CN1250380A - 牛呼吸道冠状病毒作为疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作疫苗的改良活体或灭活的牛呼吸道冠状病毒和牛肠道冠状病毒及其抗原,用来预防牛呼吸道冠状病毒和牛肠道冠状病毒疾病。以及所述疫苗的制备方法和应用。

Description

牛呼吸道冠状病毒作为疫苗
                       发明背景
发明领域：本发明涉及可以以改良活体型、灭活型、或亚单位形式应用的牛呼吸道冠状病毒，用于制备疫苗，预防牛呼吸道冠状病毒(BRCV)和牛肠道冠状病毒(BECV)产生的疾病。本发明还涉及可以以改良活体型、灭活型、或亚单位形式应用的牛肠道冠状病毒，用于制备疫苗，预防牛呼吸道冠状病毒或牛肠道冠状病毒产生的疾病以及所述疫苗的制备方法和应用。
现有技术的简单描述：在接种疫苗的畜群中爆发的呼吸道疾病出现这样的问题，即存在其它的病毒或细菌涉及引发牛呼吸道疾病综合症(运输发热)。经鉴定这种疾病综合症的主要原因为以下四种病毒：传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)，副流感病毒3型(PI3)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)。为预防这些疾病综合症，现有技术使用接种疫苗的方法，包括所有这些病毒的单体型(单价)或者组合型(如果任何两种病毒存在于一种疫苗中则为二价或者如果两种以上病毒存在于一种疫苗中则为多价)作为疫苗的应用。过去，这些疫苗看来是有效的。然而，最近用这些疫苗控制牛呼吸道疾病综合症已经令人质疑，因为接种过疫苗的畜群仍然爆发呼吸道疾病，显示其它病毒或细菌涉入的可能性。
早在1984年，McNulty等从患有呼吸综合症的小牛呼吸道分离出牛冠状病毒(Vet.Micro.(兽医微生物学)1984，9：425-434)。从那以后，一直存在着意义重大的争论：是否牛呼吸道分离出的冠状病毒(BRCV)是用目前牛呼吸道疫苗接种的牛群中爆发的疾病的病因。如果是这样，还存在着这样的争论：BRCV与牛肠道分离出的冠状病毒(BECV)是否相同。
BECV，由Mebus等于本世纪70年代首次分离(Am J Vet Res.(美国兽医研究杂志)1973，34：145-150)，现在普遍认为它是初生小牛腹泻的重要病因。还发现它与成年牛冬季腹泻有关。在增殖BECV过程中，现有技术使用多种细胞类型，包括原代细胞(气管和消化道培养物)以及几种细胞系。细胞系的例子包括：人直肠瘤细胞(ATCC命名为HRT-18)，Vero细胞，Madin Darby牛肾脏(MDBK)细胞和Madin Darby犬类肾脏1(MDCK1)细胞。添加外源胰蛋白酶能够增强或者促进这些及其它一些细胞系中BECV的生长。在这些细胞的早期传代培养物中，BECV的增殖一般不产生的可识别的细胞病变作用(CPE)。后期传代细胞产生显著的CPE，特征在于合胞体的形成和细胞分离。
一种疫苗已经制备出来并可经正常渠道获得，其用于预防BECV引起的小牛肠道疾病。在产犊之前对牛使用以便预防。该疫苗的保护能力已经引起质疑，因为它依赖于被动免疫(Myers和Snodgrras，1982，J AmVet Med Assoc(美国兽医学会杂志)181：486-488和Mostl和Burki。1988，J Vet Med(兽医杂志)：35，186-196)。给牛口服改良的活BECV进行的免疫证明在实验室实验中能够保护初乳缺乏牛，但在野外实验中无效(Thurber等，1977，Can.J.Comp.Med.，41：131-136)。
从前面的描述可以认识到，潜在地由BRCV和BECV引起的饲育场中呼吸道疾病发生率的增加、成年奶牛和肉用牛冬季痢疾、以及新生小牛腹泻表明，需要解决这类疾病问题。在学术界存在这样的争论：是否BRCV和BECV是同种病毒的变异株。Johannes Storz博士，本领域公认的权威，最近公布BRCV和BECV之间存在显著的体外和体内区别，正因为这些区别它们属于截然不同的病毒，不期望能够交叉防御(Storz，1966，JAVMA，208：9，1452-1455)。BRCV和BECV之间的上述显著区别为：1)利用克隆人直肠瘤(cHRT)细胞系，可以容易地从第一代野外分离样品中分离出BRCV，而不需要使用胰蛋白酶；以这种方式增殖的BRCV分离物显示明显增强的细胞融合细胞病理学。相反，不经过多次传代或者胰蛋白酶的促进或者两者同时使用，不能得到典型的野生型BECV分离物，并且野生型BECV分离物不表现增强的细胞融合病理学；2)BRCV和BECV分离物具有不同的体外血凝模式，其中BECV凝聚啮齿动物和鸡红血球细胞(RBCs)，而BRCV分离物仅凝聚啮齿动物RBCs；3)BECV是小牛病毒性腹泻的主要病因，而BRCV经常从患咳嗽、呼吸困难、流鼻涕、和体温升高等呼吸道综合症的牛体内分离到。因为这些区别，Storz看来不赞成使用BRCV疫苗预防BRCV和BECV引起的疾病或者使用BECV疫苗预防BECV或BRCV引起的疾病。
                       发明概述
按照上面的描述，本发明包括一种或多种改良的活体型、灭活型、亚单位形式或其混合形式的BRCV分离物用作疫苗，主动和/或被动免疫牛，以预防BRCV或BECV引起的疾病。本发明也包括一种或多种改良的活体型、灭活型、亚单位型或其混合形式的BECV分离物用作疫苗，主动或被动免疫牛，以预防BRCV或BECV引起的疾病。本发明还包括改良的cHRT细胞系以及制备和使用上述细胞系的方法，用以增殖BRCV或BECV至高滴度，以便制备在商用疫苗生产中有用的高抗原性物质。术语“高抗原性物质”指免疫有效量的病毒或来源于病毒的抗原，它们可用于免疫牛，以预防BRCV或BECV引起的疾病。术语“商用”指疫苗可以在合理耗费范围内有效地生产。例如，一种商用疫苗将不需要消耗极高水平的抗原物质浓度即可达到有效的抗原物质作为疫苗。这样一种cHRT细胞系，HRT-18G，已经由Storz博士在美国典型培养物保藏中心保藏，指定登记号为CRL11663。另一种更有效的cHRT细胞系已经由本发明人研制出来，命名为HRT-E6。该细胞系于1998年4月6日保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Md 20852，指定登记号为CRL12478。
