ES2270508T3 - Coronavirus enterico y respiratorio bovino como vacuna. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un coronavirus respiratorio bovino vivo modificado o inactivo y a un coronavirus bovino entérico y sus antígenos empleados como vacunas para protección tanto contra el coronavirus respiratorio bovino como contra la enfermedad coronavirus entérica bobina, y procedimientos para fabricar y emplear los mismos.
Description
Coronavirus entérico y respiratorio bovino como
vacuna.
Campo de la invención: La presente invención se
refiere a un coronavirus respiratorio bovino que puede usarse en una
forma viva modificada, una forma inactivada o una forma de subunidad
para producir una vacuna que protege de enfermedades causadas por
coronavirus respiratorio bovino (CVRB) y coronavirus entérico bovino
(CVEB). La invención se refiere también a un coronavirus entérico
bovino que puede usarse en una forma viva modificada, una forma
inactivada o una forma de subunidad para producir una vacuna que
protege de enfermedades causadas por coronavirus respiratorio bovino
o coronavirus entérico bovino y procedimientos para preparar y usar
dichas vacunas.
Breve descripción de la técnica anterior: Los
brotes de enfermedad respiratoria en rebaños vacunados han suscitado
cuestiones sobre la posible implicación de otros virus o bacterias
como causa del complejo de enfermedad respiratoria bovina (fiebre
del transporte). Las causas primarias del complejo de enfermedad se
han identificado como cuatro virus: virus de rinotraqueítis
infecciosa bovina (VRIB), virus de parainfluenza tipo 3 (PI_{3}),
virus de diarrea vírica bovino (VDVB) y virus sincitial respiratorio
bovino (VSRB). Para proteger frente al complejo de enfermedad, la
técnica ha usado programas de vacunación que incluyen uso de vacunas
para todos estos virus ya sea en una forma singular (monovalente) o
en una forma de combinación (bivalente si cualquiera de los dos
virus está presente en una vacuna o multivalente si en una vacuna
están presentes más de dos virus). En el pasado, estas vacunas
parecían eficaces. Sin embargo, el control del complejo de
enfermedad respiratoria bovina con estas vacunas ha sido
cuestionado recientemente debido a brotes de enfermedad respiratoria
en rebaños vacunados, lo que indica la posibilidad de que estén
implicados otros virus o bacterias.
Se aisló un coronavirus bovino en el tracto
respiratorio de terneros que tenían síntomas respiratorios ya en
1984 por McNulty y col. (Vet. Micro., 1984, 9:
425-434). Desde aquella época ha existido una
importante controversia sobre si los coronavirus aislados del tracto
respiratorio de bovinos (CVRB) son el agente causante de los brotes
de enfermedad en rebaños de vacuno vacunados con vacunas
respiratorias bovinas actuales. En caso afirmativo, existe también
una controversia sobre si CVRB es el mismo que los coronavirus
aislados del tracto entérico de bovinos (CVEB).
CVEB, aislado por primera vez en la década de
1970 por Mebus y col. (Am J Vet Res, 1973,
34:145-150), es reconocido ampliamente en la
actualidad como una causa importante de diarrea neonatal en los
terneros. También se ha reconocido como asociado con diarrea
invernal en el ganado vacuno adulto. En la propagación de CVEB, la
técnica ha empleado numerosos tipos celulares que incluyen células
primarias (cultivo de tracto digestivo y órgano traqueal) y varias
líneas celulares. Los ejemplos de las líneas celulares incluyen:
células de tumor rectal humano (designación ATCC
HRT-18), células Vero, células de riñón bovino Madin
Darby (MDBK) y células de riñón canino Madin Darby 1 (MDCK1). La
adición de tripsina exógena potencia o promueve el crecimiento de
CVEB en estas y otras muchas líneas celulares. La propagación de
CVEB en los pasos tempranos en estos cultivos celulares es
normalmente sin la producción de un efecto citopático (ECP)
reconocible. Los pasos tardíos producen un ECP acusado caracterizado
por formación de sincitios y desprendimiento celular.
Se ha producido una vacuna y está disponible con
una reivindicación para protección de terneros frente a enfermedad
entérica causada por CVEB. Se administra a las madres antes del
parto. La capacidad protectora de la vacuna se ha cuestionado
porque se basa en inmunización pasiva (Myers y Snodgrass, 1982, J Am
Vet Med Assoc 181: 486-488 y Mostl y Burki; 1988, J
Vet Med 35, 186-196). La inmunización de terneros
por administración de CVEB vivo modificado por la vía oral ha
protegido a los terneros privados del calostro en pruebas
experimentales pero no se ha demostrado eficaz en pruebas de campo
(Thurber y col., 1977, Can. J. Comp. Med.
41:131-136).
Como puede comprenderse por lo anterior, la
incidencia aumentada de enfermedad respiratoria en corrales de
engorde, disentería invernal del ganado adulto de leche y de carne y
diarrea neonatal de los terneros, causadas potencialmente por CVRB
y CVEB, indica que se necesita una solución para el problema de la
enfermedad. Existe un debate en la comunidad científica sobre si
CVRB y CVEB son variantes del mismo virus. El Dr. Johannes Storz,
líder reconocido en esta área, ha publicado recientemente que
existen diferencias in vitro e in vivo significativas
entre CVRB y CVEB y que debido a estas diferencias son virus
claramente diferentes y no debe esperarse una protección cruzada
(Storz, 1996, JAVMA, 208:9, 1452-1455). Estas
importantes diferencias entre CVRB y CVEB son: 1) CVRB puede
aislarse fácilmente de muestras de campo en el primer paso, sin la
ayuda de tripsina, usando una línea celular de tumor rectal humano
clonado (cHRT) y los aislados de CVRB propagados de esta manera
muestran una citopatología de fusión celular distinta y potenciada.
En cambio, los aislados de CVEB de tipo natural normalmente no
pueden prepararse sin pasos múltiples o potenciación de tripsina o
ambos y no muestran citopatología de fusión celular potenciada; 2)
los aislados de CVRB y CVEB tienen distintos patrones de
hemoaglutinación in vitro en los que CVEB hemoaglutina los
glóbulos rojos (GR) de roedores y pollos mientras que los aislados
de CVRB sólo hemoaglutinan GR de roedores; 3) CVEB es una causa
principal de diarrea viral en el ternero joven, mientras que CVRB se
ha aislado a partir de un alto porcentaje de ganado vacuno que
presenta síntomas respiratorios como tos, disnea, secreción nasal y
alta temperatura corporal. Debido a dichas diferencias, Storz parece
separarse del uso de una vacuna de CVRB para proteger frente a
enfermedad causada por CVRB y CVEB a la vez o una vacuna de CVEB que
proteja frente a enfermedad causada por CVEB o por CVRB.
