PT623167E - Preparacao de antigenios e vacinas do virus da mistery disease e antigenios e vacinas produzidos para a prevencao desta doenca - Google Patents

Description

- 1 - DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE ANTIGÉNIOS E VACINAS DO VÍRUS DA MISTERY DISEASE E ANTIGÉNIOS E VACINAS PRODUZIDOS PARA A PREVENÇÃO DESTA DOENÇA" O presente invento diz respeito à preparação de antigénios e vacinas do vírus da Mistery Disease, assim como aos antigénios e vacinas obtidos. A doença designada Mystery Disease (M.D.) ou doença misteriosa ou ainda Síndrome Respiratório Reprodutor Porcino (P.R.R.S.), começou a ser identificada, no porco, nos Estados Unidosa em 1986 e na Europa em 1990. Esta doença manifesta-se essencialmente no porco, por sinais de abatimento, anorexia e hipetermia da ordem dos 40°C, que se observa classicamente nos porcos de explorações pecuárias atingidas pela doença. Estes sinais são acompanhados ou seguidos de problemas de reprodução (partos precoces ou tardios e nascimento de leitões nado-mortos, mumificados ou débeis e acesssos febris das porcas). Um síndrome respiratório pode ser observado nos leitões com lesões de pneumonia intersticial. Os porcos mais idosos podem igualmente ser atingidos por problemas respiratórios. Toda esta sintomatologia pode ser acompanhada de doenças provocadas por infecções ocasionais classicamente observadas no porco. G. Wensvoort et al., em Mystery Swine Disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad viras, The Veterinary Qarterly, Vol. 13, N° 3, 19 de Julho de 1991, descreveram o isolamento de um agente associado à doença -2- referida como Mystery Diseaese, que se caracteriza como um vírus designado vírus de Lelystad, e que está presente como agente causador da doença. Esta descoberta constituiu o primeiro passo para a pesquisa de uma vacina contra esta doença. Não existia um processo de produção industrial deste vírus ou de antigénios virais, a cultura sendo possível apenas em macrófagos alveolares de porco.

Os inventores conseguiram isolar e identificar um outro vírus, responsável por esta doença. Este vírus é do tipo Mixovírus, de acordo com a análise realizada ao microscópio electrónico, e com a característica de não ser neutralisado por soros antigripe de porco H1N1 e H3N2.

Uma estirpe deste vírus identificado com a designação PI29-294 foi depositada na Collection Nationale de Cultures de Micro-organisme do Instituto Pasteur com o n° 1-1153.

No pedido de patente francês n° 91 13338 depositado em 29 de Outubro de 1991, os inventores descreveram um processo de isolamento do vírus e a sua utilização para a preparação de antigénios, um processo de produção industrial deste vírus, assim como vacinas realizadas a partir dos antigénios precipitados contendo uma quantidade vacinai eficaz de antigénios, em veículos adequados.

Ainda, paralelamente à descoberta e à utilização deste outro vírus, em que uma estirpe foi depositada com a designação PI29-294, os inventores -3- 3(38Λ isolaram, a partir do mesmo orgão da mesma porca proveniente de uma exploração de porcos na Alemanha e identificaram com o n° 294, um vírus diferente, com uma estirpe identificada com a designação P129-294B. Isolaram igualmente uma outra estirpe virai a partir de orgãos de leitão de uma exploração da Alemanha, colhidos em 13 de Fevereiro de 1991, esta estirpe sendo identificada com a designação PI20-117B.

Os inventores estabeleceram que os dois vírus, ou seja o vírus do tipo Mixovírus (por exemplo PI29-294), daqui em diante designado vírus A, e os vírus correspondentes às estirpes P129-294B ou P120-117B, daqui em diante designado vírus B, encontram-se associados nas colheitas efectuadas a partir de porcos doentes ou infectados e nos mesmos orgãos, e podem ser considerados como agentes conjuntos responsáveis pela referida doença designada Mysteiy Disease. O invento tem como objectivo um processo de isolamento da mistura de vírus (A, B) da Mystery Disease, ou seja um mixovírus (A) do tipo correspondente à estirpe PI29-294 depositado na CNCM com o n° 1-1153 e um vírus (B) correspondendo à estirpe P120-117B depositado na CNCM com ο n° I-1163, compreendendo a colheita de orgãos ou de sangue de porcos, doentes ou infectados, e passagens do sobrenadante de trituração ou constituintes do sangue em células alvo heterólogas ou homólogas, seguido de colheita do sobrenadante.

