ES2199346T3 - Complejo inmunogenico, iscom, para uso en la preparacion de una vacuna para individuos en fase de crecimiento. - Google Patents

Complejo inmunogenico, iscom, para uso en la preparacion de una vacuna para individuos en fase de crecimiento.

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ES2199346T3 ES97905540T ES97905540T ES2199346T3 ES 2199346 T3 ES2199346 T3 ES 2199346T3 ES 97905540 T ES97905540 T ES 97905540T ES 97905540 T ES97905540 T ES 97905540T ES 2199346 T3 ES2199346 T3 ES 2199346T3
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE COMPLEJOS INMUNOGENICOS EN FORMA DE ISCOM QUE CONTIENEN AL MENOS UN GLUCOSIDO, AL MENOS UN LIPIDO Y AL MENOS UN ANTIGENO, O UN FORMULADO CON UN ANTIGENO(S) DE VACUNA EN UNA ENTIDAD, MEZCLADOS CON UNA MATRIZ ISCOM EN OTRA ENTIDAD QUE CONTIENE AL MENOS UN GLUCOSIDO Y AL MENOS UN LIPIDO PARA SU USO EN VACUNAS QUE EVOCAN RESPUESTAS INMUNES EN INDIVIDUOS JUVENILES CON UN SISTEMA INMUNE INMADURO Y/O CON INMUNIDAD MATERNA.

Description

Complejo inmunogénico, iscom, para uso en la preparación de una vacuna para individuos en fase de crecimiento.
Esta invención trata de complejos inmunógenos en forma de complejos inmunoestimulantes (iscom) o matriz de iscom para su uso en preparar vacunas que estimulen las respuestas inmunes en individuos jóvenes. Un problema de los niños y jóvenes es que no son inmunocompetentes, es decir, parece que les falta la capacidad de responder inmunológicamente cuando se exponen a estímulos de antígenos. Aún más, muchas veces los niños y jóvenes ya han obtenido anticuerpos y, posiblemente, también elementos celulares que pertenecen una defensa inmune pasivamente transferida de la madre a la prole, la llamada inmunidad materna.
Es bien sabido, que las vacunas que hoy en día se utilizan para niños y jóvenes con inmunidad materna no provocan respuesta inmune, al menos no una respuesta inmune que dé suficiente protección. La inmunidad materna se transmite desde la madre al hijo a través del cordón umbilical o a través de la leche materna, en algunos animales, p. ej. en el ganado y en los caballos especialmente, a través del calostro durante los primeros 1-2 días después del nacimiento. En general, la inmunidad materna en el recién nacido se mide en forma de anticuerpos del suero dirigidos contra el agente infeccioso en cuestión. En los seres humanos y animales similares, el periodo neonatal constituye un grave problema en relación con la vacunación contra diferentes agentes infecciosos contra los cuales los individuos jóvenes necesitan una protección extra a causa de que ellos no pueden responder inmunológicamente, debido a un sistema inmune inmaduro. En este contexto, se debería indicar, que el objeto de la inmunidad materna es proteger el niño y joven de la madre. La inmunidad materna da protección desde el nacimiento y un corto espacio de tiempo a continuación, pero desde un cierto momento disminuye la protección y el niño y joven no están protegidos y son susceptibles a la infección. Durante este periodo, también se está desarrollando la inmunocompetencia, que en los ratones alcanza un nivel de adulto a las tres semanas de edad, pero que en animales más grandes y en los seres humanos lleva un mayor tiempo. Está bastante claro que existe una combinación de una capacidad más pobre en niños y jóvenes de responder inmunológicamente, que aumenta con la edad y un efecto de bloqueo de la inmunidad materna que disminuye con la edad. Por tanto, durante el periodo de separación no tienen efecto las vacunaciones hoy en día disponibles. Por ejemplo, la vacunación contra el virus de la cisticercosis no se debería administrar antes de la edad de un año, puesto que la vacuna no tiene efecto antes de esa edad. En África, así como en otras áreas en desarrollo, los niños a menudo se infectan con el virus de la cisticercosis antes de la edad de un año, lo que ocasiona graves enfermedades, dando muchas veces como resultado complicaciones que pueden llevar a la muerte. En el tercer mundo, las infecciones con el virus de la cisticercosis durante el primer año después del nacimiento, es una de las causas más comunes de la mortalidad infantil.
En la medicina veterinaria, se sabe que los perritos por lo general no responden a la vacunación antes de las 12 semanas de edad. Por tanto, se recomienda que la vacunación contra el moquillo se administre a esta edad. Además del moquillo, existe una necesidad de vacunar perros jóvenes inmunológicamente inmaduros con inmunidad materna contra parvovirus. Existe el mismo problema cuando que se van a vacunar gatos contra la panleucopenia, que es causada por un parvovirus muy relacionado con el parvovirus canino. Los dueños de perreras y los criadores de gatos pueden experimentar grandes problemas con infecciones con tales virus. La infección persiste mediante la infección del joven durante el periodo inmunológicamente inmaduro, cuando tienen todavía anticuerpos maternos que evitan que la vacunación dé el efecto deseado. De la misma manera, se han hecho intentos para vacunar caballos contra el herpesvirus equi 2 (Heq2) utilizando tipos convencionales de vacunas durante el periodo en que el potro tiene inmunidad materna. Sin embargo, no era efectiva la vacuna convencional y no se pudo detectar ninguna respuesta de anticuerpos en el suero contra el virus, e incluso en un grado menor, no se pudo detectar ninguna protección contra la infección o enfermedad.
De Vries et al. sugieren que los iscoms podían ser posiblemente una estrategia adecuada de vacuna en individuos con inmunidad materna en base a experimentos en donde adultos, monos y ratas habían sido inyectados con anticuerpos contra un patógeno (virus de la cisticercosis y una subsiguiente infección). Sin embargo, no se presentan datos experimentales sobre individuos jóvenes, en los cuales el problema es real. No se dieron datos que hablaran de los problemas de los individuos jóvenes indicando que el autor no sabía incluso nada del sistema inmune. Se ha demostrado de forma inesperada, que se pueden utilizar iscom o matriz de iscom para preparar una vacuna que provoque una respuesta inmune en individuos jóvenes con sistema inmune inmaduro con o sin inmunidad materna. Esto se ejemplifica en ratones de dos días de edad, potros de una semana, focas de dos semanas y corderos de una semana.
Los individuos en fase de crecimiento son, según esta invención, mamíferos jóvenes que son inmunocompetentes desde el punto de vista de que no responden a la vacunación, es decir, que tienen una capacidad reducida de responder inmunológicamente cuando se exponen a estímulos de antígenos. Más aún, pueden tener o no tener inmunidad materna, es decir, anticuerpos de sus madres.
El iscom contiene al menos un glicósido, al menos un lípido y al menos un tipo de sustancia antígena, particularmente proteínas y péptidos. Estos complejos favorecen la inmunogenicidad de los antígenos incluidos y pueden contener también uno o más sustancias inmunomoduladoras (coadyuvante-activo), tal como se describe en los documentos EP 0 109 942 B1, EP 0 242 380 B1 y EP 0 180 564 B1.
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La matriz contiene al menos un glicósido, una sustancia coadyuvante-activa y al menos un lípido. La matriz tiene un efecto inmunoestimulador cuando se administra al mismo tiempo que las sustancias antígenas, véase documento EP 0 436 620 B1.
De acuerdo con la invención, los complejos se pueden componer de complejos iscom con antígenos que están integrados mediante interacciones hidrófobas en el complejo iscom o unidas a un complejo iscom ya preparado.
Se pueden también componer de matriz de iscom, a la cual se ha unido un antígeno y se convierte a continuación por definición en iscom. El complejo puede ser también matriz de iscom que se mezcla con el antígeno o se guarda en entidades separadas y se administran al mismo tiempo.
Es también posible utilizar complejos iscom que contienen un antígeno o molécula que funciona como una molécula dirigida a la mucosidad a través de las membranas mucosas, junto con otro antígeno que no puede penetrar en las membranas mucosas y no puede llegar al tejido linfático en la mucosa local, tal como se describe en la solicitud de patente sueca 9600647-3. Además, se pueden utilizar complejos iscom que contienen sustancias receptoras para antígenos o moléculas dirigidas, tal como se describe en la solicitud de patente sueca 9600648-1.
Los antígenos provienen de microorganismos, tales como bacterias, virus o parásitos, particularmente los que se indican en el documento EP 0 109 942 B1. En particular, son sustancias antígenas, tales como proteínas y péptidos o carbohidratos, estructuras de carbohidratos, tales como glicolípidos, glicopéptidos o -proteínas.
Uno de tales ejemplos son las toxinas bacterianas, como la toxina del cólera o su subunidad B (CTB, por sus siglas en inglés), la toxina termolábil de E. coli, o sus subunidad B (LTB, por sus siglas en inglés). Otros ejemplos son proteínas encapsuladas de virus o proteínas de bacterias que son dirigidas al mucus y que infectan las vías respiratorias, tal como el virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés), el coronavirus, el Astrovirus, virus de Norwalk, el virus herpes, el virus de la viruela, proteínas de membrana de microplasmas y fimbrias de diferentes bacterias, tal como Haemophilus o proteínas superficiales de virus sin cápside y bacterias que infectan el intestino, tal como adenovirus, reovirus, parvovirus, rotavirus y fimbrias de Escherichia coli (K88, K99, K981-B), Shigella, Clamydia y Mycoplasma.
