SU1604851A1

SU1604851A1 - Штамм ЕNтеRоVIRUSSUIS дл диагностики энтеровирусной пневмонии свиней

Info

Publication number: SU1604851A1
Application number: SU884621471A
Authority: SU
Inventors: Владимир Филиппович Романенко; Алевтина Александровна Бокун; Нина Васильевна Бабич; Ирина Николаевна Пинчук
Original assignee: Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1990-11-07

Abstract

Изобретение относитс к ветеринарной вирусологии и представл ет собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый дл диагностики энтеровирусной пневмонии свиней. Целью изобретени вл етс получение штамма нового серотипа энтеровирусной пневмонии свиней, обладающего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток СПЭВ, безвредного и ареактогенного дл лабораторных животных. Штамм Ч-73 ENTEROVIRUS SUIS - 15 депонирован в коллекции ВГНКИ код N8, вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуютс в титре 1:1024. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамускул рно инокулированных кроликов. 1 табл.

Description

Изобретение относитс к ветеринарной вирусологии и представл ет собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый дл диагностики энтеровирусной пневмонии свиней.

Цель изобретени - получение нового серотипа штамма энтеровируса свиней , обладаюдего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток линии СПЭВ, безвредного и аре- актогенного дл лабораторных животных .

Штамм депонирован в ко ллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпре пар тов; под № 8, назван авторами Ч-73 En.N-.rovirus siiis-15 и имеет следук цие признаки .

Морфологи . Сферическа форма, типична дл энтеровирусов свиней, имеет икосаэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм.

Антигенна структура. В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличаетс от референтных штаммов известных серотипов энтеровирусов свиней.

Биологические свойства. Итамм Ч-73 Enterovirus suis-15 обладает репродуктивной активностью на культуре перевиваемых клет.ок лшпш СПЭБ и

эс

:л

накапливаетс до TIUTg-fl/MA чение 48 ч при . Обладает бл шко- образуюп5ими свойствами на перевиваемых клетках линии СПЭВ. Образует однородные бл шки размером 1-1,5 мм.

Физико-химические свойства. Явл етс РНК-содержащим, репродукци вируса в культуре клеток не подавл еткоторое нейтрализует 100 ТЩ j-o виру са в 50% инокулированных вируссьшо- роточной смесью пробирках, f Результат считают положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в четьфе и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более процентах

. с присутствием в поддерживающей ере- сывороток крови переболевших живот20

25

де 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиури- дина на 0,1-1,0 мкг/мл актиномици- на Д, устойчив к воздействию хлороформа , эфира и трипсина, а также сред со значением рН 2,0-11,0. Понижает титры на 2-3 Ig ТВД50//ИА после прогревани при 50°С в течение 30-60 мин. Термоустойчив к прогреванию при в течение 60 мин в присутствии 1 М MgCl,.

Нммуногенность. Вызывает серокон- версию у кроликов; в гипериммунных кроличьих сьгооротках вируснейтрали- зующие антитела образуютс в титре 1:1024г.

Безвредность. Не вызывает отклонений от физиологической нормы у ин- травенозно и интрамускул рно инокулированных кроликов.

Диагностику энтеровирусной пневмо- о НИИ свиней провод т путем вьщелени к идентификации вьщеленных изол - тов вирусов в реакции нейтрализации на культуре клеток СПЭВ, а также вы влением и идентификацией сывороточных антител у больных и переболевших животных.

П р и м е .р 1. Использование штамма Ч-73 энтеровируса свиней в качестве антигена дл обнаружени и идентификации антител в сьторот- ках крови больных и переболевших животных .

Обнаружение и идентификацию антител провод т в реакции нейтрализации (рН) на культуре клеток. Дп постановки рН готов т двукратные разведени сьгоороток в объеме 0,5 мл антигена с содержанием вируса а 0,1 мл 100 ТЦЦ-.. Вирус-сьшороточную смесь вьщерживают 1 ч в термостате при 37 С после чего смесь каждого разведени по 0,2 мл внос т в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростова среда.заменена на 0,8 мл поддерживающей. Учет результатов титровани антител провод т на 4-7 сут. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки.

ных.

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках на патологическом материале методом пр 5 мой иммунофлуоресценции .(11Ф) .

Дл исследовани методом иммунофлуоресценции на обезжиренных пред- .метных стеклах готов т мазки-отпечат ки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, нанос т на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фос- фатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследзтот под люминесцент ным микроскопом. Положительным ре- зультатом исследовани считают специфическое рко-зеленое свечение ци топлазмы клеток на фоне ткани, кото ра светитс серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификаци вы деленного вируса в культуре клеток.

