ES2210495T3

ES2210495T3 - Iscom o matriz de iscom que comprende una sustancia dirigida especificamente a las mucosas y un antigeno.

Info

Publication number: ES2210495T3
Application number: ES97905541T
Authority: ES
Inventors: Bror Morein; Karin Lovgren Bengtsson; Jill Ekstrom
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2017-02-20
Also published as: AU2238597A; EP0889736B1; AU719084B2; DE69726712D1; EP0889736A1; CA2247522A1; CA2247522C; SE9600647D0; WO1997030728A1; DE69726712T2; NZ331403A; ATE255905T1; JP2000504746A; US20020131982A1; US6607732B2; DK0889736T3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN COMPLEJO INMUNOGENICO QUE COMPRENDE UN INMUNOESTIMULADOR (ISCOM) Y/O UNA MATRIZ DE INMUNOESTIMULADOR (ISCOM), Y MOLECULAS DIRIGIDAS HACIA EL MUCUS, PARA UTILIZACION EN LA PREPARACION DE VACUNAS Y COMPOSICIONES ESTIMULANTES DEL SISTEMA INMUNITARIO, DE ADMINISTRACION ORAL, NASAL, UROGENITAL Y/O RECTAL. DICHO COMPLEJO INMUNOGENICO PUEDE COMPRENDER AL MENOS UN GLICOSIDO Y AL MENOS UN LIPIDO Y A) AL MENOS UNA MOLECULA DIRIGIDA HACIA EL MUCUS, ELEGIDA ENTRE SUSTANCIAS QUE SE DIRIGEN HACIA EL TEJIDO LINFATICO E INDUCEN UNA RESPUESTA INMUNITARIA CUANDO SE ADMINISTRAN LOCALMENTE SOBRE MEMBRANAS MUCOSAS; Y B) OPCIONALMENTE, TAMBIEN UN ANTIGENO TRANSPORTADO, ELEGIDO ENTRE SUSTANCIAS INMUNITARIAS O FARMACOLOGICAMENTE INMUNITARIAS, QUE NO ALCANZAN FACILMENTE EL TEJIDO LINFATICO A TRAVES DE LAS MEMBRANAS MUCOSAS.

Description

Iscom o matriz de iscom que comprende una sustancia dirigida específicamente a las mucosas y un antígeno.

La presente invención se refiere al uso de un complejo inmunógeno en la forma de iscom (immune stimulating complex) y/o matriz de iscom, y moléculas que hacen diana en las mucosas, para usar en la preparación de vacunas y composiciones estimulantes del sistema inmunitario, para administrar por vía oral, nasal, urogenital y/o rectal.

Desde hace muchos años han estado disponibles estrategias de inmunización. No obstante, ha habido una notable carencia de éxito en la vacunación para regular enfermedades de las mucosas. Descubrimientos anteriores indican que la presentación antigénica de antígenos que no se replican a través de la superficie de las mucosas es un medio ineficaz de estimulación de la respuesta inmunitaria y de que se necesitan estrategias nuevas con objeto de generar respuestas inmunitarias eficaces y protectoras mediante esta vía (Novel vaccination strategies for the control of mucosal infection, Alan J. Husband, Vaccine, Vol. 11. número 2, 107-112). La vacunación con microorganismos vivos atenuados ha sido el único modo posible de protección contra enfermedades de las mucosas.

Se ha puesto de manifiesto en la actualidad, inesperadamente, que iscoms que contienen moléculas que hacen diana en las mucosas, o antígenos, y matrices de iscom mezclados con ellos, dan lugar a altos títulos de anticuerpos cuando se administran a mucosas. Además, los iscoms que contienen tales moléculas que hacen diana en las mucosas, junto con antígenos que no inmunizan fácilmente mediante el modo de administración a las mucosas (denominados antígenos pasajeros), dan lugar a una respuesta inmunitaria incluso en varias otras mucosas alejadas del sitio de administración. Las moléculas que hacen diana en las mucosas poseen la capacidad de tener como objetivo el sistema linfático, después de administración a las mucosas. Ellas pueden ser antígenos que ayudan a los antígenos pasajeros a inducir una respuesta inmunitaria y con frecuencia, inducen también una respuesta inmunitaria a ellos mismos. En una mezcla compleja de antígenos, algunos pueden poner de manifiesto capacidad para ser moléculas de diana para moléculas pasajeras así como también para ellas mismas. La estrategia de usar una mezcla de dos o más componentes lleva consigo también la posibilidad de modular la respuesta inmunitaria que sigue a las mismas así como a antígenos pasajeros. El efecto modulador es particularmente prominente en formulaciones de iscom con moléculas que hacen diana ejemplificadas por la mejora de IgG2a, así como también la capacidad de los iscoms de mejorar la conversión de la respuesta de anticuerpos de las mucosas a IgA del moco, que es lo mejor ilustrado por el efecto de intensificación sobre la respuesta de IgA a CTB. La matriz de iscom sencillamente añadida a otros antígenos y mezclada como una entidad separada posee también propiedades similares pero con frecuencia son menos sobresalientes.

Fundamento

Se ha indicado que estructuras que contienen lípidos y que contienen saponinas de quillaja tales como los iscoms (complejos inmunoestimulantes) y matrices de iscoms, son portadores efectivos de sustancias o complejos de moléculas farmacológica y/o inmunógicamente activas. Véase, por ejemplo, el documento WO-A1-90/03184. En muchos casos, se ha demostrado que la inmunización por vía parenteral de animales de laboratorio con estructuras que incorporan antígenos diferentes, da lugar a una respuesta inmunitaria más fuerte frente a los antígenos, que la que se obtiene después de inmunización con el antígeno o antígenos correspondientes en forma libre.

Está documentado que los iscoms son portadores eficaces para intensificar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas y grandes (antígenos) usando la administración parenteral. Se ha mostrado que los iscoms con antígenos incorporados, tales como proteínas, según el documento EP O 109 942, y los iscoms que son portadores de moléculas pequeñas, tales como antígenos pequeños y oligopéptidos, según el documento EP O 180 564, inducen eficazmente una respuesta inmunitaria hacia moléculas tanto grandes como pequeñas.

Se ha puesto de manifiesto también que un antígeno proteínico, tal como la ovoalbúmina (OVA), en iscoms, es capaz de induir una respuesta inmunitaria, incluso después de inmunización por vía oral, que incluye la formación de anticuerpos, células T cooperadoras bajo restricción de clase 2 MHC y células T citotóxicas (CTL) (células matadoras) bajo restricción de clase 1 de MHC, pero que se requieren varias inmunizaciones (y dosis irrealmente altas) (Morein, B., Lövgren, K., Rönnberg, B. Clin. Immunother. 3, 461.75, 1995). Por el contrario, después de la administración de dosis altas (cientos o varios cientos de \mug por dosis de ovoalbúmina, por vía oral, en forma libre, es decir, sin incorporar en icom), o bien no hay respuesta inmunitaria o hay una respuesta baja. La ovoalbúmina libre da lugar a tolerancia y supresión de la inmunización subsiguiente por vía parenteral.

Las matrices de iscoms (y los iscoms) tienen una actividad adyuvante acumulada, bien documentada, que induce una respuesta inmunitaria con mediación de anticuerpos y con mediación celular. Las respuestas inmunitarias con mediación celular bajo restricciones de MHC tanto de clase 1 como de clase 2, son inducidas por los iscoms.

En comparación con la inmunización parenteral, la respuesta inmunitaria que sigue a la administración oral e intranasal de iscoms ha sido baja (Mowat et al., Immunology 72, 317-322 (1991); Mowat et al., Immunology, 80, 527 (1993)). Además, al emplear inmunizaciones por vía intranasal y oral, ciertos antígenos que están incorporados en iscoms, tales como la proteína g del virus de la rabia o gp 120/160 del HIV-1, no han atraido una respuesta inmunitaria medible en la forma de respuesta de anticuerpos séricos medida por el ensayo ELISA. Esto es debido, probablemente, al hecho de que solamente un número pequeño de las partículas administradas por vía oral o intranasalmente pueden penetrar en la capa mucosa, ser absorbidas por la barrera del epitelio intestinal o células M de parches de Peyers (Peyers patches) y ponerse en contacto localmente con el sistema inmunitario.

Los problemas que implican una absorción limitada e insuficiente presentación de antígeno, son causados por la incapacidad de los antígenos a penetrar la barrera mucosa y células que presentan antígenos diana (target antigen presenting cells) (APC), tejido linfático y/o la capa epitelial, por ejemplo parches de Peyer (PP) o Lamina propria (LP) en los intestinos, o tejidos linfáticos en la región amigdalar de la faringe u otras superficies revestidas por mucosas. La respuesta inmunitaria de las mucosas solamente ocurre, por lo general, cuando la administración a las mucosas se lleva a cabo localmente. Los iscoms, a semejanza de otras estructuras presentadas con antígenos, poseen una aptitud limitada para penetrar en la mucosa y, en grados variables, una aptitud limitada para fijarse y ser absorbidos por el epitelio, o para alcanzar y ser absorbidos por células M del PP para después de esto ser dirigidas a células presentadas con antígeo (APC) y estimular poblaciones de linfocitos. Incluso cuando la administración se lleva a cabo en la mucosa nasal, la objetivación y la absorción de antígeno por APC y la inducción de la respuesta inmunitaria es insuficiente al usar la tecnología actual. Se han usado CT y LT como moléculas que hacen diana en las mucosas pero debido a la alta toxicidad estas moléculas no son adecuadas para usar en el hombre ni en animales. La subunidad B de estas toxinas no son tóxicas sino mucho menos efectivas y por tal razón no son adecuadas desde el punto de vista práctico para uso profiláctico o clínico. Por tanto, existe la necesidad de mejores sistemas de presentación de antígenos destinados a usar mediante administración oral o nasal. Una razón importante de porque existe esta necesidad de mejores sistemas de presentación de antígenos, eficaces para administración por medio de las membranas mucosas, es que este tipo de administraciones induce en las membranas una respuesta inmunitaria local. Aun cuando es sabido que existen sistemas linfáticos comunes en que la inmunización, por ejemplo, en el tubo digestivo, da como resultado una respuesta inmunitaria en superficies de las mucosas alejadas, por medio de tejido linfático asociado al tubo intestinal (GALT) o inmunización en el tracto respiratorio, con el resultado de una respuesta inmunitaria en otras superficies de las mucosas a través de tejido línfático asociado a los bronquios (BALT), estas respuestas son generalmente bajas y las moléculas que hacen diana en las mucosas o sistemas que presentan antígenos que favorecen el hacer objetivo en mucosas alejadas, no está especialmente definido. Muchas infecciones tienen lugar por medio de membranas mucosas en lugares tales como los pasadizos respiratorios, los tractos intestinales o el tracto genital, y existe una primera barrera de defensa inmunitaria en las membranas mucosas. Además, ambas administraciones, la oral y la nasal, por el contrario a la administración parenteral, mediante inyección, tienen la ventaja de no necesitar personal entrenado desde el punto de vista médico.

K. Scheepers, H. Becht (Med. Microbiol. Immuno (1994) 183: 265.278) describen inmunización con iscoms que comprenden antígeno nucleoproteínico del virus de la influenza A. Los iscoms comprenden también un lipopolisacárido bacteriano que hace anfifático al antígeno con objeto de integrarlo en los iscoms. La administración gastrointestinal no proporciona respuesta de anticuerpos ni inmunidad protectora. La administración ha sido ensayada también por vía oral

Sumario de la invención

La invención se refiere al uso de un complejo inmunógeno en forma de iscom y/o matriz de iscom y moléculas que hacen diana en las mucosas, para usar en la preparación de vacunas y composiciones estimulantes del sistema inmunitario, para administración oral, nasal, urogenital y/o rectal, según la reivindicación 1.

Se ha puesto de manifiesto que con el uso de la reivindicación 1 es posible proporcionar anticuerpos contra el antígeno pasajero en el suero, respuesta inmuntaria de IgA local en secreciones de la membrana local en el sitio de la administración y también en membranas situadas en otros lugares, en particular en el tracto respiratorio, en los intestinos y en el tracto genital.

Descripción detallada

Un aspecto de la invención se refiere al uso de complejos de iscom que contienen al menos una molécula que hace diana en las mucosas y un antígeno pasajero, para preparar una vacuna o una composición que modula el sistema inmunitario dirigida contra esa molécula y/o ese antígeno.

El iscom contiene al menos un glicósido, al menos un lípido y al menos un tipo de sustancias antigénicas, en especial proteínas y péptidos. Estos complejos intensifican la inmunogenicidad de los antígenos administrados y pueden contener una más sustancias de inmunomodulación (adyuvante-activa) tal como se ha descrito en los documentos EP 0 109 942, EP 0 242 380 B1 y EP 0 180 564 B1.

Debido a que ciertos antígenos no requieren integración física en la partícula de iscom, se obtienen asimismo grandes ventajas de la administración local a las mucosas usando matriz de iscom mezclada con un antígeno pasajero, en entidades separadas. Tal antígeno es ejemplificado por gB2 del virus Hepes simplex 2, que induce una respuesta inmunitaria por administración a las mucosas, pero la respuesta inmunitaria es mejorada considerablemente por ambos, la matriz y el iscom.

Las matrices contienen al menos un glicósido que es una sustancia adyuvante-activa y al menos un lípido. Las matrices poseen un efecto inmunoestimulante sobre la administración junto con sustancias antigénicas, véase el documento EP 0 436 620 B1. Las matrices pueden tener varias clases de componentes inmunoactivos, inmunointensificadores (véase el documento EP).

Según la invención, los complejos pueden estar compuestos por un complejo de iscom con una molécula que hace diana en las mucosas y/o molécula(s) pasajera(s) (que están) integradas en el complejo de iscom o bien están unidas a un complejo de iscom ya hecho.

También pueden estar constituidos por matrices de iscom a las que la molécula que hace diana en las mucosas y los antígenos pasajeros pueden estar copulados químicamente o unidos mediante interacciones hidrófobas, haciéndolos iscom o matrices de iscom que son entidades separadas mezcladas con la fórmula del antígeno.

Según la invención estos complejos pueden ser usados para preparar vacunas y agentes inmunoestimulantes para modos de administración oral, nasal, o rectal, u otros tipo de administración local a las mucosas. Estos complejos inducen una respuesta inmunitaria en otras membranas mucosas distintas de aquellas en las que son administrados, tales como los urogenitales, los intestinos, el tracto respiratorio superior y los pulmones, así como también anticuerpos en circulación.

Según la invención, estos complejos modulan también la respuesta inmunitaria incluyendo IgA específica, fuerte, en varias secreciones de las mucosas e incluyendo una respuesta sérica de IgG2a aumentada, lo que indica una participación del interferon-gamma y una respuesta de células T cooperadoras 1.

Los iscoms, a semejanza de las matrices de iscom, pueden, según la invención, modular respuestas inmunitarias mediadas con anticuerpos y las respuestas inmunitarias mediadas con células, que se diferencian de la inmunomodulación inducida por un modo de inmunización parenteral. La administración local a las mucosas da lugar también a una respuesta inmunitaria contra otros antígenos o determinantes antigénicos. Desde este punto de vista, surgen nuevas posibilidades de inducir una respuesta inmunitaria que no es reconocible en la inmunización parenteral, por ejemplo contra estructuras de carbohidratos.

Es de interés, también, usarlos en la preparación de vacunas destinadas a inmunoterapia o para el tratamiento de alergias, por ejemplo, mediante desensibilización mediante inmunoterapia. También son útiles para romper tolerancias a antígenos inducidas por CTB o LTB u otras condiciones de tolerancia ocasionadas mediante la aplicación local.

Las moléculas que hacen diana en las mucosas y los antígenos pasajeros están derivados de microorganismos tales como bacterias, virus o parásitos, en particular los mencionados en el documento EP 0 109 942 B1.

Las moléculas que hacen diana en las mucosas son sustancias que hacen blanco en el tejido linfático induciendo una respuesta inmunitaria por administración local a las mucosas en diversas superficies de las mucosas así como también una respuesta inmunitaria sistémica. En particular, están destinadas sustancias antigénicas tales como proteínas y péptidos. Estas sustancias pueden ser glucopéptidos.

Las moléculas que hacen diana en las mucosas son de origen bacteriano o viral, tales como la toxina bacteriana del cólera y su subunidad B (CTB), o la toxina de E-coli, termolábil, y su subunidad B (LTB). Otros ejemplos son proteínas de la cubierta de virus o proteínas externas de bacterias, que pueden penetrar las membranas mucosas e infectar los pasadizos respiratorios, tales como el virus de la influenza, el virus sincitial respiratorio (RSV), Coronavirus, virus herpes, poxvirus y fimbrias procedentes de bacterias tales como hexones y pentones procedentes de adenovirus, virus Norwalk, rotavirus y enterovirus de la familia de los picornaviridae y astrovirus. Otros ejemplos de antígenos utilizables son las proteínas de la cubierta de virus y bacterias que infectan los intestinos, tales como virus de la influenza, adenovirus, reovirus, coronavirus y fimbrias procedentes de Escherichia coli (K88, K99, K981-B), Shigella, Clamydia y proteínas de membrana procedentes de Mycoplasma.

Tales microorganismos pueden ser los virus del sarampión, del sarampión Germano y virus de la varicela; Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma mucoides, Chlamydia pneumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio chloera, Salmonella typhy, Streptococcus mutans, Helicobacter pylori, Streptococcus pyogenes, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tubercolisi, Yersinia pestis, Salmonela tiphy, Borrelia burgdorferi, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparium, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Gardia lambiia y Entamoeba histolytica; y Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum, Pneumococcus pneumonia y Haemophilus influenzae.

Los antígenos pasajeros pueden escogerse entre el grupo de sustancias antigénicas farmacológicas que son relevantes para la inmunización y que penetran las membranas mucosas menos eficazmente, por ejemplo gB y gD de varios Herpes virus, incluyendo Herpes Simplex 1 y 2, virus del herpes bovino 1, picorna virus, gp 120 y gp 160 del HIV-1 o la correspondiente proteína de la cubierta del HIV-2, así como procedentes de otros retrovirus, hepadna virus, por ejemplo, poxvirus, adenovirus, cardivirus, togavirus, flavavirus, iridiovirus, birnavirus, parvovirus, popovavirus, picornavirus, calicivirus, astrovirus, arenavirus, bunyavirus, ortomyxovirus, paramyxovirus, proteína G del virus de la rabia, o procedente de bacterias tales como salmonella, E. coli, Shigella, Chlamydia, ricketsia, bartonella o Mycoplasma. También pueden ser diversos productos recombinantes o antígenos sintéticos que pierden o no su capacidad después de clonación o que aumentan su capacidad de inducir una respuesta inmunitaria mediante la incorporación en iscom con moléculas que hacen diana en las mucosas o con matrices, dado que hacen diana en el moco para el tejido linfático cuando se aplican sobre membranas mucosas.

En aquellos casos en que los complejos son iscoms, pueden ser preparados según se describe en la patente europea EP 0 109 942 B1. Para ello, se mezclan virus, micoplasmas, bacterias, parásitos y células animales, que contienen antígenos o determinantes antigénicos, en particular proteínas o péptidos o moléculas aisladas que poseen regiones hidrófobas o anfifílicas, con uno o más agentes de solubilización, después de lo cual los antígenos o determinantes antigénicos se separan del agente de solubilización en presencia de éste, o se separa del agente de solubilización y se hace pasar directamente a una solución de un glicósido, que contiene colesterol, fosfolípidos y uno o más glicósidos con dominios hidrófobos o hidrófilos, en una concentración de al menos un mínimo de la concentración micelar crítica, después de lo cual se forme un complejo proteínico y luego se aísla y se purifica.

Puede partirse de microorganismos totales que contienen antígeno pasajero, y/o moléculas que hacen diana en las mucosas, por lo que pueden añadirse moléculas que hacen diana en las mucosas o antígenos pasajeros que son preparados con mayor o menor pureza, son sintéticos o se preparan usando una técnica de DNA híbrido. El aditivo puede añadirse en cualquier fase parcial, como se explica en el documento EP 0 109 942 B1, en especial en las páginas 4-8. El procedimiento operatorio preferido consiste en incorporar el aditivo antes de añadir los lípidos y los glicósidos.

Además, se puede usar una base constituida por moléculas que hacen diana en el moco o antígenos pasajeros más o menos purificados, sintetizados químicamente o preparados usando una técnica de DNA híbrido según el documento EP 0 109 942 B1, en las páginas 4-8. En este caso es apropiado añadir los lópidos antes de que el complejo haya sido aislado y purificado, según se describe en la patente europea EP 0 242 380 B1, del Solicitante.

Los lípidos utilizados son particularmente del tipo descrito en la patente EP 0 109 942 B1, del Solicitante, en particular en la página 3, y en la patente EP 0 436 620 B1, página 7, líneas 7-24. Se han utilizado en particular esteroles tales como el colesterol y fosfolípidos tales como la fosfatidiletanolamina y lafosfatidilcolina GM1.