Tales microorganismos pueden ser virus de la cisticercosis, de la rubéola y de la viruela aviar; Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma mycoides, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumonia, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Helicobacter pylori, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Salmonella typhi, Borrelia burgdorferi, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparium, Toxoplasma gondii, Trypanosoma brucei, Gardia lamblia y Entamoeba hystolitica; y Cryptpcoccus neoformans y Histoplasma capsulatum.
Otros ejemplos son gB y gD en diferentes herpesvirus, tales como Herpes simplex 1 y 2, virus herpes bovino 1, picornavirus, gp 120 y gp 160 en HIV-1 o la correspondiente proteína en HIV-2, así como antígenos de otros retrovirus, hepadnavirus, virus de la viruela, adenovirus, cardivirus, togavirus, flavivirus, iridiovirus, birnavirus, parvovirus, popovavirus, picornavirus, calicivirus, astrovirus, arenavirus, bunyavirus, ortomixovirus, paramixovirus, proteína G del virus de la rabia o de bacterias, tales como Salmonella, E. coli, Shigella, clamidia o micoplasma, así como diferentes productos recombinantes o antígenos sintéticos. En particular se mencionan virus del moquillo, de la glosopeda, parvovirus, virus del cólera del cerdo y virus herpes equi 1, 2 y 4.
En esos casos en que los complejos son iscom, se pueden preparar tal como se ha descrito en el documento de patente europea EP 0 109 942 B1. De esta manera, los virus, micoplasmas, bacterias, parásitos, células animales conteniendo antígenos o determinantes de antígenos, particularmente proteínas o péptidos o ejemplos aislados, que tienen regiones hidrófobas o anfipáticas, se mezclan con uno o más agentes solubilizantes, formándose complejos entre los antígenos o determinantes de antígenos y los agentes solubilizantes, después de lo cual los antígenos o determinantes se separan del agente solubilizante, o se separan del agente solubilizante y se transfieren directamente a una solución de glicósidos, conteniendo colesterol, fosfolípidos y uno o más glicósidos con dominios hidrófobos o hidrófilos en una concentración de un mínimo de la concentración micelar crítica, formándose un complejo proteínico que se aísla y purifica.
El material inicial puede proceder de organismos completos conteniendo antígenos, a los cuales se pueden añadir moléculas dirigidas al mucus más o menos purificadas, o antígenos de paso, preparados con técnicas de DNA híbrido, durante el procedimiento de preparación. Este aditivo se puede poner en cualquier etapa del procedimiento, tal como se describe en el documento EP 0 109 942 B1, particularmente en las páginas 4-8. El método preferido es poner el aditivo antes de añadir los lípidos y glicósidos.
Además, la base que se usa pueden ser antígenos y moléculas dirigidas a mucus o antígenos de paso que están más o menos purificados, sintéticos o preparados con técnicas de DNA híbrido y a continuación un procedimiento, tal como se explica en el documento EP 0 109 942 B1 en las páginas 4-8. En este caso puede ser apropiado añadir lípidos antes de que el complejo se haya aislado y purificado, tal como se describe en el documento de patente europea del solicitante EP 0 424 380 B1.
Los lípidos utilizados son en particular los descritos en el documento de patente del solicitante EP 0 109 942 B1, en especial en la página 3 y en el documento de patente EP 0 436 620 B1 en la página 7, líneas 7-24. Se utilizan en especial los esteroles, tal como el colesterol y fosfolípidos, tal como fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina.
Los lípidos pueden llevar también sustancias que contienen lípidos, que se unen a los componentes de unión de las células, tal como glicolípidos incluyendo el receptor de la toxina del cólera, que es el gangliósido GM1 y antígeno fucosado de grupo sanguíneo. Seguidamente, los componentes celulares de unión pueden funcionar como molécula dirigida al mucus y unirse a las sustancias que contienen lípidos mediante la simple mezcla de ellas con complejos que las contienen.
Es también posible preparar primero partículas de iscom con un antígeno y unirlas a otro antígeno utilizando métodos de unión previamente conocidos, preferiblemente métodos químicos de unión, tal como se describen en los documentos de patentes europeas del solicitante EP 0 180 564 B1 y EP 0 436 620 B1.
Otro método es utilizar la matriz como una base, preparándola mediante solubilización de al menos un esterol en un disolvente, añadiendo el glicósido o las saponinas y los otros lípidos, después de lo cual se puede eliminar el agente solubilizante, si no es aceptable en el producto final. Normalmente se transfiere la matriz a una solución acuosa, en la cual no son solubles las partes individuales. Se puede eliminar el disolvente, por ejemplo mediante filtración con gel, ultrafiltración, diálisis o electroforesis. Seguidamente las matrices se pueden purificar de un exceso de esterol y saponina por medio de, por ejemplo, centrifugación con gradiente de densidad o mediante filtración con gel.
El agente solubilizante puede ser cualquiera de los mencionados en el documento EP 0 436 629 B1, página 5, líneas 24-45. Se describen también en este documento los otros componentes y el proceso de separación.
Se pueden unir a la matriz la molécula de paso y la dirigida a la mucosidad utilizando métodos normales de unión, véase anteriormente. El método preferido es mezclar los antígenos con la matriz antes de su administración.
Los glicósidos utilizados en el producto de preparación pueden ser los descritos en el documento EP 0 109 942 B1, página 4, último párrafo. El método preferido es utilizar saponinas, tal como triterpenosaponinas, particularmente Quil A o sus componentes, en particular los descritos en el documento de patente europea del solicitante EP 0 436 630 B1, página 4, líneas 19-46. Éstos pueden ser QHA, QHB, QHC u otras composiciones de los glicósidos de Quil A, que son coadyuvantes. También es posible incorporar otros coadyuvantes y componentes inmunomoduladores diferentes de los glicósidos en los iscoms o en las matrices, tal como se menciona en el documento EP 0 436 620 B1.
Es también factible mezclar el antígeno con las partículas de iscom en las cuales el antígeno se ha integrado o con el iscom y/o matriz de iscom a las cuales se ha unido el antígeno. Se pueden mezclar otros coadyuvantes o componentes inmunomoduladores con el iscom y/o con la matriz de iscom y no necesitan estar integrados en los complejos o unidos a ellos. Ejemplos de tales coadyuvantes se exponen en Cox et al., CRS, 1992. El método preferido es utilizar MDP, MTP y avridina. Es también posible mezclar la molécula de transporte y el antígeno de paso con un complejo o matriz iscom, en cuyo caso el complejo iscom contiene una molécula diferente de antígeno.
Si el antígeno no tiene grupos hidrófobos o anfipáticos, se pueden añadir éstos, de tal manera que el antígeno será capaz de unirse a la partícula de iscom. Ejemplos de tales grupos se encuentran en el documento EP 0 242 380 B1, página 9 y en el documento EP 0 436 620 B1, página 6, línea 33 a página 7, línea 6, en donde se describen los métodos de unión.
Se pueden ver las cantidades relativas de colesterol, lípidos y antígeno que se pueden utilizar en los documentos de patente antes mencionados EP 0 109 942 B1, EP 0 180 564 B1, EP 0 242 380 B1 y EP 0 436 620 B1.
Para hacer la matriz, la relación de esterol, el otro lípido y glicósido es 0,2-10:0,2-10:1-100, preferiblemente 1:1:5.
En principio se pueden añadir los componentes en la relación que se quiera. Se ha visto que el producto final recibe la relación en peso entre los diferentes componentes tal como se ha dado anteriormente, y que el exceso no entra en ella. Si se utiliza demasiado del otro lípido, el complejo se hace grasiento y débil y se desmenuza fácilmente. Si hay demasiado poco del otro lípido ocurre que los complejos no se forman y en su lugar se forman subunidades con forma de anillo. Esto se puede determinar mediante microscopía electrónica.
Es posible determinar si se ha obtenido el iscom o la matriz mediante el examen del producto en un microscopio electrónico.
Las típicas matrices o iscoms tienen una estructura esférica característicamente abierta que consiste en subunidades o partes circulares de la estructura esférica, tal como se puede ver en la Fig. 3 en el documento EP 0 109 942 B1. Los iscoms tienen una menor constante de sedimentación que las correspondientes micelas y a menudo una mayor constante de sedimentación que las correspondientes formas monómeras de proteína o péptido. Las matrices y los iscoms tienen una constante de sedimentación de aproximadamente 12-22 S, en particular 20 S.
La relación en peso de esterol, el otro lípido, proteína y glicósido es 0,2-10:0,2-10:0,2-10:1-100, preferiblemente 1:1:1:5-10 en administración subcutánea. En administración oral o intranasal, puede ser mayor la cantidad de glicósido en la relación anterior, a saber 1-200, preferiblemente 5-20.
Éstas son las cantidades apropiadas, tanto cuando la matriz se produce primero y se une a los antígenos utilizando métodos químicos de unión como más tarde cuando las partículas de iscom se están haciendo.
Se pueden preparar el iscom o la matriz de iscom en composiciones que contienen un agente solubilizante., p. ej. agua o cloruro sódico. La composición puede contener también el detergente utilizado en hacer del complejo que actúe como un disolvente, si es aceptable desde el punto de vista de la práctica médica humana o veterinaria. Además, la composición puede contener otros aditivos y cargas si son aceptables en la práctica médica humana o veterinaria.
