CN118480515A - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒nadc30病毒株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒株及其应用。具体地公开了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26423。本发明的病毒株可在Marc145细胞上良好增殖，培养毒价高，具备高免疫原性和良好的遗传稳定性，利用其制备的灭活疫苗免疫原性高、安全可靠、更加高效且免疫持久，可诱导机体产生高水平的抗体，达到100%的强毒攻击保护，免疫的持续期可达到7个月。本发明病毒株还可用于检测评价病毒抗体、制备感染模型、开发新的诊断策略和/或治疗策略等，具有广泛的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒株及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus NADC30，PRRSV NADC30），单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球型，直径为55～60纳米，有2个血清型，我国分离到的毒株为美洲型。近年来，我国猪场流行的NADC30毒株与美国报道NADC30毒株遗传关系相近。该毒株与国内流行的其他亚群毒株（经典PRRSV、HP-PRRSV或疫苗毒株）发生重组，经遗传变异产生了一类新病毒，国内学者将这类病毒统称为PRRSV NADC30毒株，该毒株已经成为PRRSV主要流行毒株。母猪感染后，表现为流产，仔猪感染后出现严重的呼吸道症状等，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。
预防PRRSV NADC30感染最有效的手段是接种疫苗，目前PRRSV NADC30在我国研究处于起步阶段，尚无此种疫苗和诊断制品上市销售，亟需开发针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何有效地预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染引起的疾病。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒株，所述病毒株为PRRSV NADC30株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26423。
本发明还提供了一种预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗，所述疫苗包含所述病毒株PRRSV NADC30株。
进一步地，所述病毒株PRRSV NADC30株是灭活的。
进一步地，所述疫苗还可包含佐剂。
所述疫苗可为灭活疫苗。
所述佐剂可包括生物性佐剂、植物佐剂、无机化合物类佐剂、人工合成佐剂、有机佐剂、弗氏佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂和无油佐剂等但不限于此。
进一步地，所述佐剂可为605佐剂。本文所述605佐剂的组成可为：磷酸氢二钠3.5g、磷酸二氢钾0.6 g、氯化钠7 g、海藻糖7 g、黄芪多糖7 g、谷氨酸钠3 g、明胶13 g、聚乙二醇3000 7 g，葡聚糖3 g，1000 ml注射用水。
进一步地，所述疫苗还可包含药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、防腐剂、稳定剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂、润滑剂、烟雾化剂、悬浮剂、增塑剂和分散剂。
进一步地，所述疫苗还可包含保护剂。
所述保护剂可包括二甲基亚砜（DMSO）、复合物（如脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清和甲基纤维素等）、糖类（如蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖等）、盐类（如乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵和硫代硫酸钠等）、醇类（如山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇和木糖醇等）、酸类（如柠檬酸、酒石酸和氨基酸等）以及聚合物（如葡聚糖、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等）但不限于此。
所述疫苗的剂型可为滴鼻剂或注射制剂（如注射液或注射用粉针剂）。
进一步地，所述疫苗的活性成分可为经过灭活的PRRSV NADC30株。
进一步地，所述疫苗中的病毒（PRRSV NADC30株）以大于106.0TCID50/ml、106.5TCID50/ml、107.0TCID50/ml、107.5TCID50/ml、108.0TCID50/ml、108.5TCID50/ml或109.0TCID50/ml的毒价（滴度）存在。