本发明进一步包括改良的(克隆)cHRT细胞系(命名为HRT-E6)的分离方法。该克隆方法选择性地提供了一种cHRT细胞，它能够使BRCV增殖到比用ATCC命名为CCL244的亲代细胞或本领域相关HRT-18G细胞获得的滴度更高的滴度。
另外本发明还包括使BRCV或BECV病毒增殖至高滴度的方法，以便在cHRT细胞系例如HRT-E6或HRT-18G中制备高抗原性物质，从而生产商用疫苗。
本发明进一步还包括制备或使用活体或灭活BRCV或BECV抗原(常规或重组)的方法，以及通过将免疫有效量的病毒或其抗原与稀释剂和/或佐剂组合得到的疫苗。
本发明还包括制备疫苗的方法，包括来源于BRCV或BECV提取物的亚单位形式疫苗的制备方法，或者非-BRCV或非-BECV重组有机体的制备。
已经发现灭活、与佐剂结合以及改良的活BRCV疫苗均以显著量和免疫有效量在血清反应阴性的牛中刺激中和抗体应答，产生充分免疫活性(表现为预防作用)。还可以预测用冠状病毒免疫牛将降低鼻腔内致病性BRCV感染后呼吸道和肠道冠状病毒疾病的爆发。
                       发明详述
如前所述，本发明涉及一种改良的活体型、灭活型、或亚单位形式的疫苗或其组合物，用于在牛中预防BRCV或BECV引起的疾病，其中含有免疫有效量的BRCV或BECV分离物或从它们得到的抗原。BRCV或BECV分离物可以利用来源于患病动物例如牛的样品接种敏感细胞培养物得到。亚单位可以从病毒中提取得到或者通过非-BRCV或非-BECV有机体的重组体的表达得到。
本发明的另一个实施例包括免疫牛以预防BRCV或BECV引起的疾病，其中使用免疫有效量的BECV或BRCV分离物或从它们得到的抗原。BECV或BRCV分离物或从它们得到的抗原可以为改良活病毒、灭活病毒或者由病毒提取得到的或者非一BRCV或非-BECV有机体的重组体表达得到的亚单位。上述种类的任何组合，以及上述种类添加佐剂和可药用载体都在本发明范围内。病毒在高敏感细胞系例如cHRT细胞系中增殖。
本发明的进一步实施例包括一种改良的克隆人直肠瘤细胞，HRT-E6，命名为ATCC CRL 12478。改良表现为与其母体细胞，CCL 244或者另一种cHRT细胞，HRT-18G相比，在这些改良细胞系中BRCV和BECV病毒基本上能够更有效的增殖。这种改良的cHRT细胞(本文命名为HRT-E6)可以利用本领域已知的有限稀释技术在96-孔组织培养平板上制备。这些技术涉及CCL 244细胞在容器例如滚瓶中生长、用本领域已知的胰蛋白酶处理分离出细胞(使用含有0.05％-0.25％胰蛋白酶与0.04％EDTA混合得到的胰蛋白酶-EDTA溶液)，测量从容器中分离出来的活细胞数目，用Dulbeco’s必需基本培养基(DMEM)或必需基本培养基(MEM)加血清(优选胎牛血清或马血清)对这些细胞进行10-倍或其它同样有利的稀释，以便96孔平板的大部分孔中理论上仅含有一个细胞。显微镜观察这些细胞，确定哪些孔实际上含有一个细胞。一旦含有一个细胞的孔开始铺满，这些孔中的细胞用本领域已知的胰蛋白酶消化技术分离出来，传代直到得到大量的细胞。每一种从开始的单一细胞获得的大量细胞定义为一个克隆，并给出一个单独的编号。通过用BRCV或BECV分离物接种并选择表现高滴度的细胞，测试每个克隆对BRCV和BECV的高度敏感性。举例说明，一种敏感细胞应该使BRCV或BECV增殖到数量足以产生细胞病变作用(CPE)。更敏感的克隆应该使BRCV或BECV增殖到滴度为103.0组织培养物感染剂量(TCID50/mL)。最敏感的克隆，本文定义为高敏感细胞，使BRCV和BECV增殖到105.0TCID50/mL的量。这样，最敏感的克隆连续传代直到最终产生高敏感细胞系，它可以方便地用于增殖BRCV或BECV以提供商用疫苗，同时较敏感克隆可以用于增殖和分离BRCV或BECV以诊断疾病。
本发明的再一个实施例是使BRCV或BECV增殖成为高抗原性物质，产生免疫有效量的BRCV、BECV或从它们得到的抗原的方法。该方法包括以下步骤：(1)在存在组织培养基的容器表面或悬浮液中增殖高敏感细胞至有效地产生可接受活细胞数至少为1×105/mL的细胞；(2)用BRCV或BECV接种高敏感细胞，制备感染的细胞培养物；(3)在30-38℃培养感染的细胞培养物，直到产生可接受的CPE，最好在35-37℃之间培养；(4)收获得到的感染细胞培养物，转移到收集容器中；(5)任选用以下方法破碎收获的感染细胞培养物中残留的完整细胞，所述方法包括但不限于显微流化、冷冻干燥和超声法；(6)任选浓缩感染的细胞培养物至高抗原性物质。浓缩步骤可以用本领域已知方法进行，包括但不限于超滤、离心、沉淀或层析。虽然任何高灵敏细胞均可以用于增殖BRCV和BECV，但是使用的cHRT细胞优选HRT-E6，最优选命名为ATCC CRL12478的细胞。下面是增殖方法的更具体但非限制性的描述。cHRT细胞例如HRT-T6，在容器例如滚瓶中或者在生物反应器的微载体上，在组织培养基例如添加血清(例如1-10％牛血清或供体马血清)和适当缓冲系统(例如1.3g/L碳酸氢钠)的Dulbecco’s最小基本培养基中生长。细胞传代培养直到细胞数量在24-48小时内足以达到在容器或微载体表面或悬浮液中所需的铺满度或细胞密度。除去铺满的单层细胞、悬浮细胞或微载体的生长培养基，然后用BRCV或BECV接种，得到的感染复数(MOI)为0.001-0.1，优选0.01-0.1。得到的病毒可以首先吸附到细胞单层上或与悬浮细胞混合，然后添加维持培养基。维持培养基基本上与上述细胞生长培养基相同，除了加入的血清量减少了。得到的病毒感染的组织培养物在30-38℃之间培养，优选35-37℃之间培养直到观察到完全CPE。典型地，完全CPE在感染后1-7天之间观察到，优选在感染后2-4天之间观察到。表现可接受的CPE的病毒感染的组织培养物收集(收获)到单一容器中，制备收获液体。为本发明目的的可接受的CPE表现为至少50％的细胞层破坏。
