｉ．ｎ．免疫化に使用される。工程１：例２のＯＶＡの脂質化工程２：インフルエンザウイルスからのエンベロープタンパク質の調製（３４頁を参照）工程３：エンベロープタンパク質ＰＲ８とオバルブミン（ＯＶＡ）を有するイスコムの調製１mgのコレステロール（Ｃ）、工程２からの３５０μｇのＰＲ８エンベロープタンパク質、および５mgのキルＡ（スピコシド（Spikoside）、アドヴェット（A dvet）、ルレア（Lulea）、スベリゲ（Sverige））を、脂質化ＯＶＡの溶液に加えた。溶液の総量は２．７mlであり、これをまずＲＴで２時間インキュベートし、そして次にＲＴで一晩ＰＢＳに対して透析し、次に低温（＋４℃）で４８時間保存した。対照実験で、ＰＲ８のみを有するイスコムおよび脂質化ＯＶＡのみを有するイスコムを調製した。ＰＲ８−イスコムの性状解析ＯＶＡ−イスコム（図２Ａ；３Ａ）、ＰＲ８−イスコム（図２Ｂ；３Ｂ）およびＯＶＡ−ＰＲ８−イスコム（図２Ｃ；３Ｃ）を、１０〜５０％ショ糖勾配で超遠心分離して性状解析した。１．５mlを越える試料容量は分割し、２つの同じ勾配で適用させた。試料をＴＳＴ４１．１４コントロン（Kontron）ロータで３９，０００rpmで18時間遠心分離した。すべての調製物において、画分５、６、および７中のピークとしてタンパク質が検出され、画分６が最大値を示した。粒子の沈降と形態は、イスコム粒子について予測されることとよく一致する。同じ画分に放射活性コレステロールとＰＥが検出されピークがあった。タンパク質レベルは、ブラッドフォード（Bradford）に従って測定した。図２は、調製したイスコム粒子について画分の関数としてのコレステロールまたはＰＥのタンパク質レベルと放射活性を示す。マウスでの免疫化実験５匹ずつ５群のマウス（ＮＭＲＩ）を、以下のスケジュールに従って免疫化した。：群免疫化物質投与方法ＡＯＶＡ−イスコム５μｇ抗原ｉ．ｎ．ＢＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｉ．ｎ．ＣＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム１０μｇ抗原ｉ．ｎ．ＤＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｉ．ｎ．ＥＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｓ．ｃ．用量は、ほぼそれぞれ等量部のＯＶＡとＰＲ８−抗原からなる抗原の総量を示す。マウスをメトファン（ピットマン・ムーア（Pitman Moore））で麻酔し、上記スケジュールに記載の用量の抗原を、２０μｌｉ．ｎ．またはｓ．ｃ．経路の場合は２００μｌの容量で、４週間置いて２回投与した。第１回および第２回の免疫化の２週間後、血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡ（エー・ボラー（Voller，A. ）、エー・バートレット（Bartlett，A.）、ディー・イー・ビッドウェル（Bidw ell，D.E．）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．８，１２３−１２９，１９７８）で測定した。上記スケジュールに従って５６日目に第３回の免疫化を行なった。２週間後（７０日目）に、マウスを麻酔し、肺の血管をＰＢＳ／ヘパリン（０．１％）で右心室を経由して洗浄した。肺と上気道を切開し、サポニン／ＰＢＳ −溶液（０．２％）で数時問抽出し、この材料を、例２で記載したようにフリーザーに保存し、ＯＶＡとＰＲ８に対する抗体力価をＥＬＩＳＡで測定した。異なるイスコム製剤で免疫化後のＯＶＡとＰＲ８に対する血清抗体応答図１０Ａは、インフルエンザウイルスからのエンベロープタンパク質のないＯＶＡ−イスコムに比較して、ＯＶＡ−ＰＲ８−イスコムは、２回のｉ．ｎ．免疫化後にＯＶＡに対する高い血清抗体応答を誘発し、３回の免疫化後にさらに高くなることを示す。予想されるように、１０μｇのＯＶＡ−ＰＲ８−イスコムｉ．ｎ．は、５μｇより高い抗体応答を誘発した。ＰＲ８タンパク質は、「パッセンジャー抗原」ＯＶＡについて、投与される粘膜中で標的探索分子として機能する。文献の情報（モワ（Mowat））を考慮すると、ＯＶＡ−イスコムが抗体応答誘発に関して明らかな作用を示さなかったことは、目立ったかつ予想外の特徴である。この差の理由は、上記の製剤で使用された５μｇ〜１０μｇに比較して、従来法では非現実的に高い用量（すなわち、１００μｇ〜数百μｇのＯＶＡ）が使用されるためであることは、明らかである。後の実験では、１０μｇのＯＶＡ−イスコムがｉ．ｎ．投与され、これが高い抗体応答を誘発した（３５頁参照）。上記の「標的探索」イスコムで必要な低用量は、これを免疫化に使用することを現実的に可能にする。図１０Ｂは、ＰＲ８に対する血清抗体応答を示す。ＰＲ８を含有するすべてのイスコム製剤は、ｉ．ｎ．免疫化後に抗体応答を誘発し、この応答は、２回目の免疫化後に著しく増強された。肺から抽出された分泌物中の抗体応答図１０Ｃは、前述の３回の免疫化後の肺から抽出された分泌物中のＩｇＡ抗体応答を示す。標的探索分子としてのＰＲ８−タンパク質のないＯＶＡ−イスコムに比較して、５μｇおよび１０μｇのＰＲ８−イスコムは、ｉ．ｎ．免疫化後に、用量に関連する、明確なＩｇＡ抗体応答を誘発した。ｓ．ｃ．注射したＯＶＡ−ＰＲ８−イスコムは、肺分泌物中でＯＶＡに対する抗体応答を誘発しなかった。図１０Ｄは、ＰＲ８−抗原を含有するすべてのイスコム製剤は、ＰＲ８に対して肺分泌物中で高いＩｇＡ抗体応答を誘発することを示す。結論この実験は、低用量の抗原（例えば、ＯＶＡ）は、粘膜に投与（ここでは、経鼻投与）された場合、分泌物と血清中で最適の抗体応答を誘発するために、抗原をリンパ系に導く処方が必要であることを示す。標的探索分子またはガイド分子としてＰＲ８を有するイスコムは、この要求を満たす。特に、入手できる文献（モワ（Mowat））と後述の実験を考慮すると、ＰＲ８ −ＯＶＡ−イスコムが、標的探索タンパク質のないＯＶＡ−イスコムよりはるかに効率的であるということは予想外であった。これは、前述の免疫化で使用された５μｇＯＶＡの低用量により説明される。実験の延長ＯＶＡの粘液ターゲティング分子としてインフルエンザウイルスタンパク質を使用する本実験は、１．より優れた統計的基礎を達成するため、２．臨床試験で使用される規定されたキラア（Auillaja）成分７０３を含有するように、より多くのマウスを含めた。この実験では、容量を前の実験で使用された４５〜４０ μｌからさらに２０μｌ（これは、マウスの大きさを考慮すると、現実的な容量である）まで低下させた。イスコムおよびイスコム−マトリックス製剤は、前述のように調製した。第１回の実験で、３つのタイプの製剤（すなわち、ＯＶＡ−イスコム（Ａ）、ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム（Ｂ）および別の物質中のイスコム−マトリックスを補足した遊離のＯＶＡ（Ｃ））を比較した。さらにこの計画では、より純粋ではないキラヤ（ＱＡ）または規定された７０３キラヤ製品のいずれかを含有する製剤でｉ．ｎ．免疫化したマウスの応答を比較する。６週間置いて行なった２回の投与による免疫化スケジュールは、以下の通りである：総抗原量ＱＡ／７０３投与量群１ＯＶＡ−イスコムＱＡｉ．ｎ．８μｇ６５μｇ群２ＯＶＡ−イスコム７０３ｉ．ｎ．８μｇ６５μｇ群３ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムＱＡｉ．ｎ．１６μｇ７５μｇ群４ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム７０３ｉ．ｎ．１６μｇ６５μｇ群７遊離ＯＶＡ−マトリックスＱＡｉ．ｎ．１０μｇ５０μｇ群９遊離ＯＶＡ−マトリックス７０３ｉ．ｎ．１０μｇ５０μｇ１０遊離ＯＶＡ非アジュバント化ｉ．ｎ．１０μｇ − 対照１１無関係の抗原６５μｇ結果パッセンジャー抗原ＯＶＡに対する血清抗体応答。第１および第２の免疫化後に、抗体応答は、イスコム製剤を投与されたマウス（Ａ、ＢおよびＣ）より、マトリックス−製剤を投与されたマウスの方が一般的に高かった。２回目の免疫化後の総抗体応答（図１０Ｆに結果が要約されている）は、マトリックスと別の物質として混合したＯＶＡを有する製剤で最も高かった（Ｃ）。規定のキラヤ成分（すなわち、７０３）を含有する製剤は、より純粋でないＯＶＡ（２対１；４対３；９対７）より、ＯＶＡに対してわずかに高いＩｇＧ力価を示した。ＩｇＧ２ａサブクラス中の抗体応答も、７０３製剤で高かった。ＩｇＧ２ａ応答は、ＯＶＡ＋イスコム−マトリックスでｓ．ｃ．免疫化したマウス群の血清で最も高かった。ヒトでの使用に関して最も興味深いことは、規定のキラヤ成分７０３は、より純粋でないスピコシド（Spikoside）（ＱＡ）ベースの製剤より優れていることはなくても、同等に有効な血清抗体応答のインデューサーであるということである。第２の実験で、ｉ．ｎ．免疫化後のＥＬＩＳＡで測定したＯＶＡに対する血清抗体応答を、皮下（ｓ．ｃ．）経路で免疫化したマウスと比較した。免疫化スケジュールは、６週間置いて２回投与して行い、以下のように行なった：抗原量ＱＡ／７Ｏ３投与量群３ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムＱＡｉ．ｎ．１６μｇ７５μｇ群４ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム７０３ｉ．ｎ．１６μｇ６５μｇ群５ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム７０３ｓ．ｃ．５μｇ２１μｇ群６ＯＶＡ＋マトリックスＱＡｓ．ｃ．２０μｇ１０μｇ群８ＯＶＡ＋マトリックス７０３ｓ．ｃ．２０μｇ１０μｇ結果ＯＶＡに対する血清抗体応答２回の免疫化後にＥＬＩＳＡで行なった血清抗体応答の分析は、驚くべきことに、ｉ．ｎ．免疫化は、ｓ．ｃ．投与により誘発されるのと同様の強さの抗体応答（図１０ｇ）を引き起こすことを示した。最も高い投与量（１０^4.3）は、ＱＡまたは７０３キラヤ−成分（１０^3.9）と一緒のＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムと比較して、ｓ．ｃ．免疫化したイスコム−マトリックスをアジュバントとする遊離のＯＶＡで誘発された。ＯＶＡに対する分泌物中のＩｇＡ応答ＯＶＡに対するＩｇＡ応答を、肺（図１０Ｈ）と生殖器官（図１０１）からの分泌物中で測定した。異なる群の免疫化スケジュールを２３および２４頁に記載する。肺：（図１０Ｈ）ＯＶＡに対する最も高いＩｇＡ応答は、７０３（４）またはＱＡ（３）のいずれかとのＯＶＡ／ＰＲ８である、７０３−マトリックスを補足した遊離のＯＶＡ（９）で得られた。離れた臓器の生殖器官中の抗−ＯＶＡＩｇＡ応答の誘発：図１０１は、ＯＶＡに対する最も高いＩｇＡ応答は、７０３キラヤ成分（１０^3.3+0.53）で調製したＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム７０３（４）により誘発されたことを示す。この応答は、別の物質中で混合され補足されたＯＶＡのｉ．ｎ．投与により誘発されたものより有意に高かった（７，９）。このＩｇＡ応答は、肺分泌物中で誘発されたものと同様のレベルである。ＯＶＡ−イスコム（７０３）により驚くほど高いＩｇＡ抗体応答が誘発されたが、これはＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム（７０３）により誘発されたものより低かった（１０^2.9+0.40対１０^3.3+0.53）。