Los lípidos pueden incluir también sustancias que contienen lípidos que se fijan a componentes que forman células, por ejemplo glicolípidos tales como el receptor de la tóxina del cólera, el gangliósido GM1, y antígeno de grupo sanguíneo fucosado. Los componentes que se fijan a las células pueden actuar después como moléculas que hacen diana en el moco y unirse a las sustancias que contienen lípidos, mezclando, sencillamente, con complejos que los contienen.

También es posible preparar en primer lugar partículas de iscoms a partir de una moléculas que hace diana en el moco o un antígeno pasajero y después añadir los antígenos pasajeros y moléculas que hacen diana en el moco, respectivamente, usando métodos habituales de conjugación, de preferencia métodos químicos de copulación, según se describe en las patentes europeas del Solicitante EP 0 180 564 B1 y EP 0 436 620 B1.

La base podría ser también matrices que se preparan solubilizando al menos un esterol en un agente de solubilización, añadiendo el glicósido o las saponinas y los otros lípidos, después de lo cual el agente de disolución puede separarse, si se desea, es decir, si no puede ser aceptado en el producto final. Las matrices, habitualmente, son transferidas a una solución acuosa en la que las partes individuales no son capaces de disolverse. El agente de solubilización puede ser separado, por ejemplo, mediante filtración en gel, ultrafiltración, diálisis o electroforesis. Luego, las matrices pueden ser purificadas de un exceso de esterol y saponina por medio de, por ejemplo, centrifugación a través de un gradiente de densidad o mediante centrifugación en gel.

El agente de solubilización puede ser cualquiera de los citados en el documento EP 0 436 629 B1, página 5, líneas 24-45. Los otros componentes y el procedimiento de preparación se describen también en este documento.

La molécula que hace diana en el moco y el antígeno pasajero pueden unirse a las matrices usando métodos de conjugación-unión actuales, véase anteriormente. Es posible también mezclar moléculas de adyuvante y/o antígenos pasajeros con una molécula de iscom en la que el antígeno pasajero o la molécula adyuvante ha sido integrada, o con iscom y/o complejos de matricess a los que el se ha concetado el antígeno pasajero o la molécula que hace diana en el moco. Es posible también mezclar ambos, la molécula que hace diana en el moco y el antígeno pasajero, con un complejo o matriz de iscom en una entidad separada, en cuyo caso el complejo de iscom contiene una molécula antigénica diferente.

Los glicósidos usados en la preparación pueden ser los descritos en el documento EP 0 109 942 B1, página 4, último párrafo. El método preferido consiste en usar saponinas tales como triterpenosaponinas, en particular Quil A o componentes definidos de ella, en particular los descritos en la patente europea del Solicitante EP 0 436 620 B1, página 4, líneas 19-46. Estos pueden ser QHA, QHB, QHC u otras composiciones de Quil A, tal como 703. Los glicósidos son adyuvantes. O componentes tales como los descritos por Kensil, Kersten o Dalsgaard (Kensil, C.R., Patel, U., Lennick, M. y Marciani, D., J. Immunol, 146, 431-437, 1991; Kersten, G.G.A., Spiekstra, A., Beuvery, E.C. y Commelin, D.J.A. BBA1062, 165-171, 1991; o patente WO95/09179 Dalsgaard). También es posible incorporar otros adyuvantes o componentes que modulan la respuesta inmunitaria, distintos de los glicósidos de los iscoms o de las matrices según se menciona en el documento EP 0 436 620 B1.

Ejemplos de tales adyuvantes se proporcionan por Cox et al., en CRS, 1992. El método preferido consiste en usar MDP, MTP y y avridina.

Si la molécula o moléculas que hacen diana en las mucosas o el antígeno o antígenos pasajeros carecen de grupos hidrófobos o anfipáticos, pueden añadirse de tal modo que el antígeno pueda unirse a la partícula de iscom. Ejemplos de tales grupos se encuentran en el documento EP 0 242 380 B1 página 9 y en el documento EP 0 436 628 B1, página 6, línea 33 a página 7 línea 6, en los que se describen los métodos de conexión. Pueden ser lípidos como en el Ejemplo 2 que figura más adelante.

Las cantidades relativas de colesterol, lípidos y antígenos que pueden usarse se aprecian en las patentes, antes citadas, EP 0 109 942 B1, EP 0 180 564 B1, EP 0 242 380 B1 y EP 0 436 620 B1.

De las moléculas bacterianas que hacen diana en el moco, son las mas preferibles la toxina del cólera, sus subunidades tales como B (CTB) y la toxina termolábil de E. coli con sus subunidades tales como B (LTB).

El cólera es una de las enfermedades más peligrosas de todas las enfermedades diarreicas y está ocasionada por la bacteria Vibrio cholera 0 grupo 1. Estas bacterias forman colonias en el hombre en el intestino delgado donde secretan una proteína de una exotoxina conocida como la toxina del cólera.

Enfermedades semejantes son causadas por las denominadas bacterias i "enterotóxicas" (ET) de E. coli aún cuando estos síntomas son habitualmente más suaves y son ocasionados por una toxina termolábil (LT) que es similar a la toxina del cólera (CT). Estas toxinas son tan semejantes que se unen al mismo receptor.

Las estructuras de CT y LT están bien definidas considerando estructura y función. Son proteínas de oligómeros que contienen una parte que se une al receptor de la toxina del cólera, a saber, la subunidad B, que a su vez contiene cinco subentidades cada una de las cuales tiene un peso molecular aproximado de 11.600, y poseen la forma de anillos pentámeros. Las subunidades A son polipéptidos de escisión proteolítica con un peso molecular de aproximadamente 28.000 que constan de dos fragmentos unidos por disulfuro. El fragmento mayor A1, contiene la actividad enzimática de la toxina mientras que el fragmento menor A2 se fija al fragmento A1 para el anillo B5. CT se une con fuerte afinidad a una clase de receptores que existen sobre la superficie de la denominada membrana de borde de cepillo (brush-border) del intestino delgado y a la membrana plasmática de la mayor parte de las células de mamífero también. Los receptores están compuestos del gangliósido GM1.

Además, LT se une asimismo a una glicoproteína sin denominar (Holmgren et al., Infect. Immun., 38, 424-433 (1982). Estas proteínas pueden incorporarse también en iscoms o unirse a iscoms o matrices, sirviendo de moléculas de unión a la LT.

El gangliósido GM1 y otros receptores de moléculas que hacen diana en el moco de tipo lípido o hidrófobo, pueden incluirse en la región que contiene lípido de la partícula de iscom. Incluso puede ser una parte de la composición de lípido de las matrices.

Cuando el receptor está incorporado en la partícula de iscom o la partícula de la matriz de iscom, puede estar mezclado con el ligando correspondiente que se une al receptor incorporado en la partícula. En los casos en que el portador o receptor del antígeno pasajero sea un gangliósido, el antígeno puede unirse a un receptor tal mediante un sencillo procedimiento de mezcla. Este procedimiento se explica en el Ejemplo 1 que figura más adelante. De modo semejante, otros receptores se unen a su antagonista.

La toxina del cólera contiene la subunidad A, que ejerce actividad de toxina, y la subentidad B que fija la toxina a la membrana plasmática sobre la célula por medio de un glicolípido (GM1). Para reducir la toxicidad, habitualmente sólo la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) se usa como antígeno vacunal para producir la respuesta imunitaria. La subunidad B no es tóxica e induce una respuesta inmunitaria relativamente débil en comparación con CT en inmunización local intranasal y parenteral, por ejemplo inmunización subcutánea o intramuscular. En otras palabras, la subentidad B posee baja actividad adyuvante. La CTB está disponible también como un producto de DNA recombinante. (rCTB) (documento EP 368 819).

Es difícil obtener rendimientos físicos o económicos que valgan la pena enlazando covalentemente antígenos a CTB y LTB, debido a que solamente un número limitado de grupos amino y/o grupos carboxi pueden ser activados sin disminuir fuertemente la actividad antigénica de CTB y LTB o su aptitud para hacer diana en el moco de las membranas mucosas, y su aptitud para localizarse por si mismos y los antígenos incluidos, en los órganos linfáticos y células para atraer la respuesta inmunitaria. Incluso si se encuentra disponible un número suficiente de grupos para conjugación química sobre una molécula portadora, es bien sabido que es difícil obtener un rendimiento físico y económico que valga la pena a partir de tales construcciones (Lövgren et al., Immunol. Methods 173, 237-243).

El uso de moléculas que hacen diana en el moco, en los iscoms, tiene muchas ventajas. Esto es especialmente cierto en la preparación de vacunas oral, nasal o rectal contra diversas enfermedades. Tales vacunas pueden contener una construcción de soporte con antígeno, componentes adyuvantes suplementados con, por ejemplo, CTB o LTB con objeto de situar la construcción para las células y órganos linfáticos del canal intestinal y para otras membranas mucosas mediante GALT, MALT, NALT (Gut. Mucosal and Nasalpharygeal Associated Lymphatic Tissue), tal como en los tractos respiratorios o directamente mediante administración local.

El iscom, que es mayor que las moléculas que hacen diana en el moco, tiene espacio para incorporar antígenos pasajeros escogidos y componentes adyuvantes escogidos, por conjugación o de algún otro modo, tal como mediante interacciones hidrófobas o unión electrostática.

Para producir matrices, la relación común de esterol, otro lípido y glicósido, es 0,2-10:0,2-10:1-100, preferiblemente 1:1:5. Si se usa un receptor que contiene lípido, éste puede reemplazar completamente al otro lípido de modo que la relación de esterol, receptor que contiene lípido y glicósido es como la anterior. Otra posibilidad es usar el receptor que contiene lípido y otro lípido, preferiblemente fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina más el receptor, de modo que la relación sea esterol; otro lípido:receptor:glicósido 0,2-10:0,2-10:0,1-1:5-10, preferiblemente 1:1:0,25:5. El número de moléculas de receptor depende del número de moléculas que se desea añadir.

En principio, los componentes pueden ser introducidos en cualquier proporción, sea cual fuere. Se ha indicado que el producto terminado recibe la relación en peso entre los diversos componentes tal como se ha indicado anteriormente, y que el exceso no interviene. Si se utiliza demasiado del otro o de los otros lípidos, el complejo se hace "grueso" y frágil y se desmorona con facilidad. Demasiado poco del otro lípido conduce a que los complejos no se formen y en su lugar se formen subunidades anulares (de forma de anillo). Esto puede determinarse mediante microscopía electrónica.

Es posible determinar si el iscom o la matriz han sido obtenidos examinando el producto en un microscopio electrónico. Las matrices o iscoms típicos poseen una estructura esférica, característicamente abierta, que consta de subunidades circulares, como puede apreciarse en la fig. 3 del documento EP 0 109 942 B1 y en la Fig. 3 de esta solicitud de patente. Los iscoms tienen una constante de sedimentación inferior a la de las micelas correspondientes y con frecuencia una constante de sedimentación mayor que la de las correspondientes formas monómeras de proteína o péptido. Las matrices y los iscoms poseen una constante de sedimentación de aproximadamente 12-22 S, en particular 20 S.

La ventaja de usar receptores que contienen lípidos para fijar los antígenos o las moléculas que hacen diana en el moco es que las matrices pueden ser preparadas con glicósido, esterol, posiblemente otro lípido y un receptor que contiene lípidos, y mezclando simplemente luego con la molécula que hace diana en el moco. El procedimiento es más eficaz, menos costoso y más sencillo que si se fuera a preparar iscom confeccionado conteniendo los ingredientes anteriores más el antígeno de proteína que hace diana en el moco o si se emplearan métodos químicos de copulación para conectar el antígeno con la matriz ya preparada.

Cuando se integra antígeno en el iscom o se combina con la matriz usando métodos químicos de copulación, los grupos amino o carboxilo que constituyen los determinantes antigénicos, son modificados.

Los determinantes antigénicos son desnaturalizados cuando el antígeno es activado para enlazarle covalentemente al iscom o fijar una cola hidrófoba para facilitar su integración en el iscom, o cuando es copulado mediante métodos químicos a la matriz o el iscom (cuando se usan dos antígenos). Esto significa que la cantidad de antígeno sin modificar está reducida en gran manera en comparación con el modo de permitir que el antígeno se una a un receptor que contiene lípidos. Esto puede significar, por ejemplo, que se necesita aproximadamente cinco veces más antígeno en comparación con el modo de usar un receptor que contiene lípidos, Cuando se usa un receptor que contiene lípidos el procedimiento es mucho menos costoso. En paralelo a una disminución en el grado de incorporación, hay un aumento en la cantidad de glicósido y el contenido de adyuvante, que compensa en parte la menor cantidad de antígeno en la respuesta inmunitaria obtenible. Al mismo tiempo, la toxicidad puede aumentar debido al contenido aumentado de coadyuvante. En principio, sin embargo, la respuesta inmunitaria es mayor cuando se usa unión del antígeno al receptor.

Existe otra ventaja, también, cuando se pretende unir al iscom o a la matriz una molécula que hace diana en el moco y un antígeno pasajero. Si el iscom o la matriz se preparan a partir de receptores que contienen lípidos, hay más espacio para integrar el antígeno pasajero en el iscom o unirle a la matriz usando métodos químicos de copulación. El uso de un receptor que contiene lípidos no influye en la unión del antígeno pasajero. Esto hace más fácil obtener relaciones óptimas. Es más fácil regular la cantidad de antígeno pasajero y las moléculas que hacen diana en el moco integrada en el iscom o conectada al iscom o la matriz usando métodos químicos. Por otra parte, si se prepara el iscom usando una molécula que hace diana en el moco y antígeno con los mismos métodos, éstos compiten por la unión y se hace difícil regular completamente la incorporación de ambos componentes.

En particular, en lo que respecta a la subunidad CTB del cólera, que tiene cinco subunidades se sitios de unión, es posible fijar hasta 13 veces el peso del receptor GM1. Esto todavía cede entidades de unión en la CTB capaces de unirse a receptores existentes en la membrana mucosa y que sirven como moléculas

La relación en peso de esterol, otro lípido, proteína y glicósido es 0,2-10:0,2-10:2-10:1-100, preferiblemente 1:1:1:5-10 para administración subcutánea. Para administración oral o intranasal, la cantidad de glicósido en la relación anterior puede ser mayor, a saber, 1-200, preferiblemente 5-20.

Estas son las cantidades apropiadas tanto cuando la matriz es producida primeramente como cuando se une a los antígenos usando métodos químicos de copulación y más tarde cuando se obtienen las partículas de iscom.

La cantidad de iscom, matriz y antígeno se escoge para ser eficaz desde el punto de vista farmacéutico y puede estimarse por el técnico en la materia. Para el hombre puede usarse al menos 1 \mug, en especial desde 1 hasta 200 \mug del antígeno, por lo que el límite superior viene fijado por aspectos económicos. Para animales, la dosis puede ser al menos de 0,1 \mug del antígeno, dependiendo del antígeno y del tamaño individual.

El iscom o la matriz de iscom pueden prepararse en composiciones que contienen un agente de solubilización, por ejemplo agua o cloruro de sodio. La composición puede contener también el detergente usado para preparar el complejo como agente de solubilización, si es aceptable desde el punto de vista de la práctica médica, humana o veterinaria. Además, las composiciones pueden contener otros aditivos y agentes de carga aceptables para la práctica médica, humana o veterinaria.

Una composición tal puede contener, por ejemplo, un complejo de iscom y una carga inerte tal como cloruro de sodio. También puede constar de una matriz mezclada con antígeno.

La vacuna puede hacerse disponible para modos de administración que contengan una entidad con matriz en una composición que contenga una carga inerte y una entidad con el antígeno en una composición que contenga una carga inerte. Estas dos composiciones están destinadas a administrarse a la vez.

Ejemplo 1 Incorporación de GM1 y rCTB en iscoms

La toxina del cólera (CT) es un adyuvante eficaz (Holmgren, J., Czercinsky, C., Sun, J-B. y Svennerholm, A-M. en Concepts in Vaccine Development, Compilador. S.H.E. Kaufmann, 1996) en especial mediante inmunización local. Incluso la subunidad B (CTB) es presentada como un adyuvante, según la bibliografía, debido a sus cualidades de búsqueda de objetivo por inmunización local, pero esta actividad se limita, por tanto, a una función de guía del antígeno hacia las células linfáticas de los intestinos. Si la CTB se une a una matriz de iscoms o se incorpora en iscoms, se obtiene una formulación que potencia la respuesta inmunitaria y es eficaz por inmunización local y parenteral. Este efecto es interesante en relación con la vacuna contra el cólera y por elección de adyuvante, para otros antígenos, en especial por inmunización local pero también por inmunización parenteral.

La toxina del cólera, recombinante, subunidad B (rCTB) (documento EP 0 368 819) se mezcla en diferentes preparaciones con:

MEGA-10 (Bachem P 1000 Decanoil-n-metilglucamida), 20% en peso en H_{2}O;

Fosfatidilcolina (PC) (Sigma P-5763), 10 mg/ml, diluida en MEGA-10, 20% en peso en H_{2}O;

Colesterol (C) (Sigma C8667), 10 mg/ml diluido en MEGA-10 al 20% en H_{2}O;

GM1 (Sigma G7641), 10 mg/ml diluido en MEGA-10 al 20% en H_{2}O;

Fosfatidiletanolamina (PE) (Sigma P2768), 10 mg/ml diluida en MEGA-10 al 20% en H_{2}O;

Quil A (Spikoside, Iscotec, Lule\ring{a}), 100 \mug/ml en H_{2:}O;

rCTB, 5 mg/ml en una solución tampón con TRIS 0,05 M (pH 7,5), NaCl 0,2 M, Na_{2}EDTA 0,001 M, NaN_{3} 0,003 M;

Se mezcló la fosfatidilcolina con el colesterol suplementado con cantidades rastreables de colesterol radiactivo (^{3}H-colesterol, Amersham) en proporción 1:1 (100 mg de cada lípido en 10 ml de MEGA-10 al 20%) y cantidades variables de GM1 desde 1 \mug hasta 7,5 \mug (1 \mug, 1,7 \mug, 2,5 \mug, 5 \mug, 7,5 \mug) en 1,0 ml de PBS (solución fisiológica de NaCl tamponada con fosfato), pH 7,2.

A 1 ml de las seis variantes diferentes de la solución de fosfatidilcolina/colesterol-GM1, se añadió Quil A hasta una concentración final de 0,2%. La mezcla se sometió a sonicación en un aparato Sonorex TK 52 2 x 15 minutos y se dejó a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora. Después se dializó la mezcla frente a PBS en primer lugar durante 24 horas a RT y luego durante 24 horas en ambiente frío (+4ºC). Por microscopía electrónica (EM) se verificó la existencia (presencia) de matriz. Se añadieron 100 \mug de rCTB a las seis variantes de la matriz, que diferían con respecto a los contenidos de GM1. La mezcla se mantuvo 2 horas a temperatura ambiente. Las partículas de matriz con la rCTB asociada, es decir, iscoms, se purificaron mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa de 10-50%, en PBS, durante 19 horas en un rotor TST 41.14 (Kontron) a 39.000 rpm, a 10ºC.

El gradiente se recogió en 16 a 18 fracciones. Las fracciones fueron analizadas con respecto a rCTB usando el método de determinación de proteínas de Bradford (Bradford, Analyt. Biochem., 72, (1976) 248-254) y se determinó colorimétricamente a 595 nm y con respecto a lípidos, por detección del ^{3}H-colesterol así como EM para examinar la presencia de posible matriz o estructuras de iscoms. La Fig. 1 muestra las cantidades de lípidos (\blacksquare) y rCTB (\Box) en las fracciones en la proporción de rCTB:GM1 13:1 (Fig. 1 A) y 100:1, respectivamente (Fig. 1 B).

Resultados

La máxima cantidad relativa (peso) de rCTB que estaba completamente incorporada en la matriz de GM1, es decir, formando el rCTB-iscom, era 13 veces mayor que la cantidad de GM1 incorporada (Fig. 1). En tres experimentos diferentes se ha apreciado la misma relación. Si se añade una cantidad alta de rCTB, el exceso de rCTB se acumula en el gradiente sin asociarse al ^{3}H-colesterol, lo que pone de manifiesto que este rCTB no se ha incorporado. Si se añade una cantidad menor de rCTB, se encontraran agregaciones debido a que el rCTB tiene cinco posibles sitios de unión a GM1 enlazando los iscoms formando agregaciones. La matriz asociada a rCTB, es decir, iscoms, se encuentra en las fracciones 7 hasta 9 (Fig. 1B) En la Fig. 3 se muestran por EM diferentes preparaciones de iscom. Se obtienen resultados semejantes con fosfatidiletanolamina en matriz e iscoms, respectivamente, en lugar de la fosfatidilcolina (no se muestran los resultados).

Conclusión

La rCTB puede unirse eficazmente a matrices que contienen el glicolípido GM1. La adición de una cantidad adecuada de GM1 en la preparación de la matriz implica un método eficiente de preparación de iscoms con rCTB.

Ejemplo 2

CTB E ISCOMS COMO DISPOSITIVOS DIANA INMUNOLÓGICOS PARA ANTÍGENOS PASAJEROS (PA).

