JP2892767B2 - イヌコロナウイルスワクチン - Google Patents

イヌコロナウイルスワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イヌコロナウイルス（canine corona viru
s）感染から感受性（susceptible）動物を保護するワク
チン、新規な抗原型イヌコロナウイルス及びこのような
ワクチンの製造への前記ウイルスの使用、並びにイヌコ
ロナウイルス感染から感受性動物を保護するためのこの
ワクチンの使用に関する。
コロナウイルスは独自のウイルス属として分類されて
いる。この属に属するウイルスはヒトを含む多くの種の
動物に感染性であることが知られている。コロナウイル
スは種々の疾患、例えば胃腸炎（豚、七面鳥、マウス、
仔牛、犬、猫及び人）、唾液腺感染症（齧歯類動物）、
呼吸器疾患（人、豚、鳥及び犬）及び脳炎（幼豚）を引
き起こす。コロナウイルス属内には、特有の抗原性クラ
スターを形成する一群のウイルスが見出される。猫のネ
コ感染性腹膜炎ウイルス（FIPV）及びネコ腸炎ウイルス
（FEV）、豚の伝播性胃腸炎ウイルス（TGEV）及びブタ
コロナウイルス（PCV）、犬のイヌコロナウイルス（CC
V）及び人のウイルスCV229Eは全てこの群に属する。こ
の抗原性クラスターのものはマウス肝炎ウイルス３型、
仔牛下痢ウイルス、豚の血液凝集性脳脊髄炎ウイルス、
ヒトコロナウイルスOC43及び鳥の感染性気管支炎ウイル
スのような他のコロナウイルスと交差反応することはな
い。
CCVは1971年にドイツで軍用犬から初めて単離され
た。感染に伴なう徴候には嘔吐、下痢、食欲不振、抑鬱
及び脱水症状を含んでいる。ある環境（ストレス）下で
は死亡することがある。鼻及び眼の障害を含む呼吸器疾
患が報告されている。抗体の発生頻度は国によって異な
る。英国では、家庭用の犬の40％までがCCVに対する抗
体を有しており、一方、養犬場の犬での割合はより高い
ものである。
猫及び豚にCCVを接種すると感染はするが、これらの
種でCCVにより臨床的な疾患が引き起こされることはな
い。口腔咽頭と糞からウイルスを単離することができ、
抗体反応が認められる。ヒト、ウシ及びマウスがCCVに
感受性であるという証拠はない。
交差保護の研究から、コロナウイルスはほとんど（又
は全く）互いに免疫性を誘発しないことが示されてい
る。例えば、実験的に犬をTGEV又はFIPVに感染させて
も、その後のCCV感染の影響から犬が保護されることは
ない。
CCVに対する種々のワクチンが開発されている。米国
では、アジュバントを含有する不活化ワクチンが使用さ
れてきている。弱毒化した生ワクチンは当時知られてい
たCCV株からは動物を保護したが、多価ワクチンと相容
性ではない（imcompatible）ことが示されたので市場か
ら引き上げられた。
驚くべきことに、今回、CCV疾患を有する犬から新規
なCCV株を単離することができた。この新規ウイルスを
内部標記でIN/SAV/C1と称し、Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes of Institut Pasteur
（パリ）に受託番号Ｉ−743で寄託した。このウイルス
の特徴的な性質は、CCVの既知の単離物に対する抗血清
を用いる中和テストにおいて、いかなる程度にも中和さ
れないことである。しかし、IN/SAV/C1に対する抗血清
は、IN/SAV/C1株自身並びに公知のアメリカ株全てを高
い力価まで中和する。従って、CCVのこの新規株はこれ
までに知られていない抗原型のCCVを表わしていると結
論できる。これまでのところ、CCVについては顕著な抗
原性の変異株は報告されていなかった。
この発見から、本発明により、感受性動物に投与する
とこれらの動物をCCV感染の臨床的作用から保護する新
規なワクチンが提供される。この新規なワクチンは内部
標記IN/SAV/C1の新規CCV株の抗原型ウイルス株に由来す
る。
この新規ワクチンは犬だけではなく、猫及び豚のよう
なCCV感染を受けやすい他の動物にも投与しうる。
本発明のワクチンは生きていて適宜弱毒化した形又は
不活化した形のウイルスを含む。
好ましくはイヌ又はネコの種からの細胞の培養物内で
ウイルスを連続継代することにより弱毒化させる。各ス
テップにおいて、前の培養ステップから採取したウイル
スを新しい細胞培養物を含有する培地に接種する。細胞
の培養に関しては当業界で公知の方法を使用しうる。
生ワクチン製造のためには、上記のように適宜弱毒化
した種ウイルスを細胞培養物例えばネコ胎児腺維芽細胞
（FEF）培養物上で増殖させることができる。このよう
に増殖させたウイルスは組織細胞培養液及び／又は細胞
を採集することにより収穫しうる。収穫の間に、適宜、
増殖基質からの感染性粒子の放出を改善する技法、例え
ば超音波処理によってウイルスの収率を高めることがで
きる。生ワクチンは懸濁液の形で製造することができ、
或いは凍結乾燥してもよい。凍結乾燥したCCVワクチン
には１つ以上の安定剤を加えるのが好ましい。好ましい