进一步地，所述疫苗中的病毒含量（PRRSV NADC30株的含量）可为106.0～7.0TCID50/ml、106.0～7.5TCID50/ml、106.0～8.0TCID50/ml、106.0～8.5TCID50/ml、106.0～9.0TCID50/ml、107.0～ 8.0TCID50/ml、107.0～8.5TCID50/ml、107.0～9.0TCID50/ml、108.0～8.5TCID50/ml或108.0～9.0TCID50/ml。
本发明还提供了一种制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
A1）培养所述病毒株PRRSV NADC30株，获得病毒培养液；
A2）将所述病毒培养液灭活，获得灭活的病毒培养液；
A3）将所述灭活的病毒培养液与佐剂混合，获得所述疫苗。
上述方法中，A1）中所述培养的方法包括：将所述病毒株PRRSV NADC30株接种于细胞、鸡胚、组织或动物中进行培养。
进一步地，A1）中所述培养的方法可包括：将所述PRRSV NADC30株接种于细胞中进行培养。
进一步地，所述细胞是可以用于病毒繁殖的动物细胞，包括传代细胞、原代细胞和二倍体细胞。
进一步地，所述细胞可选自PK-15（PK15）细胞、IBRS-2细胞、Vero细胞、Marc-145（Marc145）细胞、CHO细胞、COS细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、Hela细胞、293细胞、BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、WI-38细胞、TCMK细胞、MRC-5细胞、BHK细胞和鸡胚细胞。
进一步地，A2）中所述灭活的方法可使用本领域技术人员熟知的物理或化学方法进行灭活，例如可采用常见的灭活剂如甲醛溶液、烷化剂（如乙酰基乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEI）和缩水甘油醛（GDA））以及β-丙酰内酯等进行灭活。
进一步地，A2）中所述灭活的方法可包括：将二乙烯亚胺（BEI）与A1）中所述病毒培养液混合进行病毒灭活，最后混合液中添加硫代硫酸钠终止灭活。
进一步地，所述病毒培养液中所述PRRSV NADC30株的毒价大于等于107.0TCID50/ml、107.5TCID50/ml、108.0TCID50/ml、108.5TCID50/ml或109.0TCID50/ml。
进一步地，所述病毒培养液中所述PRRSV NADC30株的毒价大于等于108.0TCID50/ml。
上述方法中，所述佐剂可为生物性佐剂、植物佐剂、无机化合物类佐剂、人工合成佐剂、有机佐剂、弗氏佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂或无油佐剂。
上述方法中，所述佐剂可为605佐剂，所述605佐剂的组成可为：磷酸氢二钠3.5 g、磷酸二氢钾0.6 g、氯化钠7 g、海藻糖7 g、黄芪多糖7 g、谷氨酸钠3 g、明胶13 g、聚乙二醇3000 7 g，葡聚糖3 g，1000 ml注射用水。
进一步地，A3）中所述灭活的病毒培养液与佐剂混合的体积比可为2∶1。
进一步地，A1）中所述培养的方法可包括：将所述PRRSV NADC30株接种于Marc145细胞中进行培养。所述培养的培养基可为DMEM细胞维持液，所述DMEM细胞维持液可以是含青霉素200单位/ml、链霉素200 μg/ml和20 ml/L胎牛血清的DMEM培养基。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒培养液的制备方法包括：将PRRSV NADC30株用DMEM细胞维持液进行1∶10稀释，然后将稀释的病毒液按0.1 MOI接种于Marc145悬浮细胞，置37℃含5% CO2细胞摇床培养箱或生物反应器中培养2~3日，收获细胞培养物，细胞培养物中病毒含量测定为107.0~8.0TCID50/ml，均可以作为制备疫苗用抗原。
在本发明的一个实施方案中，将细胞培养物采用二乙烯亚胺（BEI）进行灭活，即加入2%（体积占比）的0.1 mol/L的BEI溶液，边加边搅拌，使其充分混合，37℃搅拌20~24小时灭活，然后加入过滤除菌的1 mol/L硫代硫酸钠溶液至灭活病毒液中，使硫代硫酸钠的终体积为加入BEI溶液体积的30%，充分混匀，进行灭活阻断，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒灭活液。
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有所述病毒株PRRSV NADC30株或其抗原物质。
所述试剂盒可用于检测受试者（或患者）血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30特异性抗体，进而用于诊断或辅助诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染引起的疾病。例如，可基于抗原抗体特异性结合的免疫学技术原理检测或诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的感染。
所述抗原物质可包括所述PRRSV NADC30株的组成成分，如通过加工提取得到的病原体的蛋白或多糖成分；所述抗原物质还可包括含有所述PRRSV NADC30株的培养物（如细胞培养物）。本领域技术人员熟知如何从本发明所述的病原体PRRSV NADC30株制备其抗原物质，例如所述抗原物质可通过稀释、浓缩或提取步骤获得，或者构建含有SEQ ID No.1所示DNA分子的重组载体或重组细胞。