Tal composición puede contener, por ejemplo, un complejo iscom y una carga inerte, tal como cloruro sódico, puede también consistir en una matriz mezclada con antígeno.
Se puede hacer disponible la vacuna en formas de administración que contienen una unidad con matriz en una composición que contiene una carga inerte y una unidad con el antígeno en una composición que contiene una carga inerte. Estas dos composiciones están pensadas para que se administren al mismo tiempo.
Al incorporar el antígeno Heq 2 en los iscoms, se produce una respuesta inmune inesperada en caballos después de la vacunación de potros, incluso a una edad tan pequeña como dos semanas, es decir, en animales con un sistema inmune inmaduro y cuando hay elevados títulos de anticuerpos maternos. El programa de vacunación comprendió dos inyecciones intramusculares con un intervalo de dos semanas. Durante la subsiguiente infección natural, los potros vacunados estaban protegidos, mientras que los potros no vacunados no lo estaban (Nordengran, A., Rusval, M., Merza, M., Ekstrom, J., Morein, B., Belak, S., Vet. Microbiol. 51, 55-68, 1996, Ejemplo 1). Es la primera vez que se ha realizado una vacunación con éxito en el caso de un caballo con un sistema inmune inmaduro y en presencia de inmunidad materna.
De manera similar, al incorporar antígenos de moquillo canino en iscoms, focas recién nacidas respondieron inmunológicamente. Perritos de tres semanas respondieron a la vacunación contra parvovirus con una formulación de matriz virus-iscom y corderos de una semana respondieron inmunológicamente con un inmunidad protectora significativa a la administración oral con una formulación de matriz rotavirus-iscom. Ratones de dos días de edad respondieron inmunológicamente a antígenos de virus Sendai incorporados en iscoms.
Se elige la cantidad de iscom, matriz y antígeno para que sea farmacéuticamente efectiva y se pueda estimar por el experto en la técnica.
Se pueden preparar el iscom o la matriz de iscom en composiciones que contienen un agente solubilizante, p. ej. agua o cloruro sódico. La composición puede contener también el detergente utilizado para hacer que el complejo actúe como un agente solubilizante, si es aceptable desde el punto de vista de la práctica médica humana o veterinaria. Además, las composiciones pueden contener otros aditivos y las cargas aceptables en la práctica médica humana o veterinaria.
Tal composición puede contener, por ejemplo, un complejo iscom y una carga inerte, tal como cloruro sódico, puede también consistir en una matriz mezclada con antígeno.
Se puede hacer disponible la vacuna para tipos de administración que contienen una entidad con matriz en una composición que contiene una carga inerte y una entidad con el antígeno en una composición que contiene una carga inerte. Estas dos composiciones están pensadas para administrarse al mismo tiempo.
Ejemplo 1
El tipo 2 del virus herpes equino (HEV-2) es un virus que prolifera en el sistema linfático que infecta caballos de todas las edades y se puede aislar de los glóbulos blancos de la sangre de caballos y especialmente de linfocitos. En potros jóvenes, por ejemplo durante el primer mes después del nacimiento, el virus causa primero una suave enfermedad en las vías respiratorias en una llamada fase viral. El potro parece que se recupera, pero después de un periodo de 2-3 semanas, se pone otra vez enfermo. En este momento, aparece una complicación en forma de una infección secundaria con bacterias, sobre todo Rhodococcus equi, que causa abscesos pulmonares (la fase bacteriana). El tratamiento con suero ha dado protección hasta un cierto grado, mientras que no tenía ningún efecto la vacunación utilizando vacunas convencionales. Una razón parcial de esto es que el potro no desarrolla una respuesta de anticuerpos después de la vacunación. Es bien sabido que los animales y los seres humanos no desarrollan inmunidad después de la vacunación durante el periodo después del nacimiento cuando tienen anticuerpos maternos. En el siguiente ejemplo mostramos que los potros que están vacunados con vacuna iscom desarrollan una respuesta inmune que se puede medir como una respuesta de anticuerpos y que da protección contra la infección natural.
Material y métodos Virus
Se utilizó un aislamiento húngaro de EHV-2 (cepa KT-5797). Se cultivó el virus en una línea celular de conejos (RK-13). Se cultivaron las células en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con sales de Earle complementadas con un suero de ternera fetal al 10%, 100 IE de penicilina y 100 mg de estreptomicina/ml. Se eliminaron células y restos de células mediante centrifugación a 2.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Se concentró el líquido superior 10 veces mediante ultrafiltración (Filtron, Clinton, MA, EE.UU.) con un límite de exclusión de c. 100 kDa. Se sedimentó el concentrado de virus a 14.000 rpm durante 90 minutos a 4ºC en un rotor Kontron TST-28. Se disolvió el sedimento en 500 ml de tampón fosfato, cloruro sódico (PBS), pH 7,4, se colocó en capas en un gradiente de metrizamida al 10-50% (Nyegaard & Co., Oslo, Noruega) y se centrífugo en un rotor Kontron TST-41 a 14.000 rpm durante 16 horas a 4ºC. Se recogió la banda de virus y se tomaron los especímenes para microscopía electrónica y determinación de proteínas.
Preparación de iscoms
Se disolvió virus purificado en un detergente no iónico -1-0-n-octilglucopiranósido (OG) (Boehringer, GMBH, Mannheim, Alemania) en una concentración de 2% durante 1 hora mientras que se agitaba vigorosamente. El virus solubilizado se colocó en capas en un gradiente discontinuo de sacarosa que consistía en 2 ml de sacarosa de 20% conteniendo OG al 0,5% estratificado sobre un cojín de sacarosa de 30%. Después de centrifugar a 40.000 rpm en un rotor Kontron TST-41 durante 45 minutos a 4ºC, se recogió el volumen de la muestra más la capa de sacarosa de 20%. Seguidamente se añadió Quil A (Spikoside, Iscotec, Lule\ring{a}, Suecia) hasta una concentración final de 1%. Se dializó la mezcla durante 72 horas contra tampón de acetato amónico 0,1 M, pH 7,0 a 4ºC. Se centrífugo la preparación resultante de iscom a través de sacarosa de 10% a 40.000 rpm en un rotor Kontron TST-41 durante 16 horas a 4ºC.
Se disolvió la pella que contenía los iscoms en 1 ml de PBS, pH 7,4.
Ensayo de neutralización de virus (VN)
Se incubaron diluciones de suero (diluciones en dos etapas) con 10 TCID50 de virus a 37ºC en placas de microtitulación con cuatro pocillos por dilución. Se inoculó la mezcla a 37ºC y se vigiló diariamente para detectar un efecto citopático (CPE, por sus siglas en inglés). Se leyó el ensayo cuando se había desarrollado completamente el CPE en los tubos de control. Se calculó el título como la dilución final de suero que provocaba la neutralización completa.
Se llevó a cabo la electroforesis con gel de SDS-poliacrilamida (Nordengran, A., Rusval, M., Merza, M., Ekstrom, J., Morein, B., Belak, S., Vet. Microbiol. 51, 55-68, 1996) para establecer las bandas de polipéptidos que formaban los iscoms.
Se realizó microscopía electrónica para asegurarse de la formación de los iscoms.
Diseño experimental
Experimento año 1
Cada dosis contenía 40 \mug. Se dio la primera dosis a las dos semanas de edad.
Se inmunizaron una vez tres potros.
Se inmunizaron dos veces tres potros intramuscularmente (i. m.) con un intervalo de dos semanas.
Se inmunizaron tres veces tres potros con un intervalo de dos semanas.
Ocho potros eran controles sin vacunar (Tabla 2).
Experimento año 2
Se vacunaron primero intramuscularmente 19 potros a las dos semanas de edad con iscoms de Heq2 de 40 \mug. Se realizó dos semanas más tarde la segunda inmunización intramuscular con 40 \mug.
Cinco potros eran controles sin vacunar (Tabla 2).
Recolección de especímenes. Se tomó suero de los potros para ensayos en el momento de la primera vacunación, y cada semana posterior. Se tomó suero de los animales sin vacunar cada 3 a 4 semanas.
Resultados
Los iscoms se caracterizan tal como se describe en el manuscrito (Nordengran, A., Rusval, M., Merza, M., Ekstrom, J., Morein, B., Belak, S., Vet. Microbiol. 51, 55-68, 1996).
Respuesta de anticuerpos en potros con anticuerpos maternos preexistentes (títulos recíprocos)
Potros con títulos de anticuerpos VN preexistentes de 2 o 4 respondieron todos con aumentos significativos de anticuerpos de 2 veces o más (Tabla 1). De los seis potros con títulos preexistentes de 8, tres tenían un aumento doble o mayor, mientras que dos potros tenían un aumento de una vez, y un animal después de la primera y segunda inmunización mostraba un título de 8. Un potro con un título de 16 aumentó su título de suero a 1:32 después de la primera inmunización, pero más tarde disminuyó el título a 8. Los potros con títulos de suero de 32 ó 64 aumentaron sus títulos 1 ó 2 veces.