收获液体可以用任意几种灭活试剂灭活，以制备灭活形式的疫苗。灭活试剂选自β-丙内酯、甲醛、双氮丙啶、加热和UV照射照射。
如果BRCV或BECV已经用现有技术预先减毒，也可以使用活体形式的收获物。说明性但不是限制性的减毒例子为，在组织培养物中多次传代，然后用致突变剂处理，以便选择当给小牛鼻腔内注射后不能产生疾病的突变体。另外，活的收获物可以不经诱导突变，而通过非典型途径(包括肌肉、皮下或皮内)使用从收获物得到的疫苗。
在制备亚单位疫苗时，BRCV或BECV如上述生长，收获的病毒用任何几种试剂提取，所述试剂包括但不限于去污剂和有机溶剂。提取物可以以提取形式使用，也可以进一步用超滤和/或柱层析纯化，然后与一种佐剂结合形成疫苗。这种方法的具体实例包括按照前面描述的方法用BRCV感染cHRT细胞。然后当CPE＞80％时，收获感染的细胞。收获的感染细胞通过低速离心从液体中分离出来，通过加入含去污剂的缓冲系统提取收集到的沉淀。缓冲去污剂系统包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)或任何其它对组织培养细胞无毒性的缓冲液，加入1.0％-10.0％的去污剂，例如IGEPALCA-360(Sigma Chemical Company提供)，优选使用1.0％-2.0％的选自IGEPAL CA-360、Triton-X-100(Sigma Chemical Company提供)和十二烷基硫酸钠(也由Sigma Chemical Company提供)的去污剂。使用的有机溶剂浓度相同，包括但不限于醇、酯或醚。任何缓冲系统都可以使用，只要对组织培养细胞无毒性。其它有用的缓冲液包括但不限于，其它盐例如硫酸盐、碳酸盐，和有机缓冲液例如三[羟甲基]氨基甲烷(TRIS)，N，N’-双[2-乙基磺酸]：1，4-哌嗪二乙基磺酸(PIPES)，和N-[2-羟乙基哌嗪-N’-]2-乙基磺酸(HEPES)，它们均由Sigma化学公司提供。缓冲去污剂系统用于重悬浮细胞沉淀，温度控制在4-37℃之间，优选4-l0℃之间，混合悬浮的感染细胞沉淀进行提取，直到细胞沉淀均匀溶解(通常在30-120分钟之间)。这样提取后，通过低速离心(分批或连续流动)除去所有不溶物，然后如上述再次提取。然后在加入佐剂之前，混合溶解的提取物，通过柱层析(大小排阻层析、凝集素或其它亲和层析、阴离子/阳离子交换层析，和/或反相层析)纯化，或者提取物可以直接加入佐剂。抗原物质与佐剂结合前，用本领域已知方法例如酶联免疫法(ELISA)、HPLC、FPLC或电泳测定。如果抗原物质浓度足够高，提取物或纯化的提取物可以用PBS稀释。如果抗原物质浓度太低而不能产生有效的免疫作用，提取物或纯化的提取物可以用超滤、离心、或其它类似浓缩方法浓缩。可以加入下面描述的任何佐剂。
佐剂可以与灭活或改良的活收获物液体或来源于BRCV或BECV的亚单位或重组抗原一起用于疫苗制剂。如果佐剂用于制备疫苗，已知可以加入任何佐剂，以增加疫苗的有效性。这类佐剂包括但不限于，聚合物或嵌段共聚物包括Carbopol、DEAE葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、异丁烯酸酯和POLYGENTM；IMMUGENTM；铝盐例如氢氧化铝和磷酸铝；Avridine；脂质A；二甲基十二烷基溴化铵；痘病毒蛋白例如Baypamune；油例如SUPRIMMTM，EMULSIGENTM，EMULSIGEN PLUSTM；动物油例如角鲨烯；矿物油例如Drakeol和Montanides；植物油例如花生油；三萜类糖甙例如皂角甙、QuilA和QS21；去污剂例如吐温-80和泊洛萨姆(Pluonics)；细菌成分佐剂例如来源于棒状杆菌属、丙酸菌属和分枝杆菌属的佐剂；白介素、单核因子和干扰素；脂质体；ISCOM；合成糖肽例如胞壁酰二肽和其衍生物；霍乱毒素；或者上述物质的组合。
本发明描述了增殖BRCV的方法，通过使病毒在组织培养物中生长至数量足以预防BRCV或BECV引起的牛的疾病，或者足以鉴定用于制备亚单位或重组产物的BRCV或BECV的分子结构，包括在组织培养物上(为克隆的人直肠瘤细胞(cHRT)，优选HRT-E6，命名为ATCC CRL 12478)接种BRCV，然后收获生长的病毒。
本发明也描述了增殖BECV的方法，通过使病毒在组织培养物中生长至数量足以预防BECV或BRCV引起的牛的疾病，或者足以鉴定用于制备亚单位或重组产物的BRCV或BECV的分子结构，包括在组织培养物上(为克隆的人直肠瘤细胞(cHRT)，优选HRT-E6，命名为ATCC CRL 12478)接种BECV，然后收获生长的病毒。
按照本发明，广泛交叉反应的BRCV或BECV分离物可以用于制备本文描述的疫苗。这种交叉反应性可以通过体外交叉中和研究确证(参见例如实施例5)。本发明的进一步和更具体的细节由下列实施例代表但不限于这些实施例。
                       实施例实施例1克隆HRT细胞以制备cHRT细胞
来源于ATCC(命名为CCL 244)的人腺瘤细胞用于制备下述的cHRT细胞。获得的细胞在添加10％马血清的RMPI 1640，或者含5-10％胎牛血清(FBS)的DME或MEM上开始铺板并维持生长。所有研究都用含FBS的DME或MEM进行。