Fundamento

Está bien documentado que la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) puede desempeñar activamente un papel importante como "proteína que busca la diana" para "antígeno pasajero" o antígeno que se administra junto con la subunidad B, localmente, en el moco, por ejemplo, intranasalmente u oralmente (Holmgren, J., Lycke, N., Czerkinsky, Vaccine 11, 1179-84, 1993). La subunidad B pueden ser obtenida con éxito como un producto de DNA recombinante (rCTB) y, por tanto, es interesante como una proteína que busca la diana para antígeno vacunal administrado a través de las membranas mucosas.

La finalidad de este ejemplo es poner de manifiesto que los iscoms, en combinación con la rCTB o sin rCTB favorecen el efecto inmunoestimulante del antígeno PA (antígeno pasajero) incorporado o antígeno administrado conjuntamente (CA) por aplicación intranasal (i.n) en el moco. El experimento se llevó a cabo mostrando que las construcciones de iscoms y las construcciones con matriz de iscom, poseen una efecto de inmunomodulación por inducción del tipo de respuestas inmunitarias deseadas para protección inmunitaria. En estos experimentos, se evaluaron las respuestas inmunitarias específicas contra la OVA, la rCTB o una de sus combinaciones. Se estudiaron la distribución de las respuestas inmunitarias en el moco, en los isótopos IgA e IgC, y en el suero, en diferentes subclases de IgG.

Material

OVALBUMIN fracción V (OVA) (SIGMA A2512, St. Louis, EE.UU.)

FOSFATIDILETANOLAMINA-dioleoilo (PE) 10 mg/ml en MEGA-10 al 20% en peso (SIGMA P-0890 St. Louis, EE.UU.)

PE marcada con ^{14}C (AMERSHAM, Buckinghamshire, GB).

COLESTEROL (C) 10 mg/ml en MEGA al 20% (SIGMA C 8667, P0890 Si. Louis, EE.UU.)

Fosfatidilcolina (PC) (Sigma C 8667) 10 mg/ml en MEGA-10 al 20% en H_{2}O.

MEGA 10 Bachem P1000, Basilea, Suiza, Decanoil-n-metilglucamida (20% en peso, en H_{2}O).

SULFO-NHS, N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) (PIERCE No 24510, Rockford, EE.UU.)

EDC 1, Etil-3 (-dimetilaminopropilcarbodemida-HCl (Pierce No 22980, Rockford, EE.UU.)

QUILLAJA SAPONIN i H_{2}O 100 mg/ml (Spikoside, Advet AB, Lule\ring{a}, Suecia).

rCTB, subunidad B recombinante de toxina del cólera, obsequio de Jan Holmgren, Departamento de Inmunología, Göteborg, Suecia.

PBS pH 7,2

Matriz de iscom, obtenida de Advet, Lule\ring{a}, Suecia.

Animales

Ratones NMRI, hembras, 18-20 g, del Instituto Veterinario Nacional, Uppsala, Suecia.

Métodos Preparación de iscoms

Se proporcionó OVA con un dioleoil-fosfatidiletanol (PE)-cola de lípido según la descripción del fabricante, Pierce (Rockford,Il, EE.UU.) modificado por el Solicitante (Karin Lövgren-Bengtsson). Brevemente: 1 mg de OVA, 1 mg de PE, 1 mg de NHS y 20 mg de EDC se incubaron durante 2 horas a 37ºC, con agitación, en un volumen total de 775 \mul de H_{2}O.

Se añadió 1 mg de C, 5 mg de Quillaja a la solución antes citada. Para facilitar la fijación de la CTB, se añadieron a la preparación 40 \mug de GM1 por 1 mg de OVA. La concentración final de MEGA-10 alcanzó 2% en un volumen total de 1,1 ml. La solución se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, con agitación, luego se sometió a diálisis frente a PBS a temperatura ambiente, durante 48 horas. La morfología del iscom fue confirmada por microscopía electrónica. Se añadió rCTB a la preparación con o sin GMI. Se incorporó rCTB en los iscoms como se ha descrito en el Ejemplo 1, por incorporación de GM1 (véase el Ejemplo 1). En otras preparaciones se omitió la GM1 para evitar la fijación de la rCTB. Las partículas de iscom que contenían OVA o rCTB, o ambas, fueron purificadas mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa de 10-50% en PBS, durante 18 horas, en un rotor TST 41.14 (Kontron), a 39000 rpm, a 10ºC. El gradiente se recogió en 16 a 18 fracciones. Las fracciones fueron analizadas con respecto a la rCTB mediante el método de determinación de proteínas según Bradford (Bradford, Analyt. Biochem. 72, 1976, 248-254) y se definieron colorimétricamente a 595 nm, y con respecto a lípidos por detección del ^{3}H-colesterol, así como mediante microscopía electrónica, para examinar la existencia de posibles estructuras de matriz o de iscoms.

Caracterización de los diferentes componentes de iscoms

La Fig. 4 A muestra rCTB libre (\Box) medida mediante determinación de proteína, analizada en una centrifugación en gradiente de sacarosa de 10-50%, es decir, la rCTB sin incorporar en iscoms sedimenta lentamente y se recupera en el gradiente alto, es decir, las fracciones 12-14.

La Fig. 4 B muestra la radiactividad de lípido (CPM) del colesterol que sigue el iscom por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa (\blacksquare) y OVA proteínica lipidada medida según Bradford (Ref. véase texto) (\Box); los iscoms con OVA son detectados en las fracciones 6-8. El gradiente es un gradiente de sacarosa de 20-50%, centrifugado durante 18 horas en un rotor TST 41.14 a 39000 rpm. Alguna proteína sin integrar, fracciones 11, 12 y 13. Bradford se midió como absorbencia a 595 nm.

La Fig. 4 C muestra la incorporación de rCTB en iscoms con GM1. La incorporación de rCTB en iscoms se midió mediante determinación de proteínas (Bradford) (\Box). Se pone de manifiesto la sedimentación de iscoms mediante el colesterol marcado radiactivamente (CPM) (\blacksquare) siguiendo el iscom en el gradiente. Ambas proteínas, o sea rCTB, colesterol y estructuras de iscom, las últimas verificadas mediante microscopía electrónica, se encuentran en las fracciones 6-9.

Mediante la producción de OVA_iscoms con lípido de GM1, la rCTB puede ser incorporada al ser añadida a los OVA-iscoms como muestra la Fig. 4 D. La incorporación de OVA y rCTB, ambas lipidadas, se demuestra por determinación de proteínas según Bradford (\Box). La sedimentación de iscoms se pone de manifiesto por la radiactividad del colesterol marcado (CPM)(\blacksquare) que se encuentra en las fracciones 4-6, y las estructuras de iscoms se determinaron mediante microscopía electrónica. La Fig. 4 E muestra que si se añade rCTB a OVA-iscoms que están exentos de lípidos de GM1, la rCTB no se incorpora en el iscom lo que resulta probado por el hecho de que la proteína, es decir, la rCTB, se encuentra en la parte superior del gradiente, o sea, las fracciones 11-13. La OVA incorporada en el iscom se instala en las fracciones 5-8.

Experimentos de inmunización

Se emplearon ratones NMRI, de 20 g, procedentes del estabulario del Instituto Veterinario Nacional, Uppsala. Los grupos siguientes, enumerados a continuación, habían sido inmunizados intranasalmente (i.n.) con 10 \mug de cada preparación o subcutáneamente (s.c.) con 2 \mug dos veces, separadas seis semanas.

Grupos

1. i.n. 10 \mug OVA sin Quillaja (QA)

2. i.n. 10 \mug OVA-iscom

3. i.n. 10 \mug OVA-iscom y 10 \mug de rCTB libre

4. i.n. 10 \mug de OVA y rCTB en el mismo iscom

5. s.c 2 \mug OVA-iscom

6. i.n. OVA en forma libre y rCTB en forma libre, 10 \mug de cada una

7. i.n. OVA en forma libre más matriz (10 \mug)

8. i.n. PBS, es decir, grupo testigo sin antígeno

Los ratones fueron anestesiados por inhalación de Metafano en un vaso de precipitados. Para aplicación i.n. se administraron 20 \mul de cada preparación. Cuando la inmunización se verificó por vía subcutánea la dosis se administró en un volumen de 200 \mul/ratón en PBS.

Dos semanas después de la primera inmunización, se ensayó el suero contra la OVA y la rCTB. Al cabo de 4 semanas, los ratones recibieron una dosis de refuerzo y se tomaron muestras de sangre después de dos semanas más. Antes de extraer los pulmones, los vasos sanguíneos fueron enjuagados con 20 ml de heparina al 0,1% en PBS a través del ventrículo derecho del corazón y fuera, en los pulmones, y fuera a través del resto de la circulación sanguínea. Los animales, aparentemente, estaban desangrados. Los pulmones, los tractos respiratorios superiores, el tracto genital y los intestinos fueron diseccionados, secados con una toalla de papel y colocados en tubos con heparina-PBS, previamente pesados. Los órganos fueron pesados y lavados con PBS, después fueron secados y colocados en tubos de Eppendorf y guardados a -20ºC.

Antes de llevar a cabo el ensayo de determinación de las respuestas de anticuerpos, los órganos fueron sacados del congelador y se añadió spikoside al 2% en PBS, 1:1, los pulmones fueron cortados en pequeños trozos y los tubos de Eppendorf fueron guardados en un frigorífico durante la noche. Al día siguiente, los trozos de los órganos fueron centrifugados en una centrífuga Eppendorf durante 15 minutos a 13000 rpm. El sobrenadante se analizó para determinar IgA e IgG contra OVA y rCTB, respectivamente. El suero se ensayó frente a OVA y rCTB en un ensayo ELISA y se analizaron las respuestas de anticuerpos de IgA, e IgG total, subclases de IgG IgG1 e IgG2a.

MEDIANTE ADMINISTRACIÓN INTRANASAL, LAS CONSTRUCCIONES DE ISCOM INDUCEN RESPUESTAS INMUNITARIAS MAYORES QUE LAS DE LAS FORMULACIONSES DE rCTB SIN ISCOMS O MATRICES DE ISCOMS.

LA RESPUESTA DE ANTICUERPOS SÉRICOS CONTRA OVA FUE DETERMINADA después de una y dos inmunizaciones por vía intranasal y por vía subcutánea (véase la Fig. 5).

La formulación de rCTB-OVA no induce una respuesta de anticuerpos en el suero frente a OVA, ni después de uno e incluso dos inmunizaciones. La Fig. 5 y la Tabla 1 muestran la respuesta de anticuerpos séricos frente a OVA analizada por el ensayo ELISA, después de una inmunización intranasal (i.n.) de ratones. No pudo medirse respuesta de anticuerpos frente a OVA sin adyuvante ni frente a OVA con rCTB como adyuvante. Todos los ratones que habían sido inmunizados con la formulación de OVA-iscom y OVA suplementada con matriz de iscom, respondieron por una elevación de los anticuerpos que pudo medirse con claridad.

La Fig. 5 B muestra que dos semanas después de la segunda inmunización todos los ratones que habían sido inmunizados con formulaciones de iscom o de matriz respondían con altos títulos de anticuerpos séricos frente a OVA. Los ratones que habían sido inmunizados con OVA suplementada con rCTB mezclada como entidades separadas, tenían títulos de anticuerpos séricos más bajos que los de los ratones que habían sido inmunizados solamente con OVA. Esto implica que la rCTB induce tolerancia frente a OVA teniendo como resultado que los ratones no responden con anticuerpos séricos contra la OVA.

La Fig. 5 C muestra los valores del ensayo ELISA a dilución creciente, de suero procedente de ratones después de dos inmunizaciones. Como indica esta figura, así como también aparece en la Fig. 5 B, las formulaciones de iscom con OVA rompen la tolerancia que la rCTB induce para respuesta de anticuerpos séricos contra OVA como "antígeno pasajero" o antígeno administrado conjuntamente.

La Tabla 1 muestra la respuesta de anticuerpos séricos (títulos, log^{10}) contra OVA dos semanas después de la segunda inmunización por vía intranasal de ratones, analizada en el ensayo ELISA con respecto a la respuesta total de IgG y la respuesta de las subclases IgG1 e IgG2a. Es de especial interés que los iscoms regulan altamente en aumento la respuesta de IgG2a en comparación con la matriz de iscom más OVA. Además, OVA-iscoms y OVA/rCTB-iscoms y OVA-iscoms más rCTB libre inducen una mayor respuesta de IG1 en comparación con la respuesta de IgG2a que los OVA-iscoms inyectada por vía subcutánea. Esto puede medirse como una cuota IgG1/IgG2a. La OVA sin aditivo de adyuvante atrajo una respuesta de anticuerpos baja que solamente pudo ponerse de manifiesto en la subclase IgG1. La aplicación i.n. de OVA-iscoms con rCTB libre o iscoms conteniendo rCTB y OVA, ambos, indujo una respuesta de anticuerpos séricos inesperadamente fuerte, localizada, para las dos subclases, IgG1 e IgG2a. El efecto de inmunomodulación se prueba por la producción de IgG2a. Ésta es una indicación de la inducción de una respuesta de IFN-\gamma (Coffmann, R.L., Seymour, B.W.P., Lebman, D.A. et al., Immunol. Rev. 102, 5-28, 1988). La OVA-rCTB indujo un estado semejante a una tolerancia en lo que respecta a la respuesta de anticuerpos séricos. Sin embargo, resultó inesperado que este estado de tolerancia fue, efectivamente, anulado por las formulaciones se iscom y por la matriz de iscom.

\newpage

LAS FORMULACIONES DE ISCOMS INDUCEN UNA RESPUESTA DE ANTICUERPOS EN LAS MEMBRANAS MUCOSAS DEL RATÓN CONTRA ANTÍGENOS PASAJEROS, MÁS FUERTE QUE LAS FORMULACIONES DE r-CTB (Fig. 6).

Respuesta de anticuerpos de IgA en la secreción pulmonar

Todas las formulaciones de iscoms con OVA o con OVA-matriz de iscom administradas i.n. indujeron títulos de IgA en las secreciones pulmonares, significativamente mayores que la OVA libre suplementada con rCTB y que OVA-iscoms administrados s.c. o que OVA sola en forma libre administrada i.n. En la Fig. 6 A se analizó la respuesta de anticuerpos de IgA en el pulmón (después de dos inmunizaciones en el ratón, por vía intranasal). La comparación pone de manifiesto que las formulaciones de iscoms inducen respuestas importantes de anticuerpos de IgA después de administración i.n. en oposición a la formulación de rCTB-OVA en las dosis bajas usadas (10 \mug)

La Fig. 6 B muestra una comparación entre los diferentes grupos con respecto a las respuestas de anticuerpos de IgA en el tracto respiratorio superior. OVA-iscoms y OVA suplementada con matriz inducen títulos de IgA significativamente superiores a los de las formulaciones de OVA-rCTB.

En el extracto procedente del tracto genital, OVA-iscoms complementados con rCTB indujeron títulos de IgA anti-OVA significativamente mayores (10^{2} \pm 0,38) que los de OVA con rCTB como adyuvante (10^{1,4} \pm 0,25) o que los ratones testigo (10^{1,2}). Todavía, la rCTB incorporada en OVA-iscoms indujo títulos de IgA significativamente mayores (10^{1,7}) en el extracto genital que los de los ratones testigo (10^{1,2}). Esto último indica el fundamento para el ensayo ELISA (Fig. 6 C).

Respuesta de anticuerpos de IgG contra OVA en membranas mucosas

En general, las formulaciones de iscoms y de matrices administradas por vía intranasal o subcutánea que contenían OVA, indujeron títulos de anticuerpos de IgG en el extracto procedente de membranas mucosas de los pulmones y de tractos respiratorios superiores, significativamente mayores que los de OVA más rCTB y de los ratones testigo sin inmunizar (Fig. 7 A y B).

La rCTB parece inducir una tolerancia potente contra la respuesta inmunitaria de IgG contra la OVA en extractos de pulmón, que es más pronunciada que la respuesta de anticuerpos contra IgA. Esta tolerancia está claramente anulada por los iscoms y las formulaciones de iscoms.

Asimismo, en la secreción del tracto genital las formulaciones de OVA-iscoms, OVA-rCTB-iscoms y de iscom-matriz con OVA, indujeron respuestas a OVA de anticuerpos de IgG importantes y muy altas en comparación con las inducidas por una formulación de rCTB OVA. En la secreción intestinal los iscoms con OVA indujeron títulos de anticuerpos de IgG mayores que los de OVA suplementada con rCTB libre u OVA suplementada con matriz de iscom. Los resultados se muestran en la Fig. 7 C o 7 D.

Conclusión Comparación entre iscom y rCTB

Los iscoms son inesperada y considerablemente más eficaces después de administración a las mucosas como adyuvante y "buscador de diana" para "antígeno pasajero" y SA, representado aquí por OVA, que una formulación de OVA y rCTB.

Esto es válido tanto para la respuesta secretora de anticuerpos que engloba la respuesta de IgA, localmente, en la secreción del tracto respiratorio, tal como en el pulmón, como para el de las membranas mucosas, muy lejos del sitio de administración, tal como en el tracto genital y en los intestinos.

Asimismo, las respuestas de anticuerpos de IgG en la secreción procedente de órganos mucosos tales como los pulmones, los tractos respiratorios superiores, los intestinos y el tracto genital, están considerablemente mejoradas después de administración a las mucosas de OVA como un antígeno modélico en iscoms o junto con una matriz de iscom, en comparación con la intensificación ocasionada por OVA administrada juntamente con rCTB.

Merece la pena hacer notar también que después de la administración a las mucosas de un antígeno pasajero en iscoms o administrado conjuntamente con una matriz de iscom, la respuesta de anticuerpos séricos estaba considerablemente más mejorada que la que pudo ocasionar la rCTB.

Puede obtenerse un efecto correspondiente en cuanto a la intensificación de la respuesta de anticuerpos en la secreción, si la subunidad A de la toxina del cólera se encuentra presente con su subunidad B, es decir, la toxina total del cóleral. Sin embargo la toxina total del cólera es tóxica, patógena e inaceptable como adyuvante (Holmgre, J., Czercinsky, C., Sun, J.B. y Svennerholm, A-M. en Concepts in Vaccine Development, Comp. S.H.E. Kaufmann, 1996). De modo semejante, la toxina total LT y su equivalente a CTB, es decir, LTB adolecen de los mismos problemas que LT y CTB.

La rCTB reguló en descenso la respuesta de anticuerpos de IgG en la secreción de mucosas, del antígeno administrado conjuntamente. Inesperada y muy distintamente, la regulación en descenso o efecto de inducción de tolerancia de la rCTB sobre el antígeno pasajero, fue anulado eficazmente por los iscoms y las formulaciones de matriz de iscom.

El efecto de inmunomodulación de iscoms, iscom/molécula que busca la diana o formulaciones de iscom-matriz, se demuestra por la respuesta de anticuerpos séricos regulada en ascenso contra IgG2a, también después de la administración a las mucosas, lo que es un indicador de la participación de la respuesta inmunitaria de IFN-\gamma, es decir, la respuesta de TH1.

Comparación de matriz y rCTB

Matriz más antígeno (OVA) administrada conjuntamente sobre la membrana mucosa, es más eficaz que la rCTB más antígeno administrada conjuntamente sobre la membrana mucosa por vía intranasal, como para la respuesta de anticuerpos de IgA en la secreción procedente de los pulmones y el tracto genital. Asimismo, la respuesta de anticuerpos de IgG en la secreción procedente de órganos mucosos tales como los pulmones, el tracto respiratorio y el tracto genital, está considerablemente intensificada con respecto a las de las formulaciones de OVA-rCTB.

Asimismo, la respuesta específica de anticuerpos séricos inducida por OVA con la matriz como adyuvante de las membranas mucosas fue considerablemente mayor que la inducida por una formulación de OVA suplementada con rCTB. Resultó inesperado que la matriz pudiera tener localmente un fuerte efecto adyuvante en membranas mucosas. Merece la pena hacer notar que la matriz es muy simple de usar como adyuvante, añadiéndola, sencillamente, al antígeno de la vacuna en oposición al hidróxido de aluminio, que requiere una adsorción en las condiciones correctas, o en oposición a adyuvantes oleosos que requieren una preparación técnica en forma de emulsiones, que son un procedimiento operatorio complicado en la producción de vacunas a escala industrial.

Es interesante, en especial, que el iscom o matriz de iscom puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria potente mediante administración a las mucosas. La CTB o LTB pueden usarse para regular en descenso esta respuesta inmunitaria. Estas combinaciones pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria y cuando se desea y para regular en descenso esta respuesta de anticuerpos cuando se desee. La posibilidad de regular en ascenso o descenso una respuesta de anticuerpos en el tracto genital femenino, que es específico de antígeno de esperma, tiene interés en una vacuna contraceptiva. El anticuerpo antiesperma inducido necesita ser anulado contra espermas.

Comparación entre iscom y matriz de iscom

El iscom y la matriz de iscom pueden ser similares en cuanto a morfología, por ejemplo estudiada por EM, la composición en cuanto a triterpenoides, lípidos o moléculas adyuvantes incorporadas. Sin embargo, los iscoms contienen un antígeno incorporado opuesto a la matriz que ejerce su actividad de adyuvante sobre antígenos administrados conjuntamente que no están integrados.