La presente invención engloba también una línea
celular mejorada de cHRT y los procedimientos para usar la misma
para propagación de CVRB o CVEB a una alta valoración de manera que
produzcan una alta masa antigénica que sea útil para preparar una
vacuna comercialmente viable. Por el término "alta masa
antigénica" se entiende una cantidad inmunogénicamente eficaz de
un virus o un antígeno obtenida del virus que sea útil para
inmunizar a bovinos y proporcionar protección frente a enfermedad
causada por CVRB o CVEB. Por el término "comercialmente viable"
se entiende que la vacuna puede producirse con rentabilidad de
costes. Por ejemplo, una vacuna comercialmente viable no requeriría
niveles prohibitivos en coste de concentración de la masa antigénica
para alcanzar una masa antigénica eficaz para vacunas. Una línea
celular cHRT semejante, HRT-18G, ha sido depositada
en la American Type Culture Collection, por el Dr. Storz y se le
asignó el Nº de Registro CRL11663. Una segunda línea celular de
cHRT, más eficaz, ha sido desarrollada por los autores de la
invención y designada como HRT-E6. Esta línea
celular se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC),
12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852, el 6 de abril de 1998 con
el número de registro CRL 12478.
La presente invención engloba además un
procedimiento para aislar la línea celular cHRT mejorada (clonada)
designada como HRT-E6. El procedimiento de clonación
proporcionó selectivamente una célula cHRT que propaga CVRB a una
valoración superior a la obtenida con la célula progenitora con
designación ATCC CCL 244 o con las células HRT-18G
de la técnica relacionada.
La presente invención engloba además un
procedimiento para propagar los virus CVRB o CVEB en una valoración
alta, produciendo una alta masa antigénica, en una línea celular de
cHRT como HRT-E6 tal que pueda producirse una vacuna
comercialmente viable.
Se ha descubierto que la vacuna inactivada,
coadyuvantes y de CVRB vivo modificado estimuló una neutralización
de la respuesta de anticuerpos en terneros previamente seronegativos
en una cantidad significativa para proporcionar actividad
inmunológica adecuada indicativa de protección y una cantidad
inmunogénicamente eficaz. Se ha previsto también que la inmunización
de terneros con coronavirus reduciría la enfermedad de coronavirus
respiratorio y entérico después de contaminación intencionada
intranasal con un CVRB virulento.
Según se ha expuesto anteriormente, la presente
invención se dirige a una forma viva modificada, inactivada o de
subunidad de una vacuna o una combinación de las mismas para
protección de bovinos frente a enfermedades causadas por CVRB o
CVEB, que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o
unos aislados de CVRB o CVEB o antígenos de los mismos. El o los
aislados de CVRB o CVEB pueden obtenerse por inoculación de cultivos
celulares susceptibles con muestras de un animal enfermo como un
ternero. Una subunidad puede obtenerse por extracción del virus o de
una expresión como un recombinante por un organismo no afectado por
CVRB ni CVEB.
Otra forma de realización de la invención
incluye inmunización de bovinos para protegerlos frente a enfermedad
causada por CVRB o CVEB, que comprende una cantidad
inmunogénicamente eficaz de aislado o aislados de CVEB o CVRB o
antígenos de los mismos. El o los aislados de CVEB o CVRB o sus
antígenos pueden estar en la forma de un virus vivo modificado, un
virus inactivado o una subunidad en la que la subunidad se obtiene
por extracción del virus o de una expresión como un recombinante por
un organismo no afectado por CVRB ni CVEB. Dentro del ámbito de la
invención está que cualquiera de los anteriores puede combinarse y
que puede añadirse un coadyuvante y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El virus se propaga en una línea celular de alta
sensibilidad como una línea celular cHRT.
Una forma de realización más de la invención
comprende una célula de tumor rectal humano clonada mejorada,
HRT-E6, designada por ATCC CRL CRL:12478. La mejora
comprende una propagación sustancialmente más eficaz de virus CVRB
y CVEB en estas líneas celulares que cualquiera de sus células
progenitoras, CCL 244, u otra célula cHRT, HRT-18G.
Esta célula cHRT mejorada designada en la presente memoria
descriptiva como HRT-E6 puede producirse usando
técnicas de dilución con limitación conocidas en la técnica en
placas de cultivo de 96 pocillos. Estas técnicas implican el
cultivo de células CCL 244 en un recipiente como un frasco
rotatorio, eliminando las células mediante tratamiento de tripsina
conocido en la técnica (usando una solución de
tripsina-EDTA que contiene del 0,05% al 0,25% de
tripsina combinado con el 0,04% de EDTA), contando las células
viables retiradas del recipiente y preparando diluciones de las
células de 10 veces u otras igualmente útiles en Medio Esencial
Mínimo de Dulbecco (MEMD) o Medio Esencial Mínimo (MEM) más suero,
preferentemente suero fetal bovino o suero de caballo, de manera que
una parte grande de los pocillos en la placa de 96 pocillos contenga
teóricamente sólo una célula. Las células se observan
microscópicamente para determinar que los pocillos contienen
realmente una sola célula. Una vez que los pocillos que contienen
inicialmente una sola célula se hacen confluentes, las células de
cada pocillo se eliminan mediante técnicas de tripsinización
conocidas en la técnica y se pasan hasta que se obtiene un gran
volumen de células. Cada gran volumen de células que se origina de
una sola célula se define como un clon y se proporciona un número
separado. Se prueba la alta sensibilidad de cada clon a CVRB y CVEB
por inoculación con aislados de CVRB o CVEB y seleccionando aquellos
que demuestran altas valoraciones. De modo ilustrativo, una célula
susceptible propagaría CVRB o CVEB en cantidades suficientes para
producir un efecto citopático (ECP). Los clones más susceptibles
propagarían CVRB o CVEB a valoraciones de dosis infecciosa de
cultivo de 10^{3,0} (TCID_{50}/ml) Los clones más susceptibles,
clasificados en la presente memoria descriptiva como células de
alta sensibilidad, propagan CVRB y CVEB en cantidades de 10^{5,0}
TCID_{50}/ml. De este modo, los clones más susceptibles se pasan
secuencialmente para producir finalmente una línea celular de alta
sensibilidad que puede usarse fácilmente para propagación de CVRB o
CVEB para proporcionar una vacuna comercialmente viable, mientras
que los clones más susceptibles pueden usarse fácilmente para
propagación y aislamiento de CVRB o CVEB para diagnosticar la
enfermedad.