所述试剂盒可为检测试剂盒，进一步地，所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒但不限于此。
所述试剂盒的检测样本可为血液样本（如全血、血浆、血清）、组织样本或细胞样本但不限于此。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
所述试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，组分的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明还提供了所述病毒株PRRSV NADC30株在下述任一项中的应用：
B1）在制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
B2）在制备用于在受试者中诱导针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒的特异性免疫应答的产品中的应用；
B3）在筛选和/或制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体中的应用；
B4）在检测和/或评价猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体中的应用；
B5）在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体检测试剂中的应用；
B6）在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染细胞模型或动物模型中的应用。
本文所述疫苗可为灭活疫苗。
进一步地，B3）中所述筛选和/或制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体的方法可以是以所述病毒株PRRSV NADC30株为免疫原筛选和/或制备抗体。
进一步地，所述制备抗体的方法可包括：利用所述病毒株PRRSV NADC30株免疫动物，从免疫后的动物获得所述抗体。
所述抗体可包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或单域抗体。
进一步地，所述动物可包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、犬、兔、鸡、猫、羊、牛、马、猴、羊驼等但不限于此。
进一步地，所述筛选抗体的方法可包括：将候选抗体药物与所述病毒株PRRSVNADC30株或其抗原物质接触，并测定所述病毒株的活力或毒价。
进一步地，B4）中所述检测和/或评价猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体的方法可包括：利用本发明所述PRRSV NADC30株或本发明任一所述试剂盒对待测样本进行检测或定量检测，进而可以检测待测样本中是否存在猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体，和/或，评价猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体的效价、活性、亲和力等。
抗原抗体反应是免疫学检验技术的核心与基础。本领域技术人员所熟知的是，基于抗原抗体特异性结合的原理，用已知的抗原检测分析特异性抗体，可以用于协助临床诊断、疗效观察、预后判断及预防接种效果的观察等。在传染病的流行病学调查中也具有特殊的、重要的意义。利用已知抗原检测抗体的方法均为本领域技术人员所熟知，如沉淀反应、凝集试验、荧光免疫技术、放射免疫技术、酶免疫技术、化学发光免疫分析技术，以及POCT（point-of-care testing）相关的免疫检测技术（如胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术）等。
B6）中所述细胞模型或动物模型可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染致病机制的研究、抗病毒药物筛选、开发新的诊断策略和/或治疗策略，以及疫苗免疫保护效果评价等方面。
B2）中所述产品可为试剂、制剂、药物、药物组合物或试剂盒。
本文所述病毒株PRRSV NADC30株的结构蛋白（GP5蛋白）编码基因（GP5基因）的核苷酸序列可如SEQ ID No.1所示。GP5蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID No.2所示。
本发明筛选获得了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒株PRRSV NADC30株，并提供了利用该病毒株制备灭活疫苗的方法。本发明的病毒株可在Marc145细胞上良好增殖，培养毒价高，具备高免疫原性和良好的遗传稳定性，利用该病毒株制备的灭活疫苗免疫原性高、安全可靠、更加高效且免疫持久，对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染有很好的免疫保护效果，可诱导机体产生高水平的抗体，达到100%的强毒攻击保护，并且免疫保护期长，免疫的持续期可达到7个月。此外，本发明的病毒株还可用于筛选、制备、检测和/或评价猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体，以及用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染细胞模型或动物模型，进而用于猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染致病机制的研究、抗病毒药物筛选、开发新的诊断策略和/或治疗策略，以及疫苗免疫保护效果评价等方面，具有广泛的临床应用价值。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