En este ejemplo, se llevaron a cabo comparaciones entre iscom-matriz e iscom como formulaciones adyuvantes de mucosas para administración de OVA. Los efectos son evaluados localmente en secreciones extraídas de pulmones, tractos respiratorios superiores, tractos genitales e intestinos. En general, puede establecerse que los iscoms, en ciertos casos, son adyuvantes de las membranas mucosas más eficaces que la matriz. Los iscoms, por ejemplo, inducen una mayor respuesta de anticuerpos de IgG2a en el suero, lo que puede ser ventajoso para la protección contra ciertas enfermedades ocasionadas por virus.

En otros casos, las formulaciones de matriz-OVA inducen el mismo nivel de respuesta de anticuerpos que las formulaciones de OVA-iscom. La respuesta de IgG en el moco de los intestinos fue considerablemente mayor después de inmunización por vía intranasal con formulaciones de iscom que con OVA-matriz.

La simple adición de la matriz a la preparación de antígeno es una gran ventaja.

La respuesta de anticuerpos en el suero contra la rCTB

Los resultados están presentados en la Tabla 2 después de dos inmunizaciones i.n. Las preparaciones de iscoms indujeron respuestas elevadas de anticuerpos en el suero (grupo 3: 10^{4,9} \pm 0,51; grupo 4: 10^{5,1} \pm 0,54) englobando respuestas altas de IgG2a. La rCTB indujo títulos de anticuerpos considerablemente inferiores (10^{3,3} \pm 0,4). Todas las preparaciones de rCTB indujeron títulos de anticuerpos significativamente superiores a los de los ratones testigo sin inmunizar.

Respuesta de anticuerpos de IgA contra CTB en secreciones procedentes de órganos diferentes

OVA/rCTB-iscoms o rCTB libre suplementada con OVA-iscoms o que, en este caso, servía como adyuvante en la forma de matriz de iscom para rCTB, indujeron, después de dos inmunizaciones por vía intranasal, respuestas de anticuerpos de IgA considerablemente mayores que la rCTB sin formulaciones de adyuvantes añadidas, en todos los mocos ensayados, es decir, procedentes de los pulmones, tracto respiratorio superior, intestinos y tracto genital (Fig. 8 A y B).

Una característica interesante es que la rCTB no indujo respuestas de anticuerpos de IgA a si misma en el moco procedente de los intestinos.

Respuesta de anticuerpos de IgG contra la rCTB en el moco procedente de diferentes órganos

Altas respuestas de anticuerpos de IgG fueron detectadas contra rCTB en secreciones procedentes de pulmones, tractos respiratorios superiores, tracto genital e intestinos, con formulaciones de rCTB en iscom o con matriz de iscom. Las respuestas de anticuerpos de IgG en estas secreciones de mucosas procedentes de ratones inmunizados con rCTB sin iscom ni formulaciones de matriz de iscom, fue menor que la obtenida para iscoms o formulaciones de matriz de iscom, pero los niveles eran significativamente superiores a los de testigos sin inmunizar (Fig. 8 C y D).

Conclusión

Los resultados indican que las formulaciones de iscoms intensifican eficaz e inesperadamente la respuesta de anticuerpos contra la rCTB después de inmunizaciones i.n., tanto localmente, en secreciones procedentes del tracto respiratorio, como en secreciones procedentes de órganos distantes, es decir, en secreciones procedentes de los tractos intestinal y genital.

Incluso la respuesta de anticuerpos séricos contra rCTB fue intensificada fuertemente mediante la construcción de iscom o de matriz de iscom como un adyuvante añadido por separado. El efecto modulador inmunitario del iscom y de la matriz de iscom se demuestra por el hecho de que la respuesta de anticuerpos contra la rCTB fue inducida en la subclase IgG2a, lo que indica que es inducida una producción de IFN-\gamma, lo que es una indicación de un tipo TH1 de respuesta.

Un ejemplo sorprendente de modulación inmunitaria por iscoms y matriz de iscom se demuestra por el resultado de rCTB, que por sí misma no convierte la respuesta de anticuerpos en los intestinos englobando una respuesta de IgA, en oposición a las respuestas de IgA en otras secreciones. Sin embargo, la CTB presentada por iscom o administrada conjuntamente con matriz de iscom, convirtió la respuesta de anticuerpos incluyendo IgA específica de la CTB.

Ejemplo 3

LAS CARACTERÍSTICAS CINÉTICAS DEL DESARROLLO DE LA RESPUESTA DE ESPECÍFICA DE ANTICUERPOS EN EL SUERO Y EN LA SECRECIÓN PULMONAR DESPUÉS DE INMUNIZACIÓN INTRANASAL CON ISCOMS QUE SON PORTADORES DE ANTÍGENOS DEL VIRUS DE LA INFLUENZA.

En este ejemplo se demuestran las características cinéticas del desarrollo de la respuesta específica de anticuerpos en el suero y en la secreción pulmonar después de administración intranasal de antígeno del virus de la influenza, es decir, las proteínas de la cubierta procedentes del aislado de PR8 incorporadas en el iscom.

Preparación de influenza-iscoms Preparación de la proteína de la cubierta del virus de la influenza

Se usó una preparación purificada de la PR8 aislada del virus de la influenza H1N1 (A/PR/8/34) con una concentración de 2,6 mg/ml. Se añadió el detergente MEGA-10 en una concentración final de 2% en peso, la solución se incubó a 37ºC durante 15 minutos y después durante 60 minutos a temperatura ambiente. Con objeto de separar las proteínas de la cubierta solubilizadas de los desechos de virus, la solución anteriormente citada (1 ml) de 0,6 ml de sacarosa al 10% en PBS conteniendo MEGA-10 al 2% en peso sobre una solución de 2,8 ml de sacarosa al 30% en peso en PBS, fue cenrtifugada en un rotor Kontron TST 55.5 a 40.000 rpm durante 10 minutos. Se recogieron en una capa superior de 1,5 ml las proteínas de la cubierta libres.

La cantidad de proteína se determinó como 0,855 \mug. La actividad de hemaglutinina (HA) de las proteínas de la cubierta solubilizadas (570 \mug/ml) se determinó que era \geq1:4096 con ertrocitos del pollo.

Preparación de iscoms

A una cantidad de 570 \mul de proteína de la cubierta en un ml, se añadió 0,5 mg de colesterol (C) y 2,5 mg de Quil A (Spikoside, Advet, Lule\ring{a}, Sverige). La solución se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y después se sometió a diálisis durante 48 horas en un recinto frío.

Caracterización de los iscoms preparados

Se analizó el PR8-iscom (Fig. 2 B) por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa de 10-50%. Los volúmenes de las muestras que excedían de 1,5 ml fueron divididos y distribuidos en dos gradientes idénticos. Las muestras fueron centrifugadas en un rotor Kontron TST 41.14 a 39.000 rpm durante 18 horas. En todas las preparaciones hubo proteínas en forma de una capa superior en las fracciones 5, 6, 7 y 8 con un valor máximo en la fracción 6. Esto está en línea con lo que se espera de una partícula de iscom. Se detectó el colesterol C^{14} radiactivo en las mismas fracciones. El nivel de proteína se determinó según el método de Bradford.

Otra caracterización se llevó a cabo por microscopía electrónica (Fig 3). Los iscoms fueron examinados también con respecto a su capacidad de hemaglutinación. Los PR8-iscoms aglutinaron los glóbulos rojos de las gallinas.

Experimentos de inmunización en el ratón con objeto de estudiar el desarrollo de la respuesta inmunitaria durante 48 días después de dos inmunizaciones por vía intranasal

Siete grupos de cinco ratones en cada uno, fueron inmunizados por vía i.n. con 7 \mug de PR-8-iscoms con un intervalo de tres semanas y se siguieron las respuestas de anticuerpos en el suero y en secreciones pulmonares con el ensayo ELISA como se demuestra en la Fig. 9.

Respuesta de anticuerpos en el suero

La Fig. 9 A muestra que la respuesta total de anticuerpos se elevó hasta un valor recíproco del título obtenido por el ensayo ELISA de aproximadamente 1000 después de una inmunización. Una semana después de la inyección de refuerzo se obtuvo una elevación de 40 veces los títulos totales de anticuerpos. El día 50, o sea, 30 días después de la segunda inmunización por vía intranasal, los títulos estaban todavía en el mismo nivel elevado de anticuerpos.

La Fig. 9 B muestra que se observaron títulos altos de anticuerpos en sueros, de las subclases de IgG, IgG1, IgG2a y en IgG2b. La Fig. 9 c muestra que la respuesta sérica de IgA contra PR8 en el suero fue relativamente baja.

Respuesta de anticuerpos en secreciones de los pulmones

La Fig. 9 D muestra que después de una inmunización pueden medirse títulos bajos de anticuerpos del tipo IgA, con el ensayo ELISA, por absorbancia a 450 nm y en dilución 1/90. Después de una segunda inmunización, puede observarse un efecto de refuerzo bien definido con una elevación clara de los título de anticuerpos de IgA contra PR8.

Conclusión

Una dosis baja de PR8-iscoms induce, después de solamente una inmunización i.n., una respuesta de anticuerpos en el suero así como también en secreciones pulmonares. Después de dos inmunizaciones por vía intranasal se consiguen elevaciones potentes tanto en el suero como en secreciones pulmonares. Las respuestas de anticuerpos son inesperadamente altas después de inmunización i.n. con dosis bajas de antígeno en iscoms en comparación con otras formulaciones descritas en la bibliografía científica, que, por tanto, requieren varias inmunizaciones así como también dosis más altas.

Esto implica que es posible formular un programa práctico de inmunización basado en inmunización por vía intranasal con iscoms de la composición correcta.

Ejemplo 4

ISCOMS CON MOLÉCULAS QUE BUSCAN DIANAS, PROCEDENTES DE VIRUS DE LA INFLUENZA Y ANTÍGENO PASAJERO (OVA).

Métodos Preparación de iscoms en forma de partículas portadoras para inmunización local por medio de membranas mucosas

La ovoalbúmina (OVA) es una proteína que en dosis bajas no induce espontáneamente una respuesta inmunitaria cuando se administra por medio de las membranas mucosas. Además, la OVA es una proteína que no se incorpora espontáneamente en iscoms. En este experimento, una cola de lípido se copula, por tanto, a la OVA. La OVA lipidada y la proteína de la cubierta del virus de la influenza fueron incorporadas a iscoms. Estos iscoms, que contienen tanto una proteína de la cubierta viral (proteína objetivo) como OVA (antígeno pasajero), se usan para inmunización intranasal de ratones.

Etapa 1

Lipidación de OVA según el ejemplo 2

Etapa 2

Formulación de proteína de la cubierta del virus de la influenza (véase página 29)

\newpage

Etapa 3

Formulación de iscoms con proteinas de la cubierta PR8 y ovoalbúmina (OVA)

1 mg de colesterol (C), 350 \mug de la proteína de la cubierta PR8 procedente de la etapa 2 y 5 mg de Quil A (Spikoside, Advet., Lule\ring{a}, Sverige) se añadieron a la solución de OVA lipidada. El volumen total de la solución ascendía a 2,7 ml y se incubó en primer lugar durante 2 horas a temperatura ambiente, después se sometió a diálisis frente a PBS durante la noche, a temperatura ambiente, y luego durante 48 horas manteniendo en temperatura baja (+ 4ºC).

En experimentos testigo se prepararon iscoms con solamente PR8 e iscoms con solamente OVA lipidada.

Caracterización de PR8-iscoms

OVA-iscoms (fig. 2 A; 3 A), PR8-isocms (fig. 2 B; 3 B) y OVA-PR8-iscoms (fig. 2 C; 3 C) fueron caracterizados mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa de 10-50%. Los volúmenes de muestra que excedían de 1,5 ml fueron divididos y aplicados en dos gradientes idénticos. Las muestras fueron centrifugadas durante 18 horas en un rotor Kontron TST 41.14, a 39.000 rpm. En todas las preparaciones la proteína fue detectada como un pico en las fracciones 5, 6 y 7, con un valor máximo en la fracción 6. La sedimentación y la morfología de la partícula está en línea con las expectativas de un iscom. El colesterol radiactivo y PE fueron detectados y apreciados como picos en las mismas fracciones. El nivel de proteína se determinó según el método de Bradford. La Fig. 2 indica el nivel de proteína y la radiactividad del colesterol o PE como función de fracciones para las partículas de iscom preparadas.

Experimentos de inmunización en el ratón

Cinco grupos de cinco ratones (NMRI) fueron inmunizados de acuerdo con el plan siguiente:

Grupo	Sustancia inmunizante	Modo de administración
A	OVA-iscom	5 \mug de antígeno, i.n.
B	OVA/PR8-iscom	5 \mug de antígeno, i,n,
C	OVA/PR8-iscom	10 \mug de antígeno, i.n.
D	PR8-iscom	5 \mug de antígeno, i.n.
E	OVA/PR8-iscom	5 \mug de antígeno, s.c.

La dosis indica la cantidad total de antígeno compuesto, aproximadamente, de partes iguales de OVA y PR8-antígeno, respectivamente. Los ratones fueron anestesiados con Metofano (Pitman Moore) y las dosis de antígeno establecidas en el plan anterior fueron administradas por vía i.n., dos veces, separadas cuatro semanas, en un volumen de 20 \mul, por vía intranasal o en 200 \mul por vía subcutánea. Dos semanas después de la primera y segunda inmunizaciones fueron analizados mediante el ensayo ELISA los títulos de anticuerpos en el suero (Voller, A-; Bartlett, A., Bidwell, D.E. Scand. J. Immunol. 8, 123-129, 1978). Una tercera inmunización fue llevada a cabo el día 56 según el plan anterior. Dos semanas más tarde (día 70) los ratones fueron anestesiados y los vasos sanguíneos de los pulmones fueron enjuagados con PBS/heparina (0,1%) a través del ventrículo derecho. Los pulmones y el tracto respiratorios superior fueron diseccionados y sometidos a extracción durante alguna horas con saponina/solución de PBS (0,2%) y el material fue mantenido en un refrigerador, según se ha descrito en el Ejemplo 2. Los títulos de anticuerpos contra OVA y PR8, respectivamente, fueron determinados mediante el ensayo ELISA.

Respuesta de anticuerpos séricos contra OVA y PR8 después de inmunización con diferentes formulaciones de iscoms

La Fig. 10 A muestra que los OVA-PR8-iscoms inducen una respuesta alta de anticuerpos séricos contra OVA después de dos inmunizaciones por vía intranasal y todavía mayor después de tres inmunizaciones en comparación con OVA-iscoms sin proteína de la cubierta del virus de la influenza. Como era de esperar 10 \mug de iscoms de OVA-PR8 indujeron una respuesta de anticuerpos mayor que 5 \mug.

Las proteínas PR8 actúan como moléculas que buscan su objetivo en la membrana mucosa, cuando son administradas como el "antígeno pasajero" OVA. Es una característica sorprendente e inesperada que el OVA-iscom no tuvo efecto aparente sobre la inducción de la respuesta de anticuerpos, a la vista de la información encontrada en la bibliografía científica (A.M. Mowat, A.M. Donachie, ISCOMS-A novel strategy for mucosal immunisation, Immunol. Today, 12 (1991) 383-386). La razón de esta discrepancia es, sin duda, que se usan convencionalmente dosis irrealmente elevadas, es decir, desde 100 \mug hasta varios cientos de microgramos de OVA, para ser comparadas con 5 \mug hasta 10 g que se usan en las formulaciones antes descritas. En un experimento posterior se administraron por vía intranasal 10 \mug de OVA-iscoms e indujeron respuestas altas de anticuerpos (véase el Ejemplo 3). Las dosis bajas con los iscoms "que buscan su objetivo" antes descritos, hace posible, prácticamente, usarlos para inmunizaciones.

La Fig. 10 B muestra la respuesta de anticuerpos séricos contra PR8. Todas las formulaciones de iscoms que contenían PR8 indujeron respuesta de anticuerpos después de inmunización por vía i.n. y la respuesta resultó intensificada considerablemente después de la segunda administración.

Respuesta de anticuerpos en la secreción extraída de pulmones

La Fig. 10 C muestra la respuesta de anticuerpos de IgA en la secreción extraída de pulmones después de tres inmunizaciones, según se ha descrito anteriormente. 5 \mug y 10 \mug de los PR8-iscoms indujeron respuestas claras de anticuerpos de IgA, en relación con la dosis, después de inmunizaciones por vía intranasal, en comparación con los OVA-iscoms sin proteínas PR8 como moléculas que buscan su objetivo.

Los OVA-PR8-iscoms, inyectados por vía subcutánea, no indujeron respuesta de anticuerpos contra la OVA en la secreción pulmonar.

La Fig. 10 D demuestra que todas las formulaciones de iscoms que contienen PR8 como antígeno inducen altas respuestas de anticuerpos de IgA en secreciones pulmonares contra la PR8.

Conclusión

El experimento demuestra que ciertos antígenos en dosis bajas, tales como la OVA, requieren una formulación que guíe al antígeno hacia el sistema linfático cuando se administra sobre una membrana mucosa, ejemplificado en esta memoria por una administración intranasal, con objeto de inducir una respuesta óptima de anticuerpos en secreciones y en el suero.

El iscom con PR8 como molécula que busca su diana o molécula guía, cumple este requisito.

Fue inesperado que los PR8-OVA-iscoms fueron mucho más eficaces que el OVA-iscom sin proteína que busca su diana, en especial a la vista de la bibligrafía científica de que se dispone (Mowat) y de experimentos posteriores. Este hecho puede explicarse por la dosis baja de 5 \mug de OVA que ha sido utilizada en las inmunizaciones descritas.

Extensión del experimento

Este experimento, que usa proteínas del virus de la influenza como molécula que hace diana en el moco, para la OVA, fue extendido para incluir más ratones para conseguir 1. una mejor base estadística, 2. incluir los componentes de Quijalla 703 definidos, que se usan en ensayos clínicos. En este experimento el volumen se redujo desde los 45 a 40 \mul usados en los experimentos anteriores, a 20 \mul que podían simular mejor el volumen real de la dosis, tomando en consideración las dimensiones del ratón. Los iscoms y las formulaciones de matriz de iscom se prepararon según se ha descrito anteriormente.

En un primer experimento se compararon tres tipos de formulaciones, a saber, OVA-iscom (A), OVA/PR8-Iscom (B) y OVA libre complementada con matriz de iscom en entidades separadas (C). Después, en este caso, se comparó la respuesta de los ratones a inmunización intranasal, con la formulación citada que contenía o bien la Quillaja (QA) más cruda o el producto 703 Quillaja, definido.

El plan de inmunización se llevó a cabo mediante dos administraciones separadas seis semanas, según se describe a continuación:

		Dosis total de	Dosis de
		antígeno	QA/703
Grupo 1	OVA-iscom QA i.n.	8 \mug	65 \mug
Grupo 2	OVA-iscom 703 i.n.	8 \mug	65 \mug
Grupo 3	OVA/PR8-iscom QA i.n.	16 \mug	75 \mug
Grupo 4	OVA/PR8-iscom 703 i.n.	16 \mug	65 \mug
Grupo 7	OVA libre-matriz QA i.n.	10 \mug	50 \mug

(Continuación)

		Dosis total de	Dosis de
		antígeno	QA/703
Grupo 9	OVA libre-matriz 703 i.n.	10 \mug	50 \mug
10	OVA libre sin adyuvante i.n.	10 \mug	-
Testigos		antígeno	65 \mug
11		irrelevante

Resultados

Respuesta de anticuerpos en el suero a OVA como antígeno pasajero. Después de la primera y segunda inmunizaciones las respuestas de anticuerpos eran, en general, más altas en los ratones que habían recibido formulaciones de matriz que las de los ratones que habían recibido formulaciones de iscoms (A, B y C). La respuesta total de anticuerpos después de la segunda inmunización (en la Fig. 10 E están resumidos los resultados) fue máxima para las formulaciones con OVA, como una entidad separada, mezclada con matriz (C). Las formulaciones que contenían los componentes de Quillaja definidos, es decir, 703, respondieron con títulos de IgG ligeramente superiores a la OVA, que los de la QA más cruda (2 frente a 1; 4 frente a 3; 9 frente a 7). La respuesta de anticuerpos de la subclase de IgG2a fue también más alta para las formulaciones de 703.

La respuesta de IgG2a fue máxima en el suero de ratones inmunizados por vía subcutánea con OVA más matriz de iscom. De especial interés en lo que respecta al uso humano, es que la formulación de Quillaja con componentes de Quilalla definidos 703 es un inductor tan eficaz si no mejor, de respuesta de anticuerpos en el suero que las formulaciones a base de spikosido (QA) más crudas.