Una forma de realización más de la invención es
un procedimiento de propagación de CVRB o CVEB a una alta masa
antigénica que produce una cantidad inmunológicamente eficaz de
CVRB, CVEB o antígenos de los mismos. El procedimiento comprende
las etapas de: (1) propagación de una célula de alta sensibilidad en
la superficie de un recipiente o en suspensión en presencia de un
medio de cultivo tisular para producir eficazmente las células en
un recuento viable aceptable que es al menos 1 x 10^{5}/ml; (2)
inoculación de la célula de alta sensibilidad con CVRB o CVEB para
producir un cultivo celular infectado; (3) incubación del cultivo
celular infectado a entre 30 y 38ºC hasta producir un ECP
aceptable, preferentemente a entre 35 y 37ºC; (4) recolección del
cultivo celular infectado resultante por transferencia a un
recipiente de recogida; (5) disrupción opcional de las células
enteras restantes en el cultivo celular infectado recolectado
mediante procedimientos que incluyen, pero no se limitan a,
microfluidización, congelación-descongelación y
sonicación; y (6) concentración opcional del cultivo celular
infectado a una alta masa antigénica. La etapa de concentración
puede realizarse por medios conocidos en la técnica que incluyen,
pero no se limitan a, ultrafiltración, centrifugación, sedimentación
o cromatografía. Aunque puede usarse cualquier célula de alta
sensibilidad para propagar CVRB y CVEB, el uso de células cHRT es
preferible con HRT-E6, siendo más preferible la
designada por ATCC CRL CRL:12478. A continuación se ofrece una
descripción más específica, pero no limitativa, de un procedimiento
de propagación. Las células cHRT, como HRT-E6, se
cultivan en un recipiente como un frasco rotatorio o en
microvehículos en un biorreactor en un medio de cultivo tisular
como Medio Esencial Mínimo de Dulbecco suplementado con un suero
como suero bovino al 1-10% o suero de caballo
donador y un sistema de tampón adecuado como 1,3 g/l de bicarbonato
de sodio. Los pasos celulares se preparan con recuentos celulares
suficientes para alcanzar una confluencia o densidad celular
deseada de las células de la superficie del recipiente o
microvehículos o en suspensión, en 24 a 48 horas. En las monocapas,
células suspendidas o microvehículos confluentes se ha retirado el
medio de crecimiento y a continuación se inoculan con CVRB o CVEB
para producir una multiplicidad de infección (MDI) de entre 0,001 y
0,1, preferentemente entre 0,01 y 0,1. Los virus resultantes pueden
adsorberse primero en las monocapas o combinarse con células en
suspensión y a continuación puede añadirse medio de mantenimiento.
El medio de mantenimiento es esencialmente el mismo que el medio de
crecimiento celular descrito anteriormente, con la salvedad de que
se añade una cantidad de suero reducida. Los cultivos tisulares
infectados con virus resultantes se incuban a entre 30 y 38ºC,
preferentemente entre aproximadamente 36 y 37ºC hasta que se observa
ECP completo. Normalmente, el ECP completo se observa entre 1 y 7
días después de la infección, preferentemente entre 2 y 4 días
después de la infección. Los cultivos tisulares infectados con virus
que muestran un ECP aceptable se recogen (recolectan) en un único
recipiente produciendo fluidos de recolección, Un ECP aceptable para
los objetivos de esta invención se indica por al menos el 50% de
destrucción de la lámina celular.
Los fluidos de recolección pueden inactivarse
con cualquiera de varios agentes de inactivación para preparar la
forma inactivada de la vacuna. Los agentes de inactivación se
seleccionarán del grupo constituido por
beta-propiolactona, formaldehído, etilenimina
binaria, calor y exposición a luz UV.
La recolección puede usarse también en una forma
viva si el CVRB o CVEB ha sido atenuado previamente usando técnicas
conocidas en la técnica. Los ejemplos ilustrativos pero no
limitativos de atenuación pueden ser paso múltiple en cultivo y
tratamiento tisular con agentes mutagénicos, para seleccionar un
mutante que es incapaz de producir enfermedad cuando se inyecta
intranasalmente en terneros jóvenes. Además, la recolección en vivo
puede usarse sin producción de mutaciones por administración de la
vacuna preparada de los mismos a través de vías atípicas que
incluyen la intramuscular, subcutánea o intradérmica.
En la producción de una vacuna de subunidad, se
cultiva CVRB o CVEB según se describe anteriormente y la recolección
de virus se extrae con cualquiera de varios agentes que incluyen
pero no se limitan a detergentes y disolventes orgánicos. Los
extractos pueden usarse en una forma extraída o pueden purificarse
adicionalmente por ultrafiltración y/o cromatografía de columna y
combinarse a continuación con un coadyuvante para formulación en una
vacuna. Un ejemplo específico de este procedimiento comprende
infección de células cHRT con CVRB según el procedimiento descrito
anteriormente. A continuación se recolectan las células infectadas
cuando ECP es >80%. Las células infectadas recolectadas se
separan de los fluidos por centrifugación de baja velocidad y los
sedimentos recogidos se extraen por adición de un detergente en un
sistema de tampón. El sistema tampón-detergente
consiste en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o cualquier
otro tampón que sea no tóxico para células de cultivo tisular más
del 1,0 al 10,0% de detergente como IGEPAL CA-360,
disponible en Sigma Chemical Company. Preferentemente, se usa del
1,0 al 2,0% de detergentes seleccionados del grupo constituido por
IGEPAL CA-360,
Triton-X-104 (disponible en Sigma
Chemical Company) y dodecilsulfato de sodio (también disponible en
Sigma Chemical Company). Se usan disolventes orgánicos en las
mismas concentraciones e incluyen pero no se limitan a alcoholes,
ésteres o éteres. Puede usarse cualquier sistema de tampón en la
medida en que sea no tóxico para células de cultivo tisular. Otros
tampones que son útiles incluyen pero no se limitan a otras sales
como sulfatos y carbonatos y tampones orgánicos como
tris[hidroximetil]aminometano (TRIS),
N;N'-bis[ácido
2-etanosulfónico]:ácido
1,4-piperazindietanosulfónico (PIPES), y ácido
N-[2-hidroxietilpiperazin-N'-]2-etanosulfónico
(HEPES), todo disponible en Sigma Chemical Company. Este sistema de
tampón-detergente se usa para resuspender el
sedimento celular y la extracción se realiza mezclando el sedimento
celular infectado suspendido a una temperatura controlada entre 4ºC
y 37ºC, preferentemente entre 4ºC y 10ºC hasta que el sedimento
celular se solubiliza uniformemente (generalmente entre 30 y 120
minutos). Después de esta extracción, se elimina cualquier material
insoluble por centrifugación a baja velocidad (lote o flujo
continuo) y puede reextraerse según se ha descrito anteriormente. A
continuación se combinan extractos solubilizados y se purifican por
cromatografía de columna (exclusión por tamaño, lectina u otra
afinidad, intercambio aniónico/catiónico y/o fase inversa) antes de
coadyuvar o pueden coadyuvarse extractos directamente. La masa
antigénica se mide por procedimientos conocidos en la técnica como
inmunoensayo unido a enzima. (ELISA), HPLC, FPLC o electroforesis
antes de coadyuvar. Si la masa antigénica es suficientemente alta,
el extracto o extracto purificado puede diluirse en PBS. Si la masa
antigénica es demasiado baja para ser inmunogénicamente eficaz, el
extracto o extracto purificado puede concentrarse usando
ultrafiltración, centrifugación u otro de dichos procedimientos de
concentración. La coadyuvancia puede realizarse usando cualquiera de
los coadyuvantes descritos a continuación.