术语“佐剂（adjuvant）”通常是指预先或与抗原同时注入体内可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。所述佐剂可用于疫苗成分，增强人体及动物抗体水平，也可作为非特异性免疫增强剂，用于抗肿瘤与抗感染的辅助治疗。所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：生物性佐剂如卡介苗（BCG）、短小棒杆菌（CP）、脂多糖（LPS）、细胞因子（如GM-CSF）、霍乱毒素（CTX）、大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）和植物佐剂（如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖（如茯苓多糖）、糖脂和植物血凝素）；无机化合物类佐剂如铝佐剂（如氢氧化铝和磷酸铝）和钙佐剂（如碳酸钙）；人工合成佐剂如CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）、多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和左旋咪唑。有机佐剂如矿物油；脂质体如免疫刺激复合物（ISCOM）；弗氏佐剂如弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）。CFA含有灭活的结核分枝杆菌（BCG）和矿物油，可增强机体的体液和细胞免疫应答。IFA仅含矿物油成分，可增强机体的抗体应答。CFA和IFA是动物实验中最常用的佐剂。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。
术语“毒价”也称为毒力或滴度，意在指示病毒感染力。例如，以感染发病作指标，毒价（滴度）可用组织细胞培养半数感染量（TCID50）表示。
术语“灭活”通常是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性。被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗。用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂。
术语“灭活疫苗”通常是指用免疫原性强的病原微生物或其代谢产物，接种于动物、鸡胚、组织或细胞中生长繁殖后，经灭活处理使其失去致病力，但仍保留免疫原性而制成的生物制剂。
保藏说明
参椐的生物材料（株）：PRRSV NADC30
建议的分类命名：猪繁殖与呼吸综合征病毒
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年06月05日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26423
附图说明
图1为本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株CGMCC No.26423 接种Marc145细胞致细胞病变（CPE）观察；其中，图1中A为接毒的Marc145细胞；图1中B为正常的Marc145细胞。
图2为本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV NADC30株CGMCC No.26423毒株的PCR检测结果；其中，凝胶电泳加样顺序依次为：泳道1~5：分别为猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株CGMCC No.26423毒株F1、F3、F5、F7、F10代PCR鉴定结果；泳道6：为猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV NADC30株病毒阳性对照；泳道7：阴性对照（水），M表示Marker，由上到下依次为2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用试剂和材料如下：
凝胶成像系统（型号：Tanon 1600R）购自北京原平皓生物技术有限公司；
PCR仪（型号：Mastercycler）购自Eppendorf公司；
核酸蛋白电泳仪（型号：DYY-6C）购自北京市六一仪器厂；
DL 2000 DNA Marker（货号：3427A）、DL 10000 DNA Marker（货号：3584A）购自大连宝生物工程有限公司；
EasyPure Viral DNA/RNA Kit 病毒DNA/RNA纯化试剂盒（货号：ER201-01）、RT-PCR试剂盒（货号AE411-02）购自北京全式金生物技术有限公司；