利用标准有限稀释技术在96孔组织培养平板上得到CCL 244克隆。该技术涉及从含有在胰蛋白酶/EDTA溶液(含有0.1％胰蛋白酶和0.04％EDTA)中生长的细胞的容器中分离出HRT-18细胞，测量活细胞数目，在加有10％FBS的DME或MEM中制备10倍细胞稀释液，使得96孔平板的大部分孔中理论上仅有一个细胞。用显微镜观察孔，以便确定孔实际上含有单一细胞源。一些孔显示小的细胞簇，但是选择出了五个孔，因为观察到它们具有单一细胞源。生长/维持10天后，一个孔(克隆)用胰蛋白酶处理用于在96孔平板上再次克隆。重复同样的克隆程序。第二次克隆中，观察到三个克隆似乎来自单一细胞，孔E6中的克隆选择用于扩增并用于随后的实验中。该克隆命名为HRT-E6。保留的四个克隆维持培养直到确认E6可进行至少某些其它研究，并通过本领域已知技术形成稳定的细胞系。
进行实验确认亲代CCL 244细胞和HRT-E6细胞是否对选择的牛病毒敏感。病毒包括牛呼吸道合胞体病毒(BRSV毒株375)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV NADL毒株)、牛疱疹病毒1型(BHV-1 Cooper毒株)、牛副流感病毒3型(PI3毒株SF-4)和BRCV(毒株RA2R7)。CCL 244和HRT-E6的最初单层细胞用病毒接种，在无血清培养基中吸附30-60分钟。分离除去该培养基，加入含有2％FBS的维持培养基。每天观察培养物，观察5-7天，如果没有出现CPE，培养液或者直接传递到新鲜细胞上(CCL 244和HRT-E6)或者在-70℃冷冻，然后传递到单层细胞上。对不表现CPE的各种病毒进行三次这样的盲传。Storz报道得到各种病毒在HRT-18G细胞上生长的结果(JAVMA，1996，208：9，1452-1455)。结果如下表1所示。CCL244、HRT-E6和HRT-18G细胞在第一代均对BRCV敏感。Storz报道他的HRT-18G细胞对BHV-1敏感。BHV-1在本发明的HRT-E6细胞上不表现CPE，直到第二代培养末期才出现。该实验表明HRT-E6细胞与HRT-18G细胞和亲代CCL 244细胞表型不同。
表1  CCL 244和HRT-E6细胞与Storz博士报道的HRT-18G上生长病毒的敏感性比较
    病毒  CCL 244上的生长  HRT-E6上的生长  HRT-18G上的生长
    BRSV     阴性     阴性     阴性
    BVDV     阴性     阴性     阴性
    BHV-1     阳性     阴性     阳性
    P13     阴性     阴性     阳性
    BRCV     阳性     阳性     阳性
实施例2与亲代CCL 244细胞相比cHRT细胞的独特性
为分辨包括HRT-E6在内的CCL 244细胞克隆(cHRT)的独特性(uniqueness)，进行了一个实验，评价与其它几种能够增殖牛病毒的细胞相比该细胞的BRCV生长特征。从South Dakota地区表现呼吸道疾病的牛体内得到的BRCV分离物RA2R7接种细胞系，这些细胞系包括MadinDarby牛肾细胞(MDBK)，猪睾丸细胞(ST)，猫肺细胞(FL)，Bayer9009细胞和HRT-E6细胞。BRCV分离物和/或其继代培养液在无血清培养基中吸附60分钟。如果不出现CPE，培养物或者直接传代到新鲜细胞上或者冷冻然后传代到各种细胞单层上。每种细胞系传代5次。除了HRT-E6，所有细胞在实验过程中的任何时候都不表现CPE。因此，cHRT细胞是独特的。实施例3与亲代CCL 244细胞相比cHRT细胞的独特性
为进一步论证来源于亲代CCL 244细胞的包括HRT-E6和HRT-18G在内的cHRT细胞的独特性，进行了下列实验。从Arizona地区患有呼吸道疾病的牛体内分离出来的两种BRCV分离物，RA2R7和AZ26649，以及一种BECV分离物，命名为50-3(得自于Johannes Storz博士)，按照实施例1描述的方法生长。然后每种分离物滴定到CCL 244细胞、HRT-E6细胞或HRT-18G细胞上。按照本领域已知方法用每种细胞的新鲜单层在96孔平板上进行滴定。结果列在表2中，滴度表示为log10TCID50/mL。表2 BRCV和BECV在cHRT细胞上的滴度与它们在亲代CCL 244细胞上的滴度比较
  病毒分离物 在CCL 244细胞上的滴度   在HRT-18G细胞上的滴度  在HRT-E6细胞上的滴度
    RA2R7     3.4     5.2     6.8
    AZ26649     3.0     6.5     6.4
    50-3     5.6     5.4     4.7
显然cHRT细胞比亲代CCL 244细胞更能使BRCV分离物增殖至明显较高的滴度。值得说明的是，所有这三种细胞增殖BECV分离物50-3至基本上同样的滴度水平。当增殖BRCV用于商用疫苗目的时，获得尽可能最高的滴度是很重要的。因此，cHRT细胞用于增殖BRCV是商业可行的，而CCL244细胞却不行。实施例4BRCV和BECV分离物之间的区别的确认
对实施例3中提到的各种分离物和其它下文描述的确定为BRCV的分离物之间进行了比较。按照Storz(JAVMA，1996，208：9，1452-1455)，BRCV凝聚鼠RBC而不凝聚鸡RBC。本实验中，对分离物RA2R7、AZ26649、LSU051(BRCV分离物，得自于Storz博士)、6J305(BRCV分离物，得自于ImmTech)和50-3凝聚鼠和鸡的RBC活性(HA)进行了评价。按照标准凝聚技术用0.5％的鼠或鸡RBC检测各种分离物的病毒混合物。结果表示为产生红血球凝聚的最高稀释度(HA Titer)的倒数，并由表3概述。从结果可以很清楚地看到，BRCV分离物RA2R7、AZ26649、LSU051和6J305凝聚鼠RBC，但不凝聚鸡RBC，因此与已知的BECV分离物50-3不同，50-3在较高滴度仍凝聚鼠RBC，并对鸡RBC也显示某些凝聚作用。
                        表3  BRCV和BECV分离物的凝血滴度
    分离物    对鼠RBC的HA滴度    对鸡RBC的HA滴度
    RA2R7     256     ＜8
    AZ26649     32     ＜8