Los coadyuvantes pueden usarse con los fluidos
de recolección inactivados o vivos modificados o con subunidad o
antígenos recombinantes obtenidos de CVRB o CVEB en preparación de
una vacuna. Si se usa un coadyuvante para preparación de una
vacuna, se entiende que puede añadirse cualquier coadyuvante para
aumentar la eficacia de la vacuna. Dichos coadyuvantes incluirían,
pero no se limitan a, polímeros o copolímeros de bloque que incluyen
Carbopol®, DEAE dextrano, sulfato de dextrano, metacrilatos y
POLYGEN^{TM}; lMMUGEN^{TM}; sales de aluminio como hidróxido de
aluminio y fosfato de aluminio; Avridina, Lípido A, bromuro de
dimetildodecilamonio; proteínas de poxvirus como Baypamune; aceites
como SUPRIMM^{TM}, EMULSIGEN^{TM}, EMULSIGEN PLUS^{TM};
aceites animales como escualeno; aceites minerales como Drakeol y
Montanides; aceites vegetales como aceite de cacahuete; glucósidos
triterpenoides como saponina; QuilA, y QS21; detergentes como
Tween-80 y Pluronics; coadyuvantes de componentes
bacterianos como Corynebacterium, Propionibacterium y
Mycobacterium; interleucinas, monocinas e interferones;
liposomas; ISCOM; glucopéptidos sintéticos como dipéptidos de
muramilo y derivados de los mismos, toxina del cólera; o
combinaciones de los anteriores.
Esta invención describe un procedimiento para
propagar un CVRB cultivando el virus en un cultivo tisular en una
cantidad suficiente para proteger a los bovinos frente a enfermedad
causada por CVRB o CVEB o para identificar la estructura molecular
de CVRB o CVEB para preparación de productos de subunidad o
recombinantes, comprendiendo inoculación de CVRB en un cultivo
tisular que es una célula rectal humana clonada (cHRT),
preferentemente HRT-E6 designada como ATCC CRL 12478
y recolectando el virus cultivado.
Esta invención describe también un procedimiento
para propagar un CVEB por cultivo del virus en un cultivo tisular a
una cantidad suficiente para proteger a los bovinos frente a
enfermedad causada por CVEB o CVRB o para identificar la estructura
molecular de CVEB o CVRB para preparación de productos de subunidad
o recombinantes, comprendiendo inoculación de CVEB en un cultivo
tisular que es una célula de tumor rectal humano clonada (cHRT),
preferentemente HRT-E6 designada como ATCC CRL 12478
y recolectando el virus cultivado.
Según la invención, puede usarse un aislado de
CVRB o CVEB ampliamente interreactivo para preparaciones de vacuna
descritas en la presente memoria descriptiva. Dicha reactividad
cruzada puede demostrarse por estudios de neutralización cruzada
in vitro (ver, por ejemplo, el Ejemplo 5). Se presentan
detalles adicionales y más específicos de la invención mediante los
ejemplos siguientes, aunque no se limitan a ellos.
Se usaron células de adenocarcinoma humano
obtenidas de ATCC (designadas como CCL 244) en la producción de
células cHRT del modo siguiente. Se plantaron inicialmente las
células obtenidas y se mantuvieron en RMPI 1640 con suero de
caballo al 10% añadido, o en DME o MEM con suero fetal bovino (SFV)
a entre el 5 y el 10%. Todos los estudios se realizaron usando DME o
MEM con SFV.
Se obtuvieron clones del CCL 244 usando técnicas
convencionales de dilución con limitación en placas de cultivo
tisular de 96 pocillos. Esta técnica implicó la eliminación de las
células HRT-18 de un recipiente en el que las
células se estaban cultivando por adición de solución Tripsina/EDTA
que contenía el 0,1% de tripsina y el 0,04% de EDTA, contando las
células viables y preparando diluciones de 10 veces de las células
en DME o MEM más SFV al 10% de manera que, teóricamente, una gran
parte de los pocillos de la placa de 96 pocillos tendría sólo una
célula. Se observaron microscópicamente los pocillos para determinar
que los pocillos tenían realmente un origen de una sola célula.
Muchos pocillos mostraron una pequeña agrupación de células, pero se
escogieron cinco pocillos porque parecían haberse originado de una
sola célula. Después de 10 días de cultivo/mantenimiento, se trató
con tripsina un pocillo (clon) mediante clonación adicional en una
placa de 96 pocillos. Se repitió el mismo procedimiento de
clonación. En la segunda clonación, tres clones parecían haberse
desarrollado a partir de una sola célula, y se escogió el clon del
pocillo E6 para su expansión y uso en experimentos posteriores.
Este clon se designó como HRT-E6. Los cuatro clones
restantes se mantuvieron hasta que hubo cierta seguridad de que E6
sería aceptable durante al menos algunos estudios adicionales, y el
desarrollo en una línea celular estable mediante técnicas conocidas
en la
técnica.
técnica.
Se realizaron experimentos para determinar si
las células CCL 244 y las células HRT-E6
progenitoras eran susceptibles a virus bovinos seleccionados. Los
virus incluían virus sincitial respiratorio bovino (VSRB cepa 375),
virus de diarrea de virus bovino (VDVB cepa NADL), virus de herpes
bovino tipo 1 (VHB-1 cepa Cooper), virus de
parainfluenza bovina tipo 3 (PI_{3} cepa SF-4) y
CVRB (cepa RA2R7). Se inocularon monocapas nuevas de células CCL 244
y HRT-E6 con los virus y se realizó adsorción
durante 30 a 60 minutos en medio libre de suero. Estos medios se
retiraron y desecharon y se añadió medio de mantenimiento que
contenía SFV al 2%. Se observaron los cultivos diariamente durante
5 a 7 días y si no existía ECP aparente, los fluidos de cultivo bien
se hacían pasar directamente en células nuevas (CCL 2.44 y
HRT-E6) o bien se congelaron a -70ºC y a
continuación se pasaron en las monocapas celulares. Se realizaron
tres de dichos pasos ciegos para cada virus que no mostró ECP. Los
resultados del cultivo de los diversos virus en células
HRT-18G se han obtenido de la publicación de Storz
(JAVMA, 1996, 208:9, 1452-1455). Los resultados se
tabulan a continuación en la Tabla 1. Las células CCL 244,
HRT-E6 y HRT-18G fueron
susceptibles a CVRB en el primer paso. Storz comunica que estas
células HRT-18G son susceptibles para
VHB-1. VHB-1 no mostró ECP hasta una
fase tardía en el período de incubación del segundo paso en las
células HRT-E6 de esta invención. Este experimento
demuestra que las células HRT-E6 son fenotípicamente
diferentes de las células HRT-18G y las células CCL
244 progenitoras.
