KR0142081B1

KR0142081B1 - 개의 코로나 바이러스 백신

Info

Publication number: KR0142081B1
Application number: KR1019900006177A
Authority: KR
Inventors: 바센다일 윌리암; 스튜어트 케네디 차머즈 윌리암
Original assignee: 에프.게.엠 헤르만, 아.게.제이 베르메렌; 악조 엔.브이.
Priority date: 1989-05-03
Filing date: 1990-05-01
Publication date: 1998-06-01
Also published as: AU5474190A; HU902644D0; ES2068322T3; CA2015828A1; JP2892767B2; KR900017611A; EP0396193B1; AU630186B2; ZA903142B; DE69014974T2; CA2015828C; DE69014974D1; HU214739B; US5232694A; HUT56287A; US5464621A; EP0396193A1; JPH02295934A; DK0396193T3; NZ233509A

Abstract

내용없음

Description

개의 코로나 바이러스 백신

본 발명은 개의 코로나 바이러스 감염으로부터 감수성인 동물을 보호하는 백신, 신규의 항원형을 지닌 개의 코로나 바이러스, 이러한 백신을 제조하는데 상기 신규한 바이러스를 사용하는 용도뿐 아니라 개의 코로나 바이러스 감염으로부터 감수성인 동물들을 보호하기 위해 상기 백신을 사용하는 것에 관한 것이다.

코로나 바이러스는 독자적인 바이러스 속으로 분류된다. 이 속에 속하는 바이러스는 인간을 포함한 다양한 종의 동물을 감염시키는 것으로 알려져 있다.

이들 바이러스는 위장염(돼지, 칠면조, 마우스, 송아지, 개, 고양이, 및 인간에서), 타액선 감염증(설치류에서), 호흡계 질환(인간, 돼지, 조류, 및 개에서) 및 뇌염(어린 새끼 돼지에서) 등의 다양한 질환을 일으킨다.

코로나 바이러스 속중에서도 별도의 항원성 군(cluster)을 형성하는 바이러스 그룹이 있다. 고양이에게 감염을 일으킬 수 있는 복막염 바이러스(FIPV) 및 고양이의 장염 바이러스(FEV), 전달성 위장염 바이러스(TGEV) 및 돼지의 코로나 바이러스(PCV), 개의 코로나 바이러스(CCV) 및 사람 바이러스 CV229E는 모두 이러한 그룹에 속한다. 상기 항원성 군의 구성원들은, 쥐의 간염 바이러스형 3, 송아지에게 설사를 일으키는 바이러스, 돼지의 혈액 응집성 뇌척수염 바이러스, 사람의 코로나 바이러스 OC43 및 조류에 감염을 일으키는 기관지염 바이러스등과 같은 다른 코로나 바이러스와 교차 반응을 일으키지 않는다.

CCV 는 1971년에 독일에서 군견(軍犬)으로부터 처음 분리되었다. 감염후 나타난 증상으로는 구토, 설사, 식욕부진, 우울증 및 탈수증상이 있다. 특정한 환경(스트레스)에서 사망하는 일도 있고, 코 및 눈의 장애를 포함한 호흡기 질환도 보고된 바 있다. 항체의 발생은 나라마다 다르게 나타난다. 영국에서는 가견(家犬)의 40% 이하가 CCV 에 대한 항체를 지닌 반면 개사육장의 개들은 이 보다 높은 발병율을 지녔다.

고양이와 돼지에 CCV 를 접종하면 감염을 일으킬 수 있지만, 이들 고양이와 돼지에게 CCV 가 일으키는 임상 질환은 없을 것이다. 제제는 구강인두와 배설물로부터 분리될 수 있으며, 항체 반응이 존재한다. 사람, 소 및 마우스가 CCV 에 감수성이 있다는 증거는 없다.