血清および分泌物中のインフルエンザ（ＰＲ８）ウイルス抗原に対する応答標題に記載の応答は、本例および以前の例に記載のものと一般的に一致する。しかし、７０３を含有するＯＶＡ／ＰＲ８イスコムの２回のｉ．ｎ．免疫化後、最も高い血清ＩｇＧ２ａ応答を誘発することは注目すべきである。ＩｇＧ１に比較して、血清中のＩｇＧ２ａ力価は時間とともに増加した。試験した血清抗体応答は、３回目の放血からであり、この血清抗体応答は、ｓ．ｃ．投与により誘発されるものに匹敵することを示している。結論イスコムに取り込まれたインフルエンザウイルスのエンベロープタンパク質は、この場合はＯＶＡに対する特異的ＩｇＡ抗体により測定される免疫応答を、ここでは生殖器官により例示される遠くの粘膜部位に導くことは、特に興味深い。キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria molina）起源の規定された成分７０３は、我々および他の研究者による以前の実験で使用されたあまり精製していないキルＡまたはスピコシド（Spikoside）より優れていることはないとしても少なくとも同様に有効である。これは、実験で証明されるまでは、予測できなかった。イスコム−マトリックス製剤は、抗原のｉ．ｎ．投与後の血清抗体応答の誘発については、イスコムよりイスコム−マトリックス製剤が、同等にまたはそれ以上に有効であることは予想外である。これに対して、特に粘膜ターゲティング分子（ＰＲ８−タンパク質）を有するイスコムは、特に離れた臓器で特異的分泌性ＩｇＡ応答を誘発するのに、試験した他の製剤より有効であった。肺分泌物中の高いＩｇＡ応答は予想外に高いが、離れた生殖器官の粘膜で高いＩｇＡ応答があることは、さらに予想外である。７０３とともにインフルエンザウイルスイスコムをｉ．ｎ．投与すると、より純粋ではないキルＡイスコムより有効に、血清中で測定されるＩｇＧ２ａ応答を調節することも予想外であった。例５単純ヘルペス２（ＨＳＶ−２）は、ヒトで高率（最大１０％）に生殖器官の感染を引き起こし、重い病変と苦痛を引き起こすことがある。ＨＳＶ−２は、いくつかのエンベロープタンパク質を含有するエンベロープを有するウイルスである。このうちの２つであるグリコプロテインＢ（ｇＢ２）とグリコプロテインＤ（ｇＤ２）は、抗原であると考えられ、正しい型の免疫応答を誘発するなら、最適条件下で疾患や感染に対する防御の誘発において最も重要である。ＨＳＶ−２による感染は、生殖器官を介して起きるため、生殖器官の粘膜中のＨＳＶ−２に対する免疫応答を誘発することが好ましい。以下の実験で、我々は、ｇＢ２の異なる製剤を調製し、血清中と、呼吸器官、生殖器官および小腸からの分泌物中の免疫応答を調べた。例２のように、ＰＲ８からのエンベロープタンパク質は、標的探索分子として使用され、エンベロープタンパク質ｇＢ２はパッセンジャー抗原として使用されている。異なるｇＢ２−製剤の調製ｇＢ２は、カイロン（Chiron）（カリホルニア州、アメリカ合衆国）から組換え生成物として得た。イスコム−マトリックス、すなわち抗原のないイスコムは、アドヴェット（Ad vet）ＡＢ、ルレア（Lulea）、スエーデン）から得た。ｇＢ２とｇＤ２はそれぞれ、例２に記載の方法と同様に、脂質化され、イスコム中に取り込まれた。８匹の６群のマウス（ＮＭＲＩ）メス、１８〜２０ｇ、ナショナル・ベテリナリー・インスチチュート（National Veterinary Institute）（ＳＶＡ））を、以下のスケジュールに従って免疫化した。群免疫原抗原当たりの投与量１ｇＢ２−イスコム１０μｇ２ｇＢ２／ＰＲ８−イスコム１０μｇ５ｇＢ２＋イスコム−マトリックス１０μｇ７ｇＢ２１０μｇ９対照１０μｇマウスは無関係の抗原で免疫化したマウスを２回（０週と９週）ｉ．ｎ．免疫化し、追加免疫の２週間後（７７日目）、１群当たり４匹のマウスの肺から分泌物を取り出した。１１３日目に残りのマウスから、肺、上気道、小腸および生殖器官を取り出して、臓器分泌物を得て、分泌物を分泌性ＩｇＡについて解析した。これらの臓器の抽出物を、例２に記載のように回収した。抗体応答を、例２に記載のようにＥＬＩＳＡで試験した。臓器中の抗体応答は、７７日目から各試料について試験した。１１３日目からの試料は、それぞれ各臓器と群からの群試料として試験した。結果肺分泌物中のｇＢ２に対するＩｇＡ抗体応答追加免疫の２週間後、遊離型のｇＢ２（群７）は、ＥＬＩＳＡで抗体応答を誘発しなかった（図１１Ａ）。最も高いＩｇＡ（１０^4.8）力価は、群２のマウス、すなわちｇＢ２／ＰＲ８−イスコム（すなわち、標的探索分子としてＰＲ８エンベロープタンパク質を有する）で、ｉ．ｎ．追加免疫の２週間後（７７日目）に得られた。標的探索分子のないｇＢ２−イスコム（１０^2.4）およびイスコム −マトリックスを有するｇＢ２（１０^3.7）もまた、肺分泌物中で比較的高い抗体力価を誘発したが、それぞれ１０倍および１００倍低い力価であった。１１３日目に、残りのマウスの肺分泌物中の抗体応答を測定した。抗体力価は顕著に低下したが、７７日目にも同じ抗体応答のパターンが観察された。投与部位とは別の粘膜中の分泌性ＩｇＡ応答図１１Ｂにおいて、異なる分泌物（プールした群）（すなわち、上気道、生殖器官および肺）中のｇＢ２に対する、２回の免疫化後のＩｇＡ応答が証明された。ｇＢ２−イスコム、ｇＢ２／ＰＲ８−イスコムおよびイスコム−マトリックスと混合したｇＢ２で免疫化後の生殖器官中で、ｇＢ２に対する比較的高いＩｇＡ応答が得られた。上気道では、イスコム−マトリックスを補足したｇＢ２による免疫化後のＩｇＡ応答は、ｇＢ２−イスコムおよびｇＢ２／ＰＲ８−イスコムで免疫化後のものより低かった。ＰＲ８に対する抗体応答ｇＢ２／ＰＲ８−イスコム製剤中に含有されたＰＲ８抗原に対して、分泌物および血清の両方で高レベルの抗体が観察された。対照群のマウスは、血清または肺分泌物中で、検出できるＩｇＧまたはＩｇＡ抗体応答はなかった（データは示していない）。ｇＢ２に対する血清抗体応答２回目のｉ．ｎ．免疫化の２週間後（７７日目）のｇＢ２に対する総ＩｇＧ血清抗体応答（データは示していない）。７７日目にＥＬＩＳＡで測定した最も高い総血清抗体応答は、ｇＢ２／ＰＲ８−イスコム、および別の物質中でイスコム −マトリックスで補足したｇＢ２中で誘発された。ｇＢ２単独（７）でも、ｉ．ｎ．投与により明瞭な特異的血清抗体力価を誘発したが、イスコムマトリックスやイスコム製剤に比較して１０倍またはそれ以上低かった。予防接種後１１３日目までに、総血清力価は上昇したか、または同じレベルに維持されたが、ＧＢ− ２単独による調製物では、血清力価は顕著に低下した。ＩｇＧ１血清抗体応答は、イスコム−マトリックスｇＢ２製剤についての１０^5.2 およびｇＢ２イスコムについての１０^5.3に比較して、１０^6.5でｇＢ２／ＰＲ８について最も高かった。ｇＢ２単独の製剤は、ほとんど１００倍低い血清力価を誘発した。１１３日目までに、イスコムまたはイスコムマトリックス製剤により誘発されるＩｇＧ１力価は、増加したかまたは１０⁶より上に維持されたが、ｇＢ２単独については力価は１０倍低下した（データは示していない）。ＩｇＧ２ａ血清抗体応答は、７７日目までにｇＢ２−マトリックス（１０^5.0 ）、およびｇＢ−２／ＰＲ８−イスコム（１０^4.8）について最も高く、ｇＢ２ −イスコムとｇＢ２単独については約１０倍低かった（図１１ｃ）。１１３日目までに、ＩｇＧ２血清抗体力価は、イスコムとイスコムマトリックス製剤について１０倍またはそれ以上増加し、一方ＧＢ−２単独についての血清ＩｇＧ２力価は大きく低下した。結論血清抗体応答ｇＢ２タンパク質は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａサブクラスの両方で血清抗体応答を誘発し、これは７７日目に最も高かった。２回目のｉ．ｎ．免疫化の５週間後（１１３日目）に、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ抗体力価は、大きく低下した。これに対して、ｇＢ２−イスコムとｇＢ２／ＰＲ８−イスコム製剤およびイスコムマトリックス製剤で免疫化したマウスは、総抗体力価およびサブクラスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ血清抗体力価が１０倍またはそれ以上増加した。これらの結果は、粘膜投与後にイスコムおよびイスコムマトリックス製剤は、非アジュバント化ｇＢ２に比較して免疫応答の有意な延長を誘発することを明瞭に示す。ｇＢ２／ＰＲ８−イスコムおよびｇＢ２／イスコム−マトリックス製剤は、ＩｇＧ２ａ応答の誘発に関して、試験した他の製剤より有効である。ｇＢ２単独は、免疫グロブリンに対する本来の能力を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体応答を誘発する能力を有する。後者は、インターフェロン−γ−産生を必要とすると考えられる。これらの結果は、ｉ．ｎ．経路ではｇＤ２自身は免疫原性が弱く、ＩｇＧ２ａ応答を調節する能力を持たないことを示す例６のｇＤ２の結果とは対照的である。我々の結果もまた、バイスタンダー（bystander ）タンパク質についてさえ、ｇＢ２は免疫応答の調節に有用であるかも知れないことを示す。ｇＢ２は、自己凝集する性質を有し、キラヤ成分と凝集および結合し（データは示していない）、これは、ｇＢ２とｇＤ２の差異を部分的に説明し、後者は親水性が強く、自発的に凝集またはキラヤまたはキラヤ成分と結合する傾向はない。例６本例は、イスコムに取り込まれたインフルエンザウイルス抗原（ＰＲ８）が、いくつかの粘膜（すなわち、肺、上気道、および生殖器官）のリンパ系に対する標的探索物として作用することを証明する。パッセンジャー抗原は、生殖器官に疾患を引き起こす単純ヘルペス２（ＨＳＶ−２）からのｇＤ２から構成され、従ってＨＳＶ−２に対するワクチンは好ましい。ｇＤ２は、例２のＯＶＡと同じ方法で脂質化される。イスコムは例２および例５と同じ方法で調製した。マトリックスは、アドヴェット（Advet）ＡＢ、ルレア（Lulea）、スエーデン、から得た。群免疫原抗原当たりの投与量３ｇＤ２−イスコム１０μｇ４ｇＤ２／ＰＲ８−イスコム１０μｇ６ｇＤ２＋イスコム−マトリックス１０μｇ８ｇＤ２１０μｇ１０対照マウスは、ｇＢ２について例５に記載のスケジュールと同じスケジュールに従って免疫化した。抗体応答は、例２に記載のＥＬＩＳＡで試験した。臓器の抗体応答は、７７日目に各試料で試験した。１１３からの試料を、それぞれ各臓器および各群についての群試料として試験した。結果異なるｇＤ２製剤によるｉ．ｎ．免疫化後の肺分泌物中の分泌性ＩｇＡ応答図１２Ａは、肺分泌物中の最も高いＩｇＡ応答は、群３、４、および６のマウス、すなわちそれぞれｇＤ２−イスコム、ｇＤ２／ＰＲ８−イスコム、およびイスコム−マトリックスと混合したｇＤ２で得られたことを示す。投与の部位から離れた粘膜中の分泌性ＩｇＡ応答図１２Ａは、２回のｉ．ｎ．免疫化後に、イスコムまたはイスコム−マトリックスを有する他の製剤とは異なり、生殖器官の分泌物は、標的探索分子を有するｇＤ２−イスコム（ｇＤ２／ＰＲ８−イスコム）で有効なＩｇＡ応答を誘発することを示す。ＰＲ８に対する抗体応答ＰＲ８、一部のｇＤ２／ＰＲ８−イスコム製剤に対する高い抗体応答が、分泌物と血清で観察された。ｇＤ２に対する血清抗体応答２回目のｉ．ｎ．免疫化の２週間後（７７日目）のｇＤ２に対する血清抗体応答を図１２ｃに示す。ｇＤ２は、例５にも示すようにｇＢ２が凝集して、アジュバントを加えなくてもそれ自身比較的免疫原性であるという点で、ｇＢ２とは異なる。この性質はまた、「生来の」免疫調節能力を示す。ｇＢ２はｇＤ２とは対照的に、イスコムおよびイスコム−マトリックスと効率的に結合して、低比率のキラヤ／ｇＢ２で、凝集物を形成する。これに対して、ｇＤ２は親水性、モノマー性であり、アジュバントの補足なしでは免疫原性が弱い。