\vskip1.000000\baselineskip
| Virus | Cultivado en | Cultivado en | Cultivado en |
| CCL 244 | HRT-E6 | HRT-18G | |
| VSRB | Negativo | Negativo | Negativo |
| VDVB | Negativo | Negativo | Negativo |
| VHB-1 | Positivo | Negativo* | Positivo |
| PI_{3} | Negativo | Negativo | Positivo |
| CVRB | Positivo | Positivo | Positivo |
\vskip1.000000\baselineskip
Para distinguir la singularidad de los clones de
las células CCL 244 (cHRT) que incluyen HRT-E6, se
realizó un experimento para evaluar las células características de
crecimiento de CVRB de las células en comparación con el de varias
otras células capaces de propagar virus bovinos. Se inoculó el
aislado de CVRB RA2R7 disponible en un ternero que mostraba
enfermedad respiratoria en Dakota del Sur en líneas celulares
incluyendo células de riñón bovino Madin Darby (MDBK), células de
testículo de cerdo (TC), células de pulmón felino. (PF), células
Bayer 9009 y células HRT-E6. El aislado de CVRB y/o
sus fluidos de subcultivo se adsorbieron durante 60 minutos en
medio libre de suero. Cuando no hubo ECP aparente, los cultivos bien
se hicieron pasar directamente en células nuevas o bien se
congelaron y se pasaron a continuación a las diversas monocapas
celulares. Se hicieron cinco pasos en cada línea celular. Ninguna
de las células, excepto la HRT-E6, mostraron ECP en
ningún momento durante el experimento. Por tanto, las células cHRT
son únicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar además la singularidad de las
células cHRT incluyendo HRT-E6 y
HRT-18G, a partir de las células CCL 244
progenitoras, se realizó el siguiente experimento. Se cultivaron dos
aislados de CVRB, RA2R7 y AZ26649 aislados de un ternero de Arizona
que mostraba enfermedad respiratoria, y un aislado de CVEB designado
como 50~3, (obtenido del Dr. Johannes Storz), según se describe en
el Ejemplo 1. A continuación se valoró cada uno en células CCL 244,
células HRT-E6 o células HRT-18G. Se
realizaron valoraciones en placas de 96 pocillos usando monocapas
nuevas de cada una de las células según procedimientos conocidos en
la técnica. Los resultados se recogen en la Tabla 2 en la que las
valoraciones se expresan como log_{10} TCID_{50}/ml.
| Aislado de virus | Valoración en | Valoración en | Valoración en |
| célula CCL 244 | HRT-18G | célula HRT-E6 | |
| RA2R7 | 3,4 | 5,2 | 6,8 |
| AZ26649 | 3,0 | 6,5 | 6,4 |
| 50-3 | 5,6 | 5,4 | 4,7 |
Es evidente que las células cHRT propagan los
aislados de CVRB para valoraciones significativamente más altas que
las células CCL 244 progenitoras. Es notable que las tres células
propagaron el aislado de CVEB 50-3 para niveles de
valoración aproximadamente equivalentes. Cuando se propaga CVRB con
fines de vacunas comerciales, es importante obtener las valoraciones
más altas posibles. Por tanto, las células cHRT son comercialmente
viables para propagación de CVRB mientras que las células CCL 244 no
lo son.
Se realizó una comparación entre los diversos
aislados observados en el Ejemplo 3 y otros aislados descritos a
continuación para verificar que eran aislados de CVRB. Según Storz
(JAVMA, 1996, 208:9; 1452-1455), CVRB hemoaglutina
los GR de ratón y no hemoaglutina los GR de pollo. En este
experimento, se evaluó la actividad de hemoaglutinación (AH) de
aislados RA2R7, AZ26649, LSU051 (aislado de CVRB obtenido del Dr.
Storz), 6J305 (aislado de CVRB obtenido por lmmTech) y
50-3 frente a GR de ratón y pollo. Se evaluaron las
reservas de virus de cada uno de los aislados según técnicas
convencionales de hemoaglutinación usando GR de ratón o pollo al
0,5%. Los resultados se expresan como la inversa de la dilución
máxima que produce hemoaglutinación (valoración de AH) y se resumen
en la Tabla 3. Fue evidente a partir de los resultados que los
aislados de CVRB RAZR7, AZ26649, LSU051 y 6J305 hemoaglutinan GR de
ratón, y no GR de pollo y, por tanto, son diferentes del aislado de
CVEB conocido, 50-3, que hemoagluti-
na GR de ratón en una valoración mucho más alta y muestra también cierta hemoaglutinación de los GR de pollo.
na GR de ratón en una valoración mucho más alta y muestra también cierta hemoaglutinación de los GR de pollo.
| Aislado | Valoración AH en GR de ratón | Valoración AH en GR de pollo |
| RA2R7 | 256 | <8 |
| AZ26649 | 32 | <8 |
| LSU051 | 64 | <8 |
| 6J305 | 256 | <8 |
| 50-3 | > 4.096 | 8 |
Aunque el Ejemplo 4 indicaba que los aislados de
CVRB y CVEB son distintos en que muestran patrones de AH diferentes,
es importante observar el grado de conexión antigénica para los
objetivos del desarrollo de vacunas. Por tanto, se realizó un
experimento de neutralización cruzada. Se evaluaron tres aislados de
campo de CVRB y un aislado de campo de CVEB para neutralización
cruzada, se aisló CVRB-CA de un ternero en un corral
de engorde de California. Se aisló CVRB-TX en un
ternero de carne en un corral de engorde de Texas y se aisló
CVRB-OK en un ternero de carne de Oklahoma. Se usó
nuevamente CVEB 50-3 como el aislado de CVEB
conocido. Se inyectó repetidamente a dos conejos con preparaciones
de virus purificadas (subunidades) en coadyuvante preparado a
partir de cada aislado. Después de la última inyección, se sangró a
los conejos y se recogieron los sueros. Se evaluaron los
sueros
recogidos para ver su capacidad de neutralizar aislados de CVRB y CVEB en un ensayo de cultivo celular in vitro.
recogidos para ver su capacidad de neutralizar aislados de CVRB y CVEB en un ensayo de cultivo celular in vitro.
Todos los aislados de virus se purificaron por
ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa lineal del 20 al
60%. Los virus purificados, a una concentración de 20 a 50 mg por
dosis de proteína total, se combinaron con coadyuvante completo de
Freund (FCA) para las inyecciones primarias en conejos y coadyuvante
incompleto de Freund (FIA) para tres inyecciones posteriores de
recuerdo. Las inyecciones se suministraron por la vía
intramuscular, en intervalos de 21 días. Se realizó un sangrado
final de suero siete días después de la última inyección.