    LSU051     64     ＜8
    6J305     256     ＜8
    50-3     ＞4096      8
实施例5BRCV和BECV分离物的交叉中和
虽然实施例4表明BRCV和BECV分离物的区别之处在于它们表现出不同的HA凝聚模式，注意到为疫苗研制目的的抗原相关性程度也是很重要的。因此，进行了一个交叉中和实验。对三种BRCV野外分离物和一种BECV野外分离物的交叉中和进行了评价。BRCV-CA从California地区饲育场的牛体内分离得到，BRCV-TX从Texas地区饲育场的肉牛体内分离得到，BRCV-OK从Oklahoma地区饲育场的肉牛体内分离得到。BECV 50-3再次作为已知BECV分离物使用。两只兔反复注射纯化的病毒制剂(亚单位)，该制剂由各种分离物加入佐剂制备。最后一次注射之后，对兔取血，收集血清。收集到的血清用于评价体外细胞培养分析中对BRCV和BECV分离物的中和能力。
所有的病毒分离物通过超滤在20-60％线性蔗糖梯度下纯化。纯化的病毒，浓度为20-50μg/剂量总蛋白质，与Freund’s完全佐剂(FCA)混合用于对兔首次注射，与Freund’s不完全佐剂(FIA)混合用于随后三次后续注射。注射经肌肉途径，每次注射间隔21天。最后一次注射之后七天，最后取血制备血清。
通过将分离到的特定样品血清与100-300 TCID50各种病毒分离物混合，进行交叉中和分析。在96孔平板中用每个血清样品连续稀释两次，得到稀释两倍的血清。100-300 TCID50病毒加入所有孔中，血清/病毒混合物在37℃保温一小时。保温后，将cHRT细胞加入所有孔中，平板在37℃，潮湿环境、5％CO2的保温箱中保温5-6天。表4总结了体外交叉中和分析结果。得到的免疫活性由血清抗体滴度代表，表示为完全中和病毒的最高血清稀释度的倒数。
本实验结果表明，在各种情况下对个体BRCV或BECV分离物应答的抗体，某种程度上能够中和所有异源分离物。BRCV和BECV之间的交叉中和区别明显。同样，各种BRCV分离物之间的交叉中和同样存在区别。然而，其中确定的区别程度却没有大到足以将BRCV和BECV分为单独的不同的血清型。
这些数据清楚地表明对按照本发明制备的一种BRCV或BECV分离物应答的抗体对于异源分离物的免疫攻击能够提供足够的交叉中和活性。具体地说，BRCV疫苗将诱发中和BECV免疫攻击(如上文确证为一种不同的疾病单元)以及其它异源BRCV分离物免疫攻击的抗体应答。另外，预料BECV疫苗将诱发中和BRCV免疫攻击(上文也确证为一种不同的疾病单元)以及其它异源BECV分离物免疫攻击的抗体应答。
                    表4  BRCV和BECV分离物的交叉中和滴度
分离物特定抗体    兔的编号                      病毒分离物
    BRCV-CA26649     BRCV-TX2385-42     BRCV-OK0514-50     BECV50-3
    BRCV-CA26649/Ab     001002平均     512a40962304     102410241024     512512512     256512384
    稀释倍数差异b     -     2.3     4.5     5.3
    BRCV-TX2385-42/Ab     003004平均     1024256640     204881 925120     102410241024     2561024640
    稀释倍数差异     7.7     -     5.0     7.7
    BRCV-OK0514-50/Ab     005006平均     102410241024     409620483072     204810241536     1024512768
    稀释倍数差异     1.5     2.0     00     2.0
    BECV50-3/Ab     007008平均     102410241024     409640964096     512256384     2048102414536
    稀释倍数差异     1.4     2.7     4.0     -
a＝完全中和病毒分离物的最终抗体稀释度的倒数b＝平均同源抗体/病毒滴度超过各平均异源抗体/病毒滴度的数字转化形式实施例6灭活的牛呼吸道冠状病毒疫苗(BRCV)
在本发明的实施中，抗原物质BRCV可以配制成疫苗，其中包含免疫有效量的病毒或从它得到的抗原。下面是经济可行的方法的描述，通过这种方法制备抗原物质BRCV，灭活，并配制成灭活的疫苗制剂。本发明的疫苗通过肌肉注射给药。然而，它也可以通过皮下途径给药，或者，通过鼻内、皮内或口服途径给药。给药量为1-5毫升疫苗。
BRCV分离物AZ26649可在以前曾描述过的cHRT细胞中(HRT-18G)增殖。这些细胞大多数能够在包含添加5％胎牛血清或供体马血清的DME和合适的缓冲系统(例如1.3g/L碳酸氢钠)的生长培养基中有效地培养和维持。进行细胞传代，使细胞数量24-48小时内足以达到铺满。
cHRT铺满的单层细胞用BRCV以下列方式接种。病毒储备液在无血清的DME中稀释，以获得每10-100个cHRT细胞感染一个病毒颗粒的感染复数(MOI)(0.1-0.01)。通过除去过量的生长培养基、更换稀释的病毒接种物至体积足以完全覆盖单层，在37℃吸附1小时实现病毒感染cHRT细胞。吸附之后，加入含2％胎牛血清(FBS)的DME和适当缓冲系统例如1.3g/L碳酸氢钠的维持培养基。病毒感染的组织培养物在37℃，潮湿环境，含5.0％CO2的空气中培养直到观察到完全CPE。观察到的CPE包括细胞快速聚集和融合，接着多核体从悬浮在维持培养基中的大量感染的细胞聚集体形成的底物中分离出来。通常感染后2-4天观察到完全CPE，并收获培养物。通常，得到的BRCV的TCID50的滴度范围为105.5-108.0TCID50/mL收获液。