Marc145（Monkey Kidney cell）细胞购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏中心（CVCC），CVCC编号CL32，细胞经本公司驯化为纯悬浮细胞；DMEM培养基（货号：12100046）和0.25% Trypsin-EDTA（1×）胰酶（货号：25200072）购自Gibco公司；
胎牛血清（货号：BS-1101）购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
下述实施例中的细胞维持液为DMEM细胞维持液，即含青霉素200单位/ml、链霉素200 μg/ml和20 ml/l胎牛血清的DMEM培养基。
实施例1、猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的分离鉴定
1.1、猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离
1.1.1、病料的处理
将采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒患病猪的肺组织放入运输培养液中（含1000单位/ml青霉素、1000 μg/ml链霉素和20%胎牛血清的DMEM培养基），4℃保存过夜。然后10000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜进行过滤除菌，获得的病料滤液用于接种Marc145细胞。
1.1.2、病毒的分离与传代
将上述处理后的病料滤液1 ml接种至已长满单层处于对数生长期的Marc145细胞中，37℃吸附2 h，间隔30 min轻轻摇动1次，使病料滤液与细胞充分接触。吸附后倾去液体，用PBS轻洗2遍，然后加入DMEM维持液（含青霉素200单位/ml、链霉素200 μg/ml和20 ml/l胎牛血清的DMEM培养基），于37℃、5% CO2培养箱中培养48~72小时，收获。按照此方法连续传5代，将收获的细胞培养物-70℃反复冻融2次后4000 r/min离心15 min，取上清-70℃保存备用，取样检测病毒含量。将病毒液接种Marc-145细胞进行病毒含量检测，待细胞长到单层，用0.1%胰酶消化长成单层的Marc-145细胞，将细胞悬液接种到96孔板上，100 μl/孔，待细胞长成单层后，弃去孔内培养基；每孔各加入100 μl用细胞维持液10倍倍比稀释的病毒液（10-1～10-8），每个稀释度重复4个孔，设正常Marc-145细胞为对照，37℃、5% CO2培养箱中培养72 h，通过倒置生物显微镜观察细胞病变，记录细胞病变的孔数和未有细胞病变的孔数，并用Reed- Muench法计算病毒TCID50。结果如图1所示，接种病毒的Marc145细胞可见特异性的细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），表明Marc145细胞感染病毒，且该病毒可以在Marc145细胞上增殖。
1.2、猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的PCR鉴定
1.2.1、病毒PCR检测
根据Genbank上发表的PRRSV GP5蛋白的基因序列，DNAStar比对所有PRRSV GP5蛋白基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0在保守区设计2条引物，预计扩增产物为599 bp，引物序列如下表1。
表1、PRRSV PCR引物序列及扩增目的片段大小
提取病毒RNA：取200 μl病毒细胞培养物，采用EasyPure Viral DNA/RNA Kit病毒DNA/RNA纯化试剂盒（全式金公司产品，货号：ER201-01）提取病毒RNA，置-70℃冰箱备用。
RT-PCR反应于20 μL体系中进行：2×onestep reaction mix 10 μl；ES onestepmix 0.4 μl；上下游引物（浓度均为10 pmol）各1 μl；RNA 2 μl；Rnase free water 5.6 μl，共计20 μl体系。
反应条件：98°C 30 s；98°C 10 s，58°C 10 s，72°C 30 s，30个循环；72°C 2 min。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳鉴定。PCR产物于4℃ 保存。取反应产物5μl，加入适量的上样缓冲液，混匀后于1%琼脂糖凝胶（golden view 浓度为5 μl/100 mL）中120V电压下电泳30 min，电泳结束后取出凝胶，凝胶成像仪中观察结果。结果显示扩增出一条大小约为599 bp的特异性条带，并将PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序分析，测序结果表明获得的特异性条带是核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子。该DNA分子为猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的GP5基因序列，编码猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的GP5蛋白，GP5蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.2。将该DNA分子的核苷酸序列与NCBI已发表的序列进行基因比对，与现有猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的GP5蛋白的编码基因的同源性可达99.3%，结果表明上述病毒细胞培养物中的病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30，PRRSVNADC30）。