ＥＬＩＳＡで測定した最も高い総血清抗体応答は、７７日目でｇＤ２−イスコムによりｇＤ２／ＰＲ８−イスコムにより誘発された。ｇＢ２単独とは対照的にｇＤ２自身（８）（図１２ｃ）は、ｉ．ｎ．投与により測定できる血清抗体応答を誘発しなかったことが、最も顕著である。ＩｇＧ１血清抗体応答は、ｇＤ２- イスコム（３）およびｇＤ２／ＰＲ８−イスコム（４）で最も高く、ｇＤ２／イスコム−マトリックス製剤より１０倍かつ有意に高かった（図１２ｃ）。７７日目までに、ＩｇＧ２ａ血清抗体力価は、ｇＤ２−イスコムについてよりｇＤ２／ＰＲ８−イスコムについてかなりまたは３００倍高く、ｇＤ２／イスコム−マトリックス製剤についてより５００倍高かった。最初の免疫化後１１３日までに、総血清抗体応答は、ｇＤ２−イスコムおよびｇＤ２／ＰＲ８−イスコムについて７７日についてとほぼ同じレベルで維持され、ｇＤ２マトリックス製剤も、イスコムのレベルに達した（１０^4.8）。１１３日目に、ＩｇＧ１レベルは、イスコムとイスコムマトリックス製剤について同様であった。しかしｇＤ２に対するＩｇＧ２ａ応答は、ターゲティングタンパク質のないｇＤ２−イスコムおよびイスコム−マトリックスを補足したｇＤ２より、ｇＤ２／ＰＲ８−イスコム製剤でｉ．ｎ．免疫化したマウスの血清中で１０倍高く、すなわち１０^4.1であった。結論ｇＤ２タンパク質自身は例５のｇＢ２と異なり、特異的ＩｇＧ２ａ応答を産生する能力を含む免疫応答を誘発し調節する能力は小さい。後者は、インターフェロン−γ−産生を有するＴｈ１タイプの応答の参加を反映すると考えられる。ｇＤ２／ＰＲ８−イスコム、すなわち粘膜ガイディングまたはターゲティング分子を有するイスコムは、ｉ．ｎ．経路により血清抗体応答を誘発する強い能力、およびヘルペスウイルス感染症に対する防御のための重要なタイプの免疫応答と考えられるＩｇＧ２ａ血清抗体応答を誘発（調節）する、非常に強く明瞭な能力を示した。最も重要なことは、本例は、パッセンジャー抗原（ｇＤ２）とイスコムの組合せは、それ自身では免疫学的にやや不活性であるが、免疫学的に活性なタンパク質分子（ＰＲ８分子）が粘膜モードで投与した後に免疫系を活発にターゲティングし免疫系を活性化する分子として作用して、パッセンジャー抗原を、強力な粘膜抗原、この場合免疫原性の高いｇＤ２分子に変換している。例７マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）亜種ミコイデス（ＭｍｍＳＣ）は、伝染性ウシ胸膜胃炎（ＣＢＰＰ）の原因菌であり、これは家畜ウシの大きな経済的損失の原因である。これは、多くのアフリカ諸国およびアジアのいくつかの国ならびにヨーロッパ南部（すなわち、ポルトガルやスペイン）に広がっている。長い潜伏期間中、感染したウシは無症状であり、そのため撲滅が困難であり、この疾患に対する有効な制御手段が非常に重要である。１９世紀の初めから、種々の弱毒化ワクチン株および不活性化ワクチンなどで予防接種努力が続けられている（ジェイ・ウォーカー（Walker，J.）、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｄｅｐｔ．Ａｇｒｉｃ．Ｋｅｎｙａ、ｐ．２４０−２４３、ナイロビ、１９２９；ジー・クラソン（Curasson，G.）、Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｖｅｔ．Ｆｒ．５，１７９ −１８４，１９３２；ジェイ・アール・ハドソン（Hudson，J.R.）、ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＶｅｔ．Ｊ．４１，４３−４９，１９６５）。それでも、呼吸器官を介して起きる自然の感染に対して長期間の防御作用を誘発する有効なワクチンは、欠如している。本例において我々は、洗浄剤可溶化により微生物から放出されたマイコプラズマ・ミコイデス（M．mycoides）抗原を含有するイスコムのｉ．ｎ．投与後の免疫応答を解析する。材料と方法化学物質および溶液例２のＰＢＳ。サポニン（シグマ（Sigma）、Ｎｏ．Ｓ−１２５２）またはＱＡ（アドヴェット（Advet）ＡＢ、ストックホルム、スエーデン）、例２を参照。洗浄剤オクチルグルカシド（ＯＧ）は、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-M annheim）（ドイツ）から購入した。これは１０％のストック水溶液として使用した。洗浄剤メガ−１０は、バッケム（Bachem）（ブベンドルト（Bubendort）、スイス）から得た。キルＡ（スピコシド（Spikoside））は、アドヴェット（Advet）ＡＢ（ストックホルム、スエーデン）から得た（例２）。卵黄からの脂質のコレステロールと１−３−ホスファチジルコリン（いずれも９９％〜１００％）、サイログルブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、サブスタンスＤＡＢ、ビオチン化レクチン；ＣｏｎＡ、ＷＧＡ、ＳＢＡ、ＵＥＡおよびＨＲＰ結合ストレプトアビジンは、シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。ＨＲＰ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンは、ダコパッツ（Dakopatts）（コペンハーゲン、デンマーク）から得た。ＴＭＢ試薬、過酸化水素およびコーティング緩衝液錠剤は、スバノバ・バイオテク（SVANOVA Biotech）（ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）から購入した。ツイーン−２０は、メルク（Merck）（ダルムスタット（Darmstadt）、ドイツ）から得た。マイコプラズマ（Mycoplasma）ＭｍｍＳＣのＡｆａｄｅ株およびＴ１／４４は、パソトロップ・ラボラトリー（Pathotrop laboratory）（シラ−イーエムブイティー（CIRAD-EMVT）、モントペリエ（Montpellier）、フランス）から供給された。イスコムの生成全ＭｍｍＳｃ細胞イスコムは、ＰＲ８について記載したように調製した。簡単に説明すると、５ml中の約５mgのマイコプラズマ試料に、洗浄剤ＭＥＧＡ−１０またはＯＧを最終濃度２％になるように加え、室温で２時間放置した。可溶化した物質（５ml）を、下にＰＢＳ中３０％ショ糖層を有する、０．５％ＭＥＧＡ− １０または０．５％ＯＧを含有する２mlの容量中の１０％ショ糖の上に重層した。可溶化したタンパク質を、ＴＳＴ４１．１４ロータ中で２０℃で１時間４０，０００rpmで遠心分離して、不溶性の物質から分離した。試料容量と１０％ショ糖層からなる上層を集め、コレステロール、ホスファチジルコリンおよびキルＡを加え、１０：２：１：２０の比率で混合し、室温で一晩および低温室中で４８時間、ＰＢＳに対して充分透析した。生成したイスコムを、ＴＳＴ４１．１４ロータ中で１０％と２０％のショ糖の２重層を介して３９，０００rpmで１０℃で１９時間沈降させて、取り込まれなかったタンパク質からさらに精製した。沈降したイスコムをＰＢＳに再懸濁し、使用するまで−７０℃に保存した。マウスのｉ．ｎ．免疫化マウスでのＡｆａｄｅ株イスコムのＭｍｓｍＳＣのｉ．ｎ．投与は、麻酔下（メトファン）のマウスの鼻腔に抗原を入れて行なった。８週令の１２匹のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスを、各３匹の４群に分けた。群１、２、および３のマウスにそれぞれ３、１０および２０μｇのイスコムワクチンを、７週間置いて２回与えた。群４は、非免疫対照マウスである。最初の投与後２、４および７週にマウスを放血させ、追加免疫の２週間後に、もう一度採血した。肺抽出物の調製は、例２に記載のように行なった。血液および肺抽出物中のＩｇＡのＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（５０mM炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）中の０．４μg/mlのＡｆａｄｅ株のＭｍｓｍＳＣ細胞１００μｌでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、＋４℃で一晩またはそれ以上インキュベートした。すべての洗浄（×３）は、０．２％ツイーン−２０含有ＰＢＳ（１５０mM、ｐＨ７．５）（ＰＢＳ−Ｔ）で行なった。ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ中２％ＢＳＡ２００μｌで室温で１時間攪拌しながらブロッキングした。ブロッキング緩衝液中の１００μｌの肺懸濁液上清または血清を、２倍希釈し、室温で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液中のＨＰＲ−ストレプトアビジン結合体の１：１０，０００希釈液１００μ ｌを加え、室温で１時間インキュベートした。２００μｌの基質緩衝液（ＴＭＢ、過酸化水素）を添加して室温で１５〜２０分間酵素反応物を視覚化し、次に５０μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止させ、タイターテク・マルチスキャン（Titertek Multiscan）分光光度計で４５０nmで吸光度を測定した。陰性対照動物からの肺懸濁液と血清をバックグランドとして使用し、カットオフを計算した。ウェスタンブロットエィチ・タウビン（Towbin，H.）、ティー・ステーレイン（Staehlein，T.）およびジェイ・ゴージン（Gordin，J.）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４３５０−４３５４，１９７９に従って、シュレイチェー・アンド・シュエル（Schleicher and Schuell）（ドイツ）のニトロセルロースペーパーを使用して、ウェスタンブロットを行なった。イスコムと全ＭｍｓｍＳＣ抗原は、１２％ＳＤＳ−ゲルに溶解した。結果総血清抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより測定した。４週目まで、一定の抗体の増加が得られた。マウスに追加免疫後、２週間後に血清抗体レベルの３〜５倍の上昇を記録した。抗体応答は、投与量の増加とともに上昇し、エンドポイント力価は約１０⁶になった。（図１３Ａ）。血清（図１３ｂ）中と肺分泌物（図１３Ｃ）抽出物中のＩｇＡ応答をＥＬＩＳＡで測定した。分泌性ＩｇＡレベルは、１：８０００の希釈率まで検出された。ほぼ同様のＩｇＡ力価が血清中で観察された。ＩｇＡ力価は、投与量の増加とともに上昇した。ウェスタンブロットにおいて、イスコムでｉ．ｎ．免疫化したマウスの肺分泌物では約１０のポリペプチドバンドが検出され、同じマウスの血清に２０を越えるバンドが検出された。ｓ．ｃ．免疫化マウスの血清では、ｉ．ｎ．経路で免疫化したマウスの血清とは異なるタンパク質（図１３Ｄ）が検出された。肺抽出物（Ａ）では、約１０バンドが検出され、２つ以外はすべて、ｉ．ｎ．免疫化マウスの血清に検出された（矢印を参照）。ｉ．ｎ．経路により検出された抗原は、糖脂質であり、炭水化物構造に典型的な不連続な外観ではなくふわふわした外観で示される。これは、ｉ．ｎ．免疫化は、他の投与方法では免疫原性でない抗原で免疫化するための、炭水化物に対する免疫化の迫加のシナリオを開くものである。結論結果は、ウェスタンブロット（ＷＢ）により明らかになった約１０の抗原はＩｇＡ応答を誘発するため、マイコプラズマ抗原は、標的探索分子としておよびパッセンジャー抗原として作用することを示す。特に興味深くかつ予想外であることは、ｉ．