Vacuna iscom causa la protección contra la infección natural
Experimento 1
Títulos de suero neutralizador de virus
Se vacunaron los potros una, dos y tres veces y posteriormente se dejaron expuestos a la propagación de la infección natural que había existido en la granja equina durante muchos años. Todos los animales vacunados permanecieron libres de síntomas excepto un animal que había sido inmunizado una vez y que mostraba síntomas respiratorios suaves y un ligero aumento de temperatura.
Los potros no vacunados (tres) mostraron todos graves síntomas respiratorios y uno murió (Tabla 2).
Experimento 2
Segundo año
24 potros tomaron parte en el experimento. Se conservaron cinco como controles sin vacunar. Los otros potros se vacunaron la primera vez a las dos semanas de edad y la segunda vez dos semanas más tarde. Después de ello se dejaron los animales expuestos a la propagación de la infección natural que había existido en la granja equina durante muchos años.
18 de los 19 animales vacunados permanecieron sanos y libres de síntomas. Un animal mostró un aumento de temperatura durante una semana y síntomas.
Cuatro de los cinco potros sin vacunar tenían graves síntomas respiratorios y fiebre prolongada y tres de estos potros murieron. Un potro permaneció libre de síntomas.
Conclusión
A pesar del hecho de que los potros que se vacunaron tenían anticuerpos maternos, dos vacunaciones eran suficientes para provocar aumentos muy claros de anticuerpos, lo que no se halló en los animales de control no vacunados. Los animales vacunados se protegieron contra la infección natural cuando se les administró la vacunación al menos dos veces.
Los experimentos muestran que una vacuna iscom es eficaz incluso cuando los animales son muy jóvenes con sistema inmune inmaduro y cuando los anticuerpos maternos preexisten.
Ejemplo 2
Se llevó a cabo por todo el mundo la vacunación con el virus de la cisticercosis (MV) con un virus vivo, generalmente con buenos resultados en el mundo occidental, mientras que los resultados en el tercer mundo eran decepcionantes puesto que el virus causa una elevada mortalidad incluso entre la población vacunada. Un grave problema a este respecto es que los niños en estos países están infectados a una edad en la que todavía tienen inmunidad materna que bloquea el efecto de la vacunación. El siguiente experimento se realizó para mostrar que la vacuna iscom provoca la respuesta de anticuerpos en monos que han sido provistos experimentalmente con anticuerpos de monos hiperinmunizados.
Métodos
Transmisión pasiva de anticuerpos específicos de MV. Para conseguir monos con una cantidad predeterminada de anticuerpos específicos neutralizadores de virus (VN) en el momento de la inmunización, se transfirieron de manera intravenosa diferentes volúmenes reunidos de sueros hiperinmunes de 16 monos, que habían sido previamente infectados con una cepa silvestre de MV (MV-BIL), a monos sin anticuerpos MV (es decir, monos al natural) 48 horas antes de su inmunización.
Preparación de la vacuna. La vacuna atenuada de cisticercosis de Schwartz fue un regalo del Instituto Mérieux, Lión, Francia (se utilizaron 103 dosis de cultivo tisular al 50% [TCID50] por dosis y por ampolla). Se prepararon iscoms de MV según el método de centrifugación descrito por Morein, B., Sudquist, B., Höglund, S., Dalsgaard, K. Y. Osterhaus, A., Nature 308, 457-460, 1984. Se disolvió MV reciente en Triton X-100 al 2% y se colocó en un gradiente de sacarosa de 20-60% conteniendo Quil A al 2% (Spikoside, Iscotec, Lule\ring{a}, Suecia) y se centrífugo en un rotor SW28 a 20.000 rpm durante 18 horas a 4ºC. Se reunió la fracción del gradiente que contenía partículas de iscom, se dializó y se analizó mediante microscopía electrónica, electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida y ELISA para cuantificar las proteínas H y F en las partículas de iscom.
Vacunación de monos cinomolgus. Se inmunizaron monos de dos años de edad MV-negativos con MV-Schwartz (4 monos con 100 TCID50 por dosis) o de forma intramuscular dos veces con un intervalo de cuatro semanas o con iscoms (4 monos con antígenos de 10 \mug por dosis). Se tomó sangre cada semana para análisis de los anticuerpos del suero utilizando ensayos ELISA y de neutralización de virus.
Ensayos serológicos. Se extrajo plasma de las muestras sanguíneas tratadas con heparina. Se inactivó el plasma con calor durante 30 minutos a 56ºC. Se ensayaron anticuerpos específicos para MV en las clases IgM e IgG. Se expresaron los títulos de ELISA de IgM como valores de densidad óptica (DO) a 450 nm. Se expresaron los títulos de ELISA de IgG como dilución recíproca de sueros individuales que causaban una inhibición del 50% de los valores máximos de DO a 450 nm. Se expresaron los títulos de los anticuerpos VN como dilución recíproca de los sueros que inhiben el efecto citopático en células Vero que se infectan con 100 TCID50 de cepa de virus MV-Edmonton.
Resultados Propagación de virus y respuesta de anticuerpos del suero después de la vacunación con MV-Schwarz en presencia de anticuerpos MV que se han transferido pasivamente
Antes de la vacunación, se inoculó a los monos diferentes cantidades de suero que contenían anticuerpos contra MV (véase Métodos). En ausencia o presencia de bajos títulos de anticuerpos específicos a MV transferidos pasivamente (título de VN < 5), los monos desarrollaban una marcada viremia 7-9 días después de la inmunización con MV-Schwartz. Los monos también desarrollaban anticuerpos específicos del suero contra MV de las clases IgM e IgG. Los monos con títulos de anticuerpos del suero > 5 no mostraban signos de la propagación del virus y los títulos específicos de IgM e IgG, como los títulos de VN, estaban muy reducidos en los monos (K9 y 225) que tenían títulos pasivos de anticuerpos en el momento de la vacunación en comparación con el mono 132, que no tenía títulos marcados en la vacunación (véase Fig. 1A). Estos datos muestran que la presencia de bajos anticuerpos de suero específicos contra VM (> 5 o 0,08 IU/ml) interfiere con la replicación de MV-Schwartz y con el desarrollo de una respuesta de anticuerpos específicos contra MV.
Vacunación utilizando una vacuna de la cisticercosis a base de iscom
Después de las inmunizaciones utilizando iscoms, monos MV-seronegativos (312 y 314) y monos que eran seropositivos mediante transferencia pasiva de anticuerpos MV (135 y 222) respondieron con una clara respuesta de anticuerpos de IgM. En contraste con monos inmunizados con MV-Schwartz, la vacuna iscom causaba elevadas respuestas de anticuerpos del suero de IgG que eran cien veces más elevadas que la respuesta de monos inmunizados con MV-Schwartz. Todos los monos, tanto los sero-positivos como los sero-negativos, respondieron con anticuerpos neutralizadores de virus de la misma magnitud (Fig. 1A, 1B).
Conclusión
Los resultados de este experimento muestran que las vacunas iscom inducen la respuesta inmune en presencia de anticuerpos específicos transferidos pasivamente y, por tanto, apoyan los resultados del Ejemplo 1, mostrando que las vacunas iscom son eficaces cuando están preexistentes anticuerpos transferidos pasivamente. Los monos en este experimento eran inmunocompetentes.
La Fig. 1B muestra que iscoms del virus de la cisticercosis (MV) (monos 312, 314, 135 y 222) forman anticuerpos del suero contra VM de clase IgM, IgG, que neutralizan los virus (VN). La vacuna contra MV-Schwartz no tiene esta capacidad; anticuerpos de IgM específicos contra MV no son activados en absoluto o se provoca una respuesta muy débil que es transitoria y pasa rápidamente. Las respuestas de anticuerpos de IgG y VN son de 10 a 100 veces menores que las provocadas utilizando vacuna iscom.
Ejemplo 3 Vacuna
El virus del moquillo canino (CDV) es uno de los diferentes virus que causan la enfermedad en jóvenes cachorros y durante años ha sido un grave problema en perreras. Hay disponibles vacunas eficaces para adultos, pero no hay vacuna disponible que sea eficaz en el periodo juvenil. No hay vacuna que sea efectiva antes de la edad de 12 semanas. En las perreras, el CDV y también el parvovirus canino pueden causar elevada morbilidad y mortalidad antes de la edad en que ellos responden a la vacunación dependiendo I. De un sistema inmune inmaduro, es decir un sistema inmune que no es competente como en adultos (Ridge, J. P., Fuchs, E. J., Matzinger, P. Science 271, 1723-26, 1966; Billingham, R. E, Brent, L., Medawar, P. B., Nature, 172, 603, 1953; Bandeira, A., Coutinho, A., Carnaud, C., Jacquemart, G., Forni, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 272, 1989, Schumans et al., J. Immunol. 145, 2465, 1990). II. La inmunidad materna, principalmente anticuerpos transferidos desde la madre al recién nacido, ejerce un efecto bloqueador sobre la vacuna.
En el presente estudio, se seleccionaron cachorros recién nacidos de focas, de entre 1 y 8 días de edad, para tener anticuerpos maternos (grupo 1) medidos mediante ensayo de neutralización de virus (VN).
Las focas del grupo II no se seleccionaron en relación con la presencia de inmunidad materna, habiendo por tanto cachorros seropositivos y seronegativos con respecto a CDV.