Se realizaron ensayos de neutralización cruzada
por combinación de muestras de suero específicas de aislado con 100
a 300 TCID_{50} de cada aislado de virus. Se realizaron diluciones
en serie dobles de suero en placas de 96 pocillos con dos series de
dilución por muestra de suero. Se añadieron de 100 a 300
TCID_{50} de virus a todos los pocillos y se incubó la mezcla
suero/virus durante una hora a 37ºC. Después de la incubación, se
añadieron células cHRT a todos los pocillos y se incubaron las
placas a 37ºC en una incubadora húmeda de CO_{2} al 5% durante 5 a
6 días. La Tabla 4 es un resumen de los resultados del ensayo de
neutralización cruzada in vitro. La actividad inmunológica
resultante se representa por valoraciones de anticuerpos séricos
como la inversa de la máxima dilución de suero que neutralizó
completamente el virus.
Los resultados de este experimento mostraron que
en todos los casos una respuesta de anticuerpos a aislados
individuales de CVRB o CVEB podría neutralizar todos los aislados
heterólogos en algún grado. Existieron diferencias claras de
neutralización cruzada entre CVRB y CVEB. Análogamente, parecen
existir asimismo diferencias en neutralización cruzada entre
aislados de CVRB. Sin embargo, el grado de diferencia demostrado
aquí no es suficientemente grande para clasificar CVRB y CVEB como
serotipos separados y distintos.
Estos data indican claramente que una respuesta
de anticuerpos a un aislado de CVRB o CVEB preparado según esta
invención proporciona una actividad suficiente de neutralización
cruzada para neutralizar las contaminaciones intencionadas con
aislados heterólogos. Específicamente, una vacuna basada en CVRB
provocaría una respuesta de anticuerpo que neutralizaría la
contaminación intencionada con CVEB, una entidad de enfermedad
distinta como se ha demostrado anteriormente, y otros aislados de
CVRB heterólogos. Además, podría esperarse que una vacuna basada en
CVEB provocara una respuesta de anticuerpos que neutralizaría la
contaminación intencionada con CVRB, una entidad de enfermedad
distinta como también se ha demostrado anteriormente, y otros
aislados de CVEB heterólogos.
| a = Inversa de la última dilución de anticuerpos para neutralizar completamente el aislado de virus. |
| b = \begin{minipage}[t]{150mm} Transformación numérica de la valoración media anticuerpo homólogo/virus sobre cada valoración media de anticuerpo heterólogo/virus. \end{minipage} |
En la práctica de la invención, puede formularse
una masa antigénica de CVRB en vacuna que contiene una cantidad
inmunogénicamente eficaz de virus o antígenos de los mismos. A
continuación se ofrece una descripción de un procedimiento viable
económicamente por el que se preparó, se inactivó y se formuló una
masa antigénica de CVRB en una forma de vacuna inactivada. La vacuna
de la invención se administró intramuscularmente. Sin embargo,
podría administrarse también por vía subcutánea, o alternativamente
por vías intranasal, intradérmica u oral. Pueden administrarse entre
uno y cinco mililitros de vacuna.
Se propagó aislado de CVRB AZ26649 en células
cHRT descritas anteriormente (HRT-18G). Estas
células se cultivaron con la máxima eficacia y se mantuvieron en
medio de cultivo consistente en DME suplementado con suero de
caballo donador o fetal bovino al 5% y un sistema de tampón
adecuado como 1,3 g/l de bicarbonato de sodio. Se realizaron pasos
celulares con recuentos celulares suficientes para alcanzar la
confluencia en 24 a 48 horas.
Se inocularon monocapas confluentes de células
cHRT con CVRB de la manera siguiente. Se diluyó reserva de virus en
DME libre de suero para alcanzar una multiplicidad de infección
(MDI) de una partícula de virus infecciosa por 10 a 100 (0,1 a
0,01) de células cHRT. La infección por virus de células cHRT se
alcanzó por eliminación del medio de cultivo gastado, sustitución
con el inóculo de virus diluido a volúmenes suficientes para cubrir
completamente la monocapa y adsorción durante 1 hora a 37ºC. Después
de la adsorción, se añadió un medio de mantenimiento consistente en
DME suplementado con suero fetal bovino (SFV) y un sistema de tampón
adecuado como 1,3 g/l de bicarbonato de sodio. Se incubaron los
cultivos tisulares infectados con virus a 37ºC en una atmósfera
húmeda de CO_{2} al 5,0% hasta que se observó ECP completo. El ECP
observado consistió en rápida agregación celular y fusión seguida
de desprendimiento de policariones del sustrato produciendo grandes
agregados celulares infectados suspendidos en el medio de
mantenimiento. Normalmente, se observó ECP completo y se
recolectaron los cultivos de 2 a 4 días después de la infección.
Normalmente, la valoración de TCID_{50} de CVRB obtenida estuvo
comprendida entre 10^{5,5} y 10^{8,0} TCID_{50}/ml de fluido
de recolección.
Los fluidos de recolección que contenían
10^{6,67} TCID_{50}/ml de CVRB se inactivaron con BPL al 0,1%
vol/vol usando procedimientos convencionales. Brevemente, se
combinaron los fluidos de recolección y BPL y se mezclaron durante
24 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC). Se mantuvo
un intervalo de pH de 6,8 a 7,2 durante el período de inactivación
usando NaOH 3,0 N. Los ejemplos no limitativos de otros agentes o
procedimientos de inactivación adecuados previstos incluyen
formaldehído, etilenimina binaria, calor y exposición a
luz UV.
luz UV.
Se coadyuvó CVRB con Carbopol® (B.F. Goodrich
Co.) del modo siguiente. Se combinó un volumen de coadyuvante de
reserva (Carbopol® al 1,5%) con un volumen de virus inactivado de
manera que una dosis final de vacuna contenía un 20% de coadyuvante
(vol/vol). Los fluidos coadyuvados se mezclaron durante al menos 24
horas a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC). Los ejemplos no
limitativos de otros coadyuvantes adecuados previstos incluyen
sales de aluminio como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio;
otros polímeros como POLYGEN^{TM}, DEAE dextrano, sulfato de
dextrano y metacrilatos; IMMUGEN^{TM}, bromuro de
dimetildodecilamonio; proteínas de poxvirus como Baypamune;
Avirdina, Lípido A; aceites como SUPRIMM^{TM}, EMULSIGEN^{TM},
EMULSIGEN PLUS^{TM}, aceites animales como escualano o escualeno;
aceites minerales como Drakeol y Montanides; aceites vegetales como
aceite de cacahuete; copolímeros de bloque; glucósidos
triterpenoides como saponina, QuilA y QS21; detergentes como
Tween-80 y Pluronic; coadyuvantes de componentes
bacterianos como de Corynebacterium, Propionibacterium y
Mycobacterium; interleucinas, monocinas e interferones;
liposomas; ISCOM; glucopéptidos sintéticos como dipéptidos de
muramilo y derivados de los mismos; toxina del cólera; o
combinaciones de los anteriores.