교차 보호 연구에 따르면, 코로나 바이러스들은 서로에 대해 면역을 전혀 유발하지 않거나 거의 유발하지 않는 것으로 입증된 바 있다. 예를 들면, TGEV 또는 FIPV 로 개를 감염시키는 실험을 해도, 그것이 차후의 CCV 감염의 영향으로부터 개들을 보호하지 않는다.

CCV 에 대한 여러 가지 백신들이 개발된 바 있다. 미국에서는 보조제를 함유하는 불활성화된 백신이 사용되고 있다. 약독화된 생백신은 한때 CCV균주에 대해 동물을 보호하는 것으로 알려졌지만, 다가의 백신과 상용성이 없었기 때문에 시장에서 폐기된 바 있다.

놀랍게도, CCV 질환에 걸린 개로부터 신규한 CCV 균주를 분리할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 이러한 신규의 바이러스는 내부 표기에서 IN/SAV/C1 라 칭하였고 프랑스, 파리의 엥스뛰뛰 빠스테르 국립 미생물 배양물 수집소 제 I-743 호로 기탁되었다. 이 바이러스의 특성은 CCV 의 공지된 분리물에 대한 항혈청을 사용하여 중화 테스트하면 거의 중화되지 않는다는데 있다. 하지만, IN/SAV/C1 에 대한 항혈청은 IN/SAV/C1 균주 그 자체뿐 아니라 미국에서 이미 알려진 모든 균주를 높은 역가로 중화한다. 그러므로, 이 CCV의 신규 균주는 지금까지 공지되지 않은 CCV 의 새로운 항원형을 나타내는 것으로 결론낼 수 있다 ; 지금까지 주목할만한 항원형의 변형은 CCV 의 경우 나타나지 않은 것으로 보고되었다.

이러한 발견에 의해, 본 발명에서는 감염되기 쉬운 감수성 동물에 투여하면 CCV 감염의 임상 증상에 대해 상기 동물들을 보호할 수 있는 신규한 백신을 제공하게 되었다. 상기 신규한 백신은 내부 표기가 IN/SAV/C1 인 신규의 CCV 균주 항원형을 지닌 바이러스 균주로 부터 유도된다.

신규의 백신은 개 뿐만 아니라 CCV 감염에 감수성이 고양이 및 돼지와 같은 다른 동물에게도 투여된다.

본 발명의 백신은 살아 있는 생형태(임의적으로는 약독화된 형태) 또는 불활성화된 형태의 바이러스를 함유한다.

약독화 과정은 세포배양물, 바람직하게는 개 또는 고양이종으로부터 얻은 배양물에 바이러스를 연속적으로 계대시킴으로서 수행된다. 각 단계마다, 그전 배양 단계에서 수거한 바이러스를 신선한 세포 배양물을 함유하는 배지에 접종한다.

세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용한다.

생백신 제조에 있어서, 상기와 같이 임의로 약독화된 종자 바이러스는 고양이의 태아 섬유아세포(FEF) 배양물 같은 세포 배양물상에서 증식될 수 있다. 이렇게 증식된 바이러스는 조직 세포 배양액 및/또는 세포를 수집하는 방식으로 수거된다. 임의적으로, 바이러스 수율은 수거시, 증식된 기질에서 감염성 입자들의 방출을 개선시키는 기술, 예를 들면 초음파 기술에 증가될 수 있다. 생백신은 현탁액 형태나 동결 건조 형태로 제조될 수 있다. 동결 건조된 CCV 백신에 하나 이상의 안정화제를 첨가하는 것이 바람직하다. 적합한 안정화제로는 예를 들면 SPGA(Bovarnick의 문헌 참고(1950) J. Bacteriology 59, 509), 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 슈크로즈, 덱스트란, 글루크즈), 단백질(예, 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 생성물, 단백질 함유 물질(예, 소의 혈청 또는 탈지유) 및 완충액(예,알카리금속 인산염)등이다. 임의적으로, 보조제 작용을 갖는 화합물이 하나 이상 첨가될 수 있다. 적합한 보조제로는 알루미늄 히드록사이드, 포스페이트 또는 옥사이드, 광유(예, Bayol F(R), Marcol 52(R)) 및 사포닌이 있다.