ｎ．免疫化されたマウスの血清を使用してＷＢで検出された抗原群は、ｓ．ｃ．免疫化されたマウスの血清を使用して得られたものとは異なることである。これは、ｉ．ｎ．経路は、非経口投与経路ではできない抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用できることを意味する。ｉ．ｎ．免疫化したマウスの血清でＷＢによりバンドとして検出された抗原の多くは、ｓ．ｃ．経路で免疫化したマウスの血清で検出されるものとは別であった。この現象は、炭水化物構造がｉ．ｎ．経路で検出されること、そしてｉ．ｎ．経路は、非経口投与（ｓ．ｃ．）モードの免疫化では認識されない抗原または抗原決定基（例えば、炭水化物構造）に対する免疫応答を誘発するための代替として使用できることを、強く示唆する。ニューモコッカス・ニューモニア（Pneumococcus pneumonia）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）およびストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumonia）のような種々の細菌で多糖に対する免疫応答の誘発が最も重要である。例８イスコム−マトリックスをアジュバントとする不活性化ロタウイルスの経口投与により子羊で誘発される防御性粘膜免疫概論ロタウイルスは、先進国および開発途上国の両方で５才を越える子供の重症の下痢性疾患の主原因であり、毎年この年令群で約８７０，０００例の死亡と数百万例の重症の下痢を引き起こしていると認められている。これらは、多くの家畜動物種の新生児の下痢の原因として、同様に重要である。ウサギで原発性の粘膜性免疫応答を記載する研究を除いては、この応答の詳細な解析はほとんどない。本例では、我々は、不活性化ウシロタウイルスとイスコム−マトリックスによる経口免疫化後に粘膜性免疫応答ならびに全身性応答が誘発され、これが、以後の生きた病原性ウイルスの抗原刺激に対して防御的免疫応答を引き起こすという仮説を評価した。この実験の子羊（６日令）は非常に若く、成体ほど免疫応答性でなく（ジェイ・ピー・リッジ（Ridge，J.P.）、イー・ジェイ・フックス（Fuc hs，E.J.）、ピー・マジンガー（Matzinger，P.）、Ｓｃｉｎｅｃｅ２７１，１７２３−２６，１９６６；アール・イー・ビリンガム（Billingham，R.E．）、エル・ブレント（Brent，L.）、ピー・ビー・メダワー（Medawar，P.B.）、Ｎａｔｕｒｅ１７２，６０３，１９５３；エー・バンデイラ（Bandeira，A.）、エー・クチンホ（coutinho，A.）、シー・カルノー（Carnaud，C.）、エフ．ジャッケマート（Jacquemart，F.）、エル・フォルニ（Forni，L.）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，２７２，１９８９；シュルマンス（Shurmans）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，２４６５，１９９０）、ある期間母親の抗体が優勢であると予想され、このため予防接種がさらに困難である。このため、経口粘膜投与と最近のアジュバント系の組合せが、新生児免疫化の問題を克服できるかどうかを調べることは、非常に興味深いであろう。材料と方法ウイルスワクチンウイルスは、ＭＡ１０４細胞中で増殖させたウシロタウイルスＵＫ株である。不活性化の前の感染性力価は、１０^6.8蛍光焦点単位（ffu/ml）であり、５％（v／v）の０．１Ｍの二成分エチレンイミン（ＢＥＩ）溶液で３７℃で２４時間処理後、感染は検出されなかった。無菌の子羊中で継代した病原性の子羊ロタウイルスＫ９２３株を、抗原投与に使用した。各子羊に、５mlの無菌ＰＢＳに懸濁した１０^8.5ffuを与えた。実験計画子羊は、無菌隔離装置中で生まれ維持された。６日令の子羊に、ＰＢＳと５００μｇのイスコムマトリックス（アドヴェット（Advet）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）（ＰＢＳ／ＩＳＣ；ｎ＝６）、不活性化ウシロタウイルス（ＵＫ株）および５００μｇのイスコムマトリックス（ＲＶ／ＩＳＣ；ｎ＝５）、または不活性化ウシロタウイルス単独（ＲＶ；ｎ＝３）の混合物を、経口接種した。２１日後に子羊に、病原性の羊のロタウイルス（Ｋ９２３株）を抗原投与し、抗原投与後１〜２週間後に屠殺した。試料採取と解析最初の免疫化で血清のための血液と鼻分泌物を採取し、次に定期的な間隔でＥＬＩＳＡにより特異的および全ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体のレベルを、そしてウイルス中和試験により中和力価を測定した。ロタウイルスの排泄が検出されなくなるまで、免疫化と抗原投与後に毎日、糞試料を採取した。ドデシル硫酸ナトリウム−ボリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により２本鎖ＲＮＡを検出して、ロタウイルス排泄を測定した。最初の免疫化の時と次に毎週ＰＢＬを採取して、特異的ＩｇＡとＩｇＧを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴで測定し、リンパ球亜集団の分布をＦＡＣＳ解析で測定した。抗原投与後１〜２週間後に子羊を屠殺し、空腸パイエル板（ＪＰＰ）、回腸パイエル板（ＩＰＰ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）および小腸上皮リンパ球と粘膜固有層リンパ球（ＩＥＬとＬＰＬ）からリンパ球集団を単離した。ＪＰＰ、ＭＬＮおよびＬＰＬ中の特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ産生細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴで測定した。リンパ球亜集団をＦＡＣＳで解析した。ＭＬＮとＪＰＰ中のサイトカイン発現（γ−ＩＦＮ、ＩＬ −２、およびＩＬ−４）を、ＲＴ−ＰＣＲとハイブリダイゼーションにより視覚化した。小腸分泌物中の特異的および総ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体のレベルと中和力価は、小腸粘液を使用して測定した。リンパ球単離既に記載されているように（エヌ・ケー・プリ（Puri，N.K.）、シー・アール・マッケイ（MacKay，C.R.），エム・アール・ブランドン（Brandon，M.R.）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５５，７２５−３３，１９８５）末梢血リンパ球を集め、適当な濃度で、１mMグルタミン、１００単位/mlペニシリン、０．１mg／mlストレプトマイシン、２μg/mlアンホテリシンＢ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する完全ＩＭＤＭ中に再懸濁し、既に記載されているように処理した。最終的にリンパ球を、完全ＩＭＤＭに適当な濃度で懸濁した。小腸片を集め、既に記載されている方法を若干修飾して処理した。小腸を１０cmの切片に切断し、反転させ、２mMＥＤＴＡを含有するがカルシウムとマグネシウムを含有しないＨＢＳＳ中で静かに攪拌しながら３７℃で３回洗浄して、上皮細胞と上皮内リンパ球を除去した。組織をＲＰＭＩ１６４０中で洗浄し、１mMグルタミン、１００単位/mlペニシリン、０．１mg／mlストレプトマイシン、２μg/mlアンホテリシンＢ、５μg/mlゲンタマイシン、８０単位/mlコラゲナーゼXi（シグマ（Sigma））、０．１mg／mlデオキシリボヌクレアーゼＶ型（シグマ（Sigma））、および１０％ＦＣＳを含有する３７℃のＲＰＭＩ中に入れ、粘膜固有層リンパ球を除去した。ＬＥＬとＬＰＬ懸濁液を、当量のリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標））に重層した無菌のガラスウールカラムに通し、遠心分離した。界面のリンパ球を採取し、１mMグルタミン、１００単位/mlペニシリン、０．１mg/mlストレプトマイシン、２μg/mlアンホテリシンＢ、および２％ＦＣＳを含有するＨＢＳＳ中で２回洗浄後、適当な濃度で完全ＩＭＤＭに懸濁した。測定法ウイルス中和測定法。ウシロタウイルスＵＫ株および子羊ロタウイルスＫ９２３株についてのウイルス中和測定法は、マイクロタイタープレート中で行い、エンドポイントまたはウイルス中和力価（ＶＮＴ）は、蛍光焦点単位の６０％低下により測定した。ＥＬＩＳＡ。特異的ロタウイルスＥＬＩＳＡでは、ウサギ抗ロタウイルス補足血清、子羊ＲＶＫ９２３および陰性抗原結合対照として非感染ＭＡ１０４抽出物でコーティングしたマイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、マキシソルブ（Maxisorb））、試験試料および対照試料、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ロバ抗ヒツジＩｇＧ（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site））またはマウス抗ウシＩｇＡを使用し、結合したペルオキシダーゼに基質過酸化水素およびｏ−フェジレンジアミンジヒドロクロリドを加えて発色させた。２Ｍの硫酸を加えて反応を停止させ、４９０nmで吸光度を測定した。対応するＫ９２３ウェルから陰性ウェルの値を引いて、真の吸光度を計算した。総イソタイプＥＬＩＳＡでは、ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ダコ（DAKO））またはブタ抗ヒツジＩｇＡでコーティングしたマイクロタイタープレート、試験試料、希釈剤、および対照試料、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ピアス（Pierce））またはマウス抗ウシＩｇＡを使用し、上記と同様に発色させた。希釈剤ウェル中のＯＤ値は、対応する試験ウェルから引いた。各ＥＬＩＳＡについて、標準物質を使用した：総ＩｇＧＥＬＩＳＡについては高度免疫子羊血清、ＩｇＧ濃度９，６００mg/L；総ＩｇＡＥＬＩＳＡについてはヒツジレトロウイルス（ジャーグジークテ（Jaagsiekte））（ＪＳＲＶ）で感染させたヒツジの清澄化した肺液から精製したＩｇＡのバッチ。各標準物質は、８つの２倍希釈で測定し、任意の抗体単位またはmg／mlの関数としての真の吸光度をそれぞれ、ｌｉｎ−ｌｏｇシグモイド曲線に適合させた。各場合で、得られた標準曲線は、ｒ＞０．９５の適合性であった。得られるパラメータを次に、各試料を試験した希釈率を考慮して、各試験試料について抗体単位または濃度（mg／ml）に内挿した。特異的および総ＥＬＩＳＡの結果を合わせ、ＩｇＧまたはＩｇＡの単位/mlで表した。ＥＬＩＳＰＯＴ。イソタイプ抗ロタウイルスＥＬＩＳＰＯＴでは、マウス抗ロタウイルス補足血清でコーティングしたマイクロタイタープレート（ヌンク（Nu nc）、マキシソルブ（Maxisorb））、５μg/mlの濃度の抗原としてのショ糖精製したロタウイルスＵＫ株、ＰＢＬ懸濁物（５×１０⁵細胞／ml）、西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ピアス（Pierce））またはマウス抗ウシＩｇＡを使用し、結合したペルオキシダーゼに基質である過酸化水素と３ −アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を加えて、スポットを視覚化した。