La eficacia inmunogénica de una vacuna
inactivada de CVRB preparada de la forma anterior se demostró en
terneros. Se prepararon vacunas que contenían tres masas antigénicas
diferentes basadas en la valoración de TCID_{50} de
preinactivación de los fluidos de recolección. Se formularon vacunas
de masa antigénica alta, media y baja para contener 10^{5,5},
10^{6,0} y 10^{6,5} de TCID_{50} por dosis de 2,0 ml de CVRB
respectivamente. Se administró cada vacuna a cuatro terneros y
cuatro terneros adicionales sirvieron como grupo de control no
vacunado. Se vacunó a los terneros dos veces, por la vía
intramuscular, en separaciones de 19 días. Se sangró a los terneros
antes de la vacunación primaria, en la administración de la segunda
dosis y 7 y 14 días después de la administración de la segunda dosis
para evaluación de respuesta de anticuerpos de neutralización del
virus del suero (NS) a CVRB. Durante el curso del experimento, se
mezclaron los animales vacunados y no vacunados. La Tabla 5 resume
la actividad inmunológica de NS según se demostró en este ejemplo y
medida como respuesta de anticuerpos de neutralización sérica de los
terneros después de vacunación con las diversas masas antigénicas de
vacunas inactivadas.
Según se muestra en la Tabla 5, los resultados
de este estudio demostraron que dos dosis de vacuna de masa
antigénica baja, media o alta provocaron aumentos medios de 8,4, 9,1
y 16 veces, respectivamente, en anticuerpos
anti-CVRB de neutralización del virus. Durante este
mismo período, la valoración media de anticuerpos del grupo de
control no vacunado mezclado descendió, lo que indicaba que no se
había producido exposición natural a CVRB durante el experimento.
Dado que se midió el anticuerpo de neutralización del virus y que en
general se acepta que un aumento de cuatro veces en la valoración de
anticuerpos es indicativo de actividad inmunológica significativa,
estos datos indican que puede provocarse una respuesta inmune
inmunogénicamente eficaz usando una vacuna inactivada de CVRB. Una
masa antigénica tan baja como 10^{5,5} TCID_{50}/ml ha
demostrado ser inmunogénicamente eficaz para una vacuna
inactivada.
\vskip1.000000\baselineskip
| MAG = masa antigénica |
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó aislado CVRB AZ26649 según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 6, con la salvedad de que se
propagó en la célula cHRT identificada como HRT-E6.
Se cultivó el virus hasta una valoración de 10^{6,7}
TCID_{50}/ml y se recolectó por agitación de los recipientes que
contenían los virus y células y vertiéndolos en un recipiente de
recogida. Los fluidos de virus recolectados se usaron para preparar
la vacuna para este experimento. Aunque no se usó aclaración,
concentración, inactivación y coadyuvancia para preparar esta
vacuna, la totalidad o parte de estos procedimientos podría usarse
para producir una masa antigénica más alta. Para este experimento,
la masa antigénica administrada a cada ternero fue de 5 x 10^{6,7}
TCID_{50}. Dentro de la concepción de la invención está añadir
coadyuvante a una vacuna viva modificada de CVRB o CVEB. Para
preparar con éxito una vacuna viva modificada con coadyuvante, el
CVRB o CVEB puede tener que modificarse más (por ejemplo, hacerse
menos virulento). La preparación de una versión más modificada de
CVRB o CVEB se conseguiría haciendo pasar el AZ26649 o cualquier
otro CVRB o CVEB a través de una célula de alta sensibilidad como
células cHRT hasta que dejen de producirse signos de enfermedad
cuando se administra intranasalmente a terneros seronegativos. Otro
procedimiento sería administrar la vacuna viva modificada con
coadyuvantes por una vía no natural como la intramuscular,
intradérmica, subcutánea o intraperitoneal en lugar de intranasal.
Alternativamente, el virus podría tratarse con agentes
mutagenizantes como nitrosoguanidina y podrían seleccionarse
mutantes menos virulentos. Los mutantes se seleccionarían por su
incapacidad para producir signos de enfermedad cuando se administran
intranasalmente a terneros seronegativos así como por su capacidad
continuada para producir una vacuna inmunogénicamente eficaz.
Dichos procedimientos de mayor modificación del aislado mejorarán la
seguridad de la vacuna.
Tres terneros (nº 61, nº 71 y nº 74) tenían
aproximadamente ocho meses de vida en la inoculación primaria
(primera vacunación). Los terneros eran seronegativos para CVRB y
recibieron 5,0 ml de la vacuna descrita previamente que se
administró intranasalmente. Los terneros vacunados se contaminaron
intencionadamente con 1 x 10^{5,8} TCID_{50} de CVRB AZ26649
cultivado según se ha descrito anteriormente y se incorporó en un
volumen de 10 ml, 24 días después de su vacunación primaria única.
Se contaminaron intencionadamente tres terneros de control
seronegativos no vacunados con la misma cantidad de CVRB AZ26649 en
el mismo momento. Se evaluó diariamente a todos los terneros durante
doce días en busca de signos clínicos de enfermedad por CVRB. Las
evaluaciones clínicas incluyeron medida de las temperaturas
rectales, observación de signos respiratorios (disnea, secreción
nasal y tos) y observación de signos gastrointestinales (heces,
apetito). Seguidamente se muestra el sistema de
puntuación.
puntuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Secreción nasal | Consistencia fecal | Disnea, tos, apetito |
| 0 = Normal | 0 = Normal | 0 = Normal |
| 1 = Serosa | 1 = Pastosa | 1 = Leve |
| 2 = Mucosa | 2 = Semilíquida | 2 = Moderado |
| 3 = Mucopurulento | 3 = Líquida | 3 = Grave |
| 4 = Epistaxia | 4 = Sanguinolenta |
\vskip1.000000\baselineskip
La columna de título Puntuaciones clínicas de la
Tabla 6 fue una recopilación del total de las puntuaciones
identificadas anteriormente de Secreción nasal y Disnea, tos,
apetito (enfermedad respiratoria) divididas por el número de
animales de cada grupo (promedio). Las Puntuaciones entéricas de la
Tabla 6 representan las puntuaciones promedio de Consistencia fecal
según se han identificado anteriormente. Se recogieron diariamente
hisopos nasales en MEM que contenían gentamicina al 5% y se
guardaron a -70ºC después de filtrarse a través de filtros de
jeringuilla de 0,45 mm. Los hisopos nasales se examinaron
posteriormente en busca de presencia de virus mediante
procedimientos conocidos de inoculación de las células cHRT en un
sistema de cultivo tisular. La Tabla 6 posterior muestra las
temperaturas rectales promedio, las puntuaciones clínicas totales
promedio y los resultados de aislamiento de virus para los tres
terneros vacunados (vacunados) en comparación con los tres terneros
no vacunados (controles) durante los doce días posteriores a la
contaminación intencionada.