En el segundo experimento se comparó la respuesta de anticuerpos séricos a OVA, medida mediante el ensayo ELISA, después de inmunizaciones i.n., con la de ratones inmunizados por vía subcutánea (s.c.). El plan de inmunización se llevó a cabo con dos administraciones separadas seis semanas y se presenta a continuación:

		Dosis de antígeno	Dosis de QA/703
Grupo 3	OVA/PR8-iscom QA i.n.	16 \mug	75 \mug
Grupo 4	OVA/PR8-iscom 703 i.n.	16\mug	65 \mug
Grupo 5	OVA/PR8-iscom 703 s.c.	5 \mug	21 \mug
Grupo 6	OVA + matriz QA s.c.	20 \mug	10 \mug
Grupo 8	OVA + matriz 703 s.c.	20 \mug	10 \mug

Resultados Respuestas de anticuerpos séricos a OVA

Sorprendentemente, los análisis de las respuestas de anticuerpos séricos llevados a cabo mediante el ensayo ELISA después de dos inmunizaciones, mostraron que la inmunización por vía intranasal inducía respuestas de anticuerpos de magnitudes similares (Fig. 10 F) a las inducidas por vía subcutánea. La respuesta máxima (10^{4,3}) fue inducida por OVA libre con matriz de iscom como coadyuvante, con inmunización s.c., en comparación con OVA/PR8-iscoms o bien con QA o con componentes de Quillaja 703 (10^{3,9}).

Respuestas de IgA a OVA en secreciones

Las respuestas de IgA a OVA se midió en secreciones procedentes de pulmones (Fig. 10 G) y del tracto genital (Fig. 10 H). Los planes de inmunización para los diferentes grupos se indican en las páginas 20 y 21.

Pulmón: (Fig. 10 G) La máxima respuesta de IgA a OVA se obtuvo con iscoms de OVA/PR8 o bien con 703 (4) o con QA (3), OVA libre suplementada con matriz de 703 (9).

Inducción de respuesta de IgA anti-OVA en el órgano remoto, el tracto genital

En la Fig. 10 I se muestra que la máxima respuesta de IgA a OVA había sido inducida por OVA/PR8-isocms 703 (4) preparados con componentes de Quillaja 703 (10^{3,3 \ \pm \ 0,53}). Esta respuesta fue significativamente mayor que la inducida por administración i.n. de OVA mezclada y complementada con matriz en entidades separadas (7,9) Esta respuesta de IgA es de un nivel similar a la inducida en la secreción pulmonar. Una respuesta de anticuerpo de IgA sorprendentemente alta fue inducida por OVA-iscom (703) aun cuando inferior a la inducida por OVA/PR8-iscom (703) (10^{2,9 \ \pm \ 0,40} frente a 10^{3,3 \ \pm \ 0,53}).

Las respuestas a antígeno del virus (PR8) de la influenza en el suero y en secreciones

Las respuestas citadas en el epígrafe están de acuerdo, en general, con las indicadas en este ejemplo y en los ejemplos anteriores. Sin embargo, merece la pena hacer notar que después de dos inmunizaciones por vía intranasal con iscoms de OVA/PR8 conteniendo 703, se induce la máxima respuesta de IgG2a en el suero.

Comparativamente con la IgG1, los títulos de IgG2a en el suero aumentaron con el tiempo. La respuesta de anticuerpos séricos ensayada ocurrió desde la tercera sangría, lo que muestra que la respuesta de anticuerpos séricos es comparable con la inducida mediante la administración por vía subcutánea.

Conclusión

La proteína de la cubierta del virus de la influenza incorporada en iscoms tiene un interés particular para guiar la respuesta inmunitaria, medida mediante el anticuerpo IgA específico, en este caso a OVA, a sitios remotos de las mucosas, ejemplificado aquí por el tracto genital. Los componentes definidos 703 del origen de Quillaja saponaria molina son, por lo menos, tan eficaces, si no mejores, que el Quil A crudo spikosido que ha sido utilizado en experimentos anteriores por el Solicitante y otros. No ha habido razón alguna para esperar que esto sea corroborado por trabajo experimental. Es inesperado que las formulaciones de matriz de iscom sean tan eficaces, o incluso más eficaces, para la inducción de una respuesta de anticuerpos en el suero, después de administración i.n. de antígeno, que los iscoms. Se encontró por el contrario y en particular con iscoms con moléculas que hacen diana en el moco (proteínas PR8) que eran más eficaces que otras formulaciones ensayadas para inducir respuestas secretoras de IgA específicas, en particular en un órgano alejado. Aun cuando la alta respuesta de IgA en la secreción pulmonar es inesperadamente alta, es todavía más inesperado encontrar la alta respuesta de IgA en la mucosa del tracto genital, remota. También resultó inesperado que la administración i.n. de iscom de virus de la influenza con 703 fuera más eficiente que el iscom con Quil A más cruda, para la modulación y la respuesta de IgG2a medida en el suero.

Ejemplo 5

El Herpes simplex 2 (HSV-2) ocasiona infección en el tracto genital en una gran proporción, hasta el 10% de la población humana, y puede causar lesiones graves y sufrimiento. El HSV-2 es un virus con una cubierta que contiene varias proteínas de cubierta. Dos de éstas, la glicoproteína B (gB2) y la glicoproteína D (gD2), se considera que son antígenos que, si inducen el tipo correcto de respuesta inmunitaria, son de la mayor importancia para inducir protección contra la enfermedad e infección en condiciones óptimas. Dado que la infección con el HSV-2 ocurre a través del tracto genital, es deseable inducir una respuesta inmunitaria contra el HSV-2 en la membrana mucosa del tracto genital. En los experimentos que siguen el Solicitante ha preparado diferentes formulaciones de gB2 y ha examinado la respuesta inmunitaria en el suero y en la secreción procedente de los tractos respiratorios, el tracto genital y los intestinos. La proteína de la cubierta procedente de PR8, como en el ejemplo 2, ha sido usada como molécula que busca su objetivo y la proteína de la cubierta gB2 como antígeno pasajero.

Preparación de diferentes formulaciones de gB2

Se obtuvo gB2 como un producto recombinante, de Chiron, CA, EE.UU.

Matriz de iscoms, es decir, iscoms sin antígeno, se obtuvo de Advet, Lule\ring{a}, Suecia.

gB2 y gD2, respectivamente, fueron lipidadas e incorporadas en iscoms, del modo descrito en el Ejemplo 2.

6 grupos de 8 ratones (NMRI, hembras 18-20 g, procedentes del Instituto Veterinario Nacional (SVA), fueron inmunizados según el plan siguiente:

\newpage

Grupo	Inmunógeno	Dosis por antígeno
1	gB2-iscom	10 \mug
2	gB2/PR8-iscom	10 \mug
5	gB2+matriz de iscom	10 \mug
7	gB2	10 \mug
9	Testigo	10 \mug, ratones inmunizados
		con un antígeno irrelevante

Los ratones fueron inmunizados dos veces por vía intranasal (semana 0 y 9) y desde los pulmones se extrajeron secreciones 2 semanas después de la administración de la dosis de refuerzo (día 77) de cuatro ratones por grupo. Los pulmones, los tractos respiratorios superiores, los intestinos y el tracto genital de los ratones restantes, fueron extraídos, obteniendo la secreción del órgano el día 113. Las secreciones fueron analizadas para determinar la IgA secretora. Los extractos procedentes de estos órganos fueron recuperados tal como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Las respuestas de anticuerpos fueron ensayadas por el ensayo ELISA tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las respuestas de anticuerpos en los órganos fueron determinas por el ensayo ELISA tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las respuestas de anticuerpos en los órganos fueron ensayadas sobre muestras individuales desde el día 77. Las muestras desde el día 113 fueron ensayadas como una muestra de grupo procedente de cada órgano y cada grupo, respectivamente.

Resultados Respuesta de anticuerpos de IgA contra gB2 en secreciones pulmonares

Dos semanas después de la administración de la dosis de refuerzo, gB2 en forma libre (grupo 7) no había inducido respuesta de anticuerpos en el ensayo ELISA (Fig. 11 A). Los títulos de IgA máximos (10^{4,8}) fueron obtenidos dos semanas después de la administración de la dosis de refuerzo i.n. (día 77) con los ratones del grupo 2, es decir, ratones inmunizados por vía i.n. con gB2/PR8-iscom, o sea, con proteínas de la cubierta, PR8, como moléculas que buscan su objetivo. Los gB2-iscoms sin molécula que busca su objetivo (10^{2,4}), así como gB2 en mezcla con matriz de iscom (10^{3,7}) inducen también títulos de anticuerpos relativamente altos en la secreción pulmonar, aún cuando con títulos 10 y 100 veces menores, respectivamente.

El día 113 se midió la respuesta de anticuerpos en la secreción pulmonar procedente de los restantes ratones. Los títulos de anticuerpos habían disminuido considerablemente pero se observó el mismo esquema de respuesta de anticuerpos que el del día 77.

Respuesta secretoria de IgA en otras membranas mucosas distintas de la del sitio de administración

En la Fig. 11 B se demuestra la respuesta de IgA después de dos inmunizaciones contra gB2 en secreciones diferentes (grupos reunidos), es decir, en el tracto respiratorio superior, el tracto genital y los pulmones. Se obtuvieron respuestas de IgA retalivamente altas contra gB2 en el tracto genital después de inmunización con gB2-iscoms, gB2/PR8-iscoms y gB2 mezclado con matriz de iscom. En el tracto respiratorio superior la respuesta de IgA después de inmunización con gB2 suplementada con matriz de iscom fue menor que la obtenida después de inmunizar con gB2-iscoms y gB2/PR8-iscoms.

Respuesta de anticuerpos contra PR8

Contra el antígeno PR8 incluido en la formulación de gB2/PR8-iscom se observaron altos niveles de anticuerpo tanto en la secreción como en el suero. Los ratones del grupo testigo no tenían respuestas de anticuerpos de IgG ni IgA detectables ni en el suero ni en la secreción pulmonar (no se indican los resultados).

Respuesta de anticuerpos séricos a gB2

La respuesta total de anticuerpos séricos de IgG, a gB2 dos semanas después de la segunda inmunización i.n. (día 77) (no mostrada). La máxima respuesta total de anticuerpos séricos medida por el ensayo ELISA el día 77 fue inducida por gB2/PR8-iscom y gB2 complementada con matriz de iscom, en entidades separadas. El gB2 solo (7) indujo también mediante administración i.n. títulos claros, específicos, de anticuerpos séricos, aunque un título 10 veces inferior o más comparado con la matriz de iscom y las formulaciones de iscoms. El día 113 después de la vacunación los títulos totales en el suero habían aumentado o permanecido en el mismo nivel, excepto para la preparación con gB2 solo, cuyo título en el suero había disminuido considerablemente.

La respuesta de anticuerpos séricos de IgG1 fue máxima para la construcción gB2/PR8, con un título de 10^{6,5} en comparación con 10^{5,2} para la formulación de gB2 de matriz de iscom y 10^{5,3} para iscom de gB2. Las formulaciones con gB2 solo indujeron un título en el suero casi 10 veces menor.

El día 113 los títulos de IgG1 inducidos por el iscom o la formulación de la matriz de iscom habían aumentado o permanecido por encima de 10^{6}, excepto para gB2 solo, cuyo título había disminuido 10 veces (los resultados no se indican).

La respuesta de anticuerpos séricos de IgG2 fue máxima para el gB2-matriz (10^{5,0}) y gB2/PR8-iscom, 10^{4,8}el día 77 y aproximadamente un título 10 veces menor para los gB2-iscoms y gB2 dolo/Fig. 11 C).

El día 113 los títulos de anticuerpos séricos de IgG2 había aumentado para el iscom y las formulaciones de la matriz de iscom 10 veces o más, mientras que los títulos de anticuerpos de IgG2 en el suero para GB.2 habían disminuido considerablemente.

Conclusión Respuesta de anticuerpos en el suero

La proteína de gB2 por sí misma induce respuestas de anticuerpos en el suero en ambas de las subclases IgG1 e IgG2, que fueron máximas el día 77. 5 semanas después de la segunda inmunización por vía intranasal (Día 113) los títulos de anticuerpos de IgG1 e IgG2 habían disminuido considerablemente. Por el contrario los ratones inmunizados con formulaciones de gB2-iscom y formulaciones de gB2/PR8-iscom y formulaciones de iscom-matriz habían aumentado 10 veces o más el total así como también los títulos de anticuerpos séricos de las subclases IgG1 e IgG2. Estos resultados indican claramente que el iscom y las formulaciones de matriz de iscom, después de administrar a las mucosas, inducen una prolongación importante de la respuesta inmunitaria en comparación con la gB2 sin adyuvante.

Las formulaciones de gB2/PR8-iscoms y gB2/matriz de iscom son más eficaces con respecto a la inducción de respuesta de IgG2a que las otras formulaciones ensayadas.

El gB2 solo muestra tener una capacidad innata de inmunomodulación con capacidad para inducir respuestas de anticuerpos de IgG1 y de IgG2a. Esta última se considera que requiere la producción de interferón-\gamma. Estos resultados están en contraste con los de gD2 del Ejemplo 6 que muestran que el gD2 es, por sí mismo, pobremente inmunógeno por vía i.n. y que no posee la capacidad de modular como respuesta de IgG2a. Los resultados del Solicitante indican también que el gB2 puede ser útil en la modulación de las respuestas inmunitarias, acaso también por proteínas circunstantes.

La gB2 posee la propiedad de autoagregación y se agregan y asocian con componentes de Quillaja (no indicado), lo que en parte explica la diferencia existente entre gB2 y gD2, siendo esta último más hidrófila y no teniendo tendencia a la agregación ni espontáneamente por asociación con Quillaja ni con componentes de Quillaja.

Ejemplo 6

Este ejemplo muestra que el antígeno del virus de la influenza (PR8) incorporado en iscoms, actúa como un buscador de diana para sistemas linfoides en diversas membranas mucosas, es decir, pulmones, tractor respiratorio superior y tractos genitales. El antígeno pasajero consta de gD2 procedente de Herpes simplex 2 (HSV-2) que ocasiona enfermedad en los tractos genitales y, por consiguiente, es de desear una vacuna contra el HSV-2.

La gD2 es lipidada con el mismo método que la OVA del Ejemplo 2. Los iscoms fueron pfreparados del mismo modo que en el Ejemplo 2 y 5. La matriz se obtuvo de Advet, Lule\ring{a}, Suecia.

Grupo	Inmunógeno	Dosis por antígeno
3	gD2-iscom	10 \mug
4	gD2/PR8-iscom	10 \mug
6	gD2+matriz de iscom	10 \mug
8	gD2	10 \mug
10	Testigo

Los ratones fueron inmunizados según el mismo plan que se ha descrito en el Ejemplo 5, para gB2. La respuesta de anticuerpos fue determinada mediante el ensayo ELISA que se ha descrito en el Ejemplo 2. La respuesta de anticuerpos en órganos fue ensayada en muestras individuales el día 77. Las muestras procedentes del 113 fueron ensayadas como una muestra de grupo desde cada órgano y cada grupo, respectivamente.

Resultados Respuesta secretoria de IgA en secreciones pulmonares después de inmunización intranasal con diferentes formulaciones de gD2

La Fig. 12 A muestra que la máxima respuesta de IgA en secreciones pulmonares se obtuvo en los ratones de los grupos 3, 4 y 6, es decir, ratones que habían sido inmunizados por vía intranasal con gD2-iscom, gD2/PR8-iscom y gD2 en mezcla con matriz de iscom respectivamente.

Respuesta secretoria de IgA en membranas mucosas alejadas del sitio de administración

La Fig. 12 B muestra que respuestas eficientes de IgA en secreciones del tracto genital, obtenidas con gD2-iscom, con una molécula que busca su objetivo (gD2/PR8-iscoms), se obtuvieron después de dos inmunizaciones i.n. en oposición a otras formulaciones con iscoms o matriz de iscom.

Respuesta de anticuerpos contra PR8

Altas respuestas de anticuerpos contra PR8, por formulaciones de gD2/PR8-iscom fueron observadas tanto en secreciones como en el suero.

Respuesta de anticuerpos en el suero a gD2

La respuesta de anticuerpos en el suero a gD2 dos semanas después de la segunda inmunización por vía intranasal (día 77) se muestra en la Fig. 12 C. La gD2 es diferente de la gB2, Ejemplo 5, en el sentido de que la gB2 se agrega y es relativamente inmunógena por sí misma sin adyuvantes añadidos, indicado también en el Ejemplo 5. Esta propiedad indica asimismo una capacidad de inmunomodulación "innata". La gB2, por el contrario a la gD2, se asocia eficazmente con iscom y matriz de iscom formando agregados incluso con una proporción baja de Quillaja/gB2. En contraposición, la gD2 es hidrófila, monómera y probremente inmunógena sin complementación con adyuvante.

La máxima respuesta de anticuerpos totales en el suero medidas por el ensayo ELISA tuvo lugar el día 77, inducida por gD2/PR8-iscom por gD2-iscoms.

Lo más sobresaliente es que la gD2 por sí misma (8) (Fig. 12 C) por el contrario a gB2 sola no indujo una respuesta de anticuerpos séricos medible, por administración i.n. La respuesta de anticuerpos séricos de IgG1 fue máxima para el gD2-iscom (3) y gD2/PR8-iscom (4) siendo 10 veces mayor y significativamente superior a la de la formulación de gD2/matriz de iscom (Fig. 12 C). El día 77 los títulos de anticuerpos séricos de IgG2a eran considerablemente o 300 veces superiores para los gD2/PR8-iscoms que para los gD2-iscoms o 500 veces superiores a los obtenidos con la formulación de gD2/matriz de iscom.

El día 113 después de la primera inmunización, la respuesta total de anticuerpos séricos l permanecía en aproximadamente el mismo nivel que para el día 77 para el gD2-iscom y los gD2/PR8-icoms, y la formulación de matriz de gD2 había alcanzado también los niveles del iscom (10^{4,8}). El día 113, los niveles de IgG1 eran similares para el iscom y las formulación de matriz de iscom, pero la respuesta de IgG2a a gD2 era 10 veces mayor en el suero de los ratones inmunizados por vía intranasal con la formulación de gD2/PR8-iscom, es decir, 10^{4,1,} que la obtenida para gD2-iscoms sin proteína que busca el objetivo y gD2 complementada con matriz de iscom.

Conclusión

La proteína gD2 por sí misma tiene, por el contrario a la gB2 del Ejemplo 5, mala capacidad para inducir y modular hacia una respuesta inmunitaria, incluyendo la capacidad de producir una respuesta específica de IgG2a. Esto último se considera que refleja la participación de un tipo de respuesta Th1 con la producción de interferón-\gamma. El gD2/PR8-iscom, es decir, un iscom con una molécula que hace diana o que guía hacia el moco, mostró una capacidad potente para inducir una respuesta de anticuerpos en el suero por vía intranasal, una capacidad muy fuerte y clara para inducir (modular) una respuesta de anticuerpo sérico de IgG2a, considerado como un tipo importante de respuesta inmunitaria para proteger contra infecciones de virus herpes.

Lo más importante es que este ejemplo pone de manifiesto que la combinación de un iscom con un antígeno pasajero (gD2), por sí mismo bastante inactivo (inerte) desde el punto de vista inmunológico, con moléculas de proteína inmunológicamente activas (moléculas de PR8) que actúan como moléculas que hacen diana activamente en el sistema inmunitario después de un modo de administración a las mucosas y de activación del sistema inmunológico el antígeno pasajero se convierte en un antígeno potente de las mucosas, en este caso una molécula gD2 altamente inmunógena.

Ejemplo 7

Micoides de subespecies de Mycoplasma mycoides (MmmSC) es el organismo causante de la Pleuropneumonía Bovina Contagiosa (CBPP) que es responsable de grandes pérdidas económicas en el ganado. Esta enfermedad se está propagando en muchos paises africanos y en algunos países de Asia así como por el sur de Europa, o sea, en Portugal y España. El periodo de latencia extendido durante el cual el ganado infectado no muestra síntomas, hace difícil su erradicación y es de supremo interés el disponer de medidas eficaces de control contra la enfermedad. Desde los comienzos del siglo veinte, se han llevado a cabo esfuerzos de vacunación incluyendo una diversidad de cepas vacunales atenuadas y vacunas inactivadas (Walker, J., Ann. Rep. Dept. Agric. Kenya, p. 240-243, Nairobi, 1929; Curasson, G. Bull. Acad. Vet. Fr. 5, 179-184, 1932; Hudson, J.R., Australian Vet. J. 41, 43-49, 1965).

Todavía, se carece de una vacuna eficaz para inducir una protección de larga duración contra la infección natural que tiene lugar por medio del tracto respiratorio. En el ejemplo presente el Solicitante analiza la respuesta inmunitaria después de administración intranasal de iscoms que contienen los antígenos del M. mycoides liberados del microorganismo por solubilización con detergente.

Materiales y métodos

Productos químicos y soluciones.

PBS, como en el ejemplo 2.

Saponina (Sigma No S-1252) o QA (Advet AB, Estocolmo, Suecia).

Véase el ejemplo 2.

La octilglucasida, detergente, (OG) fue adquirida de Boehringer Mannhein, Alemania. Se usó en forma de una solución de reserva al 10% en agua.

El detergente MEGA-10 se obtuvo de Bachem, Bubendort, Suiza.

Quil A (Spikoside), fue de Advet AB (Estocolmo, Suecia) (ejemplo 2).