바람직하게는 살아 있는 바이러스를 동물에게 투여하여 생후 약 4주 이후의 동물, 특히 5-12 주의 동물을 보호할 수 있다. 어떤 경우에는 예를 들면 생후 6 주 및 10 주째에 백신을 2 회 접종하는 것이 바람직하다. 생백신은 10²-10⁹pfu/투여량의 바이러스를 함유하는 것이 바람직하다.

대안으로서, 본 발명의 백신은 불활성 형태의 CCV 균주를 포함할 수 있다.

본 발명의 불활성화된 CCV 백신은 복제능과 독성 양자가 상실된 바이러스로부터 제조되는데, 일반적으로, 이러한 제법은 화학적 또는 물리적 수단에 의해 수행된다. 화학적 불활성화 방법은 예를 들면 효소, 포름알데히드, β-프로피오락톤 또는 에틸렌이민 또는 이의 유도체, 유기용매(예, 할로겐화된 탄화수소) 및/또는 세정제(예, Tween^(R), 트리톤 X^(R)), 나트륨디옥시콜레이트, 설포베타인 또는 세틸트리메틸암모늄염)으로 바이러스를 처리함으로서 수행된다. 물리적인 불활성화 방법이 더 유리하며, 바이러스를 고-에너지 농축 조사, 예를 들면 UV 조사, 감마선 조사나 X-레이처리 하는 방식으로 수행될 수 있다. 불활성화제를 중화시키는 것이 필요하다면, 예를 들어 포름알데히드-불활성화된 제제는 티오셀페이트로 중화될 수 있다. 필요하다면, 차후에 pH 는 약 7 의 값으로 만든다. 일반적으로, 보조제를 불활성화된 바이러스에 첨가하며, 임의적으로는 Tween^(R), Span^(R)같은 하나이상의 유화제를 첨가한다.

불활성화된 백신은 불활성화전에 측정했을 때 적어도 10⁷pfu/ml 의 바이러스 당량을 함유하는 것이 바람직하다.

불활성화 백신은 생후 약 4주, 특히 생후 5-12 주 동물에게 투여하는 것이 바람직하다. 동물에 2 회에 걸쳐 백신을 접종하는데, 2 회의 접종은 약 4-6 주의 간격을 두고 행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신은 다른 백신과 혼합될 수 있다. 본 발명의 백신은, 개의 파르보(parvo) 바이러스, 개의 아데노(Adeno) 바이러스 1 및 2, 광견병 바이러스, 렙토스피라(Leptospira) 및 보르데텔라 브론치셉디카(Bordetella bronchiseptica)에 대한 하나 이상의 백신들과 함께 투여되는 것이 적절하다.

코로나 바이러스 IN/SAV/C1의 분리

코로나 바이러스 분리물인 IN/SAV/C1 는 중증의 위장염을 앓고 있는 강아지 배설물로부터 얻은 것이다. 이 강아지는 큰 비글종의 혈통으로서 파르보바이러스에 감염된 것으로 의심되는 위장염을 앓고 있었다. 코로나 바이러스를 파르보 바이러스 부재하에 분리하였다.