Los resultados indican que los terneros
vacunados mostraron una reducción significativa en enfermedad
respiratoria (59%) así como una reducción significativa en
enfermedad entérica (59%). Un ternero vacunado mostró una Puntuación
entérica de 1,0 en el día 0 que duró hasta el día 11. Si el
resultado de este ternero se elimina del estudio, la vacuna de CVRB
habría demostrado una reducción del 100% en enfermedad entérica. Se
observó una reducción del 50% en días de desprendimiento del virus
en los vacunados en comparación con los controles. No se observaron
respuestas de temperatura significativas. Estos datos indican que
una vacuna de CVRB puede proteger frente a la forma respiratoria y a
la forma entérica de la enfermedad de coronavirus.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar más la actividad inmunológica de
la vacuna de CVRB de este ejemplo, se recogió suero de cada ternero
vacunado en los días 0 y 24 para evaluación de anticuerpos de
neutralización sérica para CVRB como consecuencia de la vacunación
y en los días 0 y 17 después de la contaminación intencionada para
demostrar que los terneros estaban realmente expuestos al virus. La
Tabla 7 muestra las valoraciones de neutralización sérica de todos
los terneros expresadas como la inversa de la última dilución para
producir neutralización. Una sola vacunación con la vacuna viva
modificada de CVRB produjo valoraciones significativas en todos los
terneros vacunados. Los terneros de control siguieron siendo
seronegativos, lo que indicaba que no hubo exposición a CVRB antes
de la contaminación intencionada. Después de la contaminación
intencionada, los terneros vacunados mostraron una respuesta
anamnésica.
| Nº ternero/estado | Valoración día 0 | Valoración día 24 | Valoración día 17 |
| (día de vacunación) | (día de contaminación | después de contaminación | |
| intencionada) | intencionada | ||
| 61/Vac | <2 | 64 | 512 |
| 71/Vac | <2 | 16 | 64 |
| 74/Vac | <2 | 128 | 256 |
| 54/Cont | <2 | <2 | 64 |
| 62/Cont | <2 | <2 | 32 |
| 70/Cont | <2 | <2 | 8 |
| Vac = Vacunado | |||
| Cont = Control |
Se infectan células HRT clonadas con CVRB según
el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Las células infectadas se
recolectan entre 12 y 72 horas después de infección cuando el ECP es
>80%. Se preparan células infectadas para extracción por
recolección de fluidos del cultivo tisular infectado, implicando
dicha recolección el vertido del cultivo tisular infectado en un
recipiente de recogida que puede centrifugarse a continuación a
bajas velocidades (aproximadamente, 1000 x g). El cultivo tisular
infectado puede centrifugarse en lotes usando una centrífuga normal
o en una centrífuga de flujo continuo. Después de centrifugar, se
extrae el sedimento celular por adición de un detergente en un
sistema de tampón. En este ejemplo, el
tampón-detergente es solución salina tamponada con
fosfato (PBS) más Nonidet P-40 al 1,0%. Este
tampón-detergente se usa para volver a suspender el
sedimento celular y la extracción se realiza por mezclado del
sedimento celular infectado suspendido a 4ºC hasta que el sedimento
celular se solubiliza uniformemente o aproximadamente de 30 a 120
minutos. Después de esta extracción, se elimina cualquier material
insoluble por centrifugación a baja velocidad (lote o flujo
continuo) y puede volverse a extraer según se ha descrito
anteriormente. A continuación se combinan los extractos
solubilizados y se purifica por cromatografía de columna (exclusión
por tamaño, lectina u otra afinidad, intercambio aniónico/catiónico
y/o fase inversa) antes de coadyuvancia o pueden coadyuvarse los
extractos directamente. La masa antigénica se mide por
procedimientos conocidos en la técnica como inmunoensayo unido a
enzima (ELISA) antes de coadyuvancia. Si la masa antigénica es
suficientemente alta, el extracto o el extracto purificado puede
diluirse en PBS. Si la masa antigénica es demasiado baja para ser
inmunogénicamente eficaz, el extracto o extracto purificado puede
concentrarse usando ultrafiltración u otros procedimientos de
concentración semejantes. La coadyuvancia puede realizarse usando
cualquiera de los coadyuvantes descritos anteriormente.
Dadas las anteriores descripciones, se espera
que entre los expertos en la materia se produzcan numerosas
variaciones de nuestra preparación y uso de vacunas de CVRB y CVEB,
así como de preparación de las células cHRT. Así, se pretende que
los ejemplos descritos anteriormente se entiendan sólo como
ilustrativos y el ámbito de la invención desvelada en la presente
memoria descriptiva debe estar limitado sólo por las
reivindicaciones siguientes.
Claims (4)
1. Una célula de tumor rectal humano
clonada mejorada HRT-E6, designada por ATCC CRL
12478.
2. Un procedimiento de propagación de
CVRB, coronavirus respiratorio bovino, o CVEB, coronavirus entérico
bovino, a una alta masa antigénica, que comprende las etapas de:
a. propagación de la célula de la reivindicación
1 en la superficie de un recipiente o en suspensión en presencia de
un medio de cultivo tisular para producir un recuento de células
viables aceptable;
b. inoculación de la célula propagada de la
reivindicación 1 con CVRB o CVEB para producir un cultivo celular
infectado;
c. incubación de dicho cultivo celular infectado
a entre 30 y 38ºC para producir un ECP aceptable;
d. recolección del cultivo celular infectado
resultante por transferencia a un contenedor de recogida;
e. opcionalmente, disrupción de dicho cultivo
celular infectado; y
f. opcionalmente, concentración de dicho cultivo
celular infectado a una alta masa antigénica.
3. Un procedimiento para propagar un
coronavirus respiratorio bovino (CVRB) por cultivo del virus en un
cultivo tisular en una cantidad suficiente para proteger a bovinos
frente a enfermedad respiratoria bovina o para identificar la
estructura molecular de CVRB o CVEB para preparación de productos de
subunidad o recombinantes, que comprende las etapas de inoculación
de CVRB en un cultivo tisular que es la célula de la reivindicación
1 y recolección del virus cultivado.
4. Un procedimiento para propagar un
coronavirus entérico bovino por cultivo del virus en un cultivo
tisular en una cantidad suficiente para proteger a los bovinos
frente a enfermedad por coronavirus respiratoria bovina y
enfermedad por coronavirus entérica bovina o para identificar la
estructura molecular de CVEB o CVRB para preparación de productos de
subunidad o recombinantes, que comprende la inoculación de CVEB en
un cultivo celular que es la célula de la reivindicación 1.
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