Los lípidos, colesterol y 1,3-fosfatidilcolina de yema de huevo (ambos de calidad del 99%-100%), tiroglobulina, albumina de suero bovino (BSA), el sustrato DAB, lectinas biotiniladas; Con A, WGA, SBA, UEA, y estreptavidina conjugada con HRP, eran de Sigma (St. Louis, Mo. EE.UU.).

Inmunoglobulinas de conejo anti-ratón marcadas con HRP eran de Dakopatts (Conpenhague, Dinamarca).

El reactivo TMB, el H_{2}O_{2} y las tabletas de tampón de revestimiento se compraron a SVANOVA Biotech (Uppsala, Suecia).

El Tween-20 era de Merck (Darmstadt, Alemania).

Micoplasma

Las cepas de MmmSc Afade y T1/44 fueron suministradas por el laboratorio Pathotrop, CIRAD-EMVT, Montpellier, Francia.

Formación de iscoms

Se prepararon iscoms de células de MmmSc totales según se ha descrito para el PR8. En breve, a una muestra de micoplasma de aproximadamente 5 mg en un volumen de 5 ml, se añadió el detergente MEGA-10 u OG hasta una concentración final de 2% y se dejó durante 2 horas a temperatura ambiente. El material solubilizado (5 ml) se extendió en forma de capa sobre la parte superior de sacarosa al 10% en PBS en un volumen de 2 ml conteniendo MEGA-10 al 0,5% u OG al 0,5% con una capa de sacarosa al 30% en PBS debajo. Las proteínas solubilizadas fueron separadas del material insoluble mediante centrifugación a 40.000 rpm durante 1 hora, a 20ºC, en un rotor TST 41.14. Las fracciones de la parte superior, que estaban constituidas por el volumen de la muestra y la capa de sacarosa del 10%, fueron recogidas, se añadieron el colesterol, la fosfatidilcolina y Quil A, se mezclaron en una proporción p/p de 10:2:1:20 y se sometió a diálisis extensa frente a PBS durante la noche, a temperatura ambiente, y durante 48 horas más en recinto frío. Los iscoms formados fueron purificados posteriormente de las proteínas sin incorporar mediante sedimentación a través de una capa doble de sacarosa al 10%y 20%, a 39.000 rpm durante 19 horas a 10ºC, en un rotor TST 41.14. Los iscoms sedimentados fueron resuspendidos en PBS y mantenidos a -70ºC hasta que se utilizaron.

Inmunización de ratones por vía intranasal

La administración i.n. de iscoms de MmsmSC de la cepa Afade fue llevada a cabo en ratones por instalación de antígenos en los ollares de animales, bajo anestesia (Metofano). 12 ratones hembra Balb/c de 8 semanas de edad fueron divididos en 4 grupos de 3 animales cada uno. Los ratones de los grupos 1, 2 y 3 recibieron 3, 10 y 20 \mug, respectivamente, de vacuna de iscom por vía intranasal, dos veces, separadas 7 semanas. El grupo 4 sirvió de animales testigo sin inmunizar. Los animales fueron sangrados a 2, 4 y 7 semanas después de la dosis inicial y 2 semanas más tarde, después de la dosis de refuerzo, se tomó otra muestra de sangre.

Preparación de extractos de pulmón hecha según se ha descrito en el Ejemplo 2 Ensayo ELISA para determinar IgA en sangre y en el tracto pulmonar

Se revistieron placas para el ensayo ELISA con 100 \mul de células MmsmSC de la cepa Afade, en una concentración de 0,4 \mug/pocillo en tampón de revestimiento (tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6) y se incubó a +4ºC durante la noche o más. Todos los lavados (x 3) fueron llevados a cabo con solución salina tamponada con fosfato (150 mM, pH 7,5) que contenía Tween-20 al 0,2% (PBS-T). Los pocillos fueron bloqueados con 200 \mul de BSA al 2% en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación. 100 \mul de sobrenadantes de la suspensión de pulmón o el suero en tampón de bloqueo fueron diluidos al doble e incubados a temperatura ambiente durante la noche. Se añadieron 100 \mul de diluciones 1:10.000 de conjugado de HPR-Estreptavidina en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción enzimática se visualizó por adición de 200 \mul de tampón de sustrato (TMB, H_{2}O_{2}) durante 15-20 minutos, a temperatura ambiente, después de lo cual se detuvo la reacción mediante 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M, y se midió la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro Titertek Multiscan. La supensión pulmonar y el suero procedentes de animales testigo negativos se usaron como fondo y para calcular el corte.

Transferencias western

Las transferencias western fueron hechas según Towbin, H., Staehlein, T. y Gordin, J., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 4350-4354, 1979 usando papel de nitrocelulosa de Schleicher y Schüll, Alemania. El isocom y los antígenos totales de MmsmSC fueron resueltos en un Gel con 12% de SDS.

Resultados

Las respuestas de anticuerpos séricos totales fueron medidas mediante el ensayo ELISA Una elevación estacionaria de anticuerpos se obtuvo hasta la semana 4. Después que los animales recibieron una dosis de refuerzo se registró después de 2 semanas un aumento de 3 a 5 veces los niveles de anticuerpos séricos. Las respuestas de anticuerpos aumentaron con dosis crecientes, leyendo títulos de punto final de aproximadamente 10^{6} (Fig. 13 A).

Las respuestas de IgA en el suero (Fig. 13 B) y en los extractos de secreción pulmonar (Fig. 13 C) fueron medidas mediante el ensayo ELISA. Se detectaron niveles secretorios de IgA en diluciones de hasta 1:8000. Se observaron el suero títulos de IgA aproximadamente similares. Los títulos de IgA aumentaron al aumentar las dosis.

En la transferencia western (WB) la secreción pulmonar procedente de ratones inmunizados con iscoms por vía intranasal, se detectaron iscoms de aproximadamente 10 bandas de polipéptidos y más de 20 bandas se detectaron en el suero de los mismos ratones. El suero procedente de ratones inmunizados por vía subcutánea detectó algunas proteínas diferentes (Fig. 13 D) de las del suero de ratones inmunizados por via intranasal. El extracto pulmonar (A) detectó aproximadamente 10 bandas de las que todas excepto dos bandas fueron detectadas en el suero procedente de ratones inmunizados por vía intranasal (véase la flecha). Es probable que los antígenos detectados por la vía i.n. sean glicolípidos, indicados por el aspecto esponjoso, no discreto, típico de las estructuras de los hidratos de carbono. Esto significa que la inmunización por vía intranasal abre un pronóstico adicional para la inmunización contra hidratos de carbono, a la inmunización con antígenos que no son inmunógenos por otros modos de administración.

Conclusión

Los resultados muestran que los antígenos de Mycoplasma actúan tanto como moléculas que buscan su objetivo que como antígenos pasajeros, ya que aproximadamente diez antígenos tales como los descritos por la transferencia western (WB) inducen respuestas de IgA. Es de interés particular e imprevisto que el repertorio de antígenos detectados en la transferencia western era diferente usando suero de ratones inmunizados por vía i.n. del obtenido usando suero procedente de ratones inmunizados por vía s.c. Esto significa que la vía i.n. puede ser usada para inducir una respuesta inmunitaria a antígenos, que no podría hacer la vía parenteral. Muchos de los antígenos detectados como bandas en la transferencia western por el suero procedente de ratones inmunizados por vía i.n., no eran discretos como los detectados por el suero de ratones inmunizados por la vía s.c. Este fenómeno sugiere fuertemente que las estructuras de hidratos de carbono son detectadas por la vía i.n. y que la vía i.n. debe ser usada como alternativa para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno o a determinantes antigénicos no reconocida por el modo parenteral (s.c.) de inmunización, por ejemplo de estructuras de hidratos de carbono. Es de suma importancia la inducción de una respuesta inmunitaria contra polisacáridos sobre diversas bacterias tales como Pneumoccus pneumonia, Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumonia.

Ejemplo 8 Inmunidad protectora de las mucosas inducida en el cordero mediante la administración oral de rotavirus inactivados con matriz de iscom como adyuvante Introducción

Los rotavirus son reconocidos como la causa principal de enfermedades diarréicas graves en niños menores de 5 años en países tanto desarrollados como en desarrollo, dando como resultado unas 870.000 muertes y varios millones de casos de diarreas graves, anualmente, en este grupo de edad. Tienen una significación similar como causa de la diarrea neonatal en muchas especies de animales domesticados. Con excepción de un estudio que describe la respuesta inmunitaria primaria de las mucosas en el conejo, ha habido poca caracterización detallada de esta respuesta.

En este Ejemplo se examina la hipótesis de que una respuesta inmunitaria de las mucosas así como una respuesta sistémica pueden ser inducidas después de inmunización oral con rotavirus bovinos inactivados y matriz de iscom, lo que podría resultar en una respuesta inmunitaria protectora al enfrentamiento subsiguiente con virus virulentos vivos. Ha de hacerse hincapié también en que los corderos de este experimento (de 6 días de edad) eran muy jóvenes y de que están en una edad en la que son menos inmunocompetentes que los adultos (Ridge, J.P., Fuchs, E.J., Matzinger, P. Science 271, 1723-26, 1966; Billingham, R.E., Brent, L., Medawar, P.B. Nature 172, 603, 1953; Bandeira, A., Coutinho, A., Carnaud, C. Jacquemart, F. Forni, L. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86, 272, 1989; Schurmans et al., J. Immunol. 145, 2465, 1990) y durante un período de tiempo es de esperar que los anticuerpos maternos prevalezcan, lo que hace todavía más difícil la vacunación con éxito. Por tal razón sería aun más interesante explorar si la combinación de una administración oral a las mucosas con un sistema moderno de adyuvante puede obviar el problema de la inmunización neonatal.

Material y métodos Virus

El virus vacunal era una cepa de rotavirus bovino, UK, cultivada en células MA 104. El título de infectividad, antes de inactivación, era 10^{6,8} unidades fluorescentes de foco (ffu)/ml, y después de tratamiento con una solución al 5% (v/v) de una etilenimina binaria (BEI) 0,1 M a 37ºC durante 24 horas, no se detectó infectividad. Para el enfrentamiento se usó la cepa K923 de rotavirus virulentos de cordero pasados en corderos gnotobióticos. Cada cordero recibió 10^{8,5}ffu suspendidos en 5 ml de PBS estéril.

Diseño del experimento

Los corderos nacieron y fueron mantenidos en unidades aisladoras gnotobióticas. A la edad de 6 días, los corderos fueron inoculados por vía oral con una mezcla de o bien PBS y 500 \mug de matrices de iscom (Advet, Uppsala, Suecia) (PBS/ISC; n=6), rotavirus bovinos inactivados (cepa UK) y 500 \mug de matrices de iscom (RV/ISC; n=5) o rotavirus bovinos inactivados solamente (RV; n=3). Los corderos fueron enfrentados 21 días después con rotavirus ovinos virulentos vivos (cepa K923) y sacrificados 1-2 semanas después del enfrentamiento.

Recogida de muestras y análisis

Se recogió sangre para obtención del suero y secreciones nasales en la inmunización inicial y después, a intervalos regulares, para determinar los niveles de anticuerpos específicos y totales de IgA e IgG, mediante el ensayo ELISA y los títulos neutralización mediante ensayos de neutralización de virus. Se recogieron diariamente muestras de las heces, después de la inmunización y del enfrentamiento hasta que no se detectó por más tiempo la excreción de rotavirus. La excreción de rotavirus se analizó por detección de RNA de doble hebra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Se recogiron PBLs en la etapa inicial de inmunización y luego a intervalos semanales para determinar los números de células que secretan IgA e IgG específicas mediante ELISPOTs, y la distribución de subpoblaciones de linfocitos mediante análisis FACS. Los corderos fueron sacrificados 1-2 semanas después del enfrentamiento y se aislaron las poblaciones de linfocitos a partir de parches de Jejunum Peyers (JPPs), parches de Ilium Peyers (IPPs), nódulos linfáticos mesentéricos (MLNs) y linfocitos epiteliales intesticiales del intestino delgado y linfocitos de la Lámina propia (IEL y LPL). Los números de células productoras de IgA e IgG específicas en JPPs, MLNs y LPLs, se determinaron mediante ELISPOT. Las subpoblaciones de linfocitos fueron analizadas mediante FACS. La expresión de citoquinas (\gamma-IFN. IL-2 e IL-4) en MLNs y JPPs fue visualizada mediante RT-PCR e hibridación. Los niveles de anticuerpos específicos y totales de IgA e IgG y los títulos de neutralización en las secreciones intestinales fueron determinados usando moco intestinal.

Aislamiento de linfocitos

Se recogieron los linfocitos de sangre periférica y fueron procesados según se ha descrito anteriormente (Puri, N.K., MacKay, C.R., Brandon, M.R. Immunology 55, 725-33, 1985) y resuspendidos a la concentración apropiada en IMDM completo conteniendo glutamina 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina G, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y procesados según se ha descrito anteriormente. Finalmente, los linfocitos fueron suspendidos, a las concentraciones apropiadas, en IMDM completo. Se recogieron fragmentos de intestino delgado y se procesaron con modificaciones menores de los métodos anteriormente descritos. El intestino delgado se cortó en segmentos de 10 cm, se invirtió, se lavó tres veces a 37ºC agitando suavemente en HBSS sin calcio ni magnesio conteniendo EDTA 2 mM para desprender las células epiteliales y los linfociros intraepiteliales. Los tejidos fueron lavados con RPMI 1640 y colocados en RPMI que contenía glutamina 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, 5 \mug/ml de gentamicina, 80 unidades/ml de Collagense XI (Sigma), 0,1 mg/ml de desoxirribonucleasa tipo V (Sigmna) y FCS al 10%, a 37ºC, para permitir la separación de los lifocitos de la Lamina propia. Las suspensiones de IEL y LPL fueron hechas pasar a través de columnas de lana de vidrio estéril, depositadas en forma de capa sobre volúmenes iguales de Lymphoprep® y centrifugadas. Los linfocitos fueron cosechados en la interfase y lavados dos veces con HBSS que contenía glutamina 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, y FCS al 2% antes de ser suspendidos, a la concentración apropiada, en IMDM completo.

Ensayos Ensayos de neutralización de virus

Los ensayos de neutralización de virus para la cepa UK de rotavirus bovinos y la cepa K923 de rotavirus de cordero, fueron llevados a cabo en placas de microtitulación y los puntos finales o título de neutralización de virus (VNT) se determinaron por reducción de 60% de unidades fluorescentes de foco.

Ensayos ELISA

Los ensayos ELISA de rotavirus específicos utilizaron placas de microtitulación (Nunc, Maxisorb), revestidas con un suero de conejo de captura anti-rotavirus, RV de cordero K923 y extractos de MA 104 sin infectar como testigo negativo de unión de antígenos, las muestras de ensayo y las muestras testigo, IgG de asno anti-oveja conjugada a peroxidasa de rábano picante- (El sitio de unión) o igA de ratón anti-bovina, desarrollándose el color por adición de H_{2}O_{s} y \sigma-fenilenodiamina dihidrocloruro, de sustrato, a la peroxidasa unida. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2 M y se midió la absorbancia a 490 nm. La absorbancia neta se calculó sustrayendo los valores de los pocillos negativos de los de los correspondientes pocillos de K923.

Los ensayos ELISA de isotipos totales utilizaron placas de microtitulación revestidas con Igs de conejo anti-oveja (DAKO) o IgA porcina anti-oveja, muestras de ensayo, diluyente y muestras testigo, IgG de conejo anti-oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce) o IgA de ratón anti-bovina, con el mismo desarrollo de color anteriormente descrito. Los valores de la densidad óptica de los pocillos de diluyente fueron restados de los de los correspondientes pocillos de ensayo. Para cada ensayo ELISA se usó un patrón: un suero de cordero hiperinmune para la concentración de IgG de 9.600 mg/l para el ensayo ELISA de IgG total; un lote de IgA, purificada, procedente de fluido pulmonar clarificado de una oveja infectada con un retrovirus bovino (Jaagsiekte) (JSRV) para el ensayo ELISA de IgA total. Cada uno de los patrones fue analizado en ocho diluciones al doble, y la absorbancia neta en función de unidades de anticuerpo arbitrarias o mg por ml, respectivamente, se ajustó a una curva sigmoide lin-log. En cada caso la curva estándar resultante tenía un ajuste de r>0,95. Los parámetros resultantes fueron usados luego para interpolar unidades de anticuerpo o concentración (mg/ml) para cada una de las muestras de ensayo, teniendo en cuenta el factor de dilución en el que se había ensayado cada una de las muestras. Los resultados de los ensayos ELISA específicos y totales fueron combinados y expresados en unidades/mg de IgG o IgA.

ELISPOTs

Los ELISPOTs anti-rotavirus de isotipos utilizaron placas de microtitulación (Nunc, Maxisorp), revestidas con un suero de captura, de ratón, anti-rotavirus, la cepa UK de rotavirus, purificada en sacarosa, como antígeno, en una concentración de 5 \mug/ml, la suspensión de PBL (5 x 10^{5} células/ml), IgG de conejo anti-oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce) o IgA de ratón anti-bovina, haciéndose visible las manchas añadiendo H_{2}O_{2} de sustrato y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) a la peroxidasa unida. La reacción se detuvo cuando las manchas eran visibles, tirando del sustrato. Las manchas fueron contadas (media de 6 ensayos replicados) y expresadas como células que forman mancha (SFC)/10^{6} linfocitos.

Análisis FACS

Las subpoblaciones de linfocitos fueron determinadas con un panel de anticuerpos monoclonales de ratón específicos de CD4 de ovino (17D) (MacKay, C.R., Hein, W.R., Brown, M.H., Matzinger, P. Eur. J. Immunol. 18, 1681-8, 1988; Maddox, J.F., MacKay, C.R., Brandon, M.R. Immunology 55, 739-48, 1985), CD8 (7C2) (Maddox, J.F., MacKay, C.R., Brandon, M.R. Immunology 55, 739-48, 1985), \gamma\deltaTCR (86D), cadena ligera (VPM8) (Puri, N.K., MacKay, C.R., Brandon, M.R. Immunology 55, 725-33, 1985), y CD45R (73B) (MacKay, C.R. Marston, W.L., Dudler, L. J. Exp. Med. 171, 801.17, 1990). Se aplicó un segundo anticuerpo, IgG de conejo anti-ratón marcada con fluoresceína, (DAKO), y las células fueron exploradas y contadas con un FACScan® (Becton-Dickinson Ltd).

Resultados Después de vacunar

Los niveles de anticuerpos de IgG específicos en sangre después de inmunización eran más altos para los animales vacunados con matriz de iscom RV (Fig. 14 A). Porcentajes significativamente superiores de células CD_{4}^{+} al cabo de 21 días después de la inmunización en ambos grupos vacunados con RV (Fig. 14 B) Las células CD45R^{+}(Fig. 14 C) solamente fueron registradas en el grupo vacunado con RV/matriz de ISC, en sangre, siendo lo más importante desde el punto de vista de que estas células son células de memoria y constituyen la base de una respuesta rápida para la infección subsiguiente con rotavirus. Es interesante apreciar que el grupo de PBS/matriz de ISC, es decir, el grupo sin antígeno, no mostró aumento de células CD4^{+} sino que puso de manifiesto un porcentaje significativamente superior de células \gamma\deltaTCR (no indicado).

Después de la infección de enfrentamiento

Es de esperar que después de la infección de enfrentamiento los animales respondan inmunológicamente. Sin embargo, una inmunización solitaria por vía oral no ha inducido anteriormente, con una formulación de rotavirus (sin replicación) no vivos, protección contra la infección ni contra la enfermedad. La protección contra la enfermedad depende de I. la defensa inmunitaria existente, y II de la facilidad del sistema inmunitario para responder rápidamente contra el agente causante de la infección, en este caso el RV. Esta facilidad es dependiente de las células de memoria, es decir, las células CD45R^{+} que fueron inducidas por el RV-matriz de iscom, que fueron detectadas el día 21 después de la vacunación y antes de la infección de enfrentamiento (Fig. 14 C). La medida de la facilidad contra la infección es la excreción del agente infeccioso, en este caso el RV. Hay que hacer notar que este experimento es el primero de este tipo en un rumiante, con un sistema alimentario muy complicado. Por consiguiente, para alcanzar las condiciones óptimas con respecto a dosis de adyuvante (matriz de iscom) y antígeno, etc., es necesario llevar a cabo una serie de experimentos. Sin embargo, la perspectiva muy prometedora de una vacuna con éxito basada en la tecnología de iscom y de matriz de iscom está muy indicada.

Después del enfrentamiento todos los corderos excretaron rotavirus, Ambos corderos vacunados con RV excretaron virus durante un período de tiempo más corto que los testigos, a saber, 5-6 días, 6-7 días y 8-9 días, respectivamente. No obstante, esto tuvo solamente significación (p=0,027) en el grupo vacunado con RV/matriz de ISC, lo que indica fuertemente el potencial para el desarrollo de una vacuna eficaz (Fig. 14 C).

Como era de esperar, todos los corderos tenían, después del enfrentamiento, anticuerpos específicos de IgA e IgG en el suero, en las secreciones nasales y en las raspaduras del tubo digestivo, y células que segregan anticuerpos en la sangre y en los tejidos linfoides asociados al tubo digestivo /MLNs y JPPs), después del enfrentamiento.