I

Типирование вируса провод т в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сьшоротки к вирусу штамма Ч-73, вход щего в состав набора диагностикумов. Дп титровани 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦЦ50 смешивают с 0,5 мл иммунной сьшоротки с дс содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрали зующих доз. После выдерживани ви- рус-сьшороточной смеси в течение 1,5 ч при по 0,2 мл ее внос т четыре пробирки с культурой клеток, ростова среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддержив ющей и став т в термостат на инкуба цию при 37°С. Учет результатов пров д т на 4 и 7 сутки.

Результат типировани считают по ложительным, если в 50% инокулированных вируссьшороточной смесью про бирок сыворотка нейтрализовала виру ( 1ЩД не отмечено) .

40

50

55

которое нейтрализует 100 ТЩ j-o вируса в 50% инокулированных вируссьшо- роточной смесью пробирках, f Результат считают положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в четьфе и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более процентах

0

25

о

ных.

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках на патологическом материале методом пр - 5 мой иммунофлуоресценции .(11Ф) .

Дл исследовани методом иммунофлуоресценции на обезжиренных пред- .метных стеклах готов т мазки-отпечатки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, нанос т на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фос- фатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследзтот под люминесцентным микроскопом. Положительным ре- i зультатом исследовани считают специфическое рко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне ткани, котора светитс серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификаци выделенного вируса в культуре клеток.

I

Типирование вируса провод т в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сьшоротки к вирусу штамма Ч-73, вход щего в состав набора диагностикумов. Дп титровани 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦЦ50 смешивают с 0,5 мл иммунной сьшоротки с дс содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживани ви- рус-сьшороточной смеси в течение 1,5 ч при по 0,2 мл ее внос т в четыре пробирки с культурой клеток, ростова среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и став т в термостат на инкубацию при 37°С. Учет результатов провод т на 4 и 7 сутки.

Результат типировани считают положительным , если в 50% инокулированных вируссьшороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (1ЩД не отмечено) .

40

50

55

1

Пример 4. Идентификаци вируса в культуре клеток методом имму- нофлуоресценции.

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до по влени ЦПД. После наступлени .ЦПД стекла извлекают, промьшают фосфатно буферным раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем на препараты нанос т флуоресцирующий иммуногло булин к штамму Ч-73, выдерживают 30 мин при 37 С, обильно промьшают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Микроскопию провод т на люминесцентном микроск опе.

Положительным результатом считают специфическое рко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов на 3-4 пораженных клеток. I Пример 5. Опыт по определению типовой принадлежности выделенного от свиней штамма энтеровируса Ч-73 в перекрестной реакции нейтрализации в культуре клеток СПЭВ с эталонными и выделенными (Г-95, ;Б-111) штаммами энтеровирусов свиней

Результаты типировани штамма приведены в таблице.

Данные типировани выделенного штамма энтерови руса свиней Ч-73 с эталонными и выделенными штаммами и изучени антигенного родства между ними доказывают принадлежность его к неизвестному серотипу.

Пример 6. Дл выделени вирусов от больных свиней отбирают на

10

485

t5

20

25

30

5

16

зальные смьшы, пробы легких, бронхиальных лимфатических узлов, а-дл вы влени антител - сьюоротки крови от больных и переболевших животных.

Дл вы влени и идентификации сывороточных антител в реакции нейтрализации на культуре клеток используют штаммы известных (Konratice-1; Т80, F59-2; F34-3; F78-4; F12-5; F7-6; У13-8| К-9-11; К-22-12; Л-90-13; М116-14) и нового (Ч-73-15) серотипов энтеровирусов свиней.

Дл типировани выделенных изол - тов вирусов используют гипер1-1ммун- ные кроличьи сыворотки к указанным выше штаммам.

Из 70 проб органов и назальных . смьшов, отобранных в очагах заболевани свиней энтеровирусной пневмонией , выдел ют 14 изол тов вирусов, из которых 2 идентичны штамму Ч-73 нового серотипа 15 энтеровирусов свиней.

Из 39 исследованных сывороток крови в 14 вы вл ют вируснейтрализую- щие антитела в диагностических титрах к штамму антеровируса свиней нового серотипа 15.

Полученные результаты дают возможность поставить диагноз заболевани свиней энтеровирусной пневмонией и разработать меропри ти ,по ее профилактике .

Claims

Формула изобретени

Штамм Enterovirus suis ВГНКИ № 8 дл диагностики энтеровирусной пневмо- НИ1-1 свиней.