スポットが見えた時、基質を振り落として反応を停止させた。スポットを計測（６重測定の平均）し、１０⁶リンパ球当たりのスポット形成単位として表した。ＦＡＣＳ解析。リンパ球亜集団は、ヒツジＣＤ４（１７Ｄ）（シー・アール・マッケイ（MacKay，C.R.），ダブリュー・アール・ヘイン（Hein，W.R.）、エム・エィチ・ブラウン（Brown，M.H.）、ピー・マジンガー（Matzinger，P.）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，１６８１−８，１９８８；ジェイ・エフ・マドックス（Maddox J.F.）、シー・アール・マッケイ（MacKay，C.R.），エム・アール・ブランドン（Brandon，M.R.）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５５，７３９ −４８，１９８５）、ＣＤ８（７Ｃ２）（ジェイ・エフ・マドックス（Maddox J.F.）、シー・アール・マッケイ（MacKay，C.R.），エム・アール・ブランドン（Brandon，M.R.）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５５，７３９−４８，１９８５）、γδＴＣＲ（８６Ｄ）。軽鎖（ＶＰＭ８）（エヌ・ケー・プリ（Puri，N.K.）、シー・アール・マッケイ（MacKay，C.R.），エム・アール・ブランドン（Bran don，M.R.）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５５，７２５−３３，１９８５）、およびＣＤ４５Ｒ（７３Ｂ）（マッケイ（MacKay，C.R.），ダブリュー・エル・マーストン（Marston，W.L.）、エル・ダドラー（Dudler，L.）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１，８０１．１７，１９９０）に特異的なマウスモノクローナルのパネルを用いて測定した。第２抗体であるフルオレセイン標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（ダコ（DAKO））を添加し、細胞を走査し、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson Ltd）で計測した。結果予防接種後免疫化後の血液中の特異的ＩｇＧ抗体のレベルは、ＲＶイスコムマトリックスにより予防接種した動物についてよりも高かった（図１４Ａ）。両方のＲＶ予防接種群中の免疫化後２１日目のＣＤ４⁺細胞の有意に高い比率（図１４Ｂ）。ＣＤ４５Ｒ⁺細胞（図１４Ｃ）は、ＲＶ／ＩＳＣ−マトリックスで予防接種した群でのみ血液中に記録されたことは、これらの細胞は記憶細胞であり、ロタウイルスによる以後の感染についての迅速な応答の基礎となることを考慮すると、非常に重要である。興味深いことに、ＰＢＳ／ＩＳＣ−マトリックス（すなわち、抗原のない群）は、ＣＤ４⁺細胞の増加を示さなかったが、有意に高い比率のγδ ＴＣＲ細胞を示した（データは示していない）。感染後の抗原投与抗原投与感染後に、動物は免疫学的に応答すると予想される。しかし、生きていない（複製していない）ロタウイルス製剤による経口のみの免疫化は、これまで感染または疾患に対する防御を誘発しなかった。疾患に対する防御は、Ｉ．既存の免疫防御、ii．感染物質（この場合ＲＶ）に対して迅速に応答する免疫系の迅速さに依存する。この迅速さは、記憶細胞（すなわち、予防接種後の２１日目および抗原投与感染の前に検出されたＲＶイスコム−マトリックスにより誘発されたＣＤ４５Ｒ⁺細胞）（図１４Ｃ）に依存する。感染に対する迅速さの読み値は、感染物質（この場合ＲＶ）の排泄である。この実験は、非常に複雑な消化系を有する反すう動物におけるこの種の最初の実験であることに注意されたい。従って、アジュバント（イスコム−マトリックス）および抗原などの投与量に関して最適条件に達するために、一連の実験が必要である。しかし、イスコムおよびイスコム−マトリックス技術に基づくワクチンの成功について非常に有望であることが強く示されている。抗原投与後、すべての子羊はロタウイルスを排泄した。両方のＲＶ−予防接種した子羊は、対照より短期間でウイルスを排泄した（すなわち、それぞれ５〜６日、６〜７日、および８〜９日）が、これは、ＲＶ／ＩＳＣ−マトリックスで予防接種した群でわずかに有意（ｐ＝０．０２７）であり、有効なワクチンを開発できる可能性を強く示している（図１４ｃ）。予想されたように、抗原投与後にすべての子羊は、血清、鼻分泌物、および腸管をひっかいたものの中で特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を有し、抗原投与後に血液および腸管関連リンパ組織（ＭＬＮとＪＰＰ）中で抗体分泌細胞を有した。ＲＶ／ＩＳＣ−マトリックスで予防接種した群は、血液中に有意に増加した数の特異的ＩｇＡ（図１４Ｅ）およびＩｇＧ産生細胞を有し、予防接種のプライミング効果を示している。プライミング効果は、記憶細胞の出現に依存する。特異的ＩｇＧ産生細胞の数はまた、非アジュバント化ＲＶ予防接種群に比較して有意に高かった。抗原投与後、３つの群の間でＧＡＬＴ中の特異的ＩｇＡまたはＩｇＧ産生細胞に、差はみられなかった。特異的ＩｇＧ応答は、特異的ＩｇＡ応答と同様であった。ＵＫおよびｋ９２３に対する中和抗体は、すべての群で血清中に検出された。抗原投与後、すべての子羊は、ＣＤ４⁺細胞とＰＢＳ／イスコム−マトリックスが増加しており、ＲＶ予防接種群では、ＣＤ４５Ｒ⁺細胞は、抗原投与前のＲＶ／ＩＳＣ−予防接種群で観察されたレベルと同様なレベルに上昇した。考察イスコム−マトリックスをアジュバントとした不活性化非複製ロタウイルスの単回経口投与により、以後の生きた複製ウイルスによる抗原投与時のウイルス排泄の期間が有意に短縮されたことは驚くべきことである。ウイルス排泄の有意な期間短縮は、ＲＶ／ＩＳＣ−予防接種群でのみ観察され、ＲＶ−予防接種群では観察されなかったが、この群の子羊が少数なため、統計解析は限定される。ウイルス抗原投与に対してプライムされた子羊の免疫応答の特徴には、鼻および小腸分泌物中の特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体のレベルの上昇、およびＲＶ／ＩＳＣ −予防接種群の、循環する特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ産生細胞の数の増加がある。１回のみの投与でマトリックスをアジュバントとしたＲＶが、免疫応答をプライムし、感染期間を有意に短縮することは、ＯＶＡの経口投与後にＩｇＡ応答を誘発するために数回の免疫化が必要であることをマウスで示した、モワ（Mowat ）（モワ（Mowat）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７２，３１７−３２２，１９９１）の結果を考慮すると、驚くべきことである。結論動物の若い年令（すなわち、１週令で、まだ新生児期であり、成体のように免疫応答性ではない）および経口投与による１回の免疫化で免疫応答を誘発することの難しさを考慮すると、イスコム−マトリックスまたは任意の非複製ワクチンをアジュバントとするロタウイルスの１回の投与量の経口投与により、明瞭なプライミングが達成されることは予想外である。反すう動物の複雑な消化管系を考慮すると、これは特に困難である。この点でロタウイルスまたはロタウイルスの一部が、他の抗原ならびにイスコムおよびイスコム−マトリックス製剤で免疫化を促進するのに適した、粘膜標的探索装置としての使用に適している可能性がある。これらの結果は、母親の抗体が存在する新生児期に、粘膜免疫化により動物をうまく免疫化できる可能性を示唆する。ＲＶ／イスコム−マトリックスにより誘発されるＣＤ４５Ｒ⁺細胞数の増加は、感染により迅速に集められる記憶細胞の数の増加を示し、経口抗原投与後のウイルス排泄期間の短縮を示しており、従って疾患の発症の危険性を排除または低下させる。例９概論呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、世界中の幼児や小児のウイルス性下気道感染の最も必要な起因菌である。これは、アメリカ合衆国だけでも毎年９１，０００件の入院と４，５００件の死亡を引き起こすと推定されている。密接に関連したウイルスは、ウシ呼吸合胞体ウイルスであり、これは幼い子牛の重要な呼吸器のウイルスである。国内のおよび国際的保険機関も、このウイルスを制御するためのワクチンの開発を、罹患と死亡を防止するための優先事項としている（ビー・アール・マーフィー（Murphy，B.R.）、ジー・エー・プリンス（Prince，G.A. ）、イー・イー・ワルシュ（Walsh，E.E.）、エィチ・ダブリュー・キム（Kim， H.W.）、ブイ・ジー・ヘミング（Hemming，V.G.）、ダブリュー・ロドリゲツ（R odriguez，W.）、およびアール・エム・チャノック（Chanock，R.M.）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４，１９７−２０２，１９８６）。これまでＲＳＶ噺斡ワクチンを開発する試みは成功しておらず、１９６０年代に幼児と小児で評価されたホルマリン不活性化ヒト呼吸合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）ワクチンは失敗しているため、充分な注意が必要である。これは、感染および疾患に対する耐性を誘発することができなかっただけでなく、悪質な型の呼吸下気道感染を引き起こした。ＲＳＶは、呼吸器の粘膜表面を介して感染を開始させる。このため、呼吸器の粘液中で免疫応答を誘発するワクチンは、最も重要であり、これはｉ．ｎ．免疫化により引き起こされる可能性が高い。粘膜型の免疫化は、局所的および全身性の免疫応答を誘発する可能性、安全性を上昇させる可能性、および副作用を最小にする可能性により、非経口投与に対して利点を有し、予防接種などに必要な人手や装置の必要性を低下させる。本例の目的は、経鼻投与および皮下投与後の肺および他の粘膜表面でのＩｇＭ、ＩｇＧイソタイプ、ＩｇＧサブクラスおよび分泌性ＩｇＡ応答に関して、抗体応答を比較し、経鼻投与に基づくＲＳＶイスコムワクチンを開発する可能性を調べることである。材料と方法化学物質および溶液非イオン性洗浄剤ｎ−オクチルグルコシド（１−ｏ−オクチルーグルコシド、ＯＧ）は、ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）（ＧｍｂＨ，ドイツ）から購入した。キルＡ「スピコシド（Spikoside」は、イスコテック（Iscotec ＡＢ）（ルレア（Luleae）、スエーデン）から得た。ヤギ抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３は、ノルディック（Nordic）（チルバーグ（Tilburg）、オランダ）から得た。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＡは、サザン・バイオテクノロジー・アソシエーテイッド社（Southern Biotechnology Associated，Inc．）（バーミンガム、アメリカ合衆国）から得た。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリンおよびＨＲＰストレプトアビジンは、ダコパッツ（Dakopatts）（グロストルプ（Glostrup）、デンマーク）から得た。ＲＳＶイスコムと不活性化ＲＳＶの調製ＲＳＶイスコムは、ウイルスの２つの異なる調製物から調製した。ウイルスは、ベロ（vero）細胞中で繁殖させた。