含106.67TCID50/mL BRCV的收获液采用标准方法用0.1％vol/vol BPL灭活。简单地说，收获液和BPL混合，混合液在环境温度(约25℃)下保持24小时。灭活过程中用3.0N的NaOH控制pH为6.8-7.2。其它预期的合适的灭活试剂或方法的非限制性例子包括甲醛、双二甲亚胺、热、和UV光照射。
在灭活的BRCV中如下述加入Carbopol(B.F.Goodrich Co.)佐剂。一体积的储备佐剂(1.5％Carbopol)与一体积的灭活病毒混合，使得疫苗的终剂量含20％佐剂(vol/vol)。加入佐剂的液体在环境温度下(约25℃)混合至少24小时。其它预期的合适佐剂的非限制性例子包括，铝盐例如氢氧化铝和磷酸铝；其它聚合物例如POLYGENTM、DEAE葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、异丁烯酸酯和IMMUGENTM、二甲基十二烷基溴化铵；痘病毒蛋白例如Baypamune；Avridine；脂质A；油例如SUPRIMMTM，EMULSIGENTM，EMULSIGEN PLUSTM；动物油例如角鲨烷和角鲨烯；矿物油例如Drakeol和Montanides；植物油例如花生油；嵌段共聚物；三萜类糖甙例如皂角甙、QuilA和QS21；去污剂例如吐温-80和泊洛洒姆(Pluonics)；细菌成分佐剂例如来源于棒状杆菌属、丙酸菌属和分枝杆菌属的佐剂；白介素、单核因子和干扰素；脂质体；ISCOM；合成糖肽例如胞壁酰二肽和其衍生物；霍乱毒素；或者上述物质的组合。
确证了以上述方式制备的灭活BRCV疫苗对牛的免疫有效性。基于病毒收获液的预先灭活的TCID50滴度，制备含有三种不同的抗原物质的疫苗。配制含高、中、低抗原物质的疫苗，使它们的每2.0mL剂量中分别含有105.5、106.0、106.5TCID50的BRCV。每种疫苗给四头牛接种，另外四头牛作为未接种疫苗的对照组。通过肌肉途径，给牛接种两次，间隔19天。首次接种之前、第二次接种时、和第二次接种后7天和14天分别对牛取血，评价血清-病毒中和(SN)抗体对BRCV的应答。实验过程中，接种疫苗的动物和未接种疫苗的动物混合在一起。表5概述了如本实施例确证的SN免疫活性，表示为各种抗原物质的灭活疫苗接种后牛血清中和抗体应答。
如表5所示，本研究结果确证了低、中、或高抗原性物质的疫苗两次给药诱发中和病毒的抗BRCV抗体的平均倍数分别增加了8.4、9.1和16。而同时，混合于其中的未接种疫苗的对照组的平均抗体滴度则下降；表明实验过程中未发生BRCV自然感染。由于测量了病毒中和抗体，并且通常认为抗体滴度增长四倍表明出现显著的免疫活性，因此这些数据表明可以用灭活的BRCV疫苗诱发产生有效免疫作用的免疫应答。抗原物质低至105.5TCID50/mL的灭活疫苗也显示具有有效免疫作用。
表5牛接种灭活牛呼吸道冠状病毒疫苗后的血清-病毒中和抗体应答
  组别    牛编号   首次剂量(V1)第0天   加强剂量(V2)第19天    V2后7天第26天   V2后14天第33天
  低AGM(105.5TCID50)     001002003004     8322＜2     326448     128321664     256321664
    平均     11     27     60     92
  中AGM(106.0TCID50)     005006007008     16324＜2     8324＜2     12812812864     128128128128
    平均     14     15     112     128
  高AGM(106.5TCID50)     009010011012     16216＜2     644328     2566412832     12812825664
    平均     9     27     120     144
  未接种疫苗的对照组     013014015016     46432＜2     41616＜2     21632＜2     83232＜2
    平均     26     10     13     19
AGM＝抗原物质实施例7改良的活牛呼吸道冠状病毒疫苗
按照实施例6描述的程序制备BRCV分离物AZ26649，不同之处仅在于它在鉴定为HRT-E6的cHRT细胞上增殖。病毒生长到滴度达到106.7TCID50/mL，然后通过振摇装有病毒和细胞的容器，并将它们倒入收集容器收获病毒。收获的病毒液用于制备本实验的疫苗。然而，这疫苗没有经过净化、浓缩、灭活和加入佐剂来制备，全部或部分这些步骤可以用于制备较强的抗原物质。对于本实验，每头牛使用的抗原物质滴度为5×106.7TCID50。它在本发明的将佐剂加入改良活BRCV或BECV疫苗的范畴内。为了制备成功的添加佐剂的改良活疫苗，BRCV或BECV必须进一步改良(例如，进一步降低致病力)。制备进一步改良型的BRCV或BECV，可以通过高敏感细胞例如cHRT细胞，使AZ26649或任何其它BRCV或BECV传代，直到对血清阴性牛鼻内给药后，它不再产生任何疾病迹象。可以通过例如肌肉、皮内、皮下或腹膜内等非自然途径而不是鼻内，用其它方法应用加入佐剂的改良活疫苗。或者，可以用致突变试剂例如亚硝基胍处理病毒，然后选择较低致病性的突变体。应该选择当鼻内对血清阴性牛使用后，不能够产生疾病病症，并且它们能够用来连续制备免疫有效的疫苗的突变体。这种进一步改良分离物的方法将提高疫苗的安全性。