분리 방법

배설물 시료를 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 PBS 에 넣고 1:10 의 중량/부피 비로 희석하였다. 희석 시료를 완전히 혼합한 뒤 밀리포어 0.22μ필터로 여과시켰다. 0.2ml 의 배설물 상청액을 페트리디쉬에 있는 밀집성 A72 세포 배양물의 세포 시이트상에 놓고 37℃ 에서 1 시간 동안 흡착시켰다. 이후에 페트리디쉬에 5ml 의 유지(maintenance) 배지를 넣었다. 성청액을 6일 후에 수거하고 0.5ml 분량으로 나누어 놓았다. (파르보 바이러스가 감염되었다고 의심되었기 때문에 세포들을 1:4 의 비율로 서브(sub)처리하여 파르보 비루스가 분리되었는지를 살펴보았다. 이후에 상청액을 파르보 비루스에 대해 HA 테스트한 결과 음성으로 나타났다). 페트리디쉬상의 밀집성의 A72 세포 배양액위에서 상청액을 분석하였다.

이때 상청액은 1 플레이트당 0.2ml 이고 하나의 희석 농도당 2 개의 플레이트를 사용하였다. 상청액을 37℃ 에서 1 시간 동안 흡착한 뒤 1 플레이트당 6.5ml 의 아가/중충배지로 중층(overlay)시켰다. 코로나 바이러스 플라크와 유사한 플라크가 나타났으며, 10-3 희석 농도(플라크가 나타나는 최고 희석 농도)에서 얻은 플라크를 수거하였다. 이것을 밀집성 A72 페트리디쉬상에서 37℃ 로 1 시간 동안 흡착시킨 뒤 여기에 5 ml 의 유지 배지를 다시 첨가하였다. 4 일후에 CPE 를 완전하게 시행한 뒤 다시 한 번 상청액을 수거하였다. 이 물질을 175cm²크기의 루(roux) 플라스틱병에 있는 A72 세포상에 계대시켰다.

주(主)

(1) 3 회 계대한 종자 바이러스는 중화 테스트에서 사용된 바이러스이다.

(2) 모든 경우의 상청액은 파르보 바이러스에 대해 음성이었다.

(3) CPE 는 다른 코로나 바이러스의 CPE 와 유사하였다.

(4) 형광 현미경 및 전자현미경은, 분리물이 코로나 바이러스임을 입증했다.

(5) 다른 코로나 바이러스 균주에 대한 양성 및 음성 혈청에 대한 교차 혈청 중화 시험은 플라크 감소법에 따라 수행되었다.

중화 테스트 방법

페트리디쉬상에 밀집된 48시간 동안의 A72 세포들을 사용하여 혈청 중화 테스트를 수행하였다. 혈청 샘플을 PBS 로 희석하는데 최종 희석 농도들은 1/16, 1/64, 1/256 및 1/1024 이었다. 이들은 전술된 분석 결과에 따라 산출된 바이러스 희석 농도였다. 동일량의 바이러스를 상기 희석된 혈청 각각에 첨가했다. 혈청/바이러스를 37℃ 에서 1 시간 동안 항은 배양하였다. 이 테스트에 사용된 바이러스의 희석액으로 구성된 바이러스 대조군(VC)을 상기와 유사하게 처리하였다. 배지를 페트리디쉬로부터 제거하고 0.1ml 의 혈청/바이러스 희석물을 에펜도르프 피펫을 사용하여 각 플레이트상에 놓는데, 이때 하나의 희석물당 2 개의 플레이트를 사용하였고, VC, VC10^-1, 바이러스가 없는 세포 대조군에도 2 개의 플레이트를 사용하였다. 이들 플레이트를 탈기체화된 항온배양기중에서 30 분간 흡착하였다. 이후 각 플레이트를 6.5ml 의 아가/중층배지로 중층시켰다.

플레이트를 5% CO2 로 기체화되고 37℃의, 물이 들어 있는 항온배양기에 넣었다. 감염시킨 후 4 일만에 플라크가 나타났다. 아가를 플레이트로부터 분리해 내고 2.5ml 의 나프탈렌 블랙 염료를 가한 뒤 5-10 분간 방치하고 수도물로 세척했다. 이후에 플라크는 쉽게 판독될 수 있었다. 중화는, 바이러스 대조군과 비교해 볼 때 플라크 수가 90% 까지 감소된 혈청 희석물 경우에 나타났다고 말한다.