En el mar del Norte, en el mar Báltico y alrededor de las costas de Gran Bretaña murieron muchas focas por la aparición de una enfermedad parecida al moquillo canino causada por un virus cercano del grupo de los morbilivirus. Por esa razón, se ensayó un tipo de vacuna basado en la tecnología iscom. No se pueden administrar vacunas vivas de CDV a animales salvajes, por el riesgo de causar enfermedades y causar una epizootia entre los animales salvajes.
Se hizo la propagación del virus en células VERO. Se purificó el virus mediante ultracentrifugación, tal como se describe para el virus Heq2 en el Ejemplo 1. Se prepararon los iscoms tal como se describe para virus Heq2
(Ejemplo 1).
Inmunización
Se inmunizaron los cachorros intramuscularmente (i. m.) a una edad de uno a ocho días. Ocho días después de la inmunización se tomaron muestras de suero y se ensayaron en el ensayo de VN (Tabla 4 y 5).
En grupo I, la Tabla 4 comprende focas no seleccionadas del mar lejos de la costa de Gales que se inmunizaron intranasalmente con antígeno de 7 \mug por animal. Ocho días más tarde, se tomaron muestras de suero. En este grupo ocho de los trece sueros de las focas mostraban títulos elevados de HI. Antes de la vacunación, cinco de estos sueros no tenían anticuerpos maternos detectables y estos animales respondían a la vacunación, lo que también hacían los animales con anticuerpos maternos. Ningún animal mostraba títulos decrecientes, que es lo que se hubiera esperado si no se consiguiera una respuesta inmune.
En el grupo II, (Tabla 5) se seleccionaron 23 cachorros que tenían anticuerpos maternos. Nueve sueros de estos animales mostraban títulos aumentados de HI, 12 sueros tenían los mismos títulos de anticuerpos después de la vacunación que antes y solamente dos animales mostraban títulos disminuidos de HI.
En general, deberían haber disminuido los títulos de VN, considerando el tiempo de vida media de 12 días para anticuerpos de foca. Los resultados muestran claramente que la mayoría de las focas habían respondido a la vacunación.
Durante los últimos años, se han vacunado más de 200 cachorros de focas con una preparación de iscom de CDV después de su llegada a un santuario de focas en Países Bajos. La edad de estos animales iba de 0-14 días. Aparte de una elevación de anticuerpos neutralizadores de CDV, que también sucedía en la mayoría de los casos en presencia de anticuerpos maternos, no se pudo demostrar ningún caso de moquillo de focas en cualquiera de estos animales, de los cuales más del 90% se rehabilitaron con éxito y se reintrodujeron en su hábitat natural de tres a cuatro meses después de su admisión. Esto, a pesar del hecho, que hemos demostrado, de que la infección por PDV se estaba todavía extendiendo en la población silvestre (Visser et al., Vet. Rec. 133, 320-322, 1993) y en el santuario de vez en cuando, sin causar síntomas clínicos significativos en el santuario. Se puso aislar PDV de vez en cuando de algunos de los animales del santuario que mostraban una ligera conjuntivitis.
Conclusión
Este experimento muestra claramente que las focas jóvenes responden a la vacunación en presencia de o sin anticuerpos maternos. Tales vacunas son muy deseadas, tanto para el hombre como para los animales.
Ejemplo 4 Inmunidad protectora de la mucosa inducida en corderos mediante administración oral de rotavirus inactivados coadyuvados con matriz iscom Introducción
Se reconocen los rotavirus como la principal causa de una enfermedad diarreica grave en niños menores de 5 años de edad, tanto en países desarrollados como en desarrollo, dando como resultado anualmente unas 870.000 muertes y varios millones de casos de diarrea grave en este grupo de edad. Son también de similar importancia como una causa de diarrea neonatal en muchas especies de animales domesticados. Con la excepción de un estudio que describe la respuesta inmune primaria de la mucosa en conejos, existe muy poca caracterización detallada de esta respuesta.
En este ejemplo, examinamos la hipótesis de que una respuesta inmune de la mucosa, así como una respuesta sistémica, se puede seguir después de la inmunización oral con rotavirus bovinos inactivados y matriz iscom, que daría como resultado una respuesta inmune protectora al subsiguiente ataque de virus virulentos vivos. Se debería resaltar que los corderos del experimento (de 6 días de edad) son muy jóvenes y que están en una edad que es cuando son menos inmunocompetentes que los adultos (Ridge, J. P., Fuchs, E. J., Matzinger, P. Science 271, 1723-26, 1966; Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Nature, 172, 603, 1953; Bandeira, A., Coutinho, A., Carnaud, C., Jacquemart, F., Fomi, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 272, 1989; Schumans et al., J. Immunol. 145, 2465, 1990) y durante un periodo en el que se espera que los anticuerpos maternos prevalezcan, lo que hace incluso más difícil la vacunación con éxito. Por esa razón, sería incluso más interesante explorar si la combinación de una administración oral por la mucosa con un sistema moderno de coadyuvantes superaría el problema de la inmunización neonatal.
Material y métodos Virus
El virus de la vacuna fue una cepa de rotavirus bovino, UK, cultivada en células MA 104. El título de capacidad de infección, antes de la inactivación era de 106,8 unidades de foco fluorescente (ffu, por sus siglas en inglés)/ml, y después del tratamiento con una solución etileno-imina binaria 0,1 M (BEI, por sus siglas en inglés) al 5% (v/v) a 37ºC durante 24 horas, no se detectó capacidad de infección. Se utilizó para la infección la cepa virulenta K923 de rotavirus de cordero pasada a corderos gnotobióticos. Cada cordero recibió 108,5 ffu suspendidas en 5 ml de PBS estéril.
Diseño experimental
Nacieron los corderos y se mantuvieron en unidades de aislamiento gnotobíótico. A los seis días de edad, se inoculó oralmente a los corderos una mezcla, o de PBS y 500 \mug de matrices iscom (Advet, Uppsala, Suecia) (PBS/ISC; n = 6), rotavirus bovino inactivado (cepa UK) y 500 \mug de matrices iscom (RV/ISC; n = 5), o solamente rotavirus bovino inactivado (RV; n = 3). Se infectaron los corderos 21 días más tarde con rotavirus ovino virulento vivo (cepa K923) y se mataron 1-2 semanas después de la infección.
Recolección de muestras y análisis
Se recogieron sangre para el suero y secreciones nasales en la inmunización inicial y seguidamente en intervalos regulares para determinar los niveles de anticuerpos de IgA e IgG específicos y totales mediante ELISAs y títulos neutralizadores mediante ensayos de neutralización de virus. Se recogieron muestras fecales diariamente después de la inmunización e infección hasta que no se detectó rotavirus en la excreción. Se investigó la secreción de rotavirus mediante detección de RNA de cadena doble mediante electroforesis de gel de poliacrilamida-dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE). Se recogieron PBLs durante la inmunización inicial y seguidamente en intervalos semanales para determinar los números de células específicas secretoras de IgA e IgG mediante ELISPOTs y la distribución de las subpoblaciones de linfocitos mediante análisis FACS. Se mataron los corderos 1-2 semanas después de la infección y se aisló la población de linfocitos de las placas de Peyer del yeyuno (JPPs), de las placas de Peyer del íleon (IPPs), nódulos linfáticos mesentéricos (MLNs) y de linfocitos epiteliales intersticiales y de linfocitos de lámina propia (IEL y LPL). Números de células productoras específicas de IgA e IgG en JPPs, MLNs y LPLs y se determinaron mediante ELISPOT. Se analizaron las subpoblaciones de linfocitos mediante FACS. Se visualizó la expresión de citoquinas (\gamma-IFN, IL-2, e IL-4) en MLNs y JPPs mediante RT-PCR e hibridación. Se determinaron utilizando mucus intestinal los niveles de anticuerpos específicos y totales de IgA e IgG y los títulos de neutralización en las secreciones intestinales.
Aislamiento de linfocitos
Se recogieron linfocitos de la sangre periférica y se procesaron tal como se ha descrito anteriormente (Puri, N. K., MacKay, C. R., Brandon, M. R., Immunology 55, 725-733, 1985) y se volvieron a suspender en la concentración apropiada en IMDM completo conteniendo glutamina 1mM, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B (Sigma, San Luis, EE.UU.) y se trató tal como se ha descrito anteriormente. Se suspendieron finalmente los linfocitos en las concentraciones apropiadas en IMDM completo. Se recogieron trozos de intestino delgado y se trataron con pequeñas modificaciones de los métodos previamente descritos. Se cortó el intestino delgado en segmentos de 10 cm, se le dio la vuelta, se lavó tres veces a 37ºC con suave agitación en HBSS sin calcio ni magnesio conteniendo EDTA 2 mM para obtener células epiteliales libres y linfocitos intraepiteliales. Se lavaron los tejidos en RPMI 1640 y se colocaron en RPMI conteniendo glutamina 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, 5 \mug/ml de gentamicina, 80 unidades/ml de colagenasa XI (Sigma), 0,1 mg/ml de desoxirribonucleasa tipo V (Sigma), y FCS al 10% a 37ºC para permitir que se quitaran los linfocitos de la lámina propia. Se pasaron las suspensiones de IEL y LPL a través de columnas de fibra de vidrio estéril, se colocaron en capas en un volumen igual de Lymphoprep® y se centrifugaron. Se recogieron los linfocitos en la interfaz y se lavaron dos veces en HBSS conteniendo glutamina 1 mM, 100 unidades de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 \mug/ml de anfotericina B, y FCS al 2%, antes de suspenderse en la concentración apropiada en IMDM completo.