ウイルスを採取後、遠心分離して細胞破片を除去した。ウイルスを超遠心分離により沈降させてペレットにし、１０〜５０％のショ糖勾配で遠心分離してさらに精製した。イスコムの調製法と生化学的性状解析は、前述のように行なった。簡単に説明すると、ウイルスタンパク質濃度：（１．８０mg／ml）を、最終濃度２％(w/v)のＯＧで３７℃で１時間絶えず攪拌しながら可溶化させた。可溶化したウイルスを、５０％ショ糖のクッションの上の、０．５％ＯＧを含有する２０％ショ糖層２mlの不連続なショ糖勾配に添加した。コントロン（Kontron）ＴＳＴ−１４ロータ中で４０，０００pmで４℃で１時間遠心分離後、試料容量＋（ウイルスタンパク質を含有する２０％ショ糖層）を集め、余分に脂質（すなわち、コレステロールとホスファチジルコリンおよびキラヤ（スピコシド（Spicoside）、ルレア（Luleae）、スエーデン））を１：０．５：０．５：３．５（w/w）の比率で加えた。０．１５Ｍ酢酸アンモニウムに対して４℃で７２時間充分に透析してから、１０％ショ糖でコントロン（Ko ntron）ＴＳＴ−１４ロータ中で４０，０００rpmで１０℃で１８時間遠心分離して、イスコムを精製した。ＲＳＶイスコムを含有するペレットを、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。イスコムの存在は、電子顕微鏡で例２に記載のように確認した。イスコムのタンパク質パターンは、電気泳動とウェスタンブロッティング法により測定した。キラヤ濃度はＨＰＬＣで測定した。これらの最終イスコム調製物中のキラヤとタンパク質の間の比率は、５mgキラヤ／１mgイスコムである。不活性化ＲＳＶは、ウイルス溶液に０．５％(w/v)のＢ−プロピオラクトンを加え、４℃で７日間反応を維持してウイルスを不活性化することにより調製した。マウスメスのＢａｌｂ／Ｃマウス（８〜１２週令）は、ナショナル・ベテリナリー・インスチチュート（National Veterinary Institute）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）から得た。マウスを、ウイルス、細菌およびマイコプラズマ感染についてスクリーニングし、国のガイドラインに従って維持した。免疫化各７匹のＢａｌｂ／Ｃマウスからなる７群のマウス（ＡからＧ）を、６週間置いて２回免疫化した。異なる群のマウスは、以下のように免疫化した：群Ａ、イスコムＩ５μｇ／マウスで経鼻的に（ｉ．ｎ．）。群Ｂ、イスコムＩ１μｇ／マウスで皮下的に（ｓ．ｃ．）。群Ｃ、イスコムII ５μｇ／マウスでｉ．ｎ．。群Ｄ、イスコムII １μｇ／マウスでｓ．ｃ．。群Ｅ、イスコム４μｇ（ｉ．ｎ．）＋１μｇ（ｓ．ｃ．）／マウス。群Ｆ、不活性化ＲＳＶ５００μｌ／マウスｓ．ｃ．。この調製物は、イムノドット測定法により測定したイスコム調製物と同量の融合タンパク質を含有する。群Ｇ、非免疫化対照群。経鼻免疫化のために、５μｇのイスコムを、２０μｌ容量に懸濁し、皮下投与量は、２００μｌの容量で懸濁した。ｉ．ｎ．免疫化は、麻酔下で行なった（例２に記載のように）。血清学的評価ための血液試料は、最初の予防接種後２週目と５週目に、および追加免疫後の１種目と３週目に採取した。抗体抽出ための肺は、追加免疫後２週目に採取した。各群から２匹のマウスを屠殺し、肺を取り出した。ＩｇＡは、例２に記載のように取り出した。酵素免疫定量法ＲＳＶに対する血清ＩｇＭとＩｇＧ抗体ための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、１００μｌの５０mM炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の２００μｇの精製ＨＲＳＶ／ウェルでコーティングしたマイクロタイタープレート（ヌンク（Nu nc）、ロスキルデ（Roskilde）、デンマーク）中で、４℃で一晩維持して行なった。すべての洗浄は、０．２％ツイーン−２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ−ツイーン）で行なった。インキュベーションはすべて、室温で６０分間絶えず攪拌しながら行なった。マウス血清は、２倍希釈で力価を決定した。酵素反応は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中のテトラメチルベンジジン（０．１９mg／ml）および過酸化水素（０．００６％）を使用して、光学密度は、タイターテック・マルチスキャン（Titertek Multiscan）分光光度計（フローラボラトリーズ（Flow Laboratories）、アーバイン（Irvine）、スコットランド）を使用して４５０nmで測定した。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３サブクラス測定ためのＥＬＩＳＡは、ヤギ抗マウスＩｇＧサブクラスとウサギ抗ヤギＨＲＰ結合体を使用して、同様の方法で行なった。マウスの肺抽出物中のＨＲＳＶに対する分泌性ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）レベルは、ＥＬＩＳＡを若干修飾して測定した。マイクロタイタープレートを、１００μｌのコーティング緩衝液中４００ng／ウェルの精製ＨＲＳＶでコーティングした。２倍連続希釈肺抽出物を、ウェルに加えた。室温で一晩インキュベートし、次にＰＢＳ−ツイーン−２０で洗浄後、各ウェルに１００μｌのビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＡを加えた。ＲＴで１時間インキュベート後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを加え、ＲＴで１時間インキュベートし、次にプレートを洗浄し、基質を加えた。１５分後に５０μｌの２Ｍ硫酸を加えて、酵素反応を停止させた。光学密度は４５０nmで測定した。力価と計算ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを、各試料について試験した。各マウスから採取できた血清の量が限られているため、ＩｇＧサブクラスは血清プールについて行なった。力価は、エンドポイント希釈率の逆数として表した。統計解析ＩｇＭとＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価は、数値の幾何平均として表し、マン-ホイットニイ（Mann-Whitneys）Ｕ検定により頻度と血清抗体のレベルについて比較した。ＥＬＩＳＡ力価の９５％信頼限界は、ミニタブ（Minitab）１０コンピューターソフトウェア（ミニタブ社（Minitab Inc.）、ペンシルバニアリ州、アメリカ合衆国）を使用して計算した。結果血清ＩｇＭ応答不活性化ＨＲＳ（群Ｆ）により誘発される応答と比較して、イスコムで免疫化したマウスのすべての群（群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）で有意に（Ｐ＜０．０１）高い血清ＩｇＭ応答が誘発された。イスコム免疫化した動物、特に経鼻的免疫化群（群Ａ、Ｃおよび群Ｅｉ．ｎ．＋ｓ．ｃ．）では、ＩｇＭ応答は長く続いた。イスコム予防接種群内でＩｇＭ応答を比較すると、経鼻的に免疫化した群（群Ａ、Ｃおよび群Ｅｉ．ｎ．＋ｓ．ｃ．）では、皮下に免疫化した群（群ＢとＤ）より有意に（Ｐ＜０．０１）高い応答が記録された（図１５Ａ）。血清ＩｇＧ応答血清ＩｇＧは、最初の予防接種の後と２回目の予防接種の後の２回測定した。血清ＩｇＧ応答は、古典的な方式でＩｇＭ応答に続いて起きた。イスコムで予防接種したマウス（群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）は、不活性化ＨＲＳＶで予防接種したマウス（群Ｆ）より、有意に（Ｐ＜０．０１）高いＩｇＧ応答を示した。イスコムによる予防接種（群ＡとＣ）およびｉ．ｎ．予防接種とｓ．ｃ．予防接種の組合せ（群Ｅ）は、皮下的にイスコムを予防接種した群（群ＢとＤ）より１００倍高いＩｇＧ応答を誘発した（図１５Ｂ）。ＩｇＧサブクラス応答ＩｇＧサブクラス応答は、プール血清についてＥＬＩＳＡで解析した。ＥＬＩＳＡで測定するとイスコムによるｉ．ｎ．とｓ．ｃ．免疫化（群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）により、ＩｇＧサブクラス応答と同様のプロフィールが誘発された。ＩｇＧ２ｂとＩｇＧ３よりも、ｉ．ｎ．、ｓ．ｃ．、およびｉ．ｎ．とｓ．ｃ．の組合せ予防接種後のイスコム免疫化マウスで、高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答が検出された。ｉ．ｎ．およびｓ．ｃ．免疫化マウスの間でＩｇＧサブクラス応答の差はなかった（図１５Ｃ）。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、不活性化全ウイルスで免疫したマウスより、イスコムで免疫化したマウスで高く、これはより顕著な TH １型の応答を示している。肺ｓＩｇＡ応答２回目の予防接種後、各群から２匹のマウスを屠殺し、材料と方法に記載したように肺抽出物を調製した。肺分泌性ＩｇＡＥＬＩＳＡ力価は、イスコム投与（群ＡとＣ）およびｉ．ｎ．とｓ．ｃ．投与を組合せた群Ｅにより、強いｓＩｇＡが誘発されたことを示した。これに対して、イスコムのｓ．ｃ．投与（群ＢとＤ）および不活性化ＨＲＳＶ（群Ｆ）は、非予防接種対照群（群Ｇ）に比較して肺分泌物中で測定可能な局所的ＩｇＡ応答を誘発しなかった。最も高いｓＩｇＡ応答は、ｉ．ｎ．とｓ．ｃ．投与の組合せにより免疫化した群Ｅのマウスで検出された１：１３０００であり、次にイスコムＩのｉ．ｎ．投与（１：１１０００）とイスコムIIのｉ．ｎ．投与（１：６０００）であった（図１５Ｄ）。最後の免疫化後２２週間目の肺分泌物中の最も高いＩｇＡ応答は、ｉ．ｎ．モードとｓ．ｃ．モードの免疫化の組合せにより誘発されたことが、最も顕著である。種々の粘膜臓器中の抗体応答上気道、肺、生殖器官および消化管中のＩｇＡ応答を測定した。種々の分泌物の抽出は、例２に記載のように行なった。ＲＳＶに対する最も高いＩｇＡ抗体応答は、生殖器官の分泌物から得られ、これは上気道および肺の分泌物より約７倍高かった。腸管分泌物中では、ＲＳＶに対する最も低いＩｇＡ抗体力価が観察され、すなわち逆数力価が約１００であった。詳細な結果は、図１５Ｅに示す。結論ｉ．ｎ．投与後、ＲＳＶ−イスコムは、ＲＳＶにより引き起こされる疾患に対しての防御に魅力があると考えられる（ビー・アール・マーフィー（Murphy，B. R.）、エス・エル・ホール（Hall，S.L.）ら、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．３２，１３ −３６，１９９４）サブクラスであるＩｇＧ２ａを含む、予想外に高い血清抗体力価を誘発する。１つの免疫化はすでに、明らかな血清抗体応答を誘発し、商業的利用の可能性を示している。肺と上気道からの分泌物中の高いＩｇＡ抗体は、有効なワクチンとして有望であり、感染の「入り口」（すなわち、気道）で第１線の防御を誘発する。これらの研究はまた、ＲＳＶエンベロープタンパク質（ＦとＧ）は、離れた臓器の粘膜についても粘膜ターゲティング分子として試験するために、特に最も高いＩｇＡ抗体応答が記録された生殖器官中の抗体応答の誘発について試験するために、非常に興味があることを示す。図の凡例図１Ａは、超遠心分離後の１０〜５０％ショ糖勾配中にｒＣＴＢが取り込まれたイスコム沈殿物を示す。ＣＰＭ値は、イスコムに伴う３Ｈ−コレステロール（ ■）の放射活性を示す。タンパク質の値は（ＣＴＢ）（□）は、ブラッドフォード（Bradford）に従って測定される。