항혈청

다양한 바이러스(TGE 제외)에 대한 항혈청을 고양이로부터 제조했다. 바이러스를 코-입 경로로 주입시키고, 감염 후 시간 간격을 두고 채혈하였다. 중화 작용을 나타낸 혈청을 교차 중화 테스트에서 사용하였다.

코-입 경로를 통하여 새끼 돼지를 감염시켜 TGE 항혈청을 제조하였다. 이들 돼지로부터 혈액을 채혈하였다.

[표]

실시예 1

개의 코로나 바이러스 생백신-A

고양이의 태아 섬유아세포로부터 얻은 조직 배양액중에 존재하는 균주 IN/SAV/C1 의 약독화된 생바이러스 1l 당 다음과 성분을 함유하는 동결-건조 안정화제와 혼합한다 :

·74.35g 의 슈크로즈

·0.52g 의 KH₂PO₄

·2.58g 의 Na₂HPO₄·12H₂O

·0.910g의 모노나트륨 글루타메이트

·30ml 의 30%(w/v) 소의 혈청 알부민 용액.

1ml 용량당 바이러스 약 10⁴pfu를 함유하도록 바이알에 상기 혼합물을 넣고 동결 건조한 뒤 바이알을 밀봉한다. 사용전에 증류수를 이용하여 동결 건조 생성물을 원래의 부피로 재구성한다.

실시예 2

개의 코로나 바이러스 생백신-B

개의 A72 세포에서 얻은 조직 배양액중에 균주 IN/SAV/C1 의 약독화된 생바이러스를 실시예(1)에 따른 동결 건조 안정화제와 혼합하고, 약 10⁵pfu의 바이러스를 함유하는 이 혼합물의 1ml 양을 단일 용량 바이알에 넣은 뒤 밀봉한다.

실시예 3

불활성화된 개의 코로나 바이러스 백신

바이러스 IN/SAV/C1(역가 10⁸pfu/ml)로 감염시킨 개의 A72 세포에서 얻은 조직 배양액을 β-프로피온산(최종 농도 1:500)을 첨가하여 불활성화시켰다. pH 를 NaOH(0.1 mol/1)를 사용하여 약 7 로 되게 한다.

상기 물질을 하기의 비율로 보조계와 혼합한다:

·1ml 의 불활성화된 바이러스 감염 조직 배양액

·0.18ml 의 2% 알루미늄 포스페이트 용액

·0.02ml 의 1.2 mol/1 의 글리신버퍼(pH 9)

·130 μg Quil A

이 혼합물을 바이알에 충진시킨다.

Claims

개의 코로나 바이러스 감염의 임상적 영향으로부터 감수성 동물을 보호하는 백신으로서 프랑스공화국, 파리에 소재하는 엥스뛰뛰 빠스떼르 국립 미생물 배양물 수집소에 수탁 번호 제 I-743 호로 기탁된 개의 코로나 바이러스 균주의 항원형을 가진 바이러스 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서,

상기 백신은 프랑스공화국, 파리에 소재하는 엥스뛰뛰 빠스떼르 국립 미생물 배양물 수집소에 수탁번호 제 I-743 호로 기탁된 개의 코로나 바이러스 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 백신.
개의 코로나 바이러스 균주 I-743 호의 혈청형을 가진 개의 코로나 바이러스의 순수한 배양물.
제 3 항에 있어서,

개의 코로나 바이러스 균주 제 I-743 호의 순수한 배양물.
개의 코로나 바이러스 균주 제 I-743 호의 항원형을 가진 개의 코로나 바이러스를 백신 용도에 적합한 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는, 개의 코로나 바이러스 백신을 제조하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항의 백신을 사람을 제회한 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 개의 코로나 바이러스 감염에 대해 감수성이 있는 동물중 사람을 제외한 동물을 보호하는 방법.