As células alvo homólogas podem ser essencialmente células primárias de porco, linhas celulares de porco, ou heterólogas, como sejam as células da linha Vero, MDCK (na presença de tripsina), ST, BHK. -4-

Prefere-se efectuar a colheita da amostra a partir de pulmão do animal infectado ou ainda a partir de um conjunto de orgãos compreendendo, por exemplo, coração, baço, fígado, rim e tecidos linfóides. Às amostras virais não hemaglutinam por glóbulos vermelhos de galinha, são sensíveis ao clorofórmio e reagem com soros convalescentes provenientes de amostras infectadas como foi demonstrado por imunofluores-cência indirecta. A análise estrutural por microscopia electrónica mostra estruturas com invólucro com uma dimensão de cerca de 50 nm. O invento tem igualmente como objectivo um processo de produção industrial da mistura de vírus (A, B) da Mystery Disease, ou seja um mixovírus (A) do tipo correspondente à estirpe P 129-294 depositado na CNCM com o n° 1-1153 e um vírus (B) correspondendo à estirpe P 120-117 B depositado na CNCM com o n° 1-1163, no qual se replica o vírus em células alvo homólogas, células primárias de porco, linhas celulares de porco, ou heterólogas, principalmente as células da linha Vero, MDCK, ST, BHK e colhe-se o último sobrenadante. O vírus pode ser utilizado para a preparação de antigénios. O processo de produção industrial do vírus A, descrito no pedido de patente francês referido anteriormente, produz simultaneamente o vírus B. O vírus, ou mistura de vírus, colhido pode ser utilizado para a preparação de antigénios. Para este fim, ele é convenientemente ou preferencialmente purificado seguindo processos convencionais, por exemplo por ultracen-trifiigação ou por cromatografia. Pode ser igualmente concentrado pelas técnicas habituais. -5- -5-

De acordo com a utilização a que se destinam, as preparações de antigénios de acordo com o invento podem ser constituídas por partículas virais vivas, atenuadas ou não, partículas inactivadas, antigénios de subunidades ou ainda antigénios obtidos por recombinação genética a partir de genes do ou dos vírus isolados, inseridos para serem expressos no genoma de hospedeiros recombinantes procariotas ou eucariotas. O invento tem igualmente còmo objectivo as vacinas realizadas a partir de pelo menos um dos antigénios referidos, formuladas em veículos adequados, uma quantidade vacinai de uma preparação de antigénio obtido a partir da estirpe virai PI20-117B depositada na CNCM com o n° 1-1163.

De preferência as vacinas de acordo com o invento comportam os antigénios do vírus A, em associação com os antigénios do vírus B, e eventualmente outros antigénios infecciosos para a imunização do porco ou de outras espécies animais.

Estas vacinas podem ser destinadas à administração a porcos mas igualmente a outros animais que possam ser alvos deste vírus.

Uma vacina atenuada pode ser preparada por passagens do vírus em cultura celular. r A quantidade de cada vírus por dose vacinai é de preferência entre 103 e 108 DICC50 por dose. -6- A vacina atenuada viva pode ser apresentada sob a forma líquida ou liofílizada na presença de establizadores de formulações muito variadas, podendo incluir açúcares, proteínas e tampões. A vacina pode ter adjuvantes minerais ou orgânicos. A vacina viva pode ser administrada aos animais para os proteger no início do período de engorda ou antes da inseminação artificial ou cobrição, ou no decurso da gestação, em uma e de preferência em duas injecções com três ou quatro semanas de intervalo.