三头牛(#61、#71和#74)首次接种(第一次接种疫苗)时大约都为八个月大。这些牛对BRCV都表现血清阴性，通过鼻内给药接种5.0mL的上述疫苗。当接种疫苗的牛单次初步接种疫苗后24天，用1×106.8TCID50如上述生长的BRCV AZ26649免疫攻击，注射体积为10mL。三头未接种疫苗的血清阴性对照牛用同样量的BRCV AZ 26649在同一时间免疫攻击。对所有牛的BRCV疾病的临床病症进行每日评价，进行12天。临床评价包括测量直肠温度、观察呼吸道病症(呼吸困难、流鼻涕和咳嗽)、以及观察胃肠道病症(粪便、食欲不振)。计分系统显示如下：流鼻涕         粪便稠度     呼吸困难、咳嗽、食欲不振0＝正常        0＝正常            0＝正常1＝水状        1＝糊状            1＝轻度2＝粘稠        2＝半液体状        2＝中度3＝脓性粘液    3＝液体            3＝重度4＝鼻出血      4＝血液状
表6中列出的临床计分栏是上面定义的“流鼻涕”和“呼吸困难、咳嗽、食欲不振”(呼吸道疾病)的总和除以每组动物数的综合评价(平均)。表6中的肠道分数代表如上面定义的平均粪便稠度的分数。每日鼻拭子样品收集于5％庆大霉素的MEM，用0.45μm的注射滤器过滤后于-70℃储存。之后用已知方法(接种组织培养系统中的cHRT细胞)检测鼻拭子样品中存在的病毒。下表6显示了平均直肠温度、平均总临床计分、以及三头接种疫苗的牛(接种疫苗动物)与三头未接种疫苗的牛(对照)在免疫攻击后12天之间病毒分离结果的比较。
结果表明接种疫苗的牛证明呼吸道疾病显著降低(59％)，并且肠道疾病也显著降低(59％)。一头接种疫苗的牛在0天肠道计分为1.0，该分数已知持续到11天。如果从实验中除去这头牛的结果，BRCV疫苗将使肠道疾病100％降低。观察到与对照相比接种动物的病毒排泄天数降低了50％。没有表现明显的温度反应。这些数据表明BRCV疫苗可以预防呼吸道和肠道形式的冠状病毒疾病。
                   表6 BRCV疫苗接种/免疫攻击研究的结果
    处理组  免疫攻击后天数   温度   临床计分   肠道计分   阳性分离
接种疫苗动物对照动物     00   102.0102.0     0.330.00     0.330     0/30/3
接种疫苗动物对照动物     11   102.1102.1     0.671.00     0.330.33     1/31/3
接种疫苗动物对照动物     22   102.0102.6     1.001.00     0.330.67     1/32/3
接种疫苗动物对照动物     33   102.2102.8     1.002.30     1.001.67     2/32/3
接种疫苗动物对照动物     44   102.0102.8     2.003.33     0.331.67     2/33/3
接种疫苗动物对照动物     55   102.0102.4     1.003.00     0.331.33     1/33/3
接种疫苗动物对照动物     66   102.2102.6     1.001.33     0.331.33     2/33/3
接种疫苗动物对照动物     77   101.0102.4     1.004.00     0.330.67     2/33/3
接种疫苗动物对照动物     88   102.0102.3     2.332.33     0.330.67     1/33/3
接种疫苗动物对照动物     99   101.8101.9     0.672.33     0.330.67     1/33/3
接种疫苗动物对照动物     1010   101.8102.0     0.671.33     0.330.67     1/32/3
接种疫苗动物对照动物     1111   101.9101.8     0.331.67     0.330.33     0/32/3
接种疫苗动物对照动物     1212   101.7101.8     0.001.00     00.33     0/31/3
为进一步确定本实验BRCV疫苗的免疫活性，在0天和24天收集各接种疫苗的牛的血清，用于评价血清中因接种产生的中和BRCV的抗体，并在免疫攻击后0天和17天收集血清，以确定牛的确接触了病毒。表7显示了所有牛的血清中和滴度，表示为产生中和的终稀释度的倒数。在所有接种疫苗的牛中，用改良活BRCV疫苗单次接种产生最为显著的滴度。对照牛保持血清阴性，表明免疫攻击前没有接触BRCV。免疫攻击后，接种疫苗的牛表现回忆应答。表7 接种疫苗后、免疫攻击前和免疫攻击后牛的血清中和滴度。
  牛的编号/状态  0天(接种时间)的滴度  24天(免疫攻击时间)的滴度 免疫攻击后17天的滴度
  61/Vacc     ＜2        64     512
  71/Vacc     ＜2        16     64
  74/Vacc     ＜2        128     256
  54/Cont     ＜2        ＜2     64
  62/Cont     ＜2        ＜2     32
  70/Cont     ＜2        ＜2     8
Vacc＝接种动物Cont＝对照动物实施例8亚单位疫苗的制备
按照实施例6描述的方法用BRCV感染克隆的HRT细胞。在感染后12-72小时之内，当CPE＞80％时，收获感染的细胞。通过收获感染的组织培养液制备用于提取的感染细胞，这种收获包括将感染的组织培养物倒入其后可以低速(约1000×g)离心的收集容器。感染的组织培养物可以用正常离心机分批离心，也可以在连续流动离心机中离心。离心后，加入溶于缓冲系统的去污剂提取细胞沉淀。本实验中，缓冲去污剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)加1.0％Nonidet P-40。用缓冲去污剂重悬浮细胞沉淀，通过在4℃混合悬浮的感染细胞沉淀进行提取，直到细胞沉淀均匀溶解，或者混合约30-120分钟。提取之后，低速离心(分批或连续流动)除去不溶物，然后可以如上所述再次提取。然后混合溶解的提取物，加入佐剂之前通过柱层析纯化(大小排阻层析、凝集素活其它亲合色谱、阴离子/阳离子交换、和/或反相色谱)，或者提取物可以直接加入佐剂。加入佐剂前，用本领域已知技术例如酶联免疫分析(ELISA)测定抗原物质。如果抗原物质足够高，提取物或纯化提取物可以用PBS稀释。如果抗原物质太低而不能产生有效的免疫作用，提取物或纯化提取物可以用超滤或其它类似浓缩方法浓缩。可以加入上述任何佐剂进行辅助。