安定剤は、例えばSPGA（BovarnickがJ.Bacteriology 5
9,509（1950）に記載）、炭水化物（例えば、ソルビト
ール、マンニトール、デンプン、蔗糖、デキストラン、
グルコース）、蛋白質（例えば、アルブミン又はカゼイ
ン）又はその分解産物、蛋白質含有物質（例えばウシ血
清又はスキムミルク）及びバッファ（例えば、アルカリ
金属リン酸塩）である。適宜、アジュバント活性を有す
る化合物を１つ以上加えてもよい。好適なアジュバント
は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
又は酸化アルミニウム、無機油（例えば、Bayol F（登
録商標）、Marcol 52（登録商標））及びサポニンであ
る。
好ましくは、生ワクチンは約４週令からの、より特定
的には５〜12週令の保護すべき動物に投与しうる。場合
によっては、２回、例えば６週令及び10週令時にワクチ
ン接種することが推奨される。
生ワクチンは102〜109pfu/用量のウイルスを含有する
と好ましい。
本発明のワクチンは又、不活化した形のCCV株を含む
ものでもよい。
本発明の不活化した形のCCVワクチンは、複製能と毒
性の両者を失ったワクチンから製造する。一般に、これ
は化学的又は物理的手段で達成しうる。化学的な不活化
は、例えば、酵素；ホルムアルデヒド，β−プロピオラ
クトンもしくはエチレンイミン又はこれらの誘導体；有
機溶媒（例えば、ハロゲン化炭化水素）及び／又は洗剤
（例えば、Tween（登録商標）、Triton X（登録商
標）、デスオキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン
又はセチルトリメチルアンモニウム塩）でウイルスを処
理することにより実施しうる。物理的不活化は、ウイル
スを高エネルギー照射、例えばUV光、γ−照射又はＸ−
線に処することにより有利に実施しうる。必要であれ
ば、不活化したものを中和する。例えば、ホルムアルデ
ヒドで不活化した製剤はチオサルフェートで中和でき
る。必要であれば、次に、pHを約７に戻す。一般に、ア
ジュバントをも不活化したウイルスに加え、適宜１つ以
上の乳化剤、例えばTween（登録商標）及びSpan（登録
商標）を加える。
不活化ワクチンは、好ましくは、不活化前に測定し
て、少なくとも107pfu/mlのウイルス活性（当量）を含
みうる。
好ましくは、不活化ワクチンは、約４週令からの、よ
り特定的には５〜12週令の動物に投与しうる。動物に２
回ワクチン接種するときには、２回のワクチン接種は約
４〜６週間の間隔で行うのが好ましい。
本発明のワクチンは他のワクチンと組合せることがで
きる。好適には、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイ
ルス１及び２、狂犬病ウイルス、レプトスピラ及び気管
支敗血病菌に対するワクチン１つ以上と共に本発明のワ
クチンを投与しうる。
コロナウイルスIN/SAV/C1の単離 コロナウイルス単離物のIN/SAV/C1は重篤な胃腸炎の
仔犬の糞からのものであった。仔犬は大きなビーグル犬
の血統のものであり、パルボが疑われる胃腸炎を起して
いた。パルボウイルスが存在せずにコロナウイルスが単
離された。
単 離 法 糞のサンプルを、ペニシリン及びストレプトマイシン
を含むPBSで1:10（w/v）に希釈した。希釈したサンプル
をよく混合してから、ミリポア0.22μフィルターで過
した。糞の上清0.2mlを、ペトリ皿上の集密的A72細胞培
養物の細胞シートに、37℃で１時間吸着させた。次に、
維持培地5mlをペトリ皿に加えた（refed）。６日後に上
清を収穫し、0.5mlのアリコートを取った。（パルボウ
イルス感染が疑われていたので、パルボウイルスが単離
されうるか調べるために1:4の比で細胞を分割（subbe
d）した。後から、この上清をパルボウイルスについてH
Aテストしたが、陰性であることが判った）。上清をペ
トリ皿上の集密的A72細胞培養物上でアッセイし（プレ
ート当り0.2ml、希釈当りプレート２枚）、37℃で１時
間吸着させ、そしてプレート当り6.5mlの寒天でおおっ
た。コロナウイルスのプラークに類似したプラークが出
現し、10-3希釈（プラークが出現する最高希釈）からの
プラークを採集した。この物質を集密的A72のペトリ皿
に37℃で１時間吸着させ、維持培地5mlを加えた（refe
d）。４日後に完全なCPEが現われ、もう１度、上清を採
集した。これをさらに、プラスチックの175cm2のルーサ
イズのびん中のA72細胞上で継代した。
注 （１）三代継代した種（seed）が中和テストに使用した
ウイルスである。
（２）全例で上清はパルボウイルス陰性であった。
（３）CPEは他のコロナウイルスのCPEと類似していた。
（４）単離物がコロナウイルスであることは蛍光顕微鏡
及び電子顕微鏡観察でも証明された。
（５）他のコロナウイルス株に陽性及び陰性の両者の血
清に対して、交差血清中和テストをプラーク減少法（pl
aque reduction）により実施した。
中和テスト法 ペトリ皿上の集密的48時間A27細胞を使用して血清中