Uma vacina inactivada pode ser preparada a partir de suspensões virais obtidas por passagem em sistemas celulares homólogos (porco) ou heterólogos, seguido de inactivação por agentes inactivadores químicos convencionais tais como beta-propiolactona, enzimas ou solventes orgânicos ou detergentes. A inactivação pode ser igualmente obtida por acção física, como seja por radiação ultravioleta, radiações gama ou raios X. O agente de inactivador pode ser neutralizado se necessário. A vacina inactivada contendo de preferência pelo menos o equivalente a 105 DICC50 de cada vírus por dose vacinai, concentração determinada antes da inactivação. A vacina inactivada pode ser administrada aos animais para os proteger desde o início do período de engorda ou antes da inseminação artificial ou na cobrição, ou no decurso da gestação, em uma e de preferência em duas injecções com três a quatro semanas de intervalo. Prefere-se que a vacina -7- contenha um adjuvante de origem mineral ou orgânica.

Uma vacina recombinante pode ser obtida, por exemplo, por inserção da sequência codificadora do antigénio virai com interesse no genoma do hospedeiro. O hospedeiro pode ser um vírus, principlamente para a obtenção de uma vacina viva.

Este hospedeiro pode ser igualmente um sistema bacteriano, leveduras ou outras células eucariotas. Neste caso, o hospedeiro é de preferência utilizado para a produção de antigénios que são em seguida purificados e condicionados para fazer a vacina. A vacina pode ser apresentada sob a forma monovalente ou associada a outros agentes virais ou bacterianos responsáveis por doenças no porco. O invento tem igualmente como objectivo preparações de antigénios com a finalidade de diagnóstico, caracterizadas por incluírem antigénios do vírus A ou uma mistura de antigénios do vírus A e B. Estas preparações de antigénios com finalidade de diagnóstico são realizadas de forma convencional e incluem os meios convencionais que permitem a identificação e eventual mente a quantificação das reacções serológicas positivas. O invento tem igualmente como objectivo as preparações de anticorpos contra estes antigénios, utilizáveis para o diagnóstico da doença.

Outras vantagens e características do invento surgirão da leitura da descrição que se segue, feita a título de exemplo e não sendo limitativa. -8-

Exemplo 1: Isolamento do vírus P129-294B.

As colheitas de pulmão foram realizadas numa porca proveniente de uma exploração de porcos na Alemanha e identificada com o n° 294. a) Método:

Triturado de orgãos: cada uma das amostras foi triturada individualmente em meio MEM + antibióticos.

Diluição: peso de orgão por volume de aproximadamente 1 para 10.

Centrifugação de clarificação para recuperação do líquido sobrenadante (LS).

Filtração por 0,22 μ. b) Ensaios em culturas celulares:

Primeiras passagens: o LS é inoculado numa monocamada de células de macrófagos de pulmão de porco SPF. Três dias após inoculação, observou-se um efeito citopático que se manifesta por uma modificação morfológica dos macrófagos, em diferentes estados de evolução. Este efeito citopático é máximo ao quinto dia.

Exame por microscopia electrónica: técnica realizada sobre cortes de macrófagos infectados e sãos. Os macrófagos infectados apresentam um aspecto totalmente diferente dos macrófagos sãos. Observa-se no interior das células infectadas vacúolos contendo partículas com cerca de 50 nm. -9-

Exemplo 2: Isolamento do vírus PI20-117B de orgàos de um leitão colhidos a 13 de Fevereiro de 1991. a) Método:

Triturados de orgãos: o orgão foi triturado em meio MEM mais antibióticos.

Diluição: peso do orgão por volume de cerca de 1 para 10.

Centrifugação de clarificação para recuperação do líquido sobrenadante (LS).

Filtração por 0,22 μ. b) Ensaios em culturas celulares:

Primeiras passagens: o LS foi inoculado numa linha celular de macrófagos de pulmão de porco SPF. Três dias após inoculação, observou-se um efeiito citopático que se manifestou por uma modificação morfológica dos macrófagos, em diferentes estados de evolução. Este efeito citopático é máximo ao quinto dia.

Exemplo 3: Estudo serológico.