Notablemente, los grupos vacunados con RV/matriz de ISC tenían cifras significativamente aumentadas de células que producen IgA (Fig. 14 E) e IgG, específicas, en la sangre, lo que indica un efecto primero de la vacunación. El efecto primero es dependiente del desarrollo de células de memoria. Las cifras de las células que producen IgG específica fue también significativamente superior en comparación con el grupo vacunado con RV sin adyuvante. Después del enfrentamiento no se encontraron diferencias en cuanto a células que producen IgA ó IgG específicas en el GALT entre los tres grupos. La Respuesta específica de IgG fue similar a la respuesta específica de IgA.

Se detectaron anticuerpos de neutralización contra las cepas UK y K923 en todos los grupos, en el suero. Después del enfrentamiento todos los corderos tenían un aumento de células CD4^{+} y en los grupos vacunados con PBS/matriz de iscom y con RV, las células CD45R^{+} habían aumentado a un nivel similar al observado en el grupo vacunado con RV/ISC antes del enfrentamiento

Discusión

Es sorprendente que una sola dosis oral de rotavirus sin replicar inactivado, con matriz de iscom como coadyuvante, diera por resultado un período de excreción de virus significativamente reducido, en el enfrentamiento subsiguiente con virus vivos que se replican. Se observó solamente un período significativamente reducido de excreción de virus en el grupo vacunado con RV/ISC y no en el grupo vacunado con RV, aun cuando el pequeño número de corderos de este grupo limita el análisis estadístico. Las características de la respuesta inmunitaria de animales llevados a enfrentamiento con virus incluyó niveles aumentados de anticuerpos IgA e IgG específicos en las secreciones nasales e intestinales y, en el grupo vacunado con RV/ISC, cifras aumentadas de células en circulación que producen IgA e IgG específicas.

Es sorprendente también que el RV con matriz como adyuvante, con solamente una dosis pudiera proporcionar una respuesta inmunitaria y reducir significativamente el período infeccioso a la vista de los resultados de Mowat (Mowat et al., Immunology 72, 317-322, 1991) que mostró, en el ratón, que se requerían varias inmunizaciones para inducir una respuesta de IgA después de la administración oral de OVA.

Conclusión

Es inesperado que pudiera conseguirse una respuesta clara mediante la administración oral de una dosis de Rotavirus con matriz de iscom como adyuvante o una vacuna sin replicación, teniendo en cuenta la poca edad de los animales, es decir, una semana, en la que todavía están en el período neonatal y no son inmunocompetentes como los adultos, y también a la vista de la dificultad de inducir una respuesta inmunitaria con una inmunización por vía oral. Esto es particularmente difícil a la vista del complicado sistema alimentario de los rumiantes. Es probable que el rotavirus o partes del rotavirus sea adecuado a este respecto para usar como dispositivo que busca su objetivo en la mucosas, adecuado para facilitar la inmunización con otros antígenos así como en las formulaciones de iscom y matriz de iscom. Estos resultados implican la posibilidad de inmunizar con éxito a los animales mediante inmunización de las mucosas durante el período neonatal en el que se encuentran presentes anticuerpos maternos. El número aumentado de células CD45R^{+} inducidas por RV/matriz de iscom indica un número aumentado de células de memoria que pueden ser "reclutadas" rápidamente por una infección, lo que explica el período acortado de excreción de virus que sigue al enfrentamiento por vía oral, eliminando con ello o haciendo disminuir el riesgo de desarrollo de enfermedad.

Ejemplo 9 Introducción

El virus sincitial respiratorio (RSV) es uno de los más importante agentes causantes de infecciones virales en el tracto respiratorio inferior de niños en todo el mundo. Esta enfermedad ocasiona un número estimado de 91.000 hospitalizaciones y 4.500 muertes, en un año, en los Estados Unidos solamente. Un virus estrechamente afín a éste, es el virus sincitial respiratorio bovino que es un virus respiratorio importante de reses jóvenes. Las organizaciones de la salud, tanto a nivel nacional como internacional, consideran prioritario el desarrollo de una vacuna para controlar el virus, para la prevención de la morbilidad y la mortalidad (MurphY, B.R., Prince, G.A., Walsh, E.E., Kim, H.W., Hemming, V.G., Rodríguez, W y Chanock, R.M. J. Clin. Microbiol. 24, 197-202, 1986). Hasta la fecha, los intentos realizados para desarrollar una vacuna del RSV no han tenido éxito y se han tomado grandes precauciones debido a un fallo inicial habido con una vacuna preparada con virus sincitial respiratorio humano (HRSV) inactivado con formalina, que se evaluó en jóvenes y niños en los años 1960. Esta vacuna falló no solamente en inducir resistencia a la infección y la enfermedad, sino que ocasionó también una forma agravada de enfermedad del tracto respiratorio inferior.

El RSV inicia su infección por medio de la superficie de la mucosa respiratoria. Por esta razón una vacuna que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria en el moco del tracto respiratorio es de máximo interés, que es lo más probable que sea inducida mediante inmunización por vía intranasal. El modo de inmunización de las mucosas posee ventajas sobre la administración por vía parenteral, por el potencial de inducir respuestas inmunitarias tanto locales como sistémicas, aumentando la seguridad y reduciendo al mínimo los efectos adversos, lo que hace disminuir la necesidad de personal y del equipo que se requiere para la vacunación, y así sucesivamente.

El propósito presente fue comparar respuestas de anticuerpos con respecto a IgM, isotipos de IgG, subclases de IgG y respuestas secretorias de IgA en pulmones y otras superficies de mucosas, después de administraciones intranasal y subcutánea, e investigar la posibilidad de desarrollar una vacuna de RSV- ISCOM, a base de administración intranasal.

Materiales y métodos Compuestos químicos y reactivos

El detergente no iónico n-octilglucósido (1-o-octil-glucopiranósido, OG) se obtuvo de Boehringer (Mannheim, GmbH, Alemania).

El Quillaja "Spicoside" se obtuvo de Isocotec AB (Lule\ring{a}, Suecia).

Las IgM, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b e IgG3, de cabra, anti-ratón fueron obtenidas de Nordic (Tilburg, Holanda).

La IgA de cabra, anti-ratón, biotinilada se obtuvo de Southern Biotechnology Associated, Inc. (Birmingham, EE.UU.).

Las inmunoglobulinas de conejo anti-cabra conjugadas con peroxidasa y la estreptavidina de HRP se obtuvieron de Dakopatts (Glostrup, Dinamarca).

Preparación de RSV-ISCOMs y RSV inactivado

Los RSV-ISCOMs se obtuvieron a partir de dos preparciones diferentes de virus. El virus fue propagado en células Vero. Después de cosechar el virus los desechos celulares fueron separados mediante centrifugación. El virus sedimentó formando un glóbulo por ultracentrifugación y luego fue purificado mediante centrifugación a través de un gradente de sacarosa de 10 a 50%. El procedimiento operatorio de preparación y la caracterización bioquímica de los ISCOMs se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. En breve, la proteínica vírica, concentración: (1,80 mg/ml) fue solubilizada con OG a una concentración final de 2% (p/v) durante 1 hora, a 37ºC con agitación constante. El virus solublizado se aplicó sobre un gradiente discontinuo de sacarosa de 2 ml de una capa de sacarosa al 20% conteniendo OG al 0,5%, sobre una capa de sacarosa de 50%. Después de centrifugar a 40.000 rpm en un rotor Kontron TST-41 durante 1 hora a 4ºC, se recogieron el volumen de la muestra más la capa de sacarosa de 20% que contenía las proteínas virales, y se añadieron lípidos extra, es decir, colesterol y fosfatidilcolina, y Quillaja ("Spicoside", Lule\ring{a}, Suecia), en proporciones de 1,:0,5:0,5:3,5 (p/p). Después de diálisis extensa frente a acetato amónico 0,15 M durante 72 hoas a 4ºC, los ISCOMs fueron purificados por centrifugación a través de sacarosa al 10%, a 40.000 rpm en un rotor Kontron TST-41, durante 18 horas, a 10ºC. Los glóbulos obtenidos que contenían Los RSV-ISCOMs, fueron resuspendidos en 200 \mul de PBS. La presencia de los ISCOMs fue confirmada mediante microscopía electrónica y según se ha descrito en el Ejemplo 2.

El esquema de proteínas de los ISCOMs se determinó mediante electroforesis y transferencia western. La concentración de Quillaja se midió mediante HPLC. La relación entre Quillaja y proteína en esta preparación de ISCOM final es 5 mg de Quillaja/1 mg de iscom.

\newpage

El RSV inactivado se preparó añadiendo B-propiolactona al 0,5% (p/v) a la solución del virus y la reacción se mantuvo en 4ºC durante 7 días, para inactivar los virus.

Ratones

Ratones hembra Balb/C, 8-12 semanas de edad. Se obtuvieron del Instituto Veterinario Nacional, Uppsala, Suecia. Los ratones fueron explorados para determinar infecciones virales, bacterianas y por micoplasmas y mantenidos según las pautas nacionales.

Inmunizaciones

Siete grupos de ratones (A a G), cada uno de los cuales constaba de siete ratones Balb/C, fueron inmunizados dos veces separadas 6 semanas. Los ratones de los diferentes grupos fueron inmunizados del modo siguiente:

Grupo A, 5 \mug/ratón, con ISCOM I, intranasalmente (i.n.).

Grupo B, 1 \mug/ratón, con ISCOM I, subcutáneamente (s.c.).

Grupo C, 5 \mug/ratón, con ISCOM II, i.n.

Grupo D, 1 \mug/ratón, con ISCOM II, s.c.

Grupo E, 4 \mug (i.n.) + 1 \mug (s.c.)/ratón, con ISCOM.

Grupo F, 500 \mul/ratón con RSV inactivado, s.c. La preparación contiene la misma cantidad de la proteína de fusión que la de las preparaciones de ISCOM, medida mediante un ensayo de inmunotransferencia.

Grupo G, Grupo testigo, sin inmunizar.

Para inmunización intranasal, 5 \mug de ISCOMs fueron suspendidos en un volumen de 20 \mul, mientras que la dosis subcutánea se suspendió en un volumen de 200 \mul. Las inmunizaciones intranasales se llevaron a cabo bajo anestesia (según se ha descrito en el Ejemplo 2).

Se tomaron muestras de sangre para realizar las evaluaciones serológicas en la 2ª y la 5ª semanas después de la primera vacunación, así como en la 1ª y 3ª semanas después de la dosis de refuerzo. Los pulmones para las extracciones de anticuerpos fueron tomados 2 semanas después de la dosis de refuerzo. Dos ratones de cada uno de los grupos fueron sacrificados y se separaron los pulmones. La IgA se extrajo como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Inmunoensayos enzimáticos

Se llevaron a cabo ensayos inmunoabsorbentes con enzimas ligadas (ELISA) para la determinación de anticuerpos de IgM e IgG contra RSV en el suero, en placas de microtitulación (Nunc, Roskilde, Dinamarca), revestidas con 200 ng de HRSV purificado por pocillo, en 100 \mul de tampón carbonatado 50 mM, pH 9,6, mantenidas a 4ºC durante la noche. Todos los lavados fueron llevados a cabo con solución salina tamponada con fosfato, conteniendo Tween 20 al 0,2% (PBS-Tween). Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 60 minutos, agitando constantemente. Los sueros de los ratones fueron titulados en diluciones al doble. Las reacciones enzimáticas fueron visualizadas usando tetrametilbencidina (0,19 mg/ml) y H_{2}O_{2} (0,006%) en tampón de acetato 0,1 M, pH 6,0, y se midió la densidad óptica en 450 nm con un espectrofotómetro Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Irvine, Escocia). Los ensayos ELISA para la determinación de las subclases de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 de ratón, fueron llevados a cabo mediante un procedimiento similar, utilizando subclases de IgG de cabra anti-ratón y un conjugado con HRP de conejo anti-cabra Los niveles secretorios de IgA (sIgA) para HRSV en extractos de pulmón de ratón se midieron mediante un ensayo ELISA con ligeras modificaciones. Las microplacas fueron revestidas con HRSV purificado, 400 ng por pocillo en 100 \mul de tampón de revestimiento. Extractos pulmonares diluidos al doble, en serie, fueron añadidos a los pocillos. Después de incubar durante la noche a temperatura ambiente y lavado subsiguiente con PBS-Tween 20, se añadió a cada pocillo 100 \mul de IgA de cabra anti-ratón biotinilada. D

Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se añadió estreptavidina conjugada con HRP y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las placas fueron lavadas y se añadió sustrato. La reacción enzimática se detuvo al cabo de 15 minutos añadiendo 50 mul de H_{2}SO_{4} 2 M. La densidad óptica se midió a 450 nm.

Títulos y cálculos

La IgM, IgG e IgA fueron ensayadas sobre muestras individuales. Debido a la cantidad limitada de suero que pudo recogerse de cada ratón, las subclases de IgG fueron determinadas sobre conjuntos de sueros. Los títulos se expresan como recíprocos de las diluciones del punto final

Análisis estadístico

Los títulos de los ensayos ELISA para IgM e IgG se expresan como medias geométricas de los valores aritméticos y fueron comparados con respecto a la incidencia y el nivel de anticuerpos en el suero mediante el ensayo U de Mann-Whitneys. Los límites de confianza de 95% para los títulos del ensayo ELISA se calcularon usando el soporte lógico de ordenador Minitab 10 (Minitab Inc., PA, EE.UU.).

Resultados Respuesta de IgM en el suero

Significativamente (P<0,01) respuestas mayores de IgM en el suero fueron inducidas en todos los grupos con ratones inmunizados con ISCOM (grupos A, B, C, D y E) n comparación con las inducidas mediante HRS inactivado (grupo F). La respuesta de IgM duró más tiempo en los animales inmunizados con ISCOM, en especial en los grupos inmunizados por vía intranasal (grupo A, C y grupo E i.n. más s.c). Cuando se comparan las respuestas de IgM dentro de los grupos vacunados con ISCOM, se registraron respuestas significativamente superiores (P<0,01) en los animales de los grupos inmunizados por vía intranasal (grupo A, C y grupo E i.n. más s.c) a las de los inmunizados por vía subcutánea (grupo B y D) (Figura 15 A).

Respuesta de IgG en el suero

Se midió dos veces la IgG en el suero después de la primera vacunación y de la segunda vacunaciones. La respuesta de IgG en el suero siguió a la respuesta de IgM del modo clásico. Los animales vacunados con ISCOM (grupos A, B, C, D y E) desarrollaron respuestas de IgG significativamente superiores (p<0,01) a las de los ratones vacunados con HRSV inactivado (grupo F). La vacunación i.n. con los ISCOMs (grupo A y C) y vacunaciones combinadas i.n. y s.c. (grupo E) indujeron respuestas de IgG significativamente superiores (p<0,01) o unas 100 veces superiores a las de los grupos vacunados con ISCOM por vía subcutánea (grupos B y D) (Fig. 15 B).

Respuestas de subclases de IgG

La respuesta de subclases de IgG fue analizada sobre sueros agrupados mediante el ensayo ELISA. Fueron inducidos perfiles similares de las respuestas de subclases de IgG mediante inmunizaciones por vía intranasal y por vía subcutánea con ISCOMs (grupos A, B, C, D, E), medidas mediante el ensayo ELISA. Se detectaron respuestas de IgG1 e IgG2a más altas en los ratones inmunizados con ISCOM después de vacunaciones i.n., s.c. y la combinación de i,n y s.c. que las de IgG2b e IgG3. No había diferencia en las respuestas de subclases de IgG entre los ratones inmunizados por vía i.n. y s.c. (Figura 15 C). La relación IgG2a/IgG1 fue mayor para los ratones inmunizados con iscoms que para los ratones inmunizados con el virus total inactivado, lo que indica un tipo de respuesta T_{H}1 más prominente.

Respuesta pulmonar de sIgA

Dos semanas después de la segunda vacunación, 2 ratones de cada grupo fueron sacrificados y se prepararon extractos de los pulmones según se ha descrito en Material y Métodos. Los títulos secretorios pulmonares de IgA obtenidos mediante el ensayo Elisa indicaron que había sido inducida una fuerte respuesta de sIgA mediante administración i.n. de ISCOMs (grupos A y C) y grupo E, que combina administraciones i.n. y s.c. Por el contrario, las administraciones de ISCOMs por vía s.c. (grupos B y D) y HRSV inactivado (grupo F) no indujeron en la secreción pulmonar respuesta local de IgA medible en comparación con la del grupo testigo que no había sido vacunado (grupo G). La máxima respuesta de sIgA fue 1:13000, detectada en los ratones del grupo E inmunizados mediante una combinación de administraciones i.n. y s.c. seguida de administración i.n. de ISCOM I (1:11000) y administración i.n. de ISCOM II (1.6000) (Figura 15 D). Lo más sorprendente es que la máxima respuesta de IgA en la secreción pulmonar 22 semanas después de la última inmunización, había sido inducida por el modo de inmunización combinado, i.n. y s.c.

La respuesta de anticuerpos en diversos órganos de mucosas

Se midió la respuesta de IgA en el tracto respiratorio superior, los pulmones, el tracto genital y el tracto alimentario. La extracción de las diversas secreciones se llevó a cabo según se ha descrito en el Ejemplo 2. La máxima respuesta de anticuerpos de IgA frente al RSV se obtuvo en la secreción procedente del tracto genital, que era aproximadamente, 7 veces mayor que la la secreción procedente del tracto respiratorio superior y de los pulmones. En la secreción del tubo digestivo se encontró el título mínimo de anticuerpos de IgA, frente al RSV, es decir, un recíproco del título de aproximadamente 100. Los resultados detallados se muestran en la Fig. 15 E.

Conclusión

Después de administración i.n. los RSV-iscoms inducen títulos de anticuerpos en el suero inesperadamente altos, incluyendo IgG2a, una subclase considerada interesante para comunicar protección contra la enfermedad ocasionada por el RSV (Murphy, B.R., Hall, S.L. et al., Virus Res. 32, 13-36, 1994). Una inmunización indujo ya una clara respuesta de anticuerpos en el suero, lo que lleva consigo su posibilidad comercial.

Los altos títulos de anticuerpos de IgA en las secreciones procedentes de los pulmones y del tracto respiratorio superior, dan paso a la posibilidad de una vacuna eficaz, induciendo una primera línea de defensa en la "puerta" de la infección, es decir, el tracto respiratorio.

Estos estudios sugieren también que las proteínas de la cubierta del RSV (F y G) tienen gran interés para ensayar moléculas que hacen diana en el moco también en las mucosas de órganos remotos, en particular para inducción de respuesta de anticuerpos en el tracto genital, en el que se registró la máxima respuesta de anticuerpos de IgA.

Leyendas de las figuras

Fig. 1 A. Muestra como sedimentan los iscoms con rCTB incorporada, en un gradiente de sacarosa de 10-50% después de una ultracentrifugación. Los valores de las CPM marcan la radiactividad de ^{3}H-colesterol (\blacksquare) que sigue a los iscoms. El valor proteínico (CTB) (\Box) ha sido medido según Bradford. Los iscoms y rCTB son recuperados en las fracción 6-9. Por tanto la mayor parte de la CTB está recuperada en las fracciones de iscom.

Fig. 1 B. Muestra el tipo de diagrama como en la Fig. 1 A. En este experimento la concentración de rCTB fue unas 100 veces mayor que la concentración de GM1. Se encuentra rCTB sin incorporar en la parte alta del gradiente, es decir, en la fracción 10-12.

Fig. 2. Caracteriza los iscoms por ultracentrifugación:

a) ovoalbúmina (OVA)

b) PR8-iscoms

c) PR8/OVA-iscoms

Fig. 3. Microscopía electrónica de

a. OVA-iscoms

b. PR8-iscoms

c. PRB/OVA-iscoms

Fig. 4 A. Muestra la sedimentación de rCTB libre (\Box) medida mediante determinación de proteínas por centrifugación en un gradiente de azúcar de 10-50%, es decir, rCTB sin incorporar lentamente en sedimentos de iscoms, y es recuperada en la parte alta del gradiente, o sea las fracciones 12 a 14.

Fig, 4 B. Muestra la radiactividad (CPM) de ^{14}C-fosfatidiletanolamina (^{14}C-PEA) (\blacksquare) que sigue al iscom en el gradiente de sacarosa en la ultracentrifugación. La proteína-OVA lipidada se recupera, medida mediante el método de Bradford, (Ref. véase el texto)(\Box) con iscoms recuperados en las fracciones 6-8. Algo de la proteína no integrada se recoge en las fracciones 11, 12 y 13.

Fig. 4 C. Indica la incorporación de rCTB en iscoms que contienen GM1. La incorporación de rCTB en iscoms se midió mediante la determinación de proteínas (\Box). La sedimentación de iscoms se pone de manifiesto por el colesterol marcado radiactivamente con ^{3}H (CPM) (\blacksquare) que sigue al iscom en el gradiente. Ambas proteínas, es decir, rCTB y ^{3}H colesterol siguen estructuras de iscom, verificada la última de ellas por microscopía electrónica, son recuperadas en las fracciones 6 a 9.