Ensayos
Ensayos de neutralización de virus. Se realizaron ensayos de neutralización de virus para la cepa UK de rotavirus bovino y para la cepa K923 de rotavirus de cordero en placas de microtitulación y se determinaron los puntos finales o el título de la neutralización del de virus (VNT, por sus siglas en inglés) mediante la reducción de 60% de las unidades de foco fluorescente.
ELISAs. ELISAs de rotavirus específicos utilizaron placas de microtitulación, (Nunc, Maxisorb), recubiertas con un suero de captura de anti-rotavirus de conejo, K923 RV de cordero y extractos MA 104 sin infectar como control de unión negativo de antígenos, el ensayo y las muestras de control, IgG anti-oveja de asno conjugada con peroxidasa de rábano picante (El lugar de unión) o IgA anti-bovina de ratón, con el color desarrollado mediante la adición al sustrato de H2O2 y de dihidrocloruro de \sigma-fenilendiamina a la peroxidasa de unión. Se paró la reacción con H2SO4 2 M, y se midió la absorbancia a 490 nm. Se calculó la absorbancia neta mediante la sustracción de los valores en los pocillos negativos de los correspondientes pocillos de K923.
Los ELISAs de isotipo total utilizaron placas de microtitulación recubiertas con IgG anti-oveja de conejo (Pierce) o IgA anti-bovina de ratón, con el mismo desarrollo de color, tal como se ha descrito anteriormente. Se sustrajeron los valores de DO en los pocillos de diluyente de los correspondientes en los pocillos del ensayo. Para cada ELISA se utilizó un valor estándar: un suero de cordero hiperinmune para la concentración de IgG de 9.600 mg/l para el ELISA total de IgG; una carga para IgA, purificada de fluido pulmonar clarificado de una oveja infectada con un retrovirus ovino (Jaagsiekte) (JSRV, por sus siglas en inglés) para el ELISA de IgA total. Se ensayó cada valor estándar en ocho diluciones de 2 veces, y se ajustó la absorbancia neta como una función de las unidades arbitrarias de anticuerpos o mg por ml respectivamente, a una curva sigmoidea lineal logarítmica. En cada caso la curva estándar resultante tenía un ajuste de r > 0,95. Seguidamente, se utilizaron los parámetros resultantes para interpolar unidades de anticuerpos o concentración (mg/ml) para cada una de las muestras del ensayo, tomando en consideración el factor de dilución al cual se ensayó cada muestra. Se combinaron resultados de ELISA específicos y totales y se expresaron en unidades/mg de IgG o IgA.
ELISPOTs. ELISPOTs de anti-rotavirus de isotipos utilizaron placas de microtitulación, (Nunc, Maxisorp), recubiertas con un suero de captura anti-rotavirus de ratón, cepa UK de rotavirus purificada con sacarosa como antígeno en una concentración de 5 \mug/ml, la suspensión de PBL (5 x 105 células/ml), IgG anti-oveja de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce) o IgA anti-bovina de ratón, haciendo las manchas visibles mediante la adición al sustrato de H2O2 y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, por sus siglas en inglés) a la peroxidasa de unión. Se paró la reacción cuando las manchas se hicieron visibles, mediante golpeo con el dedo al sustrato. Se contaron las manchas (media de 6 replicados) y se expresaron como células formadoras de manchas (SFC)/106 linfocitos.
Análisis de FACS. Se determinaron subpoblaciones de linfocitos con un panel de monoclonales específicos para ovinos de ratón CD4 (17D) (MacKay, C. R., Hein, W. R., Brown, M. H., Matzinger, P., Eur. J. Immunol. 18, 1681-8, 1988; Maddox, J. F., MacKay, C. R., Brandon, M. R., Immunology, 55, 739-48, 1985), CD8 (7C2) (Maddox, J. F., MacKay, C. R., Brandon, M. R., Immunology, 55, 739-48, 1985), \gamma\deltaTCR (86D), cadena ligera (VPM8) (Puri, N. K., MacKay, C. R., Brandon, M. R., Immunology, 55, 725-33, 1985) y CD45R (73B) (MacKay, C. R., Marston, W. L., Dudler, L., J. Exp. Med. 171, 801-17, 1990). Un segundo anticuerpo, IgG anti-ratón de conejo marcada con fluoresceína (DAKO), se aplicó y se escanearon las células y se contaron con un FACScan® (Becton-Dickinson Lid.).
Resultados Después de la vacunación
Los valores de los anticuerpos específicos de IgG en la sangre después de la inmunización eran más elevados en los animales vacunados con matriz de iscom de RV (Fig. 2 A). Porcentajes significativamente más elevados de células CD4+ a los 21 días después de la inmunización en los dos grupos vacunados con RV (Fig. 2 B). Solamente se encontraron células CD45R+ (Fig. 2 C) en la sangre en el grupo vacunado con matriz RV/ISC, que es lo más importante desde el punto de vista de que estas células son células de memoria y constituyen una base para una respuesta rápida a una subsiguiente infección con rotavirus. De forma interesante, la matriz de PBS/ISC, es decir, grupo sin antígenos no mostraba aumento de las células CD4+, pero sí mostraba un porcentaje significativamente más elevado de las células \gamma\deltaTCR (no mostrado).
Después de la infección
Se espera que después de la infección los animales respondan inmunológicamente. Sin embargo, hasta ahora una única inmunización por vía oral, con formulación de rotavirus que no están vivos (no se replican), no había inducido a la protección contra la infección o contra la enfermedad. La protección contra la enfermedad depende de I. La defensa inmune existente, II. La preparación del sistema inmune a responder rápidamente al agente infectante, en este caso RV. Esta preparación depende de las células de memoria, es decir células CD45R+ que se indujeron mediante matriz iscom de RE, que se detectaron el día 21 después de la vacunación y antes de la infección (Fig. 2 C). La lectura de la disponibilidad contra la infección es la excreción del agente infeccioso, en este caso el RV. Se debería indicar que este experimento es el primero de este tipo en un rumiante con un sistema de alimentación muy complicado. Por tanto, para alcanzar condiciones óptimas con respecto a la dosis del coadyuvante (matriz-iscom) y antígeno etc., son necesarios una serie de experimentos. Sin embargo, está fuertemente indicado el proyecto muy prometedor de una vacuna exitosa basada en la tecnología de iscom y matriz de iscom.
Después de la infección, todos los corderos excretaban rotavirus. Los corderos vacunados con RV excretaban virus durante un periodo más corto que los controles, a saber 5-6 días, 6-7 días y 8-9 días respectivamente, sin embargo, esto era solamente significativo (p = 0,027) en el grupo vacunado con matriz de RV/ISC, indicando seriamente el potencial para desarrollar una vacuna eficaz (Fig. 2 d).
Tal como se esperaba, todos los corderos tenían después de la infección anticuerpos específicos de IgA e IgG en el suero, en las secreciones nasales, y en los raspados del intestino y células secretoras de anticuerpos en la sangre y en tejidos linfoides asociados al intestino (MLNs y JPPs) después de la infección.
Particularmente, los grupos vacunados con matriz de RV/ISC habían aumentado de forma significativa las cifras de células productoras de IgA (Fig. 14 E) e IgG específicas en la sangre, indicando un efecto de inmunización de la vacunación. El efecto de inmunización depende del desarrollo de las células de memoria. Las cifras de las células productoras de específicas IgG eran también significativamente más elevadas, comparadas con el grupo vacunado con RV sin coadyuvantes. Después de la infección, no se hallaron diferencias en las células productoras de IgA (Fig. 2 E) o IgG específicas en el GALT entre los tres grupos. Las respuesta de IgG especificas era similar a la respuesta de IgA específicas.
Se detectaron anticuerpos neutralizadores contra UK y K923 en todos los grupos en el suero. Después de la infección, todos los corderos tuvieron un aumento de células CD4+ y en los grupos vacunados con PBS/iscom-matriz y en los vacunados con RV, aumentaron las células CD45R+ a un nivel similar al observado en el grupo vacunado con RV/ISC antes de la infección.
Discusión
Es sorprendente que una única dosis oral de rotavirus no replicantes inactivados coadyuvados con una matriz iscom diera como resultado un periodo significativamente reducido de excreción de virus después de la subsiguiente infección con virus replicantes vivos. Se observó solamente un periodo significativamente reducido de excreción de virus en el grupo vacunado con RV/ISC y no en el grupo vacunado con RV, aunque el pequeño número de corderos en este grupo limita el análisis estadístico. Las características de la respuesta inmune de los animales inmunizados contra la infección de virus comprenden niveles aumentados de anticuerpos de IgA e IgG específicas en las secreciones nasales e intestinales, y, en el grupo vacunado con RV/ISC, cifras aumentadas de células productoras de IgA e IgG específicas.
Es también sorprendente que RV coadyuvado con matriz de iscom, solamente con una dosis, causara una respuesta inmune y redujera de forma significativa el periodo infeccioso a la vista de los resultados de Mowat (Mowat et al., Immunology 72, 317-322, 1981) mostrando en ratones que eran necesarias varias inmunizaciones y elevadas dosis para inducir respuesta de IgA después de la administración oral de OVA.