和テストを実施した。血清サンプルをPBSで希釈し、採
集希釈1/16,1/64,1/256及び1/1024とした。以前のアッ
セイ結果に基きウイルスを希釈した。各血清希釈物に等
量のウイルスを加えた。次に、血清／ウイルスを37℃で
１時間インキュベートした。テストに使用したウイルス
希釈物からなるウイルスの対照（VC）も同様に処理し
た。培地をペトリ皿から傾瀉し、エッペンドルフピペッ
トを使って各プレートに血清／ウイルス希釈物0.1mlを
置いた。１希釈物当り２枚のプレートとし、VC、VC10-1
及びウイルスを含まない細胞の対照についてもプレート
２枚とした。脱気したインキュベーター内で30分間プレ
ートを吸着させた。次に、各プレートを１つあたり6.5m
lの寒天でおおった。
プレートを、５％CO2ガス、37℃の水ジャケットイン
キュベータ内に置いた。感染４日後にプラークが現われ
た。寒天をはたき落し、ナフタレンブラック染色剤2.5m
lを加え、５〜10分放置後に流水で洗い落した。その
後、プラークを簡単に読み取ることができた。ウイルス
の対照と比べてプラークの量が90％まで減少したときの
血清希釈において中和が起ったものとした。
抗 血 清 （TGEを除く）種々のウイルスに対する抗血清を猫で
調製した。これを口−鼻経路で注入し、感染後、間隔を
おいて採血した。中和活性を示す血清を交差中和テスト
に使用した。
幼豚を口−鼻経路で感染させてTGE抗血清を調製し
た。次に、これらの豚から採血した。
実施例１ イヌコロナウイルス生ワクチン−Ａ ネコ胎児線維芽細胞からの組織培養液中の株IN/SAV/C
1の生きている弱毒化ウイルスを、１当りに次のもの
を含む凍結乾燥安定剤と混合する： 蔗 糖 74.35g KH2PO4 0.52g Na2HPO4・12H2O 2.58g グルタミン酸一ナトリウム 0.910g 牛血清アルブミン30％（w/v）溶液 30ml ウイルス約104pfuの約1ml用量を含有するバイアル中
で混合物を凍結乾燥し、バイアルを密封する。
使用前に、この凍結乾燥製品を蒸留水で元の容量に戻
す。
実施例２ イヌコロナウイルス生ワクチン−Ｂ イヌA72細胞からの組織培養液中の株IN/SAV/C1の生き
ている弱毒化ウイルスを実施例１の凍結乾燥安定剤と混
合し、各々が約105pfuのウイルスを含有するこの混合物
1mlづつを１回用量用バイアルに入れ、次にこれを密封
する。
実施例３ イヌコロナウイルスの不活化ワクチン ウイルスIN/SAV/C1に感染したイヌA72細胞の組織培養
液（力価108pfu/ml）にβ−プロピオン酸（最終濃度1:5
00）を加えて、不活化する。NaOH（0.1モル／）を加
えてpHを約７に戻す。
この材料に次の割合のアジュバントを混合する： 不活化したウイルス感染組織培養液 1ml ２％リン酸アルミニウム溶液 0.18ml pH9の1.2モル／グリシンバッファー 0.02ml Quil A 130μｇ この混合物をバイアルにつめる。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/215 C12N 7/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】パリのパスツール研究所のコレクション
    ナショナル ド キュルチュール ド ミクローオルガ
    ニスムス（Collection Nationale de Cultures de Micr
    o−organismes）に寄託された、受託番号Ｉ−743のイヌ
    コロナウイルス株の抗原型ウイルス株に由来することを
    特徴とする、イヌコロナウイルス感染の臨床的作用から
    感受性動物を保護するワクチン。
  2. 【請求項２】パリのパスツール研究所のコレクション
    ナショナル ド キュルチュール ド ミクローオルガ
    ニスムス（Cullection Nationale de Cultures de Micr
    o−organismes）に寄託された、受託番号Ｉ−743のイヌ
    コロナウイルス株に由来することを特徴とする請求項１
    に記載のワクチン。
  3. 【請求項３】イヌコロナウイルス株Ｉ−743の血清型イ
    ヌコロナウイルスの本質的に純粋な培養物。
  4. 【請求項４】イヌコロナウイルス株Ｉ−743の、請求項
    ３に記載の本質的に純粋な培養物。
  5. 【請求項５】イヌコロナウイルス株Ｉ−743の抗原型イ
    ヌコロナウイルスをワクチン用途に適する形にすること
    を特徴とするイヌコロナウイルスワクチンの製法。
  6. 【請求項６】請求項１又は２のワクチンを動物に投与す
    ることを特徴とするイヌコロナウイルス感染から感染受
    性動物を保護する方法。
JP11666990A 1989-05-03 1990-05-02 イヌコロナウイルスワクチン Expired - Fee Related JP2892767B2 (ja)

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