实施例2、病毒传代培养及毒价和毒力的测定
2.1、病毒的增殖培养
将分离株以0.1 MOI接种Marc145单层细胞培养48~72小时，收获，作为F1代。收获后的病毒液按照《中国兽药典》三部附录方法进行无菌检验、外源病毒检验、特异性、病毒毒价测定系列检验，选取毒价高、纯净的分离株进行冻存保种。研究最终筛选出一株PRRSVNADC30病毒株，命名为PRRSV NADC30株，作为备用种毒，然后采用PRRSV NADC30株进行细胞连续传代，让病毒更好的适应细胞增殖，提升病毒含量（毒价）。将种毒连续传代至F10代，每个代次的病毒收获量至少100 ml，收获的病毒置-70℃保存。同时将连续传代后的病毒进行PCR检测，均可扩增到特定的目的条带，结果见图2。
本发明筛选获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株（第5代）已经于2023年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.26423，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该毒株在本文中又称猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423，也简称为PRRSV NADC30株。
2.2、毒价测定
将驯化后的病毒标记为F1代，连续传代10代，检测病毒含量。将病毒液接种Marc-145细胞进行病毒含量检测，待细胞长到单层，用0.1%胰酶消化长成单层的Marc-145细胞，将细胞悬液接种到96孔板上，100 μl/孔，待细胞长成单层后，弃去孔内培养基；每孔各加入100 μl用细胞维持液10倍倍比稀释的病毒液（10-1～10-8），每个稀释度重复4个孔，设正常Marc-145细胞为对照，37℃、5% CO2培养箱中培养72 h，通过倒置生物显微镜观察细胞病变，记录细胞病变的孔数和未有细胞病变的孔数，并用Reed- Muench法计算病毒TCID50。驯化前的病毒毒价最高106.33TCID50/ml，采用Marc145悬浮细胞培养最高为108.0TCID50/ml。其毒价比病毒经驯化前的毒价可提升10倍以上。
2.3、毒力测定
对第3代病毒培养物进行毒力测定。毒力用最小感染量（MID）表示，即将病毒采用细胞培养液进行10倍倍比稀释至10-6，取10-4，10-5，10-63个稀释度各采用滴鼻的方法接种49~56日龄PRRSV抗体、抗原均阴性的仔猪（购自河北省保定市满城区诚信养殖场），每头猪接种剂量为5 ml，每组5头，攻毒后连续观察14日，分别于攻毒后7、10、14日采血进行病毒血症检测，参照实施例1中1.2所示的方法进行病毒PCR检测，计算PRRSV病毒的最小感染量（MID）。结果表明PRRSV的MID为5×106.0TCID50/头。
实施例3、猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30灭活疫苗的制备及检验
3.1、病毒的繁殖
将猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423第3代病毒种子用DMEM细胞维持液（含青霉素200单位/ml、链霉素200 μg/ml和20 ml/l胎牛血清的DMEM培养基）进行1∶10稀释，然后将稀释的病毒液按0.1 MOI接种于生长良好的Marc145悬浮细胞，置37℃含5% CO2细胞摇床培养箱中培养2~3日收获细胞培养物，病毒含量测定为107.0~ 8.0TCID50/ml，均可以作为制备疫苗用抗原。
3.2、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒灭活
将上述细胞培养物采用二乙烯亚胺（BEI）进行灭活，即加入2%的0.1 mol/L的BEI溶液，边加边搅拌，使其充分混合，37℃搅拌20~24小时灭活，然后加入滤过除菌的1 mol/L硫代硫酸钠溶液至灭活病毒液中，使其硫代硫酸钠的终体积为加入BEI溶液体积的30%，充分混匀，进行灭活阻断，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒灭活液，置2～8℃保存。灭活的病毒液取样进行无菌检验和灭活检验，检验合格后用于疫苗配制。无菌检验按照《中国兽药典》三部附录中的方法进行；灭活检验方法为将猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒灭活液接种Marc145单层细胞2瓶，吸附1小时后弃去病毒液，补加病毒灭活液10倍体积的维持液，37℃培养3日，收获细胞培养液再按同样方法盲传1代，接种Marc145细胞检测不出现特异性细胞病变（CPE）判为合格。
其中，0.1 mol/L的BEI溶液是采用0.2 mol/L 2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA，购自上海尤恩化工有限公司）和0.4 M的氢氧化钠溶液等体积混合，置37℃水浴中，每10分钟震摇一次，作用60分钟，制备成终浓度为0.1 M的BEI（二乙烯亚胺）溶液，经无菌过滤后使用。