Conclusión
No se esperaba que se consiguiera una clara inmunización mediante administración oral de una dosis de Rotavirus coadyuvado con matriz de iscom o de cualquier vacuna no replicante en vista de la poca edad de los animales, es decir una semana, cuando todavía están en el periodo neonatal y no son inmunocompetentes como adultos y también en vista de la dificultad de inducir una respuesta inmune con una inmunización por la vía oral. Esto es particularmente difícil a la vista del sistema complicado de alimentación de los rumiantes. Es probable que el rotavirus o partes del rotavirus en lo que se refiere a esto es apropiado para utilizarse como un dispositivo de búsqueda de diana mucosa apropiado para facilitar la inmunización con otros antígenos, así como en las formulaciones de iscom y matriz de iscom. Estos resultados implican la posibilidad de inmunizar con éxito a los animales mediante la inmunización de la mucosa durante el periodo neonatal, cuando están presentes los anticuerpos maternos. El número elevado de células CD45R+ inducidas por la matriz de RV/iscom indican un número elevado de células de memoria que se pueden reclutar rápidamente por una infección, explicando el corto periodo de la excreción de virus después de la infección oral y de esta manera eliminando o disminuyendo el riesgo de desarrollo de la enfermedad.
Ejemplo 5
El virus Sendai es un paramixovirus que infecta las vías respiratorias de ratones y causa neumonía. En este experimento se extrajeron las proteínas de la cápside de las partículas de virus con detergente y se reensamblaron en los iscoms o en las micelas. Las dos partículas son esféricas con un diámetro de aproximadamente 40 nm exponiendo bien los antígenos. Las micelas no tienen un componente coadyuvante que consiste en unas proteínas de cubierta mientras que el iscom, además de las proteínas de la cubierta contiene un coadyuvante incorporado de moléculas de triterpenoide. El objeto del experimento es explorar si las proteínas de la cápside del virus Sendai integradas dentro de los iscoms inducen la respuesta inmune en ratones de dos días de edad que no tienen competencia inmunológica, debido a un sistema inmune inmaduro. Clásicamente, una dosis comparativamente elevada de 1 \mug debería inducir tolerancia a la edad de 2 días. Se llevó a cabo en el día 42 la segunda vacunación en ratones inmunológicamente adultos. La lectura del experimento sería una fuerte respuesta inmune después de la segunda inmunización. En el caso de ratones de 2 días de edad responden con células de memoria después de la primera inmunización. Los ratones que son inmunizados como inmunológicamente adultos, se esperaría que respondieran con una baja respuesta de anticuerpos. En el caso de que se induzca la tolerancia, los ratones no responderán a la segunda inmunización realizada en el día 42.
Material y métodos Formación de virus e iscom
Se propagó el virus Sendai en huevos, se purificó mediante ultracentrifugación, tal como se describe para el virus de la gripe en el documento de patente PCT/SE97 ejemplo 3 (prioridad de SE 9600647-3).
Se prepararon las micelas tal como se describe para iscoms, excepto en que se omitieron los componentes de Quillaja, dando como resultado un ensamblaje de las proteínas de cubierta anfipática mediante interacciones hidrófobas por su región transmembranal para formar micelas. (Lövgren, K., K\ring{a} berg, H., Morein, B., Clin. Exp. Immunol. 82, 435-439, 1990).
Diseño experimental
Se inmunizaron de forma subcutánea (s. c.) grupos de ocho ratones de dos días de edad, tal como se describe en la Tabla 6, con 1 \mug o 0,2 \mug de antígenos de virus de la gripe en iscoms o micelas y a continuación recibieron la misma dosis en el día 42 como inmunológicamente adultos. Otros grupos de ratones recibieron en el día 42 iscoms o micelas de 1 ó 0,2 \mug. Se midieron las respuestas de anticuerpos en ELISA, tal como se describe en el Ejemplo 4, patente XXXXX, excepto en que el antígeno adsorbido en las placas de plástico era iscom con antígeno de virus Sendai en una concentración de 0,1 \mug/ml. Las sangrías para obtener suero se realizaron dos semanas después de la segunda inmunización.
Resultados
Los ratones inmunizados con iscoms a la edad de dos días y seguidamente reforzados a la edad de 42 días respondieron con unas respuestas claras de anticuerpos después del refuerzo contra el antígeno del virus Sendai. La baja dosis de 0,2 \mug dio como resultado elevados títulos (Tabla 6) con valores de lectura de ELISA en dilución 1:2000 a DO45 de 2,5, mientras que la dosis más elevada de iscoms de 1 \mug indujo la respuesta de anticuerpos del suero, medida como un valor de lectura de 1,1 (DO450).
Los ratones inmunizados con iscoms de 0,2 \mug como inmunológicamente adultos respondieron con bajos valores de lectura a una dilución de 1:1000. El ELISA utilizado es uno usado rutinariamente para buscar entre ratones anticuerpos del suero contra virus Sendai en el Instituto Veterinario Nacional de Uppsala.
Ninguno de los ratones inmunizados con micelas, ya fuera con la dosis baja, es decir 0,2 \mug, o con la dosis más elevada de 1 \mug, respondieron a la inmunización, ni después de una o dos inmunizaciones. Esto puede indicar una inducción de tolerancia mediante la primaria a una pequeña edad, es decir cuando el sistema inmune es inmaduro. Por el contrario, las mismas dosis de antígeno en un iscom indujeron claras respuestas de anticuerpos del suero, que fueron inmunizados en ratones inmunológicamente inmaduros, que no desarrollaban tolerancia sino una fuerte respuesta inmune.
Conclusión
Ratones inmunizados con iscoms de Sendai a una edad, cuando no son inmunológicamente maduros y a una edad cuando se sabe que responden a la vacunación con una respuesta de tolerancia, no lo hicieron cuando se les inmunizaba con iscoms de virus Sendai. Pero ratones inmunizados con las mismas dosis de virus Sendai en una formación micelar no coadyuvada, no respondían serológicamente después de dos inmunizaciones, indicando el desarrollo de una tolerancia inmunológica al virus Sendai. Esto es inesperado, el que un coadyuvante rompa o supere la tolerancia inmunológica neonatal.
Ejemplo 6
Los parvovirus caninos causan una enfermedad en jóvenes cachorros y ha sido un gran problema en muchas perreras. Hay disponibles vacunas vivas y muertas para adultos, pero no hay vacuna disponible que sea eficaz para cachorros por debajo de la edad de 10 a 12 semanas. En un estudio limitado, mostramos que los parvovirus eliminados con \beta-propiolactona y coadyuvados con matriz de iscom son considerablemente más eficaces que una vacuna muerta, comercial, cuando se utiliza a una edad más pequeña de los cachorros que la recomendada por los fabricantes.
Material y métodos Preparación y purificación de virus
Se hizo crecer en células pulmonares de gato la cepa CPV-916 de parvovirus canino, amablemente proporcionada por C. G. Sjösten; Pherovet, Malmoe. Se recogió el virus en el día dos. Se utilizó centrifugación de baja velocidad (10 min. a 4200 rpm) para liberar el virus de los restos celulares. Se sedimentó el virus mediante ultracentrifugación. Se recogieron las pellas de los virus en tampón TN y el virus se siguió purificando mediante ultracentrifugación con gradiente. Se preparó gradiente de CsCl, 1,20-1,40 g/cm3, se mezcló con la muestra y se centrifugó a 30.000 rpm durante 12 horas a -20ºC. Se establecieron claramente dos bandas. La suspensión se fraccionó y cada fracción se tituló con HA y se juntó con títulos de HA \geq224, que se consideraban típico para parvovirus y se seleccionó este conjunto para posterior tratamiento y se dializó toda la noche a +4ºC en tampón TN.
El virus se diluyó hasta una concentración final de un mg por ml de PBS utilizado como diluyente y almacenado a -20ºC hasta su uso.
A partir del material almacenado, se preparó la vacuna experimental mediante dilución del virus con PBS para contener 7 \mug de virus por dosis en un volumen de 1 ml en PBS.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Se realizó el ensayo de H utilizando eritrocitos de un cochinillo de tres semanas de edad, tal como se describe en Klingeborn, B. Y Moreno-López, J., Zbl. Vet. Med. B. 7, 483-488, 1980.
Determinación de proteínas: se realizó según Bradford, Analyt. Biochem. 72, 248-254, 1976.
Diseño experimental
Se utilizó en el estudio un grupo de cachorros del centro de perros sueco de Sollefte\ring{a}. Se vacunaron cuatro cachorros a la edad de tres semanas con el parvovirus/matriz de iscom y tres cachorros se vacunaron con la vacuna muerta comercial, la primera vez a la edad de 3 semanas y la segunda vacunación 23 días más tarde (Tabla 7), es decir, ambas vacunaciones se realizaron antes de la edad en la cual se recomiendan las vacunas comerciales. Se tomó suero para ensayos 15 y 28 días después de la primera inmunización y 10 días después de la segunda vacunación (véase Tabla 7).
Resultados
Después de la dos inmunizaciones, los cachorros vacunados con la formulación parvovirus/matriz de iscom tenían títulos de HI recíprocos en el suero de 2560 o de 5120 para compararse con el título de HI recíproco del suero de 40 a 160 que era inducido por la vacuna comercial (Tabla 7).