イスコムとｒＣＴＢは画分６〜９で回収される。従ってＣＴＢの大部分は、イスコム画分中に回収される。図１Ｂは、図１Ａと同じタイプの図を示す。この実験で、ｒＣＴＢ濃度は、ＧＭ１濃度より１００倍高かった。取り込まれていないｒＣＴＢは、勾配の上の方、すなわち画分１０〜１２に観察される。図２は、超遠心分離によりイスコムを性状解析する。ａ）オバルブミン（ＯＶＡ）ｂ）ＰＲ８−イスコムｃ）ＰＲ８／ＯＶＡ−イスコム図３は、ａ．ＯＶＡ−イスコムｂ．ＰＲ８−イスコムｃ．ＰＲ８／ＯＶＡ−イスコムの電子顕微鏡写真である。図４Ａは、１０〜５０％ショ糖勾配遠心分離のタンパク質測定により測定された遊離のｒＣＴＢ（□）、すなわち、イスコム沈殿物中にゆっくり取り込まれず、勾配の上の方（すなわち、画分１２〜１４）で回収されるｒＣＴＢの沈降を示す。図４Ｂは、ショ糖勾配の超遠心分離のイスコムに伴う¹⁴Ｃホスファチジルエタノールアミン（¹⁴ＣＰＥＡ）放射活性（ＣＰＭ）（■）を示す。脂質化タンパク質−ＯＶＡは、ブラッドフォード（Bradford）（本文参照）（□）で測定して、イスコムとともに回収され、画分６〜８に回収される。組み込まれない一部のタンパク質は、画分１１、１２、および１３に回収される。図４Ｃは、ＧＭ１を含有するイスコム中のｒＣＴＢの取り込みを示す。イスコム中のｒＣＴＢの取り込みは、タンパク質測定により測定した（□）。イスコムの沈降は、勾配中のイスコムに伴う放射活性³Ｈ標識コレステロール（ＣＰＭ）（■）により示す。タンパク質ｒＣＴＢと³Ｈコレステロールの両方は、イスコム構造に伴い、後者はＥＭにより証明され、画分６〜９に回収される。図４Ｄは、ブラッドフォード（Bradford）のタンパク質測定（□）により測定した脂質化ＯＶＡとｒＣＴＢの取り込みを示す。イスコムの沈降は、画分４〜６中に回収された放射活性¹⁴ＣＰＥＡ（■）により示し、ここでも放射活性以外にイスコム構造がＥＭにより証明された。図４Ｅは、ＧＭＩ−脂質を含有しないＯＶＡ−イスコムに加えられたｒＣＴＢは、タンパク質の回収（すなわち、勾配の上の画分１１〜１３中のＣＴＢ）により証明されるように、イスコム中に取り込まれないことを示す。脂質化ＯＶＡは、画分５〜８中に観察される。図５。種々のＯＶＡ／ｒＣＴＢ製剤に伴うＯＶＡに対する血清抗体応答。免疫化実験は、以下の群を含む：１．ｉ．ｎ．キラヤ（ＱＡ）のないＯＶＡ１０μｇ２．ｉ．ｎ．ＯＶＡ−イスコム１０μｇ３．ｉ．ｎ．別の物質として混合したＯＶＡ−イスコム１０μｇとｒＣＴＢ１０μｇ４．ｉ．ｎ．同じイスコム中でＯＶＡとｒＣＴＢ１０μｇ（ＯＶＡ／ｒＣＴＢ）５．ｓ．ｃ．ＯＶＡ−イスコム２μｇ（１０μｇＱＡ）６．ｉ．ｎ．別の物質として混合したＯＶＡと遊離のｒＣＴＢ。投与量各１０μ ｇ７．ｉ．ｎ．マトリックスを補足した遊離のＯＶＡ１０μｇ８．ｉ．ｎ．抗原のない対照図５Ａは、マウスの最初の経鼻（ｉ．ｎ．）免疫化後の、ＥＬＩＳＡで解析したＯＶＡに対する血清抗体応答を示す。アジュバントなしのＯＶＡまたはｒＣＴＢにアジュバントとして加えられるＯＶＡに対しては、抗体応答は測定できなかった（６）。図５Ｂは、２回目の免疫化の２週間後に、イスコムまたはマトリックス製剤で免疫化したすべてのマウスは、ＯＶＡに対する高血清抗体力価で応答したことを示す。別の物質としてｒＣＴＢを補足したＯＶＡで免疫化したマウスは、ＯＶＡ単独で免疫化したマウスより低い血清抗体力価を示した。図５Ｃは、２回免疫化後のマウスの血清についての希釈率の上昇におけるＥＬＩＳＡの読み値を示す。この図および図５Ｂに示すように、ＯＶＡを有するイスコム製剤は、「パッセンジャー抗原」（ＰＡ）としてまたはマトリックスとともに投与されたＯＶＡに対する血清抗体応答に関して、ｒＣＴＢが引き起こした寛容を排除する。図６。免疫化実験は、図５に記載のものと同じ群を含む。図６Ａは、マウスの２回の免疫化（ｉ．ｎ．）後の肺分泌物中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体応答の解析を示す。図６Ｂは、上気道分泌物中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体応答に関して、異なる群の間の比較を示す。ＯＶＡ−イスコムおよびマトリックスを補足したＯＶＡは、ｉ．ｎ．免疫化後に、アジュバントのないＯＶＡ−ｒＣＴＢ製剤より有意に高いＩｇＡ力価を引き起こした。図６Ｃは、異なる免疫化群のマウスの生殖器官の分泌物中で誘発されたＯＶＡに対するＩｇＡ抗体応答の比較を示す。図７。粘膜中のＯＶＡに対するＩｇＧ抗体応答。この免疫化実験には図５と同じ群を含めた。図７Ａは、異なる免疫化群のマウスの肺分泌物中で誘発されたＩｇＧ抗体応答の間の比較を示す。図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、それぞれ上気道、生殖器官および消化管からの分泌物中の対応するＩｇＧ抗体応答を比較する。図８．免疫化実験において、図５に示すものと同じ群が参加した。図８ＡとＢ。一般に、ＯＶＡ−イスコムを補足したイスコムまたは遊離のｒＣＴＢ中のＯＶＡ−ｒＣＴＢ（この場合、これはｒＣＴＢのイスコム−マトリックスの形である）は、すべての試験した分泌物（すなわち、肺、上気道、消化管および生殖器官）中で、アジュバントを加えないｒＣＴＢより、ＣＴＢに対するかなり高いＩｇＡ抗体応答を誘発した。図８ＣとＤ。イスコムまたはイスコム−マトリックス中のｒＣＴＢ製剤で、肺、上気道、生殖器官および消化管からの分泌物中で、ｒＣＴＢに対する高いＩｇＧ抗体応答が得られた。イスコムまたはイスコム−マトリックス製剤のないｒＣＴＢで免疫化したマウスでは、これらの分泌物中のＩｇＧ抗体応答は、ＣＴＢ− イスコムおよびイスコム−マトリックス製剤についてのものより低いが、非免疫化対照についてのものより有意に高かった。図９。インフルエンザウイルスイスコム（７μｇ）をｉ．ｎ．で２回免疫化した後の４８日の実験期間の間にＥＬＩＳＡ測定した、血清抗体応答（Ａ、ＢおよびＣ）と肺分泌物中の応答の進展。Ａ．は、血清中のインフルエンザウイルスに対する総抗体応答の進展を示す。Ｂ．は、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ中のインフルエンザウイルス抗原に対する抗体応答の進展を示す。Ｃ．は、インフルエンザウイルス抗原に対するＩｇＡ−血清抗体応答の進展を示す。Ｄ．は、肺分泌物中のＩｇＡ−抗体応答の進展を示す。図１０。以下のスケジュールに従って５群の５匹ずつのマウス（ＮＭＲＩ）を免疫化した。群免疫化基質投与方法ＡＯＶＡ−イスコム５μｇ抗原経鼻ｉ．ｎ．ＢＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｉ．ｎ．ＣＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム１０μｇ抗原ｉ．ｎ．ＤＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｉ．ｎ．ＥＯＶＡ／ＰＲ８−イスコム５μｇ抗原ｓ．ｃ．図１０Ａは、ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムは、インフルエンザウイルスのエンベロープタンパク質のないＯＶＡ−イスコムに比較して、２回のｉ．ｎ．免疫化後に、ＯＶＡに対する高い血清抗体応答を誘発し、３回の免疫化後により高くなることを示す。予測されるように、１０μｇのＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムｉ．ｎ．は、５μｇより高い抗体応答を誘発した。図１０Ｂは、ＰＲ８に対する血清抗体応答を示す。ＰＲ８を含有するすべてのイスコム製剤は、ｉ．ｎ．免疫化後にＰＲ８に対する抗体応答を誘発した。この応答は、２回目の免疫化後にかなり上昇した。図１０Ｃは、前述の３回の免疫化後の肺の分泌物中のＩｇＡ抗体応答を示す。５μｇおよび１０μｇのＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムは、皮下投与したＯＶＡ−イスコムに比較して、ｉ．ｎ．免疫化後に用量依存性の明瞭なＩｇＡ抗体応答を誘発した。図１０Ｄは、ＰＲ８抗原を含有するすべてのイスコム製剤は、肺分泌物中でＰＲ８に対して高いＩｇＡ抗体応答を誘発することを示す。図１０Ｆは、２０頁と２１頁（例４）に記載の２回の免疫化後の、標的探索分子を含むおよび含まないＯＶＡを含有するイスコム製剤、または別の物質としてのＯＶＡとイスコム−マトリックスとの製剤により誘発された、ＯＶＡに対する血清抗体応答を示す。ＥＬＩＳＡで測定された最も高い血清抗体力価は、ＯＶＡ −イスコムマトリックス製剤（Ｃ）で記録された。図１０は、ＯＶＡ／ＰＲ８−イスコムまたはＯＶＡ−マトリックス製剤を使用するｉ．ｎ．モードの投与とｓ．ｃ．モードの投与とを比較する。ｉ．ｎ．モードの投与は、ｓ．ｃ．免疫化により誘発されるものと同程度の強さまたはわずかに弱い血清抗体を誘発した。図１０Ｈは、３９頁と４０頁（例４）に記載の２回の免疫化後の、標的探索分子（ＰＲ８）を含むおよび含まないイスコム製剤、または別の物質としてイスコム−マトリックスと混合したＯＶＡにより誘発された、肺分泌物中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体応答を示す。図１０Ｉは、３９頁と４０頁（例４）に記載の２回の免疫化後の、標的探索分子を含むおよび含まないイスコム製剤、または別の物質としてイスコム−マトリックスと混合したＯＶＡにより誘発された、生殖器官の分泌物中のＯＶＡに対するＩｇＡ抗体応答を示す。図１１Ａは、例５に記載の単純ヘルペス２（ｇＢ２）からのｇＢを含有するイスコムで、９週間の間隔を置いて２回ｉ．ｎ．免疫化した２週間後のマウスの肺分泌物（７７日目）のＩｇＡ応答を示す。図１１Ｂは、図１１Ａおよび例５に記載のイスコムでｉ．ｎ．免疫化したマウスの異なる粘膜（肺、上気道、および生殖器官）からの分泌物（１１３日目）中のｇＢ２に対するＩｇＡ応答を示す。図１１Ｃは、図１１Ａに記載のｉ．ｎ．免疫化後の血清（７７日目）中のｇＢ２に対するＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ）応答を示す。図１２Ａは、例６に記載の単純ヘルペス２（ｇＤ２）からのｇＤを含有するイスコムで、９週間の間隔を置いて２回ｉ．ｎ．免疫化した１４日後のマウスの肺分泌物（７７日目）のＩｇＡ応答を示す。図１２Ｂは、図１２Ａおよび例６に記載のイスコムでｉ．ｎ．免疫化したマウスの異なる臓器（肺、上気道、および生殖器官）からの分泌物（１１３日目）中のｇＤ２に対するＩｇＡ応答を示す。図１２Ｃは、図１２Ａに記載のｉ．ｎ．免疫化後の血清（７７日目）中のｇＤ２に対するＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ）を示す。図１３Ａ。３、１０または２０μｇのイスコムで７週間置いて２回ｉ．ｎ．免疫化したマウスのマイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）（Ｍｍ）に対する、ＥＬＩＳＡで測定した総血清抗体応答。血清は、最初の免疫化後の２、４および７週間後、および追加免疫２週間後に試験した。図１３Ｂ。Ｍｍ抗原を含有するイスコムの３つの異なる投与量で、７週間置いて２回経鼻免疫化したマウスから、２週間後に採取したマイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）（Ｍｍ）に対する、ＥＬＩＳＡで測定した血清中のＩｇＡ応答。図１３Ｃ。Ｍｍ抗原を含有するイスコムの３つの異なる投与量で、２回経鼻免疫化したマウスから、２週間後に採取したマイコプラズマ・ミコイデス（Mycopl asma mycoides）（Mm）に対する、ＥＬＩＳＡで測定した肺分泌物中のＩｇＡ応答。