3.3、疫苗制备
将检验合格的猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒灭活抗原根据灭活前的毒价测定结果，分别稀释到106.0TCID50/ml和107.0TCID50/ml，然后分别与公司自制的专利佐剂（605佐剂）以2∶1比例（体积比）混合，以100～300 r/min搅拌30分钟，充分混合均匀。其中605佐剂（即605无油佐剂）在已经授权的专利ZL201310018498.X中公开，本申请中所用配方为：磷酸氢二钠3.5 g、磷酸二氢钾0.6 g、氯化钠7 g、海藻糖7 g、黄芪多糖7 g、谷氨酸钠3 g、明胶13 g、聚乙二醇3000 7 g，葡聚糖3 g，1000 ml注射用水。
试验共制备三组疫苗，如表2所示。
表2、疫苗制备试验分组表
3.4、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗的安全性
将1号苗、2号苗和免疫对照组疫苗分别经颈部肌肉注射14~21日龄健康仔猪5头（购自河北省保定市满城区诚信养殖场），每头4.0 ml，连续观察14日，未出现猪繁殖与呼吸综合征病毒临床症状或因注射疫苗引起的局部和全身不良反应。
3.5、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗的效力
如表3所示，采用14~21日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体抗原阴性健康仔猪20头（购自河北省保定市满城区诚信养殖场），其中5头仔猪颈部肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株灭活疫苗1号苗，1.0 ml/头，5头仔猪颈部肌肉注射2号苗，1.0 ml/头，5头仔猪颈部肌肉注射免疫对照组疫苗，2.0 ml/头，免疫后21日分别以同样剂量加强免疫一次，对照组注射Marc145细胞冻融物。二免后14日采血，分离血清，按照《中国兽药典》附录中和试验法检测血清中中和抗体；同时进行攻毒保护试验，15头免疫仔猪连同5头对照仔猪分别滴鼻感染猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423株病毒5×106.0TCID50/头。攻毒后连续观察14日，分别于攻毒后7日、10日、14日采血检测病毒血清，检测引物和方法同实施例1中“1.2、猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30的PCR鉴定”。试验分组见表3。
表3、PRRSV NADC30株病毒灭活疫苗效力试验分组
血清中和抗体效价测定方法为血清中和试验（固定病毒稀释血清法），具体操作如下：
（1）准备工作
a. 血清灭活：待检血清检测前均于56℃水浴中灭活30分钟，分装冻存；
b. 细胞制备：采用96孔板细胞培养板培养Marc145细胞至长满单层；
c. 工作抗原的制备：将已知毒价的病毒用细胞基础培养液（Gibco公司产品，货号：12100046）稀释成200 TCID50/ml。
（2）操作方法
a. 取48孔细胞培养板，每孔加入细胞基础培养液200 μl；
b. 分别取待检血清和阳性血清各200 μl，加入第一列的对应孔中，充分混合，然后吸取200 μl加入第2孔，混合后再吸取200 μl加入第3孔，以此类推稀释至第8孔，混合后吸取200 μl弃去；
c. 向以上各孔中每孔加入200 μl工作抗原，充分混合后，置37℃作用1小时。
d. 取96孔板培养的生长良好单层的Marc145细胞，弃去细胞培养液，用0.01 mol/L PBS洗涤1～2次；
e. 细胞孔每孔加入中和后病毒液100 μl，每个稀释度重复4孔，置37℃，含5% CO2细胞培养箱中吸附1小时后，每孔补加100 μl细胞维持液，继续培养4日，间接免疫荧光法（IFA法）测定中和抗体效价；
f. 同时对工作抗原进行病毒回归滴定，即将工作抗原稀释成100 TCID50、10TCID50、1 TCID50，每个稀释度加4孔，每孔100 μl，然后每孔补加100 μl细胞维持液，37℃作用1小时后，全部移入长成良好单层Marc145细胞的96孔板中，置37℃、含5% CO2培养箱中培养继续培养4日，进行TCID50测定；
g. 对照设置：阳性血清对照组同待检血清同时进行效价测定，阴性血清对照做4孔，病毒对照做4孔，正常细胞对照做8孔。
（3）结果判定
标准阳性血清中和抗体效价应不低于1∶32；阴性血清和病毒对照各孔均应出现CPE；工作抗原回归滴定，病毒含量应在30～300 TCID50之间；正常细胞对照孔细胞应无CPE。按现行《中国兽药典》三部附录Reed-Muench法计算待检血清的中和抗体效价。
通过中和抗体检测结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423株制备的疫苗可诱导产生高水平的抗体结果。采用纯化和驯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423制备的疫苗，免疫接种剂量为1.0ml时，可达到病毒在纯化、驯化前（第一代）免疫接种剂量为2.0 ml时相同的抗体水平和攻毒保护率，表明猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423培养毒价更高，免疫原性更好。具体数据结果如表4。