Os antigénios constituídos por preparações virais PI29/294 B e P120/177 B, assim como por outras estirpes virais P206 e P 208 foram testados relativamente a: - um soro de referência convencional, referido como Ploufragan; - soros de porcas tendo servido à reprodução experimental da doença (colheita 21 dias após inoculação e após parto das porcas); - soros de leitões inoculados experimentalmente por via intranasal. - 10-

Os resultados serológicos por reacção de imunofluorescência indirecta são os seguintes: PI29/294 B PI20/117 B P206 ou P208 Soros Ploufragan + + + Soros de porcas + - - Soros de leitões + +

Exemplo 4: Estudo comparativo do poder patogénico dos dois viras: PI29-294 e P129-294B. a) A estirpe virai PI29-294: o agente virai isolado em ovos foi inoculado na forma de uma suspensão virai de líquido alantóico da terceira passagem , em 2 porcos SPF, por via intravenosa, num volume de 1 cm3. 2 outros porcos SPF foram inoculados igualmente por via intravenosa com vírus Newcastle, estirpe Texas. 2 porcos foram mantidos como testemunhas e inoculados com líquido alantóico não diluido. Os animais sendo alojados em compartimentos diferentes. Foram observados durante 14 dias sendo tirada a temperatura diariamente e pesados nos dias 0 e 7. As amostras de sangue foram colhidas nos dias 0 e 14.

Os dois porcos inoculados com o agente hemaglutinante apresentaram uma hipertermia compreendida entre 39,5° e 40°C entre o dia 1 após inoculação e o dia 7, enquanto que os outros 4 porcos nunca apresentaram elevação da temperatura. Observou-se no dia 2 vestígios de vomitado na cela dos 2 porcos inoculados com o agente hemaglutinante. Por outro lado, nestes dois animais observou-se uma inaptência durante alguns dias, o que se traduziu por uma evolução ponderai muito desfavorável para estes dois animais relativamente aos inoculados com o líquido alantóico testemunha ou aos inoculados com o -11 - vírus Newcastle. O gráfico que se segue ilustra esta diferença de crescimento. Na autópsia, um dos dois porcos inoculados com o agente hemaglutinante apresentava lesões pouco marcadas de pneumonia. b) A estirpe virai P129-294B foi inoculada em duas porcas, por via nasal, com 103·5 doses infecciosas do isolado no 58° e 68° dias da gestação. As porcas não apresentaram qualquer sinal clínico de doença após inoculação. No dia 110 da gestação, a porca n°25 deu à luz dois leitões nado-mortos e 8 leitões vivos. Os vivos tinham um aspecto débil e eram incapazes de caminhar. O seu comportamento assemelhava-se exactamente ao observado nos leitões das explorações infectadas. 3 leitões morreram no dia do nascimento, 2 às 24 horas, 3 às 72 horas e finalmente 1 leitão foi encontrado morto às 72 horas após nascimento tardio. Nesse dia, a segunda porca, em gestação mais precoce, apresentou febre e anorexia no dia 106 de gestação. No dia 112 de gestação, deu à luz 5 leitões nado-mortos e um leitão vivo muito débil.

Conclusão: O vírus P129-294 é responsável por sinais clínicos em leitões, surgindo sob a forma de hipertermia e de anorexia, enquanto que o vírus P129-294B é responsável por problemas na reprodução. Este conjunto clínico reproduz as observações feitas nas explorações infectadas. Finalmente, estes dois vírus foram isolados do mesmo orgão, o pulmão, de uma mesma porca.

Exemplo 5: Estudo do poder patogénico do vírus 120/117 B.

Uma inoculação experimental realizada em leitões com um peso de aproximadamente 20 Kg, com a ajuda da estirpe pl20/l 17 B, administrada por via intranasal com um inoculo de 105·5 DICC50/ml tiveram febre e inaptência durante alguns dias. X' - 12-

Exemplo 6: Acompanhamento serológico. Presença de anticorpos contra a estirpe PI29-294. 238 soros provenientes de explorações infectadas foram analisados quanto à presença de anticorpos contra a estirpe PI29-294.

Nestas explorações, os sinais de manifestação da doença misteriosa do porco foram observados (abortos, problemas respiratórios). O método serológico é um teste de ELISA indirecto; o antigénio utilizado é um antigénio obtido de ovos após ultracentrifugação. Os soros a testar foram tratados previamente com a ajuda de um antigénio de ovo negativo tendo sofrido o mesmo tratamento de ultracentrifugação. Os 238 soros provenientes de explorações infectadas na Alemanha, Bélgica ou da Holanda, apresentavam anticorpos muito positivos para 43% deles, fracamente positivos para 37% e negativos para 20%.