Fig. 4 D. Muestra la incorporación de OVA lipidada y rCTB establecida por determinación de proteínas por el método de Bradford (\Box). La sedimentación de iscoms se indica mediante PEA radiomarcada con ^{14}C (\blacksquare) recuperada en las fracciones 4 a 6, en que además radiactividad también fueron demostradas por microscopía electrónica estructuras de iscom.

Fig. 4 E. Muestra que la rCTB añadida a OVA-iscom sin contener GM1-lípido, no se incorpora en el iscom, lo que se demuestra por recuperación de la proteína, es decir, CTB en las fracciones superiores del gradiente, o sea, 11 a 13. La OVA lipidada se encuentra en las fracciones 5 a 8.

Fig. 5. La respuesta de anticuerpos séricos a OVA siguiendo diversas formulaciones de OVA/rCTB. Los experimentos de inmunización incluyeron los grupos siguientes:

1. i.n., 10 \mug de OVA sin Quillaja (QA)

2. i,n., 10 \mug de OVA-iscom

3. i.,., 10 \mug de OVA-iscom y 10 \mug de rCTB mezclados como entidades separadas

4. i.n., 10 \mug de cada una de OVA y rCTB en el mismo iscom (OVA/rCTB)

5. s.c., 2 \mug de OVA-iscom (10 \mug de QA)

6. i.n., OVA y rCTB libre mezclados como entidades separadas. La dosis,10 \mug de cada una.

7. i.n., 10 \mug de OVA libre suplementada con matriz (10 \mug)

8. i.n., testigo sin antígeno.

Fig. 5 A. Muestra la respuesta de anticuerpos séricos contra OVA, analizada mediante el ensayo ELISA (dos semanas) después de la primera inmunización de ratones por vía intranasal. No pudo medirse respuesta de anticuerpos a OVA sin adyuvante ni a OVA, que había sido añadida como adyuvante a rCTB (6).

Fig. 5 B. Muestra que dos semanas después de la 2ª inmunización todos los ratones que habían sido inmunizados con iscom o formulaciones de matriz habían respondido a la OVA con altos títulos de anticuerpos séricos. Los ratones que habían sido inmunizados con OVA suplementada con rCTB en entidades separadas, mostraban títulos de anticuerpos séricos menores que los ratones inmunizados con OVA sola.

Fig. 5 C. Muestra los valores de las lecturas del ensayo ELISA en diluciones crecientes de sueros procedentes de ratones después de dos inmunizaciones. Como pone de manifiesto esta figura, así como también en la Fig. 5 B, las formulaciones de iscoms con OVA invalida la tolerancia que atrajo la rCTB con respecto a la respuesta de anticuerpos séricos a la OVA como "antígeno pasajero" (PA) o administrada como matriz.

Fig. 6. El experimento de inmunización incluyó los mismos grupos enumerados en la Fig. 5.

Fig. 6 A. Muestra el análisis de la respuesta de anticuerpos de IgA a OVA en secreción pulmonar después de dos inmunizaciones (i,n,) de ratones.

Fig. 6 B. Muestra una comparación entre los diferentes grupos con respecto a respuestas de anticuerpos de IgA a OVA en la secreción del tracto respiratorio superior. El iscom con OVA y OVA suplementada con matriz indujo, después de inmunización i.n., títulos de IgA significativamente superiores a los de las formulaciones de OVA-rCTB sin adyuvantes.

Fig. 6 C. Muestra una comparación entre las respuestas de anticuerpos de IgA a l a Ova, inducidas en la secreción procedente del tracto genital de ratones de los diferentes grupos de inmunización.

Fig. 7. La respuesta de anticuerpos de IgG contra OVA es membranas mucosas. Los mismos grupos que se indican en la Fig. 5 fueron incluidos en este experimento de inmunización.

Fig. 7 A. Muestra una comparación entre las respuestas de anticuerpos de IgG que fueron inducidas en la secreción pulmonar de ratones de los diferentes grupos de inmunización.

Fig. 7 B, 7 C y 7 D. Comparan las correspondientes respuestas de anticuerpos de IgG en las secreciones procedentes del tracto respiratorio superior, tracto genital y el tracto alimentario, respectivamente.

Fig. 8. En los experimentos de inmunización tomaron parte los mismos grupos que se muestran en la Fig. 5.

Fig. 8 A y B. En general, OVA-rCTB en iscoms o rCTB libre suplementada con OVA-iscoms, que en este caso sirvió como adyuvante en la forma de matriz de iscom para rCTB, indujeron respuestas de anticuerpos de IgA considerablemente superiores a CTB que la rCTB sin añadir adyuvante, en todas las secreciones ensayadas, es decir, procedentes de los pulmones, el tracto respiratorio superior, el tracto alimentario y el tracto genital.

Fig. 8 C y D. Se obtuvieron alta respuestas de anticuerpos de IgG a rCTB en secreciones procedentes de los pulmones, el tracto respiratorio superior, el tracto genital y el tracto alimentario, con formulaciones de rCTB en iscoms o en matriz de iscom. Las respuestas de anticuerpos de IgG en estas secreciones para ratones inmunizados con rCTB sin iscom ni formulaciones de matriz de iscom fueron inferiores a las de CTB-iscom y formulaciones de matriz de iscom, pero significativamente superiores a las obtenidas para los testigos sin inmunizar.

Fig. 9. El desarrollo de la respuesta de anticuerpos séricos (A, B y C) y la respuesta en la secreción pulmonar (D), medidas por el ensayo ELISA durante un período experimental de 48 días después de inmunización con iscoms de virus de la influenza (7 \mug) dos veces, i.n.

A. muestra el desarrollo de la respuesta total de anticuerpos al virus de la influenza, en el suero.

B. muestra el desarrollo de la respuesta de anticuerpos frente al antígeno del virus de la influenza de las subclases de IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b.

C. muestra el desarrollo de la respuesta de anticuerpos de IgA en el suero frente al antígeno del virus de la influenza.

D. muestra el desarrollo de la respuesta de anticuerpos de IgA en la secreción pulmonar.

Fig. 10. Cinco grupos de cinco ratones (NMRI) fueron inmunizados según el plan siguiente:

Grupo	Sustancia inmunizante	Modo de administración
A	OVA-iscom	5 \mug de antígeno, i.n.
B	OVA/PR8-iscom	5 \mug de antígeno, i.n.
C	OVA/PR8-iscom	10 \mug de antígeno, i.n.
D	PR8-iscom	5 \mug de antígeno, i.n.
E	OVA/PR8-iscom	5 \mug de antígeno, s.c.

Fig. 10 A. Muestra que el OVA/PR8-iscom induce una alta respuesta de anticuerpos séricos frente a OVA después de dos inmunizaciones por vía intranasal y todavía mayor después de tres inmunizaciones, en comparación con OVA-iscoms sin proteína de cubierta procedente del virus de la influenza. Como era de esperar. 10 \mug de OVA/PR8-iscoms, i.n., indujeron mayores respuestas de anticuerpos que 5 \mug.

Fig. 10 B. Muestra la respuesta de anticuerpos séricos frente a PR8. Todas las formulaciones de iscom que contenían PR8 indujeron una respuesta de anticuerpos frente a PR8 después de inmunización i.n. Esta respuesta aumentó considerablemente después de la segunda inmunización

Fig. 10 C. Muestra la respuesta de anticuerpos de IgA en la secreción procedente de los pulmones después de tres inmunizaciones, según se ha descrito anteriormente. 5 \mug y 10 \mug de los OVA/PR8-iscoms indujeron respuestas de anticuerpos de IgA claras, dependientes de la dosis, después de inmunizaciones por vía intranasal, por contraposición a OVA-iscoms administrados por vía subcutánea.

Fig. 10 D. Muestra que todas las formulaciones de iscoms que contenían antígeno de PR8, inducen respuestas altas de anticuerpos de IgA frente a PR8 en la secreción pulmonar.

Fig. 10 E. Muestra la respuesta de anticuerpos séricos frente a OVA, inducida mediante formulaciones de iscoms que contienen OVA, con o sin moléculas que buscan su objetivo o formulaciones con OVA y matriz de iscom como entidades separadas, después de dos inmunizaciones, según se indica en Ejemplo 4. Los máximos títulos de anticuerpos séricos medidos por el ensayo ELISA fueron registrados con formulaciones de OVA-iscom (C).

Fig. 10 F. Compara el modo de administración i.n. con el modo s.c. usando formulaciones de OVA/PR8-iscom o de OVA-matriz. El modo de administración i.n. indujo anticuerpos séricos de magnitud similar o sólo ligeramente menores a los inducidos mediante inmunización por vía s.c.

Fig. 10 G. Muestra la respuesta de anticuerpos de IgA frente a OVA en secreciones pulmonares, inducidas por formulaciones de iscoms, con y sin moléculas que buscan su objetivo (PR8) o mediante OVA mezclada con matriz de iscom como entidades separadas, después de dos inmunizaciones, según se indica en el Ejemplo 4.

Fig. 10 H. Muestra la respuesta de anticuerpos de IgA frente a OVA en las secreciones del tracto genital, inducida por formulaciones de iscoms con y sin moléculas que buscan su objetivo o mediante OVA mezclada con matriz de iscom, como entidades separadas, después de dos inmunizaciones, según se indica en el Ejemplo 4.

Fig. 11 A. Muestra la respuesta de IgA en la secreción pulmonar (día 77) procedente de ratones, dos semanas después de dos inmunizaciones i.n. con un intervalo de 9 semanas, con iscom que contiene gB procedente de virus Herpes simplez 2 (gB2), según el Ejemplo 5.

Fig. 11 B. Muestra la respuesta de IgA frente a gB2 en secreciones (día 113) procedentes de diferentes membranas mucosas de ratones (pulmones, tractos respiratorios superiores y el tracto genital) que habían sido inmunizados i.n. con iscoms, como se ha descrito en la Fig. 11 A, Ejemplo 5.

Fig. 11 C. Muestra las respuestas de las subclases de IgG (IgG1 e IgG2a) frente a gB2 en el suero (día 77) después de inmunizaciones i.n. según se ha descrito en la Fig. 11 A.

Fig. 12 A. Muestra la respuesta de IgA en la secreción pulmonar procedente de ratones, 14 días después de dos inmunizaciones i.n. (día 77) con un intervalo de 9 semanas, con iscoms conteniendo gD procedente de Herpes simplex 2 (gD2), según el Ejemplo 6.

Fig. 12 B. Muestra la respuesta de IgA al gD2 en secreciones (día 113) de diferentes órganos de ratones (pulmones, tractos respiratorios superiores y tracto genital) que habían sido inmunizados por vía i.n. con los iscoms que han sido descritos en la Fig. 12 A y en el Ejemplo 6.

Fig. 12 C. Muestra las subclases de IgG frente a gD2 (IgG1 e IgG2a) en el suero (día 77) después de inmunizaciones por vía i.n., según se ha descrito en la Fig. 12 A.

13 A. Respuestas totales de anticuerpos séricos medidas mediante ensayos ELISA, frente a Mycoplasma mycoides (Mm), de ratones inmunizados por vía i.n. dos veces separadas 7 semanas con 3, 10 ó 20 \mug de iscoms. Los sueros fueron ensayados 2, 4 y 7 semanas después de la primera inmunización y 2 semanas después de administrar la dosis de refuerzo.

13 B. Respuesta de IgA en el suero, medida mediante el ensayo ELISA, frente a Mycoplasma mycoides (MM), recogido dos semanas después de dos inmunizaciones de ratones por vía intranasal, separadas siete semanas, con tres dosis diferentes de iscoms conteniendo antígenos de Mm.

13 C. Respuesta de IgA en secreción pulmonar, medida mediante el ensayo ELISA, frente a Mycoplasma mycoides (Mm), recogida dos semanas después de dos inmunizaciones por vía intranasal, de ratones, con tres dosis diferentes de iscoms conteniendo antígenos de Mm.

13 D. Análisis de transferencia western contra antígeno de Mycoplasma mycoides (Mm): Calle A. Detección con secreción pulmonar obtenida de ratones dos semanas después de la segunda inmunización llevada a cabo por vía intranasal (i.n.), separadas siete semanas, con iscoms conteniendo antígenos de Mm. Calle B. Suero procedente de ratones inmunizados i.n. según se describe en la Calle A; Calle C. Suero procedente de ratones inmunizados por vía subcutánea (s.c.) según el plan de la Calle A.

Fig. 14 A. Anticuerpos séricos específicos de IgG frente a rotavirus (RV) después de vacunación oral; Las medias de los grupos fueron analizadas por ANOVA monodireccional. Grupo vacunado con RV frente al grupo vacunado con PBS.;

\blacksquare	grupo vacunado con RV/matriz de ISC
	grupo vacunado con RV
\blacklozenge	grupo vacunado con PBS/matriz de ISC

Fig. 14 B. La subpoblación de linfocitos de células CD4^{+}(porcentaje) en sangre periférica en tiempos crecientes después de vacunación oral con vacunas de rotavirus (RV) con y sin adyuvante de matriz de iscom y subsiguiente infección de enfrentamiento el día 21. Las medias de los grupos fueron analizadas mediante ANOVA monodireccional.

Fig. 14 C. La subpoblación de linfocitos de células CD45R^{+} (porcentaje) en sangre periférica a tiempos crecientes después de vacunación oral con vacunas de rotavirus (RV) con y sin adyuvante de matriz de iscom y subsiguiente infección de enfrentamiento el día 21. Las medias de los grupos fueron analizadas mediante ANOVA monodireccional.

Fig. 14 D. Excreción de virus después de infección de enfrentamiento.

Fig. 14 E. Células de la sangre que producen IgA específica, después de vacunación e infección de enfrentamiento subsiguiente el día 21.

\blacklozenge	PBS/matriz de iscom (sin antígeno de RV)
\blacksquare	RV/matriz de iscom
	RV (virus inactivado)

Fig. 15 A. Títulos de anticuerpos séricos de IgM (títulos de media geométrica y límites de confianza de 95%) de ratones frente al virus sincitial respiratorio (RSV) medidos mediante el ensayo ELISA, después de dos inmunizaciones por vía intranasal o dos inmunizaciones por vía subcutánea, separadas 6 semanas, con iscoms de HRSV o virus inactivado. Primera sangría (1): dos semanas después de la primera inmunización. Segunda sangría (2): cinco semanas después de la primera inmunización. Tercera sangría (3): una semana después de la dosis de refuerzo. Las inmunizaciones de los grupos están descritas en el Ejemplo 9.

Fig. 15 B. Títulos de anticuerpos séricos de IgG (media geométrica y límites de confianza de 95%) de ratones frente al virus sincitial respiratorio (RSV), medidos mediante el ensayo ELISA, después de inmunización con iscoms de HRSV o con HRSV inactivado, según se ha descrito en el Ejemplo 9. Las sangrías se realizaron como se describe en 15 A. Primera sangría (1) dos semanas después de la primera inmunización. Segunda sangría (2): cinco semanas después de la primera vacunación. Tercera sangría (3): una semana después de administrar la dosis de refuerzo. Cuarta sangría (4): tres semanas después de administrar la dosis de refuerzo.

Fig. 15 C. Respuesta de subclases de IgG en el suero frente a RSVV medida mediante el ensayo ELISA, después de inmunizaciones intranasal o subcutánea con iscoms de HRSV o HRSV inactivado, según se ha descrito en el Ejemplo 9. Las sangrías para obtener el suero se llevaron a cabo según se describe en la Fig. 15 B.

Fig. 15 D. Títulos de anticuerpos de IgA procedentes s de la secreción pulmonar de ratones frente al virus sincitial respiratorio (RSV), 2, 15 y 22 semanas después de administrar la dosis de refuerzo, medidos mediante el ensayo ELISA, siguiendo los planes de inmunización descritos en el Ejemplo 9 del texto. Los pulmones fueron recogidos y las secreciones fueron extraídas según se ha descrito en el Ejemplo 2.

Fig. 15 E. Respuesta de anticuerpos de IgA frente al RSV en secreciones procedentes de diversos órganos, es decir, el tracto respiratorio superior, los pulmones, el tracto genital y los intestinos. Las secreciones fueron extraídas de los diversos órganos dos semanas después de la segunda inmunización, según se ha descrito en el Ejemplo 2. El plan de inmunización está descrito en el Ejemplo 9.

Tabla I. La respuesta de anticuerpos séricos (títulos log^{10}) frente a OVA dos semanas después de la segunda inmunización de ratones por vía intranasal, analizada mediante el ensayo ELISA, con respecto a la respuesta total de anticuerpos y las respuestas de las subclases IgG1 e IgG2a obtenidas en las inmunizaciones por vía intranasal.

Tabla II. Comparación entre las respuestas de anticuerpos séricos frente a rCTB (títulos log^{10}) después de la segunda inmunización de ratones por vía intranasal, con respecto al isotipo IgG y las subclases IgG1 e IgG2a.

Claims

1. El uso de un complejo inmunógeno o composición inmunógena en la forma de iscom y/o matriz de iscom inmunoestimulante, que comprende al menos un glicósido y al menos un lípido y

a): al menos una molécula que posee efecto de hacer diana en las mucosas haciendo diana en el tejido linfático induciendo una respuesta inmunitaria mediante administración local a las mucosas, en varias superficies de las mucosas, así como una respuesta inmunitaria sistémica, estando derivada de microorganismos que infectan las mucosas de los pulmones, el tracto respiratorio superior, los intestinos y los urogenitales, en la que dicha molécula se escoge entre la toxina bacteriana del cólera y sus subunidades, la toxina termolábil de E. coli y sus subunidades, las proteínas de la cubierta de virus, proteínas externas de virus sin cubierta y las proteínas externas de bacterias, y

b): al menos un antígeno pasajero escogido entre sustancias farmacológicamente activas del sistema inmunitario que no alcanzan fácilmente el tejido linfático a través de la membrana mucosa.

para preparar vacunas y composiciones inmunoestimulantes para administrar a las mucosas por vía oral, nasal, urogenital y/o rectal.

2. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo es un complejo de iscom y porque la molécula que hace diana en la mucosa y/o el antígeno pasajero está integrado en el complejo de iscom o ha sido copulado al complejo de iscom terminado o ha sido mezclado con éste.

3. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo es una matriz de iscom y porque la molécula que hace diana en las mucosas y/o el antígeno pasajero ha sido copulado con el complejo de la matriz de iscom terminada o ha sido mezclado con éste.

4. El uso de un complejo inmunógeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los lípidos se escogen entre esteroles, fosfolípidos y lípidos que contienen receptores para componentes que se unen a las células.

5. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 4, caracterizado porque los receptores para los componentes de unión a las células son glicolípidos.

6. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 5, caracterizado porque los glicolípidos son el gangliósido GM1 y el antígeno del grupo sanguíneo fucosado.

7. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el complejo comprende al menos un adyuvante adicional.

8. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula que hace diana en la mucosa y/o el antígeno pasajero y/o el adyuvante han sido mezclados con iscom y/o complejo de matriz.

9. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque los antígenos pasajeros derivan de microorganismos.

10. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 9, caracterizado porque los microorganismos son bacterias, virus o parásitos.

11. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la molécula que hace diana en la mucosa y el antígeno pasajero son productos genéticos o antígenos sintéticos.

12. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el antígeno pasajero está seleccionado entre péptidos, proteínas, hidratos de carbono y estructuras de hidratos de carbono.

13. El uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 12, caracterizado porque las moléculas que hacen diana en las mucosas son glicopéptidos o glicoproteínas.

14. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la molécula que hace diana en las mucosas se escoge entre proteínas de la cubierta procedentes del virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (RSV), coronavirus, herpesvirus, poxvirus, u otras proteínas procedentes de adenovirus, virus de Norwalk, rotavirus, de la familia de Picornaviridae, por ejemplo, enterovirus y astrovirus, tales como hexones y pentones procedentes de fimbrias de adenovirus de bacterias de Haemphilus; fimbrias de Escherichia coli que infectan al hombre o a animales, por ejemplo, el cerdo (tales como K88, K99, K981-B), Shigella, Chlamydia y proteínas de la membrana procedentes de Mycoplasma.

15. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el antígeno pasajero se escoge entre gB y gD de varios herpesvirus, incluyendo herpes simplex 1 y 2, herpesvirus bovino 1, picornavirus, gp 120 y gp 160 de HIV-1 o la proteína correspondiente de HIV-2, así como procedente de otros retrovirus, hepadnavirus, proteínas g procedentes de rhabdovirus, poxvirus, papovirus, adenovirus, cardivirus, togavirus, flavavirus, iridovirus, birnavirus, bunyavirus, arenavirus, ortomixovirus, paramixovirus, parvovirus, popovavirus, picornavirus, calicivirus, astrovirus, proteína G procedente del virus de la rabia o procedente de bacterias tales como salmonelas, E. coli, Shigella, Chlamydia o Mycoplasma, o de parásitos tales como Echinococcus, nematodos, trematodos, esquistosoma, o protozoos tales como Toxoplasma, Trypanosoma Leichmailia.

16. El uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque los antígenos pasajeros son antígenos vacunales recombinantes.