攻毒后连续观察14日，每日测量体温，观察记录临床症状，并于攻毒后7、10、14日采血，参照实施例1中1.2所示的方法进行病毒PCR检测，综合体温（体温升高超过40.5℃，且至少持续2日）、临床症状（出现精神萎靡、饮食减退等症状）和病原检测（排毒检测）综合指标评价，其攻毒保护率可达到4/5以上，即产生80%以上的强毒攻击保护，结果见表4。结果表明：猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV NADC30株病毒CGMCC No.26423毒株可诱导产生高水平的抗体，同时可产生100%的强毒攻击保护。
表4、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗效力研究结果
注：第3-5列中，分数的分子为判为发病未保护的头数。
实施例4、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗抗体持续期研究
采用14~21日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体抗原阴性健康仔猪（购自河北省保定市满城区诚信养殖场），分为2组。组1为本发明所述疫苗免疫组（2号苗），颈部肌肉接种本发明疫苗1.0 ml，免疫后21日加强免疫一次，组2为Marc145细胞冻融物免疫对照组。分别于免二后1个月、3个月、5个月、7个月采血测定中和抗体效价。结果如表5所，表明免后3个月猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平达到最高，至免后7个月抗体仍可维持较高水平。抗体持续期结果见表5。
表5、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗抗体持续期研究
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒株，其特征在于，所述病毒株为PRRSVNADC30株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.26423。
2.一种预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述的病毒株。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述病毒株是灭活的。
4.根据权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含佐剂。
5.一种制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1）培养权利要求1所述的病毒株，获得病毒培养液；
A2）将所述病毒培养液灭活，获得灭活的病毒培养液；
A3）将所述灭活的病毒培养液与佐剂混合，获得所述疫苗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，A1）中所述培养的方法包括：将权利要求1所述的病毒株接种于细胞、鸡胚、组织或动物中进行培养。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述佐剂为生物性佐剂、植物佐剂、无机化合物类佐剂、人工合成佐剂、有机佐剂、弗氏佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂或无油佐剂。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于，所述佐剂为605佐剂，所述605佐剂的组成为：磷酸氢二钠3.5 g、磷酸二氢钾0.6 g、氯化钠7 g、海藻糖7 g、黄芪多糖7 g、谷氨酸钠3 g、明胶13 g、聚乙二醇3000 7 g，葡聚糖3 g，1000 ml注射用水。
9.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的病毒株或其抗原物质。
10.权利要求权利1所述的病毒株在下述任一项中的应用：
B1）在制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染或猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
B2）在制备用于在受试者中诱导针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30病毒的特异性免疫应答的产品中的应用；
B3）在筛选和/或制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体中的应用；
B4）在检测和/或评价猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体中的应用；
B5）在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30抗体检测试剂中的应用；
B6）在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30感染细胞模型或动物模型中的应用。
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