図１３Ｄ。マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）（Ｍｍ）抗原に対するウェスタンブロッティング解析：レーンＡ、Ｍｍ抗原を含有するイスコムで７週間置いて２回目の経鼻（ｉ．ｎ．）免疫化を行なった後の２週間目のマウスから得た肺分泌物による検出。レーンＢ、レーンＡに記載のｉ．ｎ．免疫化したマウスの血清。レーンＣ、レーンＡに記載のスケジュールのように皮下（ｓ．ｃ．）免疫化したマウスの血清。図１４Ａ。経口予防接種後のロタウイルス（ＲＶ）に対する特異的ＩｇＧ血清抗体。群の平均は、１元配置分散分析で解析した。ＲＶ−予防接種群対ＰＢＳ− 予防接種群； ■ ＲＶ／ＩＳＣ−マトリックス−予防接種群ＲＶ−予防接種群 ◆ ＰＢＳ／ＩＳＣ−マトリックス予防接種群図１４Ｂ。イスコム−マトリックスアジュバントを有するおよび有さないロタウイルス（ＶＲ）ワクチンによる経口予防接種後、および以後の２１日目の抗原投与感染後の、時間の経過に伴う末梢血中のＣＤ４⁺細胞のリンパ球亜集団（パーセント）。群の平均は、１元配置分散分析で解析した。図１４Ｃ。イスコム−マトリックスアジュバントを有するおよび有さないロタウイルス（ＶＲ）ワクチンによる経口予防接種後、および以後の２１日目の抗原投与感染後の、時間の経過に伴う末梢血中のＣＤ４５Ｒ⁺細胞のリンパ球亜集団（パーセント）。群の平均は、１元配置分散分析で解析した。図１４Ｄ。抗原投与感染後のウイルス排泄。図１４Ｅ。予防接種および以後の２１日目の抗原投与感染後の血液中の特異的ＩｇＡ産生細胞。 ■ ＲＶ／ＩＳＣ−マトリックス（ＲＶ抗原なし） ◆ ＲＶ／イスコム−マトリックスＲＶ（不活性化ウイルス）図１５Ａ。ＨＲＳＶイスコムまたは不活性化ウイルスによる、６週間置いた２回の経鼻または２回の皮下免疫後の、ＥＬＩＳＡで測定した呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するマウスのＩｇＭ血清抗体力価（幾何平均力価および９５％信頼限界）。１回目の放血（１）：最初の免疫化の２週間後。２回目の放血（２）：最初の免疫化の５週間後。３回目の放血（３）：追加免疫の１週間後。群の免疫化は、本文６４頁に記載されている。図１５Ｂ。本文６４頁に記載のＨＲＳＶイスコムまたは不活性化ＨＲＳＶによる、６週間置いた２回の経鼻または２回の皮下免疫化後の、ＥＬＩＳＡで測定した呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するマウスのＩｇＧ血清抗体力価（幾何平均および９５％信頼限界）。１回目の放血（１）：最初の免疫化の２週間後。２回目の放血（２）：最初の免疫化の５週間後。３回目の放血（３）：追加免疫の１週間後。４回目の放血（４）：追加免疫の３週間後。図１５Ｃ。本文６４頁に記載のＨＲＳＶイスコムまたは不活性化ＨＲＳＶによる、経鼻または皮下免疫化後の、ＥＬＩＳＡで測定したＲＳＶに対する血清ＩｇＧサブクラス応答。血清を得るための放血は、図１５Ｂに記載のように行なった。図１５Ｄ。本文（６４頁）に記載の免疫スケジュールに従ってＥＬＩＳＡで測定した追加免疫後の２、１５および２２週間目の呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するマウスの肺分泌物のＩｇＡ抗体力価。肺は、例２に記載のように採取し、分泌物を抽出した。図１５Ｅ。種々の臓器（すなわち、上気道、肺、生殖器官および小腸）からの分泌物中のＲＳＶに対するＩｇＡ抗体応答。分泌物は、例２に記載のように２回目の免疫化後２週間目に、種々の臓器から抽出した。免疫化スケジュールは、本文６４頁に記載される。表Ｉ。総抗体応答およびサブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ経鼻免疫化に関して、ＥＬＩＳＡで解析した、マウスの２回目の経鼻免疫化後の２週間後の、ＯＶＡに対する血清抗体応答（ｌｏｇ¹⁰力価）。表II。ＩｇＧイソタイプおよびＩｇＧ１とＩｇＧ２ａサブクラスに関する、マウスの２回目の経鼻免疫化後の、ｒＣＴＢに対する血清抗体応答の比較（ｌｏｇ¹⁰ 力価）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/235 39/215 39/245 39/235 39/39 39/245 37/64 39/39 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ロブグレン，ベングトソン，カリンスウェーデン国エス―752 40 ウプサラ，リンドスベルグスガタン８シー (72)発明者エクストロム，ジルスウェーデン国エス―740 50 アルンダ, クレブ

Claims

【特許請求の範囲】１．ワクチンの製造、および経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の免疫刺激組成物の製造に使用するための、イスコム（iscom）および／またはイスコムマトリックスと粘液ターゲティング分子とを含んでなる免疫原性複合体。２．請求の範囲第１項記載の免疫原性複合体であって、少なくとも１つのグリコシド、少なくとも１つの脂質、およびａ）局所的に粘膜に投与された時、リンパ組織をターゲティングし免疫応答を誘発する物質から選択される、少なくとも１つの粘液ターゲティング分子、およびｂ）おそらく、粘膜を通過して容易にリンパ組織に到達できない、薬学的免疫作用性または免疫物質から選択される１つのパッセンジャー抗原、を含んでなる、ワクチンの製造、および経口、経鼻、尿生殖器、および／または直腸投与用の上記複合体。３．請求の範囲第２項記載の免疫原性複合体であって、これらはイスコム複合体であり、粘液ターゲティング分子および／またはパッセンジャー抗原はイスコム複合体体に取り込まれたかまたは最終イスコム複合体に結合または混合していることを特徴とする、上記複合体。４．請求の範囲第３項記載の免疫原性複合体であって、複合体はイスコムマトリックスであり、パッセンジャー抗原は、最終イスコム複合体に結合または混合していることを特徴とする、上記複合体。５．請求の範囲第２〜４項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、脂質は、ステロール、リン脂質、および細胞結合性成分（例えば、ガングリオシドＧＭＩおよびフコース化血液型抗原のような糖脂質）の受容体を含有する脂質、とから選択されることを特徴とする、上記複合体。６．請求の範囲第２〜５項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、複合体は少なくとも１つのアジュバントを含むことを特徴とする、上記複合体。７．請求の範囲第２〜６項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子および／またはパッセンジャー抗原および／またはアジュバントは、イスコムおよび／またはマトリックス複合体と混合されることを特徴とする、上記複合体。８．請求の範囲第２〜７項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子および／またはパッセンジャー抗原は、細菌、ウイルスまたは寄生体などの微生物から得られることを特徴とする、上記複合体。９．請求の範囲第２〜７項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子およびパッセンジャー抗原は、遺伝子生成物または合成抗原であることを特徴とする、上記複合体。１０．請求の範囲第２〜７項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子およびパッセンジャー抗原は、ペプチド、タンパク質、炭水化物および炭水化物構造（すなわち、糖脂質または糖ペプチドもしくは糖タンパク質）であることを特徴とする、上記複合体。１１．請求の範囲第２〜１０項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子は、粘膜、特に肺、上気道、小腸および尿生殖器の粘膜に感染する微生物に由来することを特徴とする、上記複合体。１２．請求の範囲第２〜１１項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、粘膜ターゲティング分子またはパッセンジャー抗原は、インフルエンザウイルス、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスからの、またはアデノウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルスのような非エンベロープウイルスからの、エンテロウイルスやアストロウイルスのようなピコルナウイルス科からの、エンベロープまたは外タンパク質、例えば、アデノウイルスからのヘキソンやペントン、マイコプラズマの膜タンパク質および細菌のヘモフィルス（haemophilus）からの綿毛；細菌の外タンパク質、コレラ毒素、およびそのサブユニットＢ（ＣＴ、ＣＴＢ）、または大腸菌（E．coli）の熱不安定性毒素およびそのサブユニットＢ（ＬＴ、ＬＴＢ）、およびヒトまたは動物（例えばブタ）からの大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Schigella）、およびクラミジアの綿毛（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｋ９８１−Ｂ）、およびマイコプラズマ（Mycoplasma）の膜タンパク質、から選択されることを特徴とする、上記複合体。１３．請求の範囲第２〜１２項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、パッセンジャー抗原は、種々のヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１および２、ウシヘルペスウイルス１を含む）、ピコルナウイルスのｇＢおよびｇＤ、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０およびｇｐ１６０またはＨＩＶ−２ならびに他のレトロウイルス、ヘパドナウイルスの対応するタンパク質、例えばＨＩＶ−１のＧＰ１２０／１６０またはＨＩＶ−２の対応する抗原、ラブドウイルス、ポックスウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、カルジウイルス、トガウイルス、フラバウイルス、イルジオウイルス、ビルナウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、オルトミキソウイルス、パラミキソウイルス、パルボウイルス、ポポバウイルス、ピコルナウイルス、カルシウイルス、アストロウイルスの対応するｇ−タンパク質、狂犬病ウイルス、またはサルモネラ、大腸菌（E．coli）、赤痢菌（Shigella）のような細菌、クラミジアまたはマイコプラズマ、またはエキノコッカス（Ecchinococcus）、線虫、吸虫、住血吸虫、原生動物（例えば、トキソプラズマ、トリポノソーマ・レイクマニア（Tryponosoma Leichmania））のＧ−タンパク質（粘膜ターゲティング分子は、細菌またはウイルス起源、例えば細菌起源でもよい）から選択されることを特徴とする、上記複合体。１４．請求の範囲第２〜１３項までのいずれか１項に記載の免疫原性複合体であって、パッセンジャー抗原は、粘膜に投与された時に自発的には免疫応答を引起こさない組換えワクチン抗原であることを特徴とする、上記複合体。