Conclusão: Nos casos clínicos de doença misteriosa, observa-se uma serologia positiva contra a estirpe PI29-294 em 80% dos casos. Deve-se notar que os soros provenientes de explorações não suspeitas, são negativos, ou que a frequência de positividade é significativamente inferior à observada nas elevages clinicamente suspeitas.

Estes resultados mostram a importância da infecção por mixovírus no síndrome da doença misteriosa.

Exemplo 7: Preparação de vacina viva.

Os vírus PI29-294 e P120-117B ou P129-294B foram replicados por passagens num sistema de células adaptadas. O material colhido foi tratado de acordo com a vacina a ser produzida: vacina liofilizada para reconstituição em - 13 - solvente aquoso, em solvente oleoso ou noutras vacinas. Pode-se também apresentar em vacina líquida em solvente aquoso, oleoso ou noutra vacina.

Exemplo 8: Preparação de vacina inactivada.

Os vírus PI29-294 e P120-117B ou P129-294B foram replicados em células BHK, Vero, macrófagos ou linhas celulares de porco e inactivadas pela beta-propiolactona, etilenimina, depois combinada com um adjuvante aquoso ou oleoso.

As estirpes virais P120-117B e P129-294B foram depositadas na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM): PI20-117B depositados como n° 1-1163 P129-294B depositado com o n° 1-1164. O vírus PI20-117B surge como um togavírus.

Lisboa, 23 de Fevereiro de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o isolamento da mistura de vírus (A, B) da Mystery Diseaese, ou seja um mixovírus (A) do tipo correspondente à estirpe P129-294 depositado na CNCM com o n° 1-1153 e um vírus (B) correspondendo à estirpe P120-117B depositado na CNCM com o n° 1-1163, compreendendo a colheita de orgãos ou de sangue de porcos doentes ou infectados e as passagens do sobrenadante de trituração ou de constituintes do sangue em células alvo heterólogas ou homólogas, seguido de colheita do sobrenadante.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as passagens serem efectuadas na linha de células Vero, MDCK, ST, BHK.
3. 3. Processo para a produção industrial da mistura de vírus (A, B) da Mystery Disease, ou seja um mixovírus (A) do tipo correspondente à estirpe P 129-294 depositada na CNCM com o n° 1-1153 e um vírus (B) correspondendo à estirpe P 120-117 B depositado na CNCM com o n° 1-1163, no qual se cultiva o vírus em células alvo homólogas, células primárias de porco, linha celular de porco, ou células heterólogas, principalmente células da linha Vero, MDCK, ST, BHK e colhe-se o último sobrenadante.
4. 4. Preparação purificada da estirpe virai P 120-117 B depositado na CNCM com o n° 1-1163.
5. 5. Preparação antigénica compreendendo partículas vivas, atenuadas ou não, ou partículas inactivadas, ou antigénios de subunidades virais, obtidos a partir da preparação de acordo com a reivindicação 4. -2-
6. 6. Vacina contra a Mystery Disease caracterizada por conter, numv veículo adequado, uma quantidade vacinai de uma preparação de acordo com uma das reivindicações 4 ou 5.
7. 7. Vacina atenuada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por ser preparada pela passagem do ou dos vírus em questão em cultura celular.
8. 8. Vacina atenuada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a quantidade de vírus por dose vacinai estar compreendida entre 103 e 108 DICC50.
9. 9. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o sobrenadante da cultura ser inactivado por um agente de inactivação químico ou físico.
10. 10. Vacina inactivada de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por conter pelo menos um equivalente de 105 DICC50 de vírus por dose vacinai.
11. 11. Preparação para utilização em diagnóstico da doença referida como Mystery Disease, caracterizada por compreender uma preparação de acordo com as reivindicações 4 e 5 ou anticorpos contra tal preparação.

    Agente Oficial da Propriedade Industrie RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA Lisboa, 23 de Fevereiro de 2000