根据上面的公开内容，本领域技术人员可以对我们的BRCV和BECV疫苗制剂和应用以及cHRT细胞制剂进行各种改变。因此，上述实施例旨在进行说明，本文公开的本发明的范围只应当由下列权利要求限制。

Claims (27)

1.用于预防牛感染BRCV和BECV的疫苗，其含有免疫有效量的BRCV分离物或从它得到的抗原。
2.按照权利要求1的疫苗，其中所述BRCV分离物为改良活体或灭活型。
3.按照权利要求1的疫苗，其中所述来源于BRCV分离物的抗原为亚单位型或重组型。
4.用于预防牛感染BRCV和BECV的疫苗，其含有免疫有效量的BECV分离物或从它得到的抗原。
5.按照权利要求4的疫苗，其中所述BECV分离物为改良活体或灭活型。
6.按照权利要求4的疫苗，其中所述来源于BECV分离物的抗原为亚单位型或重组型。
7.权利要求1的疫苗，还含有一种佐剂。
8.权利要求7的疫苗，其中所述佐剂选自聚合物、铝盐、二甲基十二烷基溴化铵、痘病毒蛋白例如Baypamune、Avirdine、脂质A、油、去污剂、细菌成分佐剂、白介素、单核因子、干扰素、脂质体、ISCOM、合成糖肽和霍乱毒素，或者上述物质的组合。
9.权利要求8的疫苗，其中所述聚合物选自Carbopol、POLYGENTM、IMMUGENTM、DEAE葡聚糖和异丁烯酸酯，或者上述物质的组合。
10.权利要求8的疫苗，其中所述油选自SUPRIMMTM、EMULSIGENTM、EMULSIGEN PLUSTM、Drakeol、Montanides、植物油、花生油、角鲨烷和角鲨烯，或者上述物质的组合。
11.权利要求4的疫苗，进一步包括一种佐剂。
12.权利要求11的疫苗，其中所述佐剂选自聚合物、铝盐、二甲基十二烷基溴化铵、痘病毒蛋白例如Baypamune、Avirdine、脂质A、油、去污剂、细菌成分佐剂、白介素、单核因子、干扰素、脂质体、ISCOM、合成糖肽和霍乱毒素，或者上述物质的组合。
13.权利要求12的疫苗，其中所述聚合物选自Carbopol、POLYGENTM、IMMUGENTM、DEAE葡聚糖和异丁烯酸酯，或者上述物质的组合。
14.权利要求11的疫苗，其中所述油选自SUPRIMMTM、EMULSIGENTM、EMULSIGEN PLUSTM、Drakeol、Montanides、植物油、花生油、角鲨烷和角鲨烯，或者上述物质的组合。
15.一种改良的克隆人直肠瘤细胞HRT-E6，命名为ATCC CRL 12478。
16.将BRCV或BECV增殖成高抗原性物质的方法，包括：
a.在含有组织培养基的容器表面或悬浮液中增殖高敏感细胞，达到可接受的活细胞数量；
b.用BRCV或BECV接种增殖的高敏感细胞，产生感染的细胞培养物；
c.在30-38℃培养所述感染细胞，直至产生可接受的CPE；
d.收获得到的感染细胞培养物，转移到收集容器中；
e.任选破碎所述感染的细胞培养物；
f.任选浓缩所述感染的细胞培养物，得到高抗原性物质。
17.按照权利要求16的方法，其中高敏感细胞为克隆人直肠瘤细胞。
18.按照权利要求17的方法，其中克隆人直肠瘤细胞为HRT-E6，命名为ATCC CRL 12478。
19.增殖牛呼吸道冠状病毒(BRCV)的方法，通过使病毒在组织培养物上生长至数量足以使牛抵御牛呼吸道(BECV)疾病或者足以鉴定用于制备亚单位或重组产物的BRCV或BECV的分子结构来进行，该方法包括将BRCV接种到属于克隆人直肠瘤细胞(cHRT)的组织培养物上，然后收获生长的病毒。
20.权利要求19的方法，其中克隆人直肠瘤细胞为HRT-E6，命名为ATCCCRL 12478。
21.增殖牛肠道冠状病毒的方法，通过使病毒在组织培养物上生长至数量足以使牛抵御牛呼吸道冠状病毒疾病和牛肠道冠状病毒疾病或者足以鉴定用于制备亚单位或重组产物的BRCV或BECV的分子结构来进行，包括将BECV接种到属于克隆人直肠瘤细胞(cHRT)的组织培养物上。
22.权利要求21的方法，其中克隆人直肠瘤细胞为HRT-E6，命名为ATCCCRL 12478。
23.生长和分离BRCV或BECV的方法，包括接种存在于组织细胞培养基和任选存在的生长营养物质中的cHRT细胞，保持温度在30-38℃之间培养接种的细胞。
24.制备亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：
a.在含有组织培养基的容器表面或悬浮液中增殖高敏感细胞，达到可接受的活细胞数量；
b.用BRCV或BECV接种所述高敏感细胞，制备感染的细胞培养物；
c.在30-38℃培养所述感染细胞培养物，直至产生可接受的CPE；
d.通过将得到的感染细胞培养物转移到收集容器中，进行收获；
e.从培养基中分离感染细胞；
f.在制备去污剂-缓冲系统的含有去污剂的缓冲系统中，或者在制备有机溶剂-缓冲系统的有机溶剂中重悬浮分离出的感染细胞；
g.控制温度在4-37℃之间混合所述去污剂-缓冲系统或者所述有机溶剂-缓冲系统，以制备亚单位悬浮液；
h.任选重复步骤e到g；
i.任选纯化所述亚单位悬浮液，以制备纯化亚单位；
j.在所述亚单位或所述亚单位悬浮液中加入佐剂。
25.按照权利要求24的方法，其中所述去污剂选自IGEPAL CA-360、Triton-X100和十二烷基硫酸钠。
26.按照权利要求24的方法，其中所述有机溶剂选自醇、酯和醚。
27.按照权利要求24的方法，其中所述缓冲系统选自盐和有机化合物。
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