Conclusión
Es obvio que la vacuna experimental parvo/matriz de iscom en el estudio limitado presentado es superior al parvovirus muerto comercial, que se ha ensayado en los grupos de edad de los cachorros. Los títulos de HI obtenidos con la vacuna experimental parvo/matriz de iscom eran muy elevados, incluso aquellos obtenidos en los perros adultos o cachorros vacunados a una edad recomendada de 12 semanas o más. Estos resultados son inesperados a la vista del hecho de que no se espera de que ninguna vacuna de parvovirus comercial, muerta o incluso algo viva, sea eficaz en los grupos de edad de los cachorros ensayados.
Leyendas de figuras
La Fig. 1A, 1B muestran que los iscoms del virus de la cisticercosis (MV) (mono 312, 314, 135 y 222) provocan anticuerpos del suero contra MV de clase IgM, IgG, que neutralizan los virus (VN). La vacuna de MV-Schwartz no tiene esta capacidad.
Fig. 2A Anticuerpos específicos de IgG en sangre después de la vacunación; Se analizaron medias de grupos mediante ANOVA en una dirección.. Grupos vacunados con RV con respecto a grupo vacunado con PBS;
grupo vacunado con RV/ISC-matriz
grupo vacunado con RV
\vskip1.000000\baselineskip
grupo vacunado con PBS/ISC-matriz
Fig. 2B. La subpoblación de linfocitos de células CD4+ (porcentaje) en sangre periférica en intervalo de tiempo creciente después de la vacunación oral con vacunas de rotavirus (RV) con y sin coadyuvante de matriz de iscom y día 21 de la subsiguiente infección. Se analizaron las medias de los grupos mediante ANOVA en una dirección.
Fig. 2C. La subpoblación de linfocitos de células CD45R+ (porcentaje) en sangre periférica en intervalo de tiempo creciente después de la vacunación oral con vacunas de rotavirus (RV) con y sin coadyuvante de iscom-matriz y día 21 de la subsiguiente infección. Se analizaron las medias de los grupos mediante ANOVA en una dirección.
Fig. 2D. Excreción de virus después de la infección.
Fig. 2E. Células productoras de IgA específicas en sangre después de la vacunación y día 21 de la subsiguiente infección.
PBS/matriz de iscom (no antígeno de RV)
\vskip1.000000\baselineskip
RV/matriz de iscom
RV (virus inactivado)
TABLA 1
El desarrollo de anticuerpos de neutralización de virus (VN) en suero de potros en
presencia de anticuerpos maternos
Títulos de anticuerpos del suero
Después de 1ª vacunación 2ª vacunación
Semanas 0 1 4
Controles no vacunados 2 2 4
2 2 4
4 2 8
2 2 2
Una vacunación 16 32 64
2 4 8
4 2 8
2 2 2
Dos vacunaciones 2 32 64
2 2 64
2 8 64
2 4 16
4 2 16
4 4 16
4 4 16
4 8 16
8 8 8
8 4 16
8 8 32
8 16 16
8 16 -
8 16 64
16 32 8
32 32 64
64 128 128
64 128 256
TABLA 2 (Exp. 1)
Se obtuvo la protección contra la infección natural después de dos inmunizaciones con iscoms de EHV-2
en potros
Grupo Número de potros inmunizados Número de animales () con
síntomas y tipo de síntomas
I 1 (1) -
(1) +/-
II 2 (3) -
III 3 (3) -
TABLA 2 (Exp. 1) (continuación)
Se obtuvo la protección contra la infección natural después de dos inmunizaciones con iscoms de EHV-2
en potros
Grupo Número de potros inmunizados Número de animales () con
síntomas y tipo de síntomas
IV Testigos no vacunados (1) +++
(1) ++
(1) +
- Sin síntomas
+/- Temperatura corporal por encima de 39,5ºC, síntomas suaves en las vías respiratorias durante menos de
6 días
++ Fiebres recurrentes elevadas o fiebre prolongada (por encima de 39,5ºC) y graves síntomas respiratorios
+++ Los potros murieron después de elevada fiebre recurrente o fiebre prolongada (por encima de 40ºC) y
graves síntomas respiratorios
TABLA 3 (Exp. 2)
Se obtuvo la protección contra la infección natural después de dos inmunizaciones con iscoms de EHV-2
en potros
Grupo Número de Número de inmunizaciones Número de animales () con
animales síntomas y tipo de síntomas
I 5 Testigos no vacunados 1 (3) +++
(1) ++
(1)
II 19 2* (1) +
(18) –
* Se vacunaron los potros primero a las dos semanas de edad y a continuación se reforzaron a las cuatro
semanas
- Sin síntomas
+ Temperatura corporal por encima de 39,5º-40,5C, fiebre aproximadamente una semana, infección
respiratoria
++ Temperatura corporal por encima de 39,5ºC, fiebre prolongada y graves síntomas de las vías respiratorias
+++ Muertos después de elevada fiebre recurrente o fiebre prolongada (por encima de 40ºC) con síntomas
respiratorio
TABLA 4
La respuesta de anticuerpos del suero de focas jóvenes inmunizadas con iscom de CDV medida
mediante neutralización del virus. Las focas del grupo II eran de la costa fuera de Gales y comprenden
animales con y sin anticuerpos maternos detectables contra CDV
Nombre CDV-VNT CDV-VNT
Tigh 20 20
Sine 20 20
Matthew 20 20
Gittara 20 20
Bonnie < 20 20
Rob < 20 20
Pax 20 60-180
Fury 20 20
Benfro < 20 20
Bolly 20 20
Sidney < 20 20
Solomon 20 20
Jetty < 20 20
TABLA 5
La respuesta de anticuerpos del suero de focas jóvenes inmunizadas con iscom de CDV medida
mediante neutralización de virus. Las focas se seleccionaban para tener anticuerpos contra CDV
Nombre Primera muestra Segunda muestra
95-09 30 30
95-10 100 300
95-15 100 300
95-11 30 30
95-58 30 10
95-27 30 30
96-12 20 60
95-30 30 30
95-39 100 100
95-47 10 30
TABLA 5 (continuación)
La respuesta de anticuerpos del suero de focas jóvenes inmunizadas con iscom de CDV medida
mediante neutralización de virus. Las focas se seleccionaban para tener anticuerpos contra CDV
Nombre Primera muestra Segunda muestra
95-04 100 100
95-50 100 100
95-69 30 10
95-59 300 1000
95-86 100 100
95-87 30 30
95-20 100 300
95-97 30 100
95-57 30 30
96-12 30 30
96-10 30 30
95-30 20 60
95-96 100 300
TABLA 6
La inmunización con iscoms de virus Sendai inducen la respuesta inmune en ratones neonatos
Grupos Inmunización primaria Refuerzo Respuesta Ab
1 1 \mug de iscom/dosis 1 \mug de iscoms/dosis ++
2a 1 \mug de micelas/dosis 1 \mug de micelas/dosis -
3a No 1 \mug de iscoms/dosis +/-
3b No 1 \mug de micelas/dosis -
4 0,2 \mug de iscoms/dosis 1 \mug de iscoms/dosis +++
5 0,2 \mug de iscoms/dosis 1 \mug de micelas/dosis -
TABLA 7
Respuesta de anticuerpos del suero medida mediante HI de perritos vacunados con
parvovirus muertos en matriz-iscom (I) o una vacuna comercial (sin símbolo) a la edad
de 3 semanas (día 0) y una segunda vez (día 23)
Títulos de HI en el día de muestreo después de la primera vacunación
Nº de código del perrito: 0 10 23 33
9694 I 40 20 < 10 2560
9695 20 10 10 160
9696 I 20 20 160 5120
9697 10 10 10 160
9698 I 20 10 < 10 2560
9699 40 20 10 40
9700 I 10 20 20 5120

Claims (9)

1. Uso de complejos inmunógenos en forma de iscom que comprenden al menos un glicósido, al menos un lípido y al menos un antígeno o en la forma de una matriz de iscom que comprende al menos un glicósido y al menos un lípido para preparar una vacuna que provoca una respuesta inmune en individuos en fase de crecimiento que tienen un sistema inmune inmaduro porque tienen una capacidad reducida para responder inmunológicamente cuando se exponen a estímulos de antígenos o tienen una inmunidad materna, es decir anticuerpos de sus madres, o tienen un sistema inmune inmaduro y una inmunidad materna.
2. Uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 1, en donde el complejo se compone de un complejo iscom.
3. Uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 1, en donde el complejo se compone de matriz de iscom y la matriz de iscom se mezcla con uno o más antígenos destinados a incitar una respuesta inmune específica al o a los antígenos incluidos o a esa matriz de iscom y los antígenos se preparan como entidades separadas (unidades) destinadas a administrarse mezcladas o por separado.
4. Uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la formulación de antígeno e iscom o matriz de iscom se administra por mucosidad.
5. Uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 4, en donde la formulación de antígeno e iscom o matriz de iscom se administra por administración oral, nasal, urogenital y/o rectal.
6. Uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el o los antígenos se derivan de microorganismos.
7. Uso de un complejo inmunógeno según la reivindicación 6, en donde el o los antígenos se derivan de virus, bacterias o parásitos.
8. Uso de un complejo inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el o los antígenos se producen mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química.
9. Uso de complejos inmunógenos según las reivindicaciones 6-8, en donde el o los antígenos de virus se eligen de la cisticercosis, virus del moquillo canino, parvovirus